JPH03117480A - 酵母菌体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ 本発明は海洋酵母を用いて、再生産可能なバイオマス資
源から大量に生産できるエタノールを発酵原料として、
リノール酸（１８：２）とリノレン酸（１８：３）含量
の高い脂質を菌体内に蓄積する酵母菌体を製造する方法
に関するものである。

さらに詳細には、カンジダ属に属しエタノール資化性を
有する海洋酵母菌株をエタノールを炭素源として含有す
る培地で培養し、リノール酸とリノレン酸含量の高い脂
質を含む酵母菌体を製造する方法に関する。

〔従来の技術〕

従来、微生物タンパク質（ＳＣＰ）は養魚飼料や家畜の
飼料として利用できることが知られている。

そして、これらのＳＣＰは糖蜜、パルプ廃液、ｎ　−パ
ラフィン、メタン、メタノールおよびエタノールなどの
原料から生産することができる（桝田淑部、微生物タン
パクの開発、講談社、　１９７８年）。

また、海洋酵母は養魚飼料や海産魚類の種苗生産に不可
欠な動物プランクトン（シオミズツボワムシ）の餌料に
なることも知られている（特公昭６０−４０８０８号）
。

最近、魚も哺乳動物と同じように魚種によって異なるが
、１８：２．１８：３及びω３高度不飽和脂肪酸を必須
脂肪酸として要求することがわかってきた。

例えば、ギンザゲは１８：３を５、またシロザケは海水
または淡水のいずれで飼育しても１８：２と１８：３を
要求する（日水誌、４８巻、　１７４５頁、　１９８２
年）。

しか１〜ながら、従来開発されたパン酵母、バルブ酵母
、石油酵母などのｓｅｐが養魚用飼料として使用された
場合、これらの酵母菌体は水中での分散が悪く餌料効率
が劣り、生酵母であっても海水のようなイオン濃度の高
い高張液中では不安定で菌体中の有効成分の流出を起こ
すと共に、飼育水の汚染を引き起こす欠点を有している
（代田昭彦。

水産餌料住物学、３０３頁、恒星社厚生開、　１９７５
年）。

上記のような欠点を解決するため、海洋酵母が開発され
ているが、発酵原料にグルコースやアルコール発酵母液
（日水誌、４９巻、　１０１５頁、　１９８３年）が使
用されている。また、海洋性酵母のエタノール資化性に
一ついての研究報告があるが、エタノール資化性は菌の
生理的性質の一部として知られているにすぎない（日水
誌、４９巻、　１０１５頁、　１９８３年）。

海洋酵母からのＳＣＰの生産に、大量供給が可能なエタ
ノールを利用する試みばみられない。

また、微生物による油脂の生産Ｑこ関する研究は古くか
ら行われているが、特殊な用途や機能をもった油脂、例
えば必須脂肪酸であるリノール酸等を多量に含む油脂の
生産に関する研究は少なく、今だ目的とする成果は得ら
れていない（油化学。

３１巻、４３１頁、　１９８２年）。リノール酸含量の
高い脂質を形成する酵母菌体の製造法が、特公昭５７−
２３１４号に記載されているが、エタノールを炭素源と
した場合、中性脂質の脂肪酸組成で１８：２が１１．２
％、１８：３は１．３％、極性脂質のそれで１８＝２が
１３．８％２．１８：３が１．６％とその含有壇は高く
なく、とくに１８：３含量は少ない。メタノールを炭素
源とした場合、中性脂質の脂肪酸組成で１８：２含量は
約２倍の２２．８％に増加しているが、１８：３含″！
ｄはｌ、７１′！６と低い。以−トのように微生物によ
り１８：２を多量に含む油脂の生産が試みられているが
、いずれも満足できるものではなかった。

エタノールを発酵原料として、リノール酸（１８：２）
とリノレン酸（１８：３）含量の高い脂質を菌体内乙に
蓄積する海洋酵母の生産については全く知られていない
。

〔発明が解決し、ようとする課題］ 本発明は、以上のようなことに鑑みなされたものであっ
て、本発明の「１的はバイオマス資源から友星に供給さ
れるエタノールから、海水中で安定で飼１）効９べがよ
く、か一つ必須脂肪酸であるリノール酸（１８：２）と
りノ［・ン酸（１計３）含量の高い脂質を菌体内に蓄積
する海洋酵母を生産する方法を提供することにある。

本発明者らはこの目的を達成するため鋭意研究を重ねた
結果、エタノール資化性を有し、エタノールを炭素源と
する培地でよく増殖し、リノール酸（１８：２）とリノ
レン酸（１８：３）含量の高い脂質を菌体内に蓄積する
海洋酵母を、沿岸海域の海水から見出し、本発明を完成
するに至った。

〔課題を解決するだめの手段〕

本発明の要旨は、カンジダ属に属し、エタノール資化性
を有し、リノール酸とリノレン酸含量の高い脂質を菌体
内に形成することができる菌株を、エタノールを炭素源
として含有する培地において培養し、リノール酸とリノ
レン酸含量の高い脂質を含む酵母菌体を製造する方法Ｑ
こある。

本発明においては、海洋酵母でカンジダ属に属し２、エ
タノール資化性を有し、１８：２と１８＝３を含ｆＪす
る脂質を菌体内に形成する微生物であれば」べて使用す
ることができる。このような微生物として例えば本発明
者らが沿岸の海水から分離（７たカンジダ属（Ｃａｎｄ
ｉｄａ）　ｓｐ、　５３０Ｗ２株（ＦＥｌｉＭ　Ｐ　１
１０２３）を例示できる。

ごの菌株５３０匈２　（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１０２３）の
菌学的１″１−質１よ丁記の如くである。

１、形態学的性質 １）栄養細胞′″１大きさ（μｍ）　（２−５）Ｘ（３
−１２）形　状　楕円形ないしとき乙こは 伸長形 ２）栄養体生殖″′ｌ　多極出芽によってよく増殖する
。

３）仮性菌糸０２　　芽出胞子を伴った仮性菌糸を形成
する。

分裂子゛２　　形成せず。

子のう胞子１３形成せず。

射出胞子″４　形成せず。

テリオスボア１５　　　　　形成せず。

生理的性質 ｉＤｆ／（Ｆ色素”６生成せず。

その他 を炭素源とした寒天斜面培地で保存し、その培地での植
継ぎ回数の多い菌株では、表面が粗い（ｒｏｕｇｈ）コ
ロニー（Ｒ型コロニー）の出現がみられた。Ｒ型コロニ
ーを分離し、Ｓ型コロニと比較した結果、エタノールを
炭素源とする培地で、菌体収量、菌体脂質含量及び脂質
の脂肪酸組成に大きな差は認められなか−、た。

また、本菌株のＧＰＹ培地を用いたときの生育温度を第
１図に示した。最適生育温度は１０〜２０℃であったが
、５℃の低温でもよく増殖する。

しかし３０″Ｃ以トではほとんど増殖できない低温性の
酵母であった。第１図の試験はＬ型試験にＧＰＹ培地１
０ｍ２を入れ、酵母８３０に２株を接種し、振とう培養
を行った。第１図〜囚は振とう温度勾配培養装置、第１
図−■は恒温培養室または恒温水槽にて、それぞれ振と
う培養し７た。

”１：　ＹＭ液体培地（酵母エキス（Ｄｉｒｃｏ）　３
ｇ。

麦芽エキス（Ｄｉｆｅｏ）　３ｇ、　ヘプｈ　７　（Ｄ
ｉｒｃｏ）５ｇ、グルコース１０ｇ、蒸留水１ｅ、ｐＨ
５，５）にて２５℃，３日培養後観察。

”２：コーンミール寒天培地（Ｄｉｆｃｏ）　６２５℃
１１〜１７日培養、スライドカルチャ法。

”３：　ＹＭ　寒天培地（Ｄｉｒｃｏ）、野菜汁Ｖ−８
寒天培地、　Ｇｏｒｏｄｋｏｗａ寒天培地及びＭｃＣｌ
ａｒｙらのＡｅｅｔａｔ、ｅ寒天培地を用い、２５℃で
３日培養後、２０℃にて６週間培養し観察。

′に４：バレイショ・グルコース寒天培地（Ｄ　ｉ　ｒ
　ｃｏ）にて、２５゛Ｃで１１日また２０゛Ｃで４週間
培養し観察。スライドグラス法。

″５：コーンミール寒天培地（口１ｆｅｏ）で１０”Ｃ
。

６週間培養し観察。

”６：麦芽エキス寒天培地（Ｏｘｏｉｄ）を用い２０゛
Ｃと２５゛Ｃで１６日培養して観察。

”７：　ＧＰＹ培地（グルコース２０ｇ、ペプトン（Ｄ
ｉｒｃｏ）　１０ｇ、　　酵母エキス（Ｄｉｒｃｏ）　
５ｇ。

茎留水２５０ｄ、塾成海水１５０ｍ１．寒天２０ｇ、　
ｐＨ６−０＋液体培地の場合はｐＨ５，５とした。） 以」二の菌学的性質をＴｈｅ　ｙｅａｓｔｓ　ａ　ｔａ
ｘｏｎｏｍｉｃｓｔｕｄｙ（３ｒｄ　ｃｄ、、　Ｎ、Ｊ
、Ｗ、　Ｋｒｅｇｅｒ−ｖａｎ　Ｒｉｊ編＋　１９８４
年）と対比した結果、本菌株はカンジダ属（Ｃａｎｄ■
ハ）に属すると認められたので、カンジダｓｐ、　５３
０Ｗ２株（Ｃａｎｄｉｄａ　ｓｐ、　５３０Ｗ２株）と
命名した。

本発明の微生物を培養する培地及び培養条件は、通常の
酵母を培養するために用いられる培地及び培養条件を使
用することができる。

本発明に使用される菌株を培養する培地は、天然海水ま
たは人工海水、またそれらを適度に希釈した海水に、主
炭素源としてエタノール、窒素源、無機塩類及びビタミ
ンその他の生育因子を適当に含有する培地であれば、天
然培地でも合成培地でも使用できる。また一般酵母の培
地、例えば唱Ｃｋｅｒｈａｍの合成培地（Ｌ、Ｊ、Ｗｉ
ｃｋｅｒｈａｍ、　Ｔａｘｏｎｏｍｙ　ｏｆｙｅａｓｔ
ｓ、　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｉ’１ｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎ
ｏ、１０２９．　ｐ、６−９Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅ
ｓ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ、　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔ
ｕｒｅＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　１９５１年）を使用す
ることもできる。

炭素源のエタノール濃度は０．１〜５．０％（ｖ／ｖ）
　。

好ましくは０．５〜２％（ν／ν）。エタノールは高濃
度になると微生物の生育を阻害する。またエタノールは
低沸点のため培養中に蒸散する可能性もある。このよう
なことから、エタノールは低濃度を維持して、培養中に
適当量のエタノールをフィードすることは好ましい。し
かし最初に添加し７たエタノールのみで培養を終了させ
ることもできる。

また、エタノールを炭素源として用いる場合、酵母菌株
が資化できる他の炭素源、例えば炭化水より大量に生産
できるようになった（発酵と工業３９巻、４９０頁、　
１９８１年；パイオザ・イエンスとインダストリー、４
７巻、８４４頁、　１９８９年）、。

エタノールは水に易溶で発酵原料として取扱いやずく、
また古くから食品の一部として利用されている安全性の
高いものである。

培地の窒素源としては、ペプトン、肉エキス、＝ｌンス
ティープリカー、カザミノ酸、麦芽エキス、脱脂人υな
どの天然窒素源の他に、塩化アンモニウム、硫酸アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸
す１−リウム、硝酸カリウムなどの硝酸塩等の無機窒素
源、尿素等の有機窒素源を用いることができる。培地中
の窒素源の濃度は通常０゜０１〜５，０％（？ｉ／ν）
、　好ましくは０．１〜２．０％ｈ／ν）である。

また、必要に応じてン毎水成分以夕（に硫酸銅、ヨカ化
カリウム、塩化鉄、モリブデン酸す１−リウム、硫酸曲
鉛などの無機塩類が用いられる。

ビタミンＭ、アミノ酸類、核酸及びその塩類なども生育
囚イーとして利用できる。また上記の生育因子庖含有す
るペプトン、肉エキス、コンスティープリカー、カザミ
ノ酸、酵母エキスなども微Ｖ栄淫源として使用できる。

これらの培地成分は微生物の増殖を阻害１．ない濃度で
あればとくに制限はない。

培地の海水濃度は１００％自然海水または１００％人工
海水、またはそれらを適当に希釈し、た海水でも使用で
きる。また本菌株は第２図に示したよ・）に１００％海
水で調製した培地より希釈海水を用いた培地が、菌体収
量、脂質含量とも良好であった。

また本菌株は一般酵母の培地であるＷｉｃｋｅｒｈａｍ
Ｏ）合成ＩＨ’Ｈ地（炭素化合物同化試験用培地）のＬ
−゛クミン類とアミノ酸類を０．５ｇの酵母エキスでお
きかえ、炭素源としてエタノール１％（ν／ν）を添加
し、た培地でも増殖する。

培養温度は３〜２９゛Ｃ１好、Ｅ　Ｌ　＜　（、！、５
−２０　”Ｃｔと（−１培地のｐＨは３，５〜８．Ｏ１
好ましくは１１・−６とずろのがよい。本菌株の培養は
振とう培養、通気攪拌培養または静置培養でもよい。培
養期間は温度によっても異なるが、通常２０時間程度か
ら２週間イ＼）行う。

上記のように培養し２て、菌体内に１８：２と１８＝３
を含有する脂質が菌体内に住成蓄積される。培養液から
の菌体ルび菌体からの脂質の採取は下記のよう己こ行う
。

培養終了後、培湿液を遠心分離するごとにより菌体が得
られる。この菌体を水で十分洗浄した湿菌体ヲクロロホ
ルムーメタノール等の有機溶媒中で機械的に磨砕、撹拌
により、菌体から脂質を抽出する。この抽出物から減圧
下で有機溶媒を留去することによって、リノール酸（１
８：２）とリノレン酸（１８：３）を含ｆ１する脂質が
得られる。

本発明の方法で得られた海洋酵母は、養魚飼料、家畜飼
料、動物プランクトン飼料、高機能性脂質の製造Ｃごお
いて特に有用なものである。

次に実、ｌＩｉ！ｉ例によりこの発明をさらに具体的に
説明する。

実施例１ 第１表の基本培地組成からエタノールを除いた培地１０
０　ｄ　含５００　ｍｉ容三角フラスコに入れ、オート
クレーブで滅菌した後、濾過滅菌したエタノール１ｍｌ
を添加ｊ−だ。前記培地でカンジダｓｐ、　５３０Ｗ２
株（’、’Ｅ叶Ｐ−１１０２３）を接種し、２０”Ｃ，
２日間振さ−う培養した培養液を前培養液とした。ごの
前培俣液１　ｍｌを前記培養フラスコに接種し７、［１
−・タリーシェーカー（１８０ｒｐｍ）により２０゛Ｃ
で２目ｒ４１１駁々う培養した。

菌体収量（乾燥菌体重￥ＤＣＷ）は培養路１′液１０ｍ
βを１５ｍＮ容沈殿管に取り、遠心骨１席後、菌体を水
で洗浄し、１１０　’Ｃで一夜乾燥して重量を測定し、
培養液１０瀬当りのＤ（Ｊｌとして求めた。

菌体からの脂質の抽出は次のように行った。菌の増殖に
応じて培養終了液４０Ｌ−１５００ｍＲ（上記フラスコ
４〜１５本）から遠心分離により菌体を採取した。この
菌体を水で洗浄した湿菌体３＝５　ｇをＩ　ｊｏｈらの
方法（Ｙｕｋａｇａｋｕ、　２３Ｓ＋　３５０頁、　１
９７４年）を用いて、りし１０ホルム−メタノールの混
合溶媒中でガラスピーズと共に磨砕、撹拌することによ
り抽出した。この抽出した脂質を減圧デシゲータ−中で
乾燥した後、重量を測定し脂質量を求めた。

また、上記脂質抽出用の湿菌体の一部約０．６−１．０
ｇを秤量びんに取り　１１０°（で１夜乾燥ｊ）で、乾
燥菌体重量を求めた。この乾燥菌体重量から湿菌体中の
乾燥菌仕置の比率を求めた。この比率から、脂質抽出用
湿菌体の乾燥菌体Ｍを算出した。菌体中の脂質含量はこ
の乾燥菌体当りの含量として重量％で表示した。

脂質中の脂肪酸の分析は次のよ・うな行った。Ｌ記脂質
２０〜３０■を９０％メタノール性ＩＮＫＯＩ＋を用い
て８０’Ｃにて２時間アルカリ分解後、１４％ＢＦｉメ
タノール錯塩処理により脂肪酸のメチルエステルを得た
。この脂肪酸のメチルエステルの組成はガスクロマｌグ
ラフにより分析した。

菌体収量、２脂質含量及び脂質脂肪酸組成について検討
した結果を第２表に示しまた。２８時間の培養で脂質脂
肪酸組成中のリノール酸（１８：２）とリノレン酸（１
８：３）の比率が最も高く前者が３８．３％、後者が２
２．４％、１８：２と１８：３の比率は脂肪酸組成中の
６０．７％を占めた。この値は特公昭５７−２３１４号
に記載されているエタノールを炭素源とした結果と比較
すると、１８：２で約３倍、１８：３で約２０倍高く、
特に１８：３含量の高いことが特徴的である。培養２［
］目になると１８：２と１８：３含量は約２０％減少し
た。

第２表に示したように不飽和脂肪酸含量が高いことは低
温酵母の特徴を示し７ているものと思す、）れる。

第２図６、二項地中の海水濃度の影響を検ｌｉｔ　１．
、た結果を示した。第１表の培地組成の人工海水を各種
の濃度に希釈した人工海水６、二おきがえた培地を使用
し７だ。海水濃度が低いほど菌体収量と脂質含［ｄが高
くなった。また前記Ｗｉｃｋｅｒｈａｍの合成培地でも
よく増殖した。この酵母は沿岸海域から分渾されたもの
で、食塩要求性については海洋細菌のような特徴はみら
れなかった。一般に海洋酵母は、耐塩性はあるが、海洋
細菌のような塩類要求性を不さないものが多いといわれ
ている。

実施例２ カンジダｓｐ、　５３０Ｗ２株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１０
２３）を用いて、次に菌体収量、菌体脂質含量及び脂質
脂肪酸組成に及ぼず培養温度の影響を検討した。

培地は第１表に示した培地組成の人工海水を１４にに釈
した人工海水におきかえた培地を用いた。

培養は５℃，１０℃、２０’Ｃて実施例１と同しように
行った。菌体収量、菌体中の脂質含量及び脂質の脂肪酸
組成の分析は実施例１と同様に行った。それらの結果を
第３表に示した。

菌体収量は１０℃で最も高く、脂質含量は２０’Ｃに比
べ５℃，１０℃の低温側でやや高い傾向がみられた。脂
質中の脂肪酸組成のうち１８：２．ｅ１８：３はいずれ
の培養温度においても、培養初ＮＪＪζこ最も高く、脂
質含ｈ１が最も高くなった時点で著１．＜減少し、これ
以後の定常期では大きな変動はみられなかった。また１
８：３含量はとくに低温側で高い値を示した。

以上のことから、増殖（ｇｒｏｗｔｈ　ｐｈａｓｅ）と
培養温度をコントロールすることにより、リノール酸（
１８：２）とリノレン酸（１８：３）含量の高い脂質を
得ることができる。

ｌＯｏＣで最も高い菌体収量が１７られたのは、低温酵
母の増殖特性を示すと共に、培養中に低沸点のエタノー
ルの揮散が少なく炭素源の利用効率がよい、ことにも起
因しているもの古考えられる。また、低温で培養すると
１８：２．１８：３などの不飽和脂肪酸含量が高くなる
のは、細胞膜の流動性を維持するためと思われる。以上
のことがら、低温での増殖、また脂質脂肪酸組成の中で
１８：２．１８：３などの不飽和脂肪酸含量が高いこお
ば、低温酵母の特性に基づくものと推察される。

〔発明の効果〕

本発明によれば、再生産可能なハイマス資源から石油の
代替エネルギーとして大量に供給できるエタノールを原
料上して、これを微生物に資化せしめることにより、必
須脂肪酸である１８：２と１８：３含星の高い脂質を菌
体内に含む酵母菌体を製造することができる。本発明に
よって得られる酵母菌体は、栄養価の高い養魚用飼料、
家ｉＶの飼料及び海産魚類の種苗生産乙こ必要な動物ブ
七゛・ンク１ヘンの餌料よして広く使用することができ
る。また、本海水中で安定であるため、 菌体中の有効成分が流 出Ｕ７飼育水の汚染を起こすこともない。

第１表 基本培地 エタノール （ＮｌＩｎ）ｚｓＯｎ Ｋ１１２ＰＯ４ ＣｔｉＳＯ４・５ＨｚＯ ｌ ＦｅＣ１ｚ・６ＨｚＯ ＭｎＳＯｉ・４−６ｔ（ｚＯ ＮａＪｏ０４−２ＨｚＯ ＺｎＳＯａ４ＨｚＯ 酵母エキス 蒸留水 人工海水０ ｐ　Ｉ（ ０人工海水（Ｄ、Ｒ，Ｋｅｓｔｅｒら １２、１７６　（１９６７）） １％　（ｖ／ｖ） ３、Ｏｇ ｉ、ｏ　　　　　ｇ ４０　　　　μｇ １００　　　　μｇ ２００　　　μｇ ４００　　　μｇ ２００　　　　μＢ ４Ｏ０μｇ ０．５ｇ ２５０　　　　　　ｍｌ ７５０　　　　　　　ｍｌ ５．５ ：　Ｌｉｍｎｏｌ。

Ｏｃｅａｎｏｇｒ− （来夏以下余白） 第２表 （来夏以下余白）

【図面の簡単な説明】

第１図は、生育に及ぼす培養温度の影舌、第２図は、菌
体収量及び菌体脂質含量に及ぼす培地中の塩濃度の影♂
を示す図である。 第２図 菌体収量及び菌体脂質含量に及ぼす培地中の塩濃度の影
響　　　（２０℃，２日培養）ＯＣＷ：乾燥菌体重量 培地の人工海水濃度（Ｏん） 第１１ 生育に及ぼす培養温度の影 培養温度（’Ｃ） 響（ＧＰＹ培地） （Ｂ） 培養時間（ｄ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、カンジダ属に属し、エタノール資化性を有し、リノ
   ール酸とリノレン酸含量の高い脂質を菌体内に形成する
   ことができる酵母菌株をエタノールを炭素源として含有
   する培地において培養し、培養物からリノール酸とリノ
   レン酸含量の高い脂質を含む酵母菌体を採取することを
   特徴とする酵母菌体の製造法。 ２、培養を５〜２０℃の低温で行うことを特徴とする請
   求項１記載の方法。 ３、海水を含有する培地において培養することを特徴と
   する請求項１記載の酵母菌体の製造法。