JPH0312169A - 人工血管 - Google Patents
人工血管Info
- Publication number
- JPH0312169A JPH0312169A JP1146604A JP14660489A JPH0312169A JP H0312169 A JPH0312169 A JP H0312169A JP 1146604 A JP1146604 A JP 1146604A JP 14660489 A JP14660489 A JP 14660489A JP H0312169 A JPH0312169 A JP H0312169A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- blood vessel
- smooth muscle
- cells
- muscle cells
- formic acid
- Prior art date
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- Granted
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- Materials For Medical Uses (AREA)
- Prostheses (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は人工血管、特に哺乳動物の血管を処理し、生体
内の血管と同様の措置と機能を持つことが期待される人
工血管を製造する方法及びそれより得られる人工血管に
関する。
内の血管と同様の措置と機能を持つことが期待される人
工血管を製造する方法及びそれより得られる人工血管に
関する。
これまで多くの研究者によって人工血管の材質や構造、
さらには表面修飾などについて研究されており、ダクロ
ン（登録商標）やテフロン（登録商標）を素材とするも
のの研究がなされ、特に自家静脈使用不能例の小口径血
管にはエキスパンデッドポリテトラ フルオロエチレン
（ＥＰＴＦＥ）血管が主に使用されている。最近では抗
血栓性と柔軟性をもつ新しい素材としてポリウレタンが
注目されている（松本薄志９入工臓器、 １７：６１０
，１９８８、および田村康−ら、人工臓器、１７：６１
４，１９８８）。
さらには表面修飾などについて研究されており、ダクロ
ン（登録商標）やテフロン（登録商標）を素材とするも
のの研究がなされ、特に自家静脈使用不能例の小口径血
管にはエキスパンデッドポリテトラ フルオロエチレン
（ＥＰＴＦＥ）血管が主に使用されている。最近では抗
血栓性と柔軟性をもつ新しい素材としてポリウレタンが
注目されている（松本薄志９入工臓器、 １７：６１０
，１９８８、および田村康−ら、人工臓器、１７：６１
４，１９８８）。
また既存の素材を使用したものでも良好な治療過程を得
るためにコラーゲン被膜〔スコツト（ＳｃｏｔｔＳ、Ｍ
、）ら、ジャーナルオブカルディオヴアスクサージェリ
ー（Ｊ、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ、Ｓｕｒｇ、）２８：４
９８．１９８７）やアルブミン浸漬（マクグリ−（Ｍｃ
ｇｒｅｅ Ｇ、Ｓ、）らアメリカンサージョン（Ａｍｅ
ｒ、Ｓｕｒｇｅｏｎ、）５３：６９５゜１９ｇ？）など
の工夫をした人工血管も開発されている。さらには培養
系を利用して人工血管の内皮細胞を植えつける（ ｓｅ
ｅｄｉｎｇ）ハイブリッド型人工血管の研究もヘリング
ら〔ヘリング（Ｈｅｒｒｉｎｇ Ｎ、）らサージエリ−
（Ｓｕｒｇ、）８４：４９８，１９８７）やグラハムら
〔グラハム（Ｇｒａｈａｍ Ｌ、Ｍ、）ら、アーケイッ
クサージェリ−（Ａｒｃｈ、Ｓｕｒｇ、）１１５：１２
９８，１９８０）によって報告されて以来多くの研究が
なされている。また本来生体内に存在しない人工物を使
用するよりも、生体由来の血管結合繊を素材として使用
したほうが良いとする考えもあり、ヒト鎖体静脈をグル
タルアルデヒドで架橋処理した代用血管もしばしば使用
されてきた〔ダルデイック（Ｄａｒｄｉｃ １１．）ら
、アナーレンサージェリー（Ａｎｎ、Ｓｕｒｇ）１８３
：２５２゜１９７６、および笹嶋唯博１日外会誌、８５
：６５，１９８４）。
るためにコラーゲン被膜〔スコツト（ＳｃｏｔｔＳ、Ｍ
、）ら、ジャーナルオブカルディオヴアスクサージェリ
ー（Ｊ、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ、Ｓｕｒｇ、）２８：４
９８．１９８７）やアルブミン浸漬（マクグリ−（Ｍｃ
ｇｒｅｅ Ｇ、Ｓ、）らアメリカンサージョン（Ａｍｅ
ｒ、Ｓｕｒｇｅｏｎ、）５３：６９５゜１９ｇ？）など
の工夫をした人工血管も開発されている。さらには培養
系を利用して人工血管の内皮細胞を植えつける（ ｓｅ
ｅｄｉｎｇ）ハイブリッド型人工血管の研究もヘリング
ら〔ヘリング（Ｈｅｒｒｉｎｇ Ｎ、）らサージエリ−
（Ｓｕｒｇ、）８４：４９８，１９８７）やグラハムら
〔グラハム（Ｇｒａｈａｍ Ｌ、Ｍ、）ら、アーケイッ
クサージェリ−（Ａｒｃｈ、Ｓｕｒｇ、）１１５：１２
９８，１９８０）によって報告されて以来多くの研究が
なされている。また本来生体内に存在しない人工物を使
用するよりも、生体由来の血管結合繊を素材として使用
したほうが良いとする考えもあり、ヒト鎖体静脈をグル
タルアルデヒドで架橋処理した代用血管もしばしば使用
されてきた〔ダルデイック（Ｄａｒｄｉｃ １１．）ら
、アナーレンサージェリー（Ａｎｎ、Ｓｕｒｇ）１８３
：２５２゜１９７６、および笹嶋唯博１日外会誌、８５
：６５，１９８４）。
又天然血管に類似した血管壁モデルの作成は、ジョーン
ズ（Ｊｏｎｅｓ）が１９７９年、ラット平滑筋細胞をデ
イシュ上で培養し細胞外基質を十分産生させた後、ウシ
内皮細胞を平滑筋細胞層の上に植付け（ｓｅｅｄｉｎｇ
） Ｌ一種の血管壁モデルを作成し、培養下における血
管壁の再構築（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）の可能性を示し
た〔ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ Ｐ、Ａ、）：プロシージ
ングスオブザナショナルアカデミーオブサイエンス（Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、） 、７６：１
８８２゜１９７９）。ワインベルブ（すｅｉｎｂｅｒｇ
）らはコラーゲンゲルを利用して血管モデルを作成した
〔ワインベルブ（Ｗｅ１ｎｂｅｒｇ＋Ｃ，Ｂ、） ｌサ
イエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ： ２３１：３９７，１
９８６）が、強度や弾性の面から代用血管への応用は難
しい。
ズ（Ｊｏｎｅｓ）が１９７９年、ラット平滑筋細胞をデ
イシュ上で培養し細胞外基質を十分産生させた後、ウシ
内皮細胞を平滑筋細胞層の上に植付け（ｓｅｅｄｉｎｇ
） Ｌ一種の血管壁モデルを作成し、培養下における血
管壁の再構築（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）の可能性を示し
た〔ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ Ｐ、Ａ、）：プロシージ
ングスオブザナショナルアカデミーオブサイエンス（Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、） 、７６：１
８８２゜１９７９）。ワインベルブ（すｅｉｎｂｅｒｇ
）らはコラーゲンゲルを利用して血管モデルを作成した
〔ワインベルブ（Ｗｅ１ｎｂｅｒｇ＋Ｃ，Ｂ、） ｌサ
イエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ： ２３１：３９７，１
９８６）が、強度や弾性の面から代用血管への応用は難
しい。
前記のとおり、高血栓性に優れ、適度な弾性を持ち、か
つ細胞親和性の良い人工血管を開発するために、人工血
管の材質や構造、表面修飾の検討。
つ細胞親和性の良い人工血管を開発するために、人工血
管の材質や構造、表面修飾の検討。
さらに培養系を利用したハイブリット型人工血管など、
多くの研究が行われている。しかし、自家静脈以上のも
のはまだ開発されていない。また、生体材料をグルタル
アルデヒドやポリエポキシ化合物などで架橋処理した血
管には生きた血管壁細胞は存在せず、また細胞親和性も
必ずしも良好とはいえない。
多くの研究が行われている。しかし、自家静脈以上のも
のはまだ開発されていない。また、生体材料をグルタル
アルデヒドやポリエポキシ化合物などで架橋処理した血
管には生きた血管壁細胞は存在せず、また細胞親和性も
必ずしも良好とはいえない。
又、天然血管に類似した血管壁モデルの作成についても
、これまで試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で完全な形で
血管壁モデルを作成した例はない。
、これまで試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で完全な形で
血管壁モデルを作成した例はない。
したがって、小口径血管や静脈系血管に対する血行再建
術に用いられる十分満足できる人工血管の開発が望まれ
るところである。
術に用いられる十分満足できる人工血管の開発が望まれ
るところである。
本発明者は、血管結合繊と血管壁細胞が存在する天然血
管とほぼ同等の構造と機能を持った代用血管が最も理想
的な人工血管であるという考えから、培養系を用いた新
しい生体代用血管の作成を目指し、その基礎として天然
血管とほぼ同等の構造をもつ血管壁モデルを試験管内（
ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で作成することを試みた結果、哺乳
動物の血管の血管壁を特定の溶液で処理し、ついで特定
の細胞で培養することにより天然血管に近い血管壁を有
するものが作られることを見出し１本発明に到達したも
のである。
管とほぼ同等の構造と機能を持った代用血管が最も理想
的な人工血管であるという考えから、培養系を用いた新
しい生体代用血管の作成を目指し、その基礎として天然
血管とほぼ同等の構造をもつ血管壁モデルを試験管内（
ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で作成することを試みた結果、哺乳
動物の血管の血管壁を特定の溶液で処理し、ついで特定
の細胞で培養することにより天然血管に近い血管壁を有
するものが作られることを見出し１本発明に到達したも
のである。
即ち、本発明は、哺乳動物の血管の血管壁をギ酸処理後
、平滑筋細胞と内皮細胞を培養して、該血管壁を再構築
することを特徴とする人工血管の裏通方法及び上記の方
法により作られた人工血管に関する。
、平滑筋細胞と内皮細胞を培養して、該血管壁を再構築
することを特徴とする人工血管の裏通方法及び上記の方
法により作られた人工血管に関する。
哺乳動物の血管としてはブタ、犬、牛、ウサギ等をはじ
めとする哺乳動物の大動脈を用いることができる。
めとする哺乳動物の大動脈を用いることができる。
人工血管において、天然血管とほぼ同等の構造と機能を
持った生体代用血管が最も理想的であると考えられ、コ
ラーゲンとエラスチンを基本骨格とし平滑筋細胞や内皮
細胞を有し、かつ、将来的には自己血管そのものに変化
しうる代用血管であることが必要であり、そして、適度
な弾性と強度を得るにはエラスチンの弾性板構造が必要
と考えられる。この血管壁の基本骨格となる細胞各期質
（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）を人工
的に作成することは容易ではなく、天然血管を利用する
のが簡便であり、そのためには異種血管の抗原性を除去
しかつ細胞親和性のある基質（ｍａｔｒｉｘ）とするよ
うな処理方法が必要となる。そこで異種血管の細胞成分
はもちろん、エラスチンとコラーゲン以外の蛋白や糖を
できるだけ除去できる処理方法を検討した結果、ギ酸水
溶液での処理が適当であった。
持った生体代用血管が最も理想的であると考えられ、コ
ラーゲンとエラスチンを基本骨格とし平滑筋細胞や内皮
細胞を有し、かつ、将来的には自己血管そのものに変化
しうる代用血管であることが必要であり、そして、適度
な弾性と強度を得るにはエラスチンの弾性板構造が必要
と考えられる。この血管壁の基本骨格となる細胞各期質
（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）を人工
的に作成することは容易ではなく、天然血管を利用する
のが簡便であり、そのためには異種血管の抗原性を除去
しかつ細胞親和性のある基質（ｍａｔｒｉｘ）とするよ
うな処理方法が必要となる。そこで異種血管の細胞成分
はもちろん、エラスチンとコラーゲン以外の蛋白や糖を
できるだけ除去できる処理方法を検討した結果、ギ酸水
溶液での処理が適当であった。
用いられるギ酸水溶液の濃度は７０〜９５％好ましくは
８０〜９０％であり、処理時間は１日〜１週間である。
８０〜９０％であり、処理時間は１日〜１週間である。
また処理温度は５℃凧下、好ましくは４℃以下が適当で
ある。ギ酸はある条件下では血管のエラスチン以外の成
分を大部分除去し。
ある。ギ酸はある条件下では血管のエラスチン以外の成
分を大部分除去し。
弾性板の基本構造をほぼ原形のまま残すことが知られて
いるがエイ、エム、エイ アルカイーブパソロジー（Ａ
、Ｍ、Ａ、Ａｒｃｈ Ｐａｔｈ、６５：５１９，１９５
８）、本発明者は５℃以下で処理すれば機械的強度が維
持できる程度にコラーゲンが残ることを見出した。
いるがエイ、エム、エイ アルカイーブパソロジー（Ａ
、Ｍ、Ａ、Ａｒｃｈ Ｐａｔｈ、６５：５１９，１９５
８）、本発明者は５℃以下で処理すれば機械的強度が維
持できる程度にコラーゲンが残ることを見出した。
その他溶液での処理：例えば蒸留水は浸透圧により細胞
を膨潤させ水溶性の糖や蛋白を除去できると考えられた
が、結合繊の密な血管壁深部までは作用させるのはむず
かしい。トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ １００ （ロ
ームアンドパートナ社）は非イオン性の表面活性剤であ
り生体膜を可溶化するため細胞除去には適していると考
えられたがこの方法でも不十分であった。また塩酸グア
ニジンは血管壁のコラーゲンやエラスチンを分画するの
にしばしば使われており、ギ酸等の有機酸と同様に用い
ることができる。ギ酸等の有機酸や塩酸グアニジン処理
により強度が若干は減弱するがこれは血管壁細胞による
結合繊が再合成によって強化されるので不都合ではない
。ギ酸等の有機酸や塩酸グアニジン処理した血管はつい
で血管壁の再構築を行う。そのため平滑筋細胞と内皮細
胞を培養する。
を膨潤させ水溶性の糖や蛋白を除去できると考えられた
が、結合繊の密な血管壁深部までは作用させるのはむず
かしい。トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ １００ （ロ
ームアンドパートナ社）は非イオン性の表面活性剤であ
り生体膜を可溶化するため細胞除去には適していると考
えられたがこの方法でも不十分であった。また塩酸グア
ニジンは血管壁のコラーゲンやエラスチンを分画するの
にしばしば使われており、ギ酸等の有機酸と同様に用い
ることができる。ギ酸等の有機酸や塩酸グアニジン処理
により強度が若干は減弱するがこれは血管壁細胞による
結合繊が再合成によって強化されるので不都合ではない
。ギ酸等の有機酸や塩酸グアニジン処理した血管はつい
で血管壁の再構築を行う。そのため平滑筋細胞と内皮細
胞を培養する。
平滑筋細胞はウサギ平滑筋細胞、ブタ平滑筋細胞、牛平
滑筋細胞、大平滑筋細胞等が用いられる。
滑筋細胞、大平滑筋細胞等が用いられる。
又内皮細胞はブタ内皮細胞、大内皮細胞等が用いられる
。
。
培養方法としては、滅菌したギ酸等の処理血管壁を蒸留
水および生理食塩水で水洗浄し、ダルベツコ改変イーグ
ル培地（ＤＭＥＭ）（細胞接着因子として利用されるフ
ィブロネクチン等１００４ｇ／ｍｌ含有）に浸透した後
、（１）ブタ平滑筋細胞浮遊液（約Ｉ Ｘ Ｉ Ｏ”ｃ
ｅｌｌｓ／耐）中で培養するか、又は（２）ブタ平滑筋
細胞浮遊液（約Ｉ Ｘ １０’−Ｇｃｅｌｌｓ／ｍｌ）
を２７Ｇの注射針で約０．２ｍｌ／ｇｒａｆｔ注入した
後、培養する。培養時間は１週間以上好ましくは１ケ月
以上である。
水および生理食塩水で水洗浄し、ダルベツコ改変イーグ
ル培地（ＤＭＥＭ）（細胞接着因子として利用されるフ
ィブロネクチン等１００４ｇ／ｍｌ含有）に浸透した後
、（１）ブタ平滑筋細胞浮遊液（約Ｉ Ｘ Ｉ Ｏ”ｃ
ｅｌｌｓ／耐）中で培養するか、又は（２）ブタ平滑筋
細胞浮遊液（約Ｉ Ｘ １０’−Ｇｃｅｌｌｓ／ｍｌ）
を２７Ｇの注射針で約０．２ｍｌ／ｇｒａｆｔ注入した
後、培養する。培養時間は１週間以上好ましくは１ケ月
以上である。
又、ウサギ平滑筋細胞等についても上記ブタ平滑筋細胞
と同様の方法で培養する。
と同様の方法で培養する。
血管壁の再構築には平滑筋細胞の培養に加えてさらに内
皮細胞が培養される。この内皮細胞の培養は平滑筋細胞
培養、或いは同注入培養後の血管壁を０．５ｍｇ／ｍｌ
フィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）／ＤＭＥ
Ｍ等の細胞接着物質に浸漬（室温〜３７℃、１〜数日）
後、及ブタ内皮細胞浮遊液（約ｌＸ１０’ｃｅｌｌｓ／
ｍｌ）と共に培養する。
皮細胞が培養される。この内皮細胞の培養は平滑筋細胞
培養、或いは同注入培養後の血管壁を０．５ｍｇ／ｍｌ
フィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）／ＤＭＥ
Ｍ等の細胞接着物質に浸漬（室温〜３７℃、１〜数日）
後、及ブタ内皮細胞浮遊液（約ｌＸ１０’ｃｅｌｌｓ／
ｍｌ）と共に培養する。
以上のようにして、哺乳動物のギ酸処理血管を用いて試
験管内で血管壁の再構築を行なった。平滑筋細胞との培
養は天然血管のような弾性板間に多数の細胞が散在性に
存在する状態を作成するためのものであり、又内皮細胞
との培養は内膜再構築である。平滑筋細胞が壁外から自
然に壁内深層に侵入するまでには長期間（４週間以上）
を要する。
験管内で血管壁の再構築を行なった。平滑筋細胞との培
養は天然血管のような弾性板間に多数の細胞が散在性に
存在する状態を作成するためのものであり、又内皮細胞
との培養は内膜再構築である。平滑筋細胞が壁外から自
然に壁内深層に侵入するまでには長期間（４週間以上）
を要する。
哺乳動物の血管を有機酸や塩酸グアニジンで処理し、平
滑筋細胞及及び内皮細胞を培養することにより、血管結
合織と血管壁細胞を有した天然血管に近い血管壁モデル
が試験管内で作成できることが示された。この手法によ
り天然血管とほぼ同様の構造と機能をもった生体代用血
管の作成が可能となる。すなわち異種血管や死体血管を
処理した後、患者自身の血管の一部から培養増殖させた
血管壁細胞で血管壁を再構築させることにより抗血栓性
と弾性をもった生体代用血管となり、移植後は自己の細
胞によって分解吸収と再合成がなされ、最終的には自己
血管そのものに変化する可能性のある血管が期待できる
ものである。
滑筋細胞及及び内皮細胞を培養することにより、血管結
合織と血管壁細胞を有した天然血管に近い血管壁モデル
が試験管内で作成できることが示された。この手法によ
り天然血管とほぼ同様の構造と機能をもった生体代用血
管の作成が可能となる。すなわち異種血管や死体血管を
処理した後、患者自身の血管の一部から培養増殖させた
血管壁細胞で血管壁を再構築させることにより抗血栓性
と弾性をもった生体代用血管となり、移植後は自己の細
胞によって分解吸収と再合成がなされ、最終的には自己
血管そのものに変化する可能性のある血管が期待できる
ものである。
以下に実施例を記載して本発明を更に説明するが、本発
明はこれらの実施例に限定されるものではない。
明はこれらの実施例に限定されるものではない。
用いた材料及び各種の測定は以下のとおりであった・
１、血管壁細胞（内皮細胞及び平滑筋細胞）の採取およ
び培養方法 ブタ胸部大動脈の内膜から擦過法で内皮細胞を採取しｌ
Ｏ％牛脂児血清を含むダルベツコ改変イーグル培地（Ｄ
ＭＥＭ）で継代培養した。平滑筋細胞は中膜からエクス
プラント（６ｘｐｌａｎｔ）法で分離培養した。またウ
サギ平滑筋細胞も同様に胸部大動脈より採取培養した。
び培養方法 ブタ胸部大動脈の内膜から擦過法で内皮細胞を採取しｌ
Ｏ％牛脂児血清を含むダルベツコ改変イーグル培地（Ｄ
ＭＥＭ）で継代培養した。平滑筋細胞は中膜からエクス
プラント（６ｘｐｌａｎｔ）法で分離培養した。またウ
サギ平滑筋細胞も同様に胸部大動脈より採取培養した。
実験にはそれぞれ２％４継代の細胞を使用した。
２、各種処理血管壁の断裂強度試験法
約６ｍ幅の各種各種処理血管壁に５−０針付きナイロン
糸を通し一方向に加重し断裂時の加重量を測定した。
糸を通し一方向に加重し断裂時の加重量を測定した。
３、処理血管壁の蛋白分画定量法
各処理血管の処理前後の乾燥重量を測定するとともにギ
酸処理群および塩酸グアニジン処理群については総蛋白
量、コラーゲン量およびエラスチン量を簡易的に定量し
た。
酸処理群および塩酸グアニジン処理群については総蛋白
量、コラーゲン量およびエラスチン量を簡易的に定量し
た。
（１）コラーゲン定量
第４表に示す方法で分画した水溶性分画とオートクレイ
プ（１２０℃、１２時間、２回）可溶性分画中のヒドロ
キシプロリンをウエスナー（Ｗｏｅｓｓｎｅｒ）法（ｌ
１ｏｅｓｓｎｅｒ 、 Ｊ 、 Ｆ 、 Ｊｒら、アー
キテクチュアノくイオケミカルズアンドバイオフイジカ
ルズ（Ａｒｃｈ。
プ（１２０℃、１２時間、２回）可溶性分画中のヒドロ
キシプロリンをウエスナー（Ｗｏｅｓｓｎｅｒ）法（ｌ
１ｏｅｓｓｎｅｒ 、 Ｊ 、 Ｆ 、 Ｊｒら、アー
キテクチュアノくイオケミカルズアンドバイオフイジカ
ルズ（Ａｒｃｈ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、）、９３：４４０，
１９６１）にて測定しコラーゲン量に換算（ヒドロキシ
プロリン量Ｘ １０）した。
１９６１）にて測定しコラーゲン量に換算（ヒドロキシ
プロリン量Ｘ １０）した。
（２）エラスチン定量
第４表に示す不溶性分画をエラスチン量とした。
（３）総蛋白量の定量
第４表に示す水溶性分画とオートクレイプ可溶性分画中
からロウリ−（ｌｏｉｇｒｙ）法で測定した蛋白量と上
記測定エラスチン量との和を総蛋白量とした。
からロウリ−（ｌｏｉｇｒｙ）法で測定した蛋白量と上
記測定エラスチン量との和を総蛋白量とした。
（１）血管壁の基本骨格となる外細胞基質（６ｘｔｒａ
ｃｅｌＬｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）を作成するため、異
種血管の抗原性を除去し、且つ細胞親和性のある基質と
するために、ブタ大動脈の外膜を除去し約６Ｘ８ｎｎ大
の短冊状に分割した後、■蒸留水浸漬（４℃、７２時間
）、■グルタルアルデヒド処理（１％、２０℃、４８時
間）、■ポリエポキシ化合物（ＤｅｎａｃｏｌＥＸ ８
１０．ナガセ化成）処理（５％、２０℃、４８時間）、
■ポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテル（
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００、ロームアンドハース社製）
処理（１％、４℃、７２時間）、■塩酸グアニジン処理
（５Ｍ、４℃、７２時間）、■ギ酸処理（８８％、４℃
、７２時間）の６種の処理群に分けた。
ｃｅｌＬｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）を作成するため、異
種血管の抗原性を除去し、且つ細胞親和性のある基質と
するために、ブタ大動脈の外膜を除去し約６Ｘ８ｎｎ大
の短冊状に分割した後、■蒸留水浸漬（４℃、７２時間
）、■グルタルアルデヒド処理（１％、２０℃、４８時
間）、■ポリエポキシ化合物（ＤｅｎａｃｏｌＥＸ ８
１０．ナガセ化成）処理（５％、２０℃、４８時間）、
■ポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテル（
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００、ロームアンドハース社製）
処理（１％、４℃、７２時間）、■塩酸グアニジン処理
（５Ｍ、４℃、７２時間）、■ギ酸処理（８８％、４℃
、７２時間）の６種の処理群に分けた。
各処理後、蒸留水で十分洗浄してから７０％エタノール
に浸漬保存した。
に浸漬保存した。
（２）次いで、各種エタノール浸漬血管壁を蒸留水およ
び生理食塩水で十分洗浄し１００μｇ ／ ｍ １フイ
ブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）含有ＤＭＥＭ
に浸漬（３７℃、２４時間）後、ウサギ平滑筋細胞浮遊
液（約５ Ｘ １０’ｃｅｌｌｓ／ｍ １ ）中で培養
した。さらに前記ウサギ平滑筋細胞と同様の方法で、各
種処理血管壁とブタ内皮細胞浮遊液（約４ Ｘ １０’
ｃａｌｌｓ／ｍ１）を培養した。
び生理食塩水で十分洗浄し１００μｇ ／ ｍ １フイ
ブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）含有ＤＭＥＭ
に浸漬（３７℃、２４時間）後、ウサギ平滑筋細胞浮遊
液（約５ Ｘ １０’ｃｅｌｌｓ／ｍ １ ）中で培養
した。さらに前記ウサギ平滑筋細胞と同様の方法で、各
種処理血管壁とブタ内皮細胞浮遊液（約４ Ｘ １０’
ｃａｌｌｓ／ｍ１）を培養した。
前記処理をしたブタ大動扉壁に上記の方法でウサギ平滑
筋細胞を培養させたものの培養２日後の走査電顕的観察
では第１図および第１表に示すように、グルタルアルデ
ヒド処理群で細胞接着が不良であったが、他群では良好
であり一週間後にはほぼ良好になった。
筋細胞を培養させたものの培養２日後の走査電顕的観察
では第１図および第１表に示すように、グルタルアルデ
ヒド処理群で細胞接着が不良であったが、他群では良好
であり一週間後にはほぼ良好になった。
第１図は各種処理血管へのウサギ平滑筋細胞培養２日後
の走査電顕像（Ｘ ４００）であり、Ａ蒸留水処理二表
面は平滑筋細胞でほぼ完全に覆われている。Ｂ ｇｌｕ
ｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ処理：平滑筋細胞の接着はわず
かである。 ＣＤｅｎａｃｏｌ処理：平滑筋細胞が多数
接着している。Ｄ ギ酸処理：表面は平滑筋細胞で完全
に覆われている、ことを示すものである。
の走査電顕像（Ｘ ４００）であり、Ａ蒸留水処理二表
面は平滑筋細胞でほぼ完全に覆われている。Ｂ ｇｌｕ
ｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ処理：平滑筋細胞の接着はわず
かである。 ＣＤｅｎａｃｏｌ処理：平滑筋細胞が多数
接着している。Ｄ ギ酸処理：表面は平滑筋細胞で完全
に覆われている、ことを示すものである。
さらに、培養２週間後の先頭的観察ではグルタルアルデ
ヒド処理群を除いて１〜２層の平滑筋細胞層が形成され
ていたが、壁内深層への細胞侵入はほとんど認めなかっ
た（第３図）。培養４週間後のギ酸処理血管壁の先頭的
観察では壁内深層への平滑筋細胞の侵入を認めた。しか
し他群ではほとんど見られなかった。また、ギ酸処理群
の血管壁内には元の細胞成分は完全に消失した。しかし
、他の処理群では多少の細胞成分の残存を認め、特に蒸
留水処理群では多数残存していた（第２図）。
ヒド処理群を除いて１〜２層の平滑筋細胞層が形成され
ていたが、壁内深層への細胞侵入はほとんど認めなかっ
た（第３図）。培養４週間後のギ酸処理血管壁の先頭的
観察では壁内深層への平滑筋細胞の侵入を認めた。しか
し他群ではほとんど見られなかった。また、ギ酸処理群
の血管壁内には元の細胞成分は完全に消失した。しかし
、他の処理群では多少の細胞成分の残存を認め、特に蒸
留水処理群では多数残存していた（第２図）。
第２図は各種処理血管へのウサギ平滑筋細胞培養２週間
後の電顕像（Ｘ ４００）であり、Ａ蒸留水処理、Ｂ
ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ処理、 ＣＤｅｎａｃｏ
ｌ処理、Ｄ ギ酸処理したものである（ｇｌｕｔａｒａ
ｌｄｅｈｙｄｅ処理血管を除いて１〜２暦の平滑筋細胞
層を認める）。
後の電顕像（Ｘ ４００）であり、Ａ蒸留水処理、Ｂ
ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ処理、 ＣＤｅｎａｃｏ
ｌ処理、Ｄ ギ酸処理したものである（ｇｌｕｔａｒａ
ｌｄｅｈｙｄｅ処理血管を除いて１〜２暦の平滑筋細胞
層を認める）。
以上の結果から、血管壁の細胞成分を完全に除去しかつ
細胞の接着および壁内侵入に適した処理方法としてはギ
酸で処理するのが最も良い方法であることがわかる。
細胞の接着および壁内侵入に適した処理方法としてはギ
酸で処理するのが最も良い方法であることがわかる。
木ＳＥＭ ５ＣＯＲＥ ：走査電顕観察視野中の細胞占
有面積割合 ０：細胞（−）１：Ｏ〜１０２：１０〜４０３：４０〜
６０ ４：６０〜９０５：９０〜１００％＊＊Ｒ３ＭＣ
：ウサギ平滑筋細胞 ＊零＊ＰピＣ：ブタ内皮細胞 又、ブタ内皮細胞培養２日後の走査電顕的ｖＡ察では、
ウサギ平滑筋細胞とほぼ同様にグルタルアルデヒド処理
群でほとんど内皮細胞の接着を見なかった。しかし他群
では比較的良く接着増殖しており（第１表）、培養１週
間目にはほぼ良好であった（第３図、第４図）。
有面積割合 ０：細胞（−）１：Ｏ〜１０２：１０〜４０３：４０〜
６０ ４：６０〜９０５：９０〜１００％＊＊Ｒ３ＭＣ
：ウサギ平滑筋細胞 ＊零＊ＰピＣ：ブタ内皮細胞 又、ブタ内皮細胞培養２日後の走査電顕的ｖＡ察では、
ウサギ平滑筋細胞とほぼ同様にグルタルアルデヒド処理
群でほとんど内皮細胞の接着を見なかった。しかし他群
では比較的良く接着増殖しており（第１表）、培養１週
間目にはほぼ良好であった（第３図、第４図）。
第３図はギ酸処理血管へのブタの平滑筋細胞および内皮
細胞培養の走査電顕像であり、Ａ ギ酸処理血管内膜面
：細胞成分は全く存在せず内弾性板が露出している（
ｘ ４００）、Ｂ平滑筋細胞培養２週間後：完全な平滑
筋細胞層で覆われている（ｘｌｏｏ）、 Ｃ内皮細胞培
養１週間後：完全な内皮細胞層が形成されている（ ｘ
４００）、ことを示すものである。
細胞培養の走査電顕像であり、Ａ ギ酸処理血管内膜面
：細胞成分は全く存在せず内弾性板が露出している（
ｘ ４００）、Ｂ平滑筋細胞培養２週間後：完全な平滑
筋細胞層で覆われている（ｘｌｏｏ）、 Ｃ内皮細胞培
養１週間後：完全な内皮細胞層が形成されている（ ｘ
４００）、ことを示すものである。
又、第４図は各種電顕像であり、Ａ未処理血管：内膜側
は一層の内皮細胞で覆われ、・壁面には平滑筋細胞が多
数存在している（Ｘ４００）、Ｂ ギ酸処理血管：細胞
成分は完全に消失しているが、弾性板構造は温存されて
いる（Ｘ４００）、Ｃ平滑筋細胞ｓｅｅｄｉｎｇ ４週
間後：平滑筋細胞が壁内深層まで侵入している（Ｘ４０
０）、Ｄ内皮細胞ｓｅｅｄｉｎｇ１週間後ニー層の内皮
細胞が形成されている（Ｘ４００）、Ｅ平滑筋細胞注入
培養２週間後：弾性板間に平滑筋細胞が散在している（
Ｘ４００）、Ｆ平滑筋細胞注入１週間＋内皮細胞ｓｅｅ
ｄｉｎｇ ３日後：内膜は完全な一層にはなっていない
が内皮細胞が接着しており、壁内には少数であるが平滑
筋細胞が散在している（ ｘ ２００）、ことを示すも
のである。
は一層の内皮細胞で覆われ、・壁面には平滑筋細胞が多
数存在している（Ｘ４００）、Ｂ ギ酸処理血管：細胞
成分は完全に消失しているが、弾性板構造は温存されて
いる（Ｘ４００）、Ｃ平滑筋細胞ｓｅｅｄｉｎｇ ４週
間後：平滑筋細胞が壁内深層まで侵入している（Ｘ４０
０）、Ｄ内皮細胞ｓｅｅｄｉｎｇ１週間後ニー層の内皮
細胞が形成されている（Ｘ４００）、Ｅ平滑筋細胞注入
培養２週間後：弾性板間に平滑筋細胞が散在している（
Ｘ４００）、Ｆ平滑筋細胞注入１週間＋内皮細胞ｓｅｅ
ｄｉｎｇ ３日後：内膜は完全な一層にはなっていない
が内皮細胞が接着しており、壁内には少数であるが平滑
筋細胞が散在している（ ｘ ２００）、ことを示すも
のである。
又、断裂強度はギ酸処理群と塩酸グアニジン処理群では
滅弱しており、デカノールやグルタルアルデヒドの架橋
処理群では未処理群よりも強かった（第２表）。
滅弱しており、デカノールやグルタルアルデヒドの架橋
処理群では未処理群よりも強かった（第２表）。
第２表 各種処理血管壁の断裂強度
木ＳＥＮ ５ＣＯＲＥ（平均±ＳＤ、ｎ＝５）そして、
各処理後の乾燥重量測定結果から、各処理による血管壁
成分の損失量がわかり、ギ酸処理群および塩酸グアニジ
ン処理群の蛋白分画をみると、コラーゲン量はわずかに
減少しているが、エラスチン分画は処理前後でほとんど
変化せず、その他の蛋白成分の損失が大きいことがわか
った（第３表）。このことから、ギ酸処理または塩酸グ
アニジン処理によりエラスチンとコラーゲンを主成分と
する血管壁構築を残すことができることがわかる。
各処理後の乾燥重量測定結果から、各処理による血管壁
成分の損失量がわかり、ギ酸処理群および塩酸グアニジ
ン処理群の蛋白分画をみると、コラーゲン量はわずかに
減少しているが、エラスチン分画は処理前後でほとんど
変化せず、その他の蛋白成分の損失が大きいことがわか
った（第３表）。このことから、ギ酸処理または塩酸グ
アニジン処理によりエラスチンとコラーゲンを主成分と
する血管壁構築を残すことができることがわかる。
第３表 各種処理血管壁の乾燥重量および蛋白分画残存
割合韓厨賄膣ユ回■ネ、Ｗ、＝１００．平均±ＳＤ、
ｎ＝３）大ｆｌ側 血管壁（乾燥重量） ↓ 細切後、蒸留水を加え均質化させる ↓ 遠心分離→上清・・・水溶性分画 ↓ 残渣 ↓ 蒸留水を加えオートクレイプ１２０℃、１２時間×２↓ 遠心分離→上清・・・熱可溶性分画 ↓ 残渣 ・・・不溶性分画 （エラスチン分画） （１）ブタ大動脈壁のギ酸処理 冷凍保存（−８０℃）ブタ大動脈の外膜を除去した後約
６Ｘ８ｍ＋ａ大に細切し、８８％ギ酸に浸漬（４℃、７
２時間）した後、蒸留水およびリン酸緩衝液（ｐＨ８，
０）で十分洗浄中和した。さらに滅菌のため７０エタノ
ールに２４時間以上浸漬保存した。
割合韓厨賄膣ユ回■ネ、Ｗ、＝１００．平均±ＳＤ、
ｎ＝３）大ｆｌ側 血管壁（乾燥重量） ↓ 細切後、蒸留水を加え均質化させる ↓ 遠心分離→上清・・・水溶性分画 ↓ 残渣 ↓ 蒸留水を加えオートクレイプ１２０℃、１２時間×２↓ 遠心分離→上清・・・熱可溶性分画 ↓ 残渣 ・・・不溶性分画 （エラスチン分画） （１）ブタ大動脈壁のギ酸処理 冷凍保存（−８０℃）ブタ大動脈の外膜を除去した後約
６Ｘ８ｍ＋ａ大に細切し、８８％ギ酸に浸漬（４℃、７
２時間）した後、蒸留水およびリン酸緩衝液（ｐＨ８，
０）で十分洗浄中和した。さらに滅菌のため７０エタノ
ールに２４時間以上浸漬保存した。
（２）ブタ平滑筋細胞の単純培養
滅菌したギ酸処理血管壁を蒸留水および原理食塩水で十
分洗浄し、ＤＭＥＭ （フィブロネクチン１００μｇ／
ｍｌ含有）に浸漬（３７℃、２４時間）した後、ブタ平
滑筋細胞浮遊液（約Ｉ Ｘ １０”ｃｅｌｌｓ／ｍ ｌ
）中で培養した。
分洗浄し、ＤＭＥＭ （フィブロネクチン１００μｇ／
ｍｌ含有）に浸漬（３７℃、２４時間）した後、ブタ平
滑筋細胞浮遊液（約Ｉ Ｘ １０”ｃｅｌｌｓ／ｍ ｌ
）中で培養した。
（３）ブタ平滑筋細胞の注入培養
上記と同様に処理した血管壁内にブタ平滑筋細胞浮遊液
（約Ｉ Ｘ １０５″−Ｇｃｅｌｌｓ／ｍ ｌ ）を２
７Ｇの注射針で約０．２ｍ ｌ ／グラフト注入した後
、培養を継続した。
（約Ｉ Ｘ １０５″−Ｇｃｅｌｌｓ／ｍ ｌ ）を２
７Ｇの注射針で約０．２ｍ ｌ ／グラフト注入した後
、培養を継続した。
（４）平滑筋細胞と内皮細胞の共存培養ブタ平滑筋細胞
注入培養１〜２週間後の血管壁を０．５■、／＋１フィ
ブロネクチン／ＤＭＥＭに浸漬（３７℃、１０分）した
後、ブタ内皮細胞浮遊液（約Ｉ Ｘ １０５ｃｅｌｌｓ
／ｍ ｌ ）と共に培養した。
注入培養１〜２週間後の血管壁を０．５■、／＋１フィ
ブロネクチン／ＤＭＥＭに浸漬（３７℃、１０分）した
後、ブタ内皮細胞浮遊液（約Ｉ Ｘ １０５ｃｅｌｌｓ
／ｍ ｌ ）と共に培養した。
得られた結果は以下のとおりである。
（１）動脈壁をギ酸処理することによって、エラスチン
とコラーゲンを主成分とした結合組織片を作成すること
ができ、先頭および走査電顕的ａｍでは細胞成分は全く
見られず、はぼ原形に近い弾性板構造と膠原繊維および
弾性線維網が観察された（第３図Ｃ９第４図Ｄ）。
とコラーゲンを主成分とした結合組織片を作成すること
ができ、先頭および走査電顕的ａｍでは細胞成分は全く
見られず、はぼ原形に近い弾性板構造と膠原繊維および
弾性線維網が観察された（第３図Ｃ９第４図Ｄ）。
（２）ギ酸処理血管壁への平滑筋細胞培養１〜２週間後
にはｆｆｌ織片表片表面ぼ完全に平滑筋細胞層で覆われ
、弾性板内への細胞侵入はわずかであったが、４週間以
上では壁内深層への細胞侵入が得られた（第４図Ｃ）。
にはｆｆｌ織片表片表面ぼ完全に平滑筋細胞層で覆われ
、弾性板内への細胞侵入はわずかであったが、４週間以
上では壁内深層への細胞侵入が得られた（第４図Ｃ）。
（３）ギ酸処理血管壁の平滑筋細胞注入培養１〜２週間
後の光顕像では、弾性板間に均等ではないが、平滑筋細
胞が散在性に見られた（第４図Ｅ）。
後の光顕像では、弾性板間に均等ではないが、平滑筋細
胞が散在性に見られた（第４図Ｅ）。
（４）平滑筋細胞注入血管壁と内皮細胞の共存培養では
、数日間で内膜面はほぼ完全に内皮ｍ胞層で覆われた（
第３図Ｃ２第４図Ｆ）。これは平滑筋細胞を含むエラス
チン弾性板構造をもち、表面ば内皮細胞で覆われており
、天然血管に近い血管壁モデルといえるものであった。
、数日間で内膜面はほぼ完全に内皮ｍ胞層で覆われた（
第３図Ｃ２第４図Ｆ）。これは平滑筋細胞を含むエラス
チン弾性板構造をもち、表面ば内皮細胞で覆われており
、天然血管に近い血管壁モデルといえるものであった。
本発明により、血管結合織と血管壁細胞が存在する天然
血管とほぼ同等の構造と機能を持ち、これまでの人工血
管に比して小口径血管や静脈血管に対する血行再建術に
使用できる人工血管の作成が期待できる。
血管とほぼ同等の構造と機能を持ち、これまでの人工血
管に比して小口径血管や静脈血管に対する血行再建術に
使用できる人工血管の作成が期待できる。
第１図は各種処理血管へのウサギ平滑筋細胞培養２日後
の走査電顕像（Ｘ ４００）であって生物の形態を示す
写真であり、第１図Ａは蒸留水処理、第１図Ｂはグルタ
ルアルデヒド処理、第１図Ｃはデカノール処理、第１図
りはギ酸処理のものである。 第２図は各種処理血管へのウサギ平滑筋細胞培養２週間
後の光顕像（ｘ４００）であって生物の形態を示す写真
であり、第２図Ａは蒸留水処理、第２図Ｂはグルタルア
ルデヒド処理、第２図Ｃはデカノール処理、第２図りは
ギ酸処理のものである。 第３図はギ酸処理血管へのブタの平滑筋細胞および内皮
細胞培養の走査電顕像であって生物の形態を示す写真で
あり、第３図Ａはギ酸処理血管内膜面、第３図Ｂは平滑
筋細胞培養２週間後、第３図Ｃは内皮細胞培養１週間後
のものである。 第４図は各種電顕像図であって生物の形態を示す写真で
あり、第４図Ａは未処理血管、第４図Ｂはギ酸処理血管
、第４図Ｃは平滑筋細胞シーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ
） ４週後、第４図りは内皮細胞シーディング（ｓｅｅ
ｄｉｎｇ） １週後、第４図Ｅは平滑筋細胞注入培養２
週後、第４図Ｆは平滑筋細胞注入１週間＋内皮細胞シー
ディング３日後のものである。
の走査電顕像（Ｘ ４００）であって生物の形態を示す
写真であり、第１図Ａは蒸留水処理、第１図Ｂはグルタ
ルアルデヒド処理、第１図Ｃはデカノール処理、第１図
りはギ酸処理のものである。 第２図は各種処理血管へのウサギ平滑筋細胞培養２週間
後の光顕像（ｘ４００）であって生物の形態を示す写真
であり、第２図Ａは蒸留水処理、第２図Ｂはグルタルア
ルデヒド処理、第２図Ｃはデカノール処理、第２図りは
ギ酸処理のものである。 第３図はギ酸処理血管へのブタの平滑筋細胞および内皮
細胞培養の走査電顕像であって生物の形態を示す写真で
あり、第３図Ａはギ酸処理血管内膜面、第３図Ｂは平滑
筋細胞培養２週間後、第３図Ｃは内皮細胞培養１週間後
のものである。 第４図は各種電顕像図であって生物の形態を示す写真で
あり、第４図Ａは未処理血管、第４図Ｂはギ酸処理血管
、第４図Ｃは平滑筋細胞シーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ
） ４週後、第４図りは内皮細胞シーディング（ｓｅｅ
ｄｉｎｇ） １週後、第４図Ｅは平滑筋細胞注入培養２
週後、第４図Ｆは平滑筋細胞注入１週間＋内皮細胞シー
ディング３日後のものである。
Claims (3)
- （１）哺乳動物の血管の血管壁を有機酸或いは塩酸グア
ニジン処理後、平滑筋細胞と内皮細胞を培養して、該血
管壁を再構築することを特徴とする人工血管の製造方法
。 - （２）哺乳動物の血管がブタ、犬、牛、又はウサギの大
動脈血管である請求項１記載の人工血管の製造方法。 - （３）請求項１記載の方法により作られた人工血管。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14660489A JP2758027B2 (ja) | 1989-06-12 | 1989-06-12 | 人工血管 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14660489A JP2758027B2 (ja) | 1989-06-12 | 1989-06-12 | 人工血管 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0312169A true JPH0312169A (ja) | 1991-01-21 |
| JP2758027B2 JP2758027B2 (ja) | 1998-05-25 |
Family
ID=15411487
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14660489A Expired - Fee Related JP2758027B2 (ja) | 1989-06-12 | 1989-06-12 | 人工血管 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2758027B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104095692A (zh) * | 2013-04-08 | 2014-10-15 | 天津市塑料研究所有限公司 | 牛颈静脉带瓣管道的制作方法 |
-
1989
- 1989-06-12 JP JP14660489A patent/JP2758027B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104095692A (zh) * | 2013-04-08 | 2014-10-15 | 天津市塑料研究所有限公司 | 牛颈静脉带瓣管道的制作方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2758027B2 (ja) | 1998-05-25 |
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Legal Events
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