JPH03123490A - 新規なセリンプロテアーゼインヒビター蛋白質、これを含む医薬、この蛋白質のためにコードするｄｎａ配列及びこれら蛋白質、医薬及びｄｎａ配列を作り出す方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明の対象はひとの白血球エラスターゼに対して著し
い阻害作用を有し、そして類似的に作用する天然生成物
とは対照的に、酸化的な失活に対して抵抗性を有し、ま
た従って公知の生成物よりもより良好に治療的使用に適
している新規なセリンプロテアーゼインヒビター蛋白質
を作り出すことである。これらの新規なセリンプロテア
ーゼインヒビター蛋白質は組換えＤＮＡ技術によって得
ることができる。従って本発明の対象にはこのようなイ
ンヒビター蛋白質の含まれた医薬、この新規な蛋白質の
ために切断し、得られた断片及びこれら蛋白質、医薬及
びＤＮＡ配列の製造方法も包含される。生きた細胞及び
生物体においては種々の酵素の活性はまず第１に種々の
酵素の新しい合成と化学的な変性とによって制御される
。しかしながら、この場合に成る細胞或は生物体が成る
特定の酵素の高められた活性を要求するような状態変化
に対して迅速に適応するためには全ての場合にこの酵素
の新しい合成の高揚が起るわけではなく、しばしばむし
ろ潜在的酵素備蓄（ｌａｔｅｎＬｅｒＥｎｚｙｍｖｏｒ
ｒａｔ）　　が活性化される。そのような潜在酵素の活
性化の機構としては、特定のベブチターゼによる分解、
プロティンキナーゼによるホスホリル化、小胞からの流
出及びアロステリックなりガントによる蛋白質コンフォ
メーションの変化が知られている。

上述の諸活性化反応の過剰進行及びその活性化された酵
素の長時間の作用はこれらの酵素の特異的阻害又は故意
の分解によって避けることができる。例えば活性化され
たプロテアーゼ類の生物学的活性はしばしば特別なプロ
テアーゼインヒビターによってブロックされる。

〔従来の技術〕

近年において種々のプロテアーゼインヒビターの臨床学
的及び病原論的重要性が認識されるようになった。すな
わち内反性のセリンプロテアーゼ類は例えば消化管内に
おける蛋白質の分解に際して、細胞内での蛋白質分解及
び蛋白質再構築に際して、止血的平衡の維持に際して、
感染防止において、及び負傷後の組織の再生に際して重
要な生理学的役割を果す。殆どの場合にそれらセリンプ
ロテアーゼ類の活性は永久的に、又は−時的に種々の内
厚性インヒビターによって抑制され、それによって種々
の蛋白質分解過程が一定の生物学的機能を果すような特
殊な状態における生物組織に対する蛋白質分解的攻撃（
ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｓｃｈｅｒ　Ａｎｇｒｉｆｆ　）
は制限されたままに留められる。しかしながら病的状態
においてはプロテアーゼ類とそれらのインヒビターとの
間のこのような平衡は著しく乱されることがある。この
場合には非生理学的に高いセリンプロテアーゼ活性かも
との組織障害を強める場合がある。このような状態の例
としては体外的循環により、抗原／抗体反応により、又
は敗血症にによりもたらされる生体組織的補体の活性化
、敗血性ショックにおける胆管内凝血又は強い繊維素溶
解現象、感染、炎症及びショック又は腫瘍浸潤に際して
の結合組織の分解、膵炎の間にその正常な周囲部分から
出てくる膵臓のセリンプロテアーゼ類による生体固有蛋
白質の分解等があげられる。

セリンプロテアーゼ類とセリンプロテアーゼインヒビタ
ー類との間の平衡の乱れを伴って現われる各臨床的病型
はそれに対応して凝血障害、腫瘍の浸潤的増殖、肺気腫
、関節炎、腎炎（例えば糸球体腎炎）及び中でも例えば
、いずれも呼吸困難症を伴い、又は伴うことなく経過し
得る多外傷性又は敗血性のショック並びに膵炎における
ような極めて急速に進行する炎症を包含する。

多数のセリンプロテアーゼ類の中から最近、ひとの多形
核白血球から遊離されたエラスターゼに治療的な仲介作
用についての重要性が見出されている。このものは白血
球からこれを例えばオブゾニン化された異物によって、
例えばホルミル化されたバクテリア性ペプチド又はアナ
フィラトキシンのような可溶性刺激剤によって活性化し
たときに排出される（このひと白血球エラスターゼを以
−下において”ＨＬＥ”と呼ぶ）。このＨＬＥ、の蔽も
重要な生理学的役割は貧食された微生物体又は蛋白質含
有細胞破片を消化することであると認められるが、しか
しながらこのものはエラスチン及びコラーゲンをも分解
し、すなわち弾性的結合組織又は細胞外の全結合組織物
質の本質的な部分をも分解する。

活性化されたＨＬＥ　　は生理学的な若干の条件のもと
では全く測定されず、と言うのはこのものはα２−マク
ログロブリン、αビブロテアーゼインヒビター（α、Ｐ
Ｉ又はα１−アンチトリプシン）又はアンチ−ロイコプ
ロテアーゼ（以下ＡＬＰ　　又は、例えば”ＨＵＳＩｉ
”とも略記することとする）によって阻害されるからで
ある。この場合にα２−マクログロブリンはＩＩＬＥ　
　の活性の制御に際しては副次的な重要性しか持たない
ようであり、と言うのはこのものの会合反応速度定数（
ｋａ、、）があまりに低過ぎるからである。これに対し
てα、ＰＩ及び△ＬＰはその遊離されたＩＩＬＥ　　を
効果的に阻害するけれども、これらはその白血球活性化
の条件のもとて同時に遊離される酸素ラジカルによって
容易に酸化的に失活される。

特に炎症的疾患に際して前面に現われる白血球の活性化
は従って同程度にエラスターゼとスーパー酸化物ラジカ
ルとの遊離をもたらす。スーパー酸化物ラジカルは分子
状酸素と過酸化水素とに分解（ｄｉｓｍｕｔｉｅｒｅｎ
）　　する。次いでこの過酸化水素とスーパー酸化物ラ
ジカルとの混合物から（広く偏在する）遷移金属イオン
の痕跡の存在のもとにヒドロキシルラジカルが生じ、こ
のものがセリンプロテアーゼインヒビターα、ＰＩ及び
ＡＬＰ　　を迅速に失活させる。これはまた更に、ハロ
ゲンイオンと白血球酵素ミエロペルオキシダーゼとの存
在のもとに過酸化水素によっても引き起され得る（Ｆｌ
ｏｈｅ等：　”Ｈａｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｉｎｆｌａｍｍ
ａｔｉｏｎ”第５巻、２５５−２８１頁（＋９８５）　
Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）　。このプロテアーゼインヒビター
類の失活が、慢性的及び特に急性の炎症に際して観測さ
れるような種々の組織障害に対する前提条件となるよう
である。

α、ＰＩの場合にはこの失活は、　　ＨＬＥ　　の活性
ポケットに結合している蛋白質ループ　（Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ−ｓｃｈｌｅｉｆｅ）の上に存在している特殊なメチ
オニン残基の酸化に帰せられる。このメチオニンを組換
えＤＮＡ技術によってバリンと置き換えることにより、
活性のα＋ＰＩ−類縁化合物が得られたが、このものは
酸化的な失活に対して抵抗性であフた（　Ｒｏｓｅｎｂ
ｅｒｇ等：　”Ｎａｔｕｒｅ　、　３１２．７７−８０
、（＋９８４３　）。一方、α、ＰＩのｉ　３５８　　
番位置におけるメチオニンのアルギニンとの置き換えは
この蛋白質の機能の変化をもたらし、このものはもはや
エラスターゼインヒビターではなくなり、そしてトロン
ビンインヒビターとして作用することが知られている（
　Ｏｗｅｎ　　等：　”Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、　Ｊ、　Ｍｅ
ｄ、”　３０８６９４−６９８　（１９８３）） セリンプロテアーゼ類とセリンプロテアーゼインとビタ
ー類との間の平衡の乱れに基づく種々の疾病の治療のた
めに例えば西ドイツ特許ＡＩ第３６００５７１公報には
そこにあげられているアミノ酸配列を有する幾つかの蛋
白質が提案されており。

これらはｕｕｓｒ−ｔの型のインヒビター（ひと性漿イ
ンヒビター）、すなわちＡＬＰ　　型のインヒビターで
ある。Ｉ−ＩＵＳＩ−１は酸に安定なプロテアーゼイン
ヒビターであってこのものは顆粒球のりソソーム性顆粒
からのプロテアーゼを阻害し、すなわち例えばエラスタ
ーゼをも阻害する。他の細胞内及び細胞外プロテアーゼ
類に対してはＨＵＳＩ−Ｉは弱い阻害活性しか示さない
。このものの分子量は約１１０００である。

上記西ドイツ特許ＡＩ第３６００５７１　　号公報に従
い得られたインヒビター分子は一方において酵素キモト
リプシンをその生物学的活性に関して阻害することによ
り、また他方において免疫学的には＋１ＬＪｓＭ型イン
ヒビターとして特徴付けられた。

上記西ドイツ特許Ａ１第３６００５７１　　号公報にお
いてｒＨＵｓＩ−１型インヒビターの生物学的活性を有
する蛋白質」とはＨＵＳＩ−１型インヒビターの生物学
的活性を有し、すなわち天然蛋白質の免疫学的諸性質を
有し、及び／又は天然蛋白質の特異的阻害特性を有する
ような蛋白質及び融合蛋白質を意味する。ＨＵＳＩ−１
のアミノ酸配列の部分領域のみをカバーするか又は含有
するような蛋白質及び融合蛋白質も上記西ドイツ特許Ａ
１第３６００５７１　　号公報においてｒＨＵｓＩ−１
型インヒビターの生物学的活性を有する蛋白質」として
あげられている。このような各種蛋白質のアミノ酸配列
の部分領域も「ドメイン」と呼ばれる。

層、Ｐ　（又はＨＵＳＩ−Ｉ）　　は既に古くから知ら
れており且つ研究されていた蛋白質の一つ（例えばＳｒ
、ｈｉｅｓｓｌｅｒ　　　等　：　　”Ｎｅｕｔｒａｌ
　　ｐｒｏｔｅａｓｅｓ　　ｏｆ　　ｈｕｍａｎｐｏｌ
ｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ　１ｅｕｃｏｃｙｔｅｓ
　−Ｈａｖｅｍａｎｎ等−Ｕｒｂａｎ　＆　Ｓｃｈｗａ
ｒｚｅｎｂｅｒｇ、　Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、　Ｍｕｎｉ
ｃｈ（＋９７８）、＋９５−２０７頁参照〕であって、
このものは　１０７　　個のアミノ酸残基を含み、そし
て相同性の比較に基づいて二つのインヒビタードメイン
よりなっている。その第一の（Ｎ−末端側の）ドメイン
はトリプシン類似の種々の酵素の阻害をもたらし、一方
その第二の（Ｃ−末端側の）ドメインはＸ線結晶学的研
究によればキモトリプシンに結合しており、そしてこの
ドメインはエラスターゼ阻害作用をも保持すると考えら
る（　Ｇｒｕｅｔｔｅｒ　　等：Ｅｍｂｏ　Ｊ、”ｌ、
３４５−３５１　（１９８８））。

この公知の１０７　　個のアミノ酸を含むセリンブロチ
アーゼインヒビター蛋白質のアミノ酸連鎖の中の１個又
はそれ以上のアミノ酸残基を他のものと交換することが
既に提案されているけれども、これは未だ実現されてい
ない（Ｗｏ　８６１０３４９７、特にその１１−１３　
　頁参照）。すなわちアルギニン（第２０番位置）をリ
ジンと、ロイシン（第７２又は７４番位置）をリジン又
はアルギニンと、及び／又はメチオニン（第７３番位置
）をリジン又はアルギニンと置き換えることによってト
リプシン類似のセリンプロテアーゼ類に対する阻害作用
が高められるとされている。一方この文献にはキモトリ
プシン類似の、カテブシンＧを含むセリンプロテアーゼ
類に対する活性の上昇のために第２０　　番位置のアミ
ノ酸（アルギニン）、第７２又は７４番位置のアミノ酸
（ロイシン）及び／又は第７３番位置のアミノ酸（メチ
オニン）の一つ又はそれ以上をフェニルアラニン、チロ
シン又はトリプトファンと置き換えることが考えられた
。最後に、第２０番位置のアミノ酸（アルギニン）、第
７２又は７４番位置のアミノ酸（ロイシン）及び／又は
第７３番位置のアミノ酸（メチオニン）の一つ又はそれ
以上をアラニンと置き換えることによって膵臓エラスタ
ーゼ類似の各種セリンプロテアーゼ類に対するインヒビ
ター作用を改善することも提案されている。

しかしながらまた他方においてＮｏ　８６１０３４９７
には第２０番位置のアルギニンをグリシンと置き換える
ことによってトリプシンに対する阻害作用が、また第７
３番位置のメチオニン又は第７２番及び／又は第７４番
位置のロイシンをグリシンと置き換えることによって白
血球エラスターゼに対する阻害作用が高められると言う
ことも示唆されている。

更に上記ＷＯ８６１０３４９７にはまた、Ｒｏｓｅｎｂ
ｅｒｇ等の発見（＠述）に引き続く、そのプロテアーゼ
インヒビターの酸化的失活に対する安定性を改善するた
め、或はまた白血球エラスターゼ及びカテプシンＧに対
する阻害作用を上昇させるためにメチオニンをバリンと
置き換える提案もなされている（但しいずれにしてもそ
の蛋白質中の４個のメチオニン基の全て又はいずれかを
このような効果の達成のために交換すべきなのか、或は
また例えば上述した第７３番位置におけるメチオニンの
フェニルアラニン、トリプシン又はトリプトファンによ
る交換を補足する追加的な変更を問題とすべきなのかに
ついては明らかにされていない）。

上記１９０８６１０３４９７　　に従うブロテイナーゼ
インヒビターの上記に引用した全ての変更の提案、並び
にそれについてあげられているその蛋白質の機能の変化
や特性の変化については実験的証明やその他の具体的説
明は存在しないけれども、しかしながら第２０番位置及
び／又は第７２ないし７４番位置、中でも第７３番位置
におけるアミノ酸の変更が恐らくは特定のセリンプロテ
アーゼ類に対するインヒビター作用の損失又は変化をも
たらすこと、或はもたらすことができること、及び例え
ば第７２−７４　　番位置、中でも第７３番位置におい
ての上記と異なる他のアミノ酸の導入によっていかなる
作用の変化がもたらされ得るかについては全く予測でき
ないということが当業者には知られていたことをそのこ
とから読み取ることができる。このような未知性はまた
上に引用したＯｗｅｎ等の、メチオニン残基をアルギニ
ン残基と置き換えることによるαビアンチトリブシンの
作用の変化に関する発見によっても更に支持されている
。

この場合に、Ｋｒａｍｐｓ　　等の”Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ
ｅｍ、　Ｈｏｐｐｅ−５ｅｙｌｅｒ”　３６９．５ｕｐ
ｐ１．．８３−８８　（＋９８８＞にあげられた発見に
よればＡＬＰ　　の酸化的失活がトリプシン＋＜■害作
用のみならず、エラスターゼ分解の阻害作用の損失をも
もたらすこと、すなわち上記第ドメイン中にはメチオニ
ンが含まれていないのでメチオニンの酸化には（にのみ
には）基づき得ないと言うことも注意すべきである。従
ってＡＬＰの第ニドメイン中の成る（完全な、又は部分
的な）メチオニンの交換が酸化抵抗性の活＋ｉ　ＡＬＰ
突然変異体をもたらすかどうかについては予測すること
ができなかったのである。

既に述べたように、ＡＬＰ　　（又はＨＵＳＩ−Ｉ等の
プロテアーゼインヒビター類）は中でも（これまで知ら
れていない方式で）酸化により急速に失活すると言うこ
とが知うわている。従フてこの種の白血球エラスターゼ
インヒビターの治療のための利用に関しては、酸化に対
してより安定なセリンプロテアーゼインヒビターを人手
できることが強く望まれている。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って本発明の対象の一つは、真正のひとインヒビター
がそれに対してできるだけ維持されていて、中でもひと
の白血球エラスターゼに対する阻害作用並びにその他の
好ましい諸性質を有するけれども活性化された白血球に
よる酸化的な失活に対して天然ＡＬＰ　　よりもより安
定であるか又は完全に抵抗性であるようなセリンプロテ
アーゼインとビターＡＬＰ　　の新規な突然変異体を作
り出すことである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明に従う新規なセリンプロテアーゼインヒビター蛋
白質は下記式　（１）　　のアミノ酸配列又は少なくと
もその第５３−１０１番位置の配列を包含する： ５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−５ｃｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ８ Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｎ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−八ｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙ
ｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−５ｅｒ−Ａｓｐ
−Ｔｒｐ−６ Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａ
ｒｇ−（：ｙｓ−（：ｙｓ−Ｐｒｏ−八５ｐ−Ｔｈｒ−
Ｃｙｓ−Ｇ　１ｙ−Ｉ　１ｅ−ＬｙｓＪ：ｙｓ−Ｌｅｕ
−八５ｐ−Ｐｒｏ−４ Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔ
ｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙ
ｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−−Ｗ−−Ｇｌｙ
−Ｇｌｎ−２ Ｃｙｓ−−Ｚ−−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−−Ｙ−−Ｐ
ｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−（：ｙｓ−０ Ｇｌｕ−−Ｘ、−−八５ｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−
Ｌｙｓ−へｒｇ−へ５ｐ−Ｌｅｕ上式において賃　はチ
ロシン又はグルタミン酸であり、Ｘ、、　Ｘ２　　及び
×３は同一であっても異なっていてもよいがこれらの残
基のおのおのはメチオニン又はロイシンであり、その際
ｘ３は更にメチオニン、ロイシン又はフェニルアラニン
であることもでき、Ｙはプロリン又はアルギニンを表わ
し、そして２　はロイシンを意味するか、又は胃がチロ
シンでｘｌ、ｘｌ及び×３がロイシンであるときはイソ
ロイシンをも意味する。

好ま ばチロ ジョ インヒ （Ｉａ） しくは上記式（Ｉ）　　又は　（Ｉ　ａ）においてＷシ
、ンデアル。

ウキ式　（１）　　の新規なセリンプロテアーゼビター
蛋白質の好ましい群のものは下記式５式％ で表わされるものか、又はこのものの、少なくともその
第５３−１０１番の配列を含む部分領域であり、その際
×３、×２、Ｙ　及び２　は前記と同じ意味を有し、そ
して×３°　はメチオニン又はロイシンを表わす。

全く一般的に、すなわちＷ　及びＹ　の意味に無関係に
、上記式　（１）　　又は　（Ｉａ）においてＸ３、×
２、　×３及び２　がロイシンであるような生成物又は
その部分領域が特に好ましい。

更にまた、前記式（Ｔ）　　又は　（Ｉａ）においてＹ
がプロリンであるような生成物又はその部分領域が好ま
しい。

本発明に従う新規なセリンプロテアーゼインヒビターの
アミノ酸配列は好ましくは式　（Ｉ）　　又は（Ｉ　ａ
）の第１ないし１００　　番のアミノ酸位置及びその第
４８−１０７番、　イ９−１０７番並びに５０−１０７
番の部分配列を包含する。しかしながらまた本発明の対
象にはこれらの新規なセリンプロテアーゼインヒビター
類の融合蛋白質類、中でもＮ−末端側の信号配列又は例
えばβ−ガラクトシダーゼを含むそれらも包含される。

前記式　（【）　　又は（Ｉａ）　　の蛋白質において
アスパラギン酸（第４９番位置）までのＮ−末端側部分
領域中で、例えば前述のＷＯ８６１０３４９７から第２
０番位置のアルギニンの取り換えに関して公知であるよ
うな態様で他のアミノ酸類も取り換えられていることが
できる。

本発明に従う新規なセリンプロテアーゼインヒビターは
、中でもこれらにおいてＹ　かプロリンであって２　が
ロイシンであるようなインヒビターは白血球エラスター
ゼに対する、或はまた例えばキモトリプシンに対する際
立ったインヒビター作用により、または（より低い効果
での）カテブシンＧ、チマーゼ及びトリプシンに対する
インヒビター作用に加えての高められた酸化安定性によ
って優れている。

本発明に従うセリンプロテアーゼインヒビターにおいて
Ｘ、、　Ｘ２及び×３がロイシンを意味し、モしてＹ　
がアルギニンであるか又はＺ　がイソロイシンであるよ
うな場合、或はまた×１、×２及び２　がロイシンであ
って一方ｘ３がフェニルアラニンを表わす場合には、そ
の該当する生成物の基質特異性が変化し、と言うのはこ
の場合にはその白血球エラスターゼは依然として顕著に
阻害されるけれども、キモトリプシン及び例えばカテブ
シンＧに対するインヒビター作用がもはや与えられない
からである。これらの生成物、中でも×１×３　がロイ
シンであって２　がイソロイシンであるもの、並びに×
１、×２及びＺ　がロイシンであって×３がフェニルア
ラニンであるものは従って白血球エラスターゼに対して
選択的インヒビターである（特に中でも第５３−１０１
番位置ないし第４８〜１０７番位置を包含する配列領域
が含まれる一つのドメインのみが存在しているが、又は
例えば式（１）　　又は　（Ｉａ）の蛋白質において第
２０番のアルギニンがグリシンと置き換えられているこ
とによってトリプシンに対する阻害作用が高められた場
合に）が、これは更に特に酸化抵抗性でもある。好まし
い本発明に従う生成物は従って式（１）又は　（Ｉａ）
において×１及び×２がロイシンであり、ｘ３　　がロ
イシンであってＺ　がイソロイシンであるか、又は×３
がフェニルアラニンであって２　がロイシンであるよう
なセリンプロテアーゼインヒビター（又はそれらの配列
の部分領域）である。これらの化合物の群のなかではＷ
がチロシンであってＹ　がプロリンであるようなものが
好ましい。

本発明の更にもう一つの対象は、前記式（１）又は　（
Ｉａ）のアミノ酸配列又は少なくともその第５３−１０
１番位置の部分領域を含むセリンプロテアーゼインヒビ
ター蛋白質のためにコードするようなＤＮＡ配列を作り
出すことである。好ましい一つの実施態様において本発
明のＤＮＡ配列は式（Ｉ）又は　（Ｉａ）の１０７　　
個のアミノ酸を含む蛋白質のためにコードする。本発明
に従う特に好ましい実施形態は添付の第２ａ、２ｂ及び
３ないし８図に示したアミノ酸配列を有する蛋白質のた
めにコードするようなＤＮＡ配列である。

発現に用いる宿主、好ましくはＥ、ｃｏｌｉによるコド
ンの利用及び制限切断部位を一つだけ導入することの利
点の考慮のもとに、これらのＤＮＡ配列は式（１）　　
又は　（Ｉ　ａ）に従う目的のアミノ酸配列に基づいて
遺伝子コードにより設計し、合成した。この合成のため
にはまずそのシンセサイザの中で得られたＤＮＡオリゴ
ヌクレオチド（例えば第１図参照）を用い、適当なベク
ター、好ましくはｐｔａｃＳＤＴ　（ＤＳＭ　５０１８
）の中でのクローニングによって、式（Ｉ）　　の特定
の蛋白質のために既にそのままでコードすることができ
るけわども式　（１）の他の蛋白質のためにコードする
ような他のＤＮＡ配列のための前駆体遺伝子としても用
いることができるような遺伝子を作る。このような、式
（１）の蛋白質のために直接コードするけれども前駆体
遺伝子としても使用することができるような遺伝子の例
は第２ａ及び第２ｂ図に示した遺伝子ＡＬＰ　２３０及
びＡＬＰ　２４０　　である。式（１）　　の他の蛋白
質のために切断し、得られた断片を前駆体遺伝子の含ま
れたプラスミドから構築するためにこのものは制限エン
ドヌクレアーゼ類、好ましくはＢｓｔ　Ｅｌｆ及びＳｔ
ｕ　Ｉ　　によって切断し、そして次に脱ホスホリル化
する。式　（Ｔ）　　に従う配列中の第６６−７６　　
番位置のアミノ酸のためにコードするオリゴヌクレオチ
ドをこれら両方の切断位置の間でクローニングによって
異なったアミノ酸配列の式（Ｉ）　　の種々部分量にコ
ードする遺伝子が得られる。この場合に用いるオリゴヌ
クレオチド類（対として、すなわちＭｌとＭｌ、Ｍ３と
Ｍ４　　又はＭ５とＭ６はそれぞれ下記式に相当するも
のである： ３’−ＧＣ：ＣＣＡＡ　　ＧＴＣＧＴＣＧＴ（：　　Ｃ
ＧＴ　　ＧＡＧ　　ＴＧＧ　　ＣＡＴＣＣＡ　ＴＴＧ　
−５′　　　　　　　　　　　　　（Ｍｌ）３’−Ｇ　
ＡＴＧ　ＣＣＡ　ＧＴＣ：　ＡＧＧ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　
ＧＡＧ　ＴＴＧ　ＧＧＣ−５′　　　　　　　　　　　
　　　　　　　（Ｍｌ）３’−ＧＣＣ，（：ＡＡ　　Ｇ
Ｔ（：　　ＧＴＩＩＩ：　　ＣＴＡ　ＣＧＴ　　ＧＡＣ
ＴＧＧ　　ＣＡＴＣＣＡ　ＴＴＧ　−５′　　　　　　
　　　　　　　（Ｍ３）３　−　　Ｇ　　ＡＴＧ　　Ｃ
ＣＡ　ＧＴＡ　　Ａ（：Ｇ　　ＴＡＧ　　ＧＡＧ　　Ｇ
ＡＣＴＴＧ　　ＧＧＣ−５′　　　　　　　　　　　　
　　　　　　（Ｍ４）３’−ＧＣ（：　　にＡＡ　　Ｇ
ＴＣＧＴＣＧＴＣＣＧＴ　　ＧＡＣＴＧＧ　　へＡＧＣ
Ｃへ　ＴＴＧ　　−５°　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　（Ｍ５）３’−Ｇ　ＣＴＴ　Ｃｔ
ｌ：Ａ　ＧＴＧ　ＡＣＧ　ＧＡＣ：　ＧＡＧ　ＧＡＧ　
ＴＴＧ　ＧＧ（：＝５・　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　（Ｍ６ンしかしながらもし式（１）　　において×
３がフェニルアラニンであるべき場合には、オリゴヌク
レオチドＭｌ　−Ｍ６　　によって構築されたプラスミ
ドから出発するが、この場合にはその中に式（１）の蛋
白質の第９６番位置においてフェニルアラニンの発現を
もたらすようなオリゴヌクレオチドがクローンされる。

このようなオリゴヌクレオチド類は例えば式（Ｉ）　　
の蛋白質において×１と×２とがロイシンであり、そし
て×３がフェニルアラニンであって、Ｊ　Ｙ及び２　が
前記と同じ意味を有する場合に下記の各式のオリゴヌク
レオチドである： ３’−Ａ　ＧＡＡ　ＣＧＣＡＡＴ　（：ＧＧ　ＧＣＣＡ
ＡＴ　ＴＣＣＧＡＡ　（：ＴＡＴＯに　ＴＡＧ　ＴＴＧ
　ＡＴＣ−５“　　　　　　　（Ｅｌ′−ＴＣＧＡＧ　
　［；Ｔ八　Ｇ（：Ｇ　　ＧＴＣＡＧＧ　　ＴＴＴ　　
ＧにＴ　　ＣＴＡ　　ＧＡＧＴＴＴ　　ＡＧＧ　　ＡＩ
ＣＧ　　ＧＡＣＣＧＡ　　ＡＡＣＡＧＧ　　（、ＣＡ　
　ＴＴＴ−５”　　　　　　　　　　　　　　　　（Ｅ
ｌ）及び ３　−　　Ａ　　ＡＣＴ　　ＡＧＧ　　ＡＴ八　ＧＴＴ
　　ＣＧＧ　　ＡＡＴ　　ＴＧＧ　　ＣＣＣ，ＧＡＴＴ
ＧＧ　　ＧＴＴ　　ＧＴＡ　　ＡＡＴ　　ＧＧＣＧＴＧ
　　ＴＴＴ　　ＧＧＧ　　ＴＣＣＧＴＣＣＴＡ　ＡＡＣ
ＴＣＴ　　ＡＧＡ　　ＧＧＡ　　ＡＡＣＧＴＧ　　ＡＣ
ＣＧＧＴ　ＡＧ（：　−５′　　　　　　　　　　　　
　　　　　（Ｅ３）これらのオリゴヌクレオチドを（ホ
スホリル化とハイブリダイゼーションとの後で）それぞ
れの出発プラスミドの中に組み込むためにこの後者を好
ましくは制限エンドヌクレアーゼ５ａｃｌ及びＳｐｅ　
Ｉにより切断し、通常の態様で脱ホスホリル化し、そし
て次にそのようにして得られた断片をハイブリダイゼー
ションされたオリゴヌクレオチドＥｌ　−Ｅ３　　によ
り連結反応させる。

そのようにして得られたプラスミドは好ましくは次にそ
の各発現ベクターが対応する各遺伝子を２重に（２個の
終止コドンにより分離されて　１４−１７個、好ましく
は１６個のヌクレオチドを含む１つの配列、１つのシャ
インダルガルノ配列及びもう１つの、６ないし９個、好
ましくは７個のヌクレオチドを含む配列）そのｔａｃ−
プロモータの背後に有して１個のターミネータ配列が後
続するように組換えられる。Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ　　等
〔”Ｊ。

Ｂａｃｔ、”　１３８．７０５−７１４　（１９７９）
）によって記述されたターミネータ配列（ｔｅｔＡ１０
ｒｆＬターミネータ）が特に適している。

本発明の更にもう一つの対象は、式（Ｉ）　　のアミノ
酸配列又は少なくともその第５３−１０１番位置の部分
領域を含む新規なセリンプロテアーゼインヒビターを製
造するための、適当な宿主生物体の（上記並びに以下に
おいて、また後述の語例において記述するように得られ
た）各種ベクターと発現物質とによる形質転換及び引き
続くその蛋白質の分離、再生段階及び精製並びに場合に
よりそれに引き続いて行なわれる、Ｎ−末端側が第４８
番位置の前、中でも第５０番位置の前に、又はＣ−末端
側が第１０１　　番位置の後方に存在するような配列部
分を切断するための、部分加水分解により鎖長を変化さ
せる方法である。

適当な宿主生物体はＥ、ｃｏｌｉ、　Ｂ、　５ｕｂｊｉ
ｌｉｓ、５ｔａｐｈｙｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｃａｒｎｏｓ
ｕｓ又は他のダラム陽性又はダラム陰性の各種バクテリ
ア、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ
、　５ｔｒｅｐｔｏ［ＩＩｙｃｅｓ　　の種の種々の株
、他の、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ、　Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ　　又はＳａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ　５ｅｒｅｖｉｓｉａｅのような顕微鏡
的微小菌類又は動物やひとの細胞である。好ましい宿主
生物体はＥ、ｃｏＨの種の種々の株、中でも亜族に１２
　　の、例えばＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＪＭ　１０３（
ＡＴＣＣ３９４０３）、Ｅ、ｃｏｌｉ　　に１２　　Ｊ
Ｍ　　１０３　　（ＡＴＣＣ３９４０３）、Ｅ。

ｃｏｌｉ　Ｋ］２　ＪＭ　１０５　（ＤＳＭ　４１６２
）　　及びＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２ＤＨＩ　（ＡＴＣに　
３３８４９）　　等である。

上述の宿主生物体の形質転換のため、及びここに記述す
る蛋白質の発現のための適当なベクターは例えばｐＢＲ
３２２のようなプラスミド及びそれから導かれる種々の
プラスミド類、又は更に例えばλファージのゲノム又は
ファージＭ］３　　のそれのようなウィルスゲノム類で
ある。市販の適当な発現ベクターは例えばｐｕｃ　９．
１）Ｕ（：　１２、ｐｕｃ　１３、ｐｕｃ　１８、Ｉ）
Ｕ（：　ｉ！ｌ、ｐＵＬ−λ、ｐＫに２３３−２、ｐＫ
Ｋ　２２３−３、ｐＹＥＪ　００１、ｐＴｚ　１８Ｒ，
ｐＴＺ　１９Ｒ，ｐＵＢ　１１０、ｐＷＨ４１８、ｐＤ
Ｈ３２、ｐＪＤＢ　２０７、ｐＡＮ　７−１、ｐ３５Ｒ
２、ｐｓｖｔ、、　ｐＫＳＶ　　その他である。

ｔａｃ−プロモータを含むＥ、ｃｏｌｉ−発現系中への
発現の導入は例えばグルコース除去又は好ましくはイソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドの添加によ
ってもたらすことができる。生じた蛋白質は分離し、ク
ロマトグラフで特製し、次いで例えば尿素又は塩酸グア
ニジン並びにチオール類及びジスルフィド類を含む緩衝
混合液の存在のもとに再生（Ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）　　
過程にすける。最後に所望の生成物をクロマトグラフィ
ーにより精製する。

式（１）　　又は　（Ｉａ）の蛋白質或はこのものの少
なくとも第４９−１０１番までの配列部分を含む部分領
域又はこのような生成物のＮ−末端側の融合蛋白質の第
４９−５０　　番位置における酸に不安定なアスパラギ
ン酸−プロリン間の結合の存在に基づいてこれら蛋白質
又は融合蛋白質の第５０番位置の手前にある全ての配列
部分を切断分離し、それによってこの式（１）　　又は
　（Ｉａ）の生成物の、配列領域５０−１０１ないし５
０−１０７を包含するＣ−末端側のドメインを作り出す
ことができる。

このためにはその出発蛋白質又は出発融合蛋白質（第４
９番位置より前の配列部分を含む）を例えば室温におい
て７０％濃度の蟻酸又はそれに匹敵する酸性試薬で２４
−３６　　時間処理し、次いでその完全なＣ−末端側ド
メインをクロマトグラフィーにより分離し、次いで特製
する。

式（１）又は　（Ｉ　ａ）或はそれらの部分領域の目的
とする生成物中でＸ、及び×２の基がロイシンであり、
そして×３がロイシンか又はフェニルアラニンであるべ
き場合には、公知の方法に従ってその生成物のために切
断し、得られた断片に５°−末端側でメチオニンのため
にコードするコドン八ＴＧを結合させるように行なうこ
とも可能である。このものから融合蛋白質の発現に際し
て所望の蛋白質のＮ−末端の手前に追加的なアミノ酸Ｍ
ｅ　ｔ−’がもたらされ、この所望の蛋白質は次に例え
ばブロムシアン分解によフて通常の態様で得ることがで
きる。

他方においてその得られた蛋白質のＣ−末端側の端から
第１０７−１０２　　番位置　（第１０７　　番のアラ
ニンのちころから開始されて）全ての、又は１ないし５
個だけのアミノ酸を、例えばカルポキシベブチターゼ類
の作用によって酵素反応的に切断分離することができる
。

そのようにして得られた種々の異なった鎖長のインヒビ
ターは例えばＥＬＩＳＡ　　試験によって定量的に分析
することができ、その隔成るポリクローン抗体をひと真
正＾１５Ｐ　　に対して使用することができる。

以下の記述において下記の省略記号を用いる＝ＡＬＰ　
　　　　　　（天然）アンチロイコプロテアーゼ ｂｐ　　　　　　　塩基対 クローラミン　Ｎ−クロロ−ｐ−ドルオールスルＴ　　
　　　　ホンアミドのナトリウム塩ＤＴＴ　　　　　　
ジチオスレイトールＥＤＴＡ　　　　　　エチレンジア
ミン四酢酸ＨＥＰＥＳ　　　　　２−　［４−（２−ヒ
ドロキシエチル）−ビベラジノ］−エタンスルホン 酸 旧、Ｅ　　　　　ひと白血球エラスターゼ［ＰＴＧ　　
　　　　イソプロピル−β−０−チオガラクトピラノシ
ド ＰＭＡ　　　　　　ホルポールミリスチルアセテート ＳＤ−配列　　　シャインダルガルノ配列トリス　　　
　トリスヒドロキシメチルアミノメタン Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００オクチルフェノキシアセトキ
（登録商標）　ジェタノール　（オクトキシノール−Ｉ
Ｏとも呼ばれる） 本発明に従う蛋白質の阻害作用は天然ＡＬＰ　　のひと
白血球エラスターゼ（ＨＬＥ）　　に対する阻害作用と
比較して次のように求める： ＨＬＥの活性の測定は色原性基質メトキシスクシニル−
し−アラニル−し−アラニル−Ｌ−プロリル−し−バリ
ルーｐ−ニトロアニリド（＝ＨＬＥ−基質、Ｐｒｏ−ｔ
ｏｇｅｎ　）を用いて２５℃において行なう（Ｇｅｉｇ
ｅｒ等：Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２３．
８２１　（１９８５）　）　。このＨＬＥ−活性決定の
ための実験条件は、０．１　ＭのＨＥＰＥＳ、　ｐＨ７
，５、３０ｎＭのＨＬＥ　（出発溶液：　０．８３μＭ
、２．５　ｍＭ　ＨＣＩ）及び０．３　ｍＭの）ＩＬＥ
−基質である。反応は０．１　Ｍ　　の　ＨＥＰＥＳ　
　と　３０　ｎＭ　　の１１ＬＥとを含有する反応混合
物にＨＬＥ−基質を加えることによって開始させ、そし
て２５℃において１０　　分間インキュベーションした
後、　０．６Ｍ　酢酸に調節することによって停止させ
る。ＨＬＥ　　を含まない対照反応混合物を並行してイ
ンキュベーションする。１０分間の間の吸収の変化を４
０５ｎｍ　　において測定する。式Ｉ　の化合物又はＡ
ＬＰの阻害活性を求めるために、順に増大する量の各種
インヒビターを用いて一定のＨＬＥ　　ｖＡ度（３０ｎ
ｍ）で１０分間２５℃において予備インキュベーション
し、そして反応を上述のように開始させ、停止させ、そ
して測定する。ＡＬＰ　　又は種々異なった式（１）　
　の化合物の存在のもとてのＨＬＨの阻害をインヒビタ
ー濃度に対するＩＩＬＥ　　活性％としてプロットする
（第９図参照）。

更に、本発明に従う種々の蛋白質の阻害活性並びに（対
照試験として）天然ＡＬＰ　　のうし膵臓からのキモト
リプシンに対する阻害活性も次のようにして測定する： キモトリプシン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｈｅｉ
ｍ　　社）の活性の決定は色原性基質スクシニル−１５
−アラニルし一アラニルーＩ４−プロリルーＬ−フェニ
ルアラニルｐ−ニトロアニリド（＝キモトリプシン基質
、ＰｒｏＬｏｇｅｎ）を用いて行なう（Ｇｅｉｇｅｒ　
：　”Ｍｅｔｈｏｄｓｏｆ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎ
ａｌｙｓｉｓ”第５巻、９９−１０９頁−Ｖｅｒｌａｇ
　（：ｈｅｍｉｅ　（＋９８４））　。試験条件はトリ
スＨＣ！　０．１　Ｍ、　　ｐＨ７，８、Ｇａ（：１２
２０　ｍＭ、　　Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１０００，８ｍＭ
、キモトリプシン（出発溶液：キモトリブシ’、ｔ　　
１００　ｎＭ、　　）［１２，５ｍＭ　　及びＴｒｉｔ
ｏｎ−Ｘ−１０００，８ｍＭ）　２．８　ｎＭ　　及び
キモトリプシン基質０．１５　ｍＭである。反応は前記
緩衝液中に２．８　ｎＭのキモトリプシンの含まれた混
合物にキモトリプシン基質を０．１５　ｍＭ　　の濃度
になるように加えることにより開始させ、そして　１５
分間２５℃においてインキュベーションした後でこれを
酢酸濃度０．６Ｍに調節することによって停止させる。

これと並行してキモトリプシンの含まれない対照混合物
をインキュベーションする。　１５分間の間の吸収の変
化を４０５　ｎｍにおいて測定する。対応的に調製した
試験混合物中で各試験されるべきインヒビター（式（Ｔ
）　　の化合物及びＡＬＰ）の濃度を順に高くなるよう
に変えて２．８　ｎ１ＩＩのキモトリプシン濃度におい
て２５℃で１０分間予備インキュベーションし、そして
上述した測定を行なう。キモトリプシンの阻害をインヒ
ビター濃度に対してキモトリプシン活性の％の値でプロ
ットする（第１Ｏ図）。

カテブシンＧ　（Ｇａｌｂｉｏｃｈｅｍ　Ｇ＋ｎｂＨ社
）の活性の測定を同様に上記キモトリプシン基質（Ｐｒ
ｏｔｏｇｅｎ社）を用いて行なう。この場合の試験条件
は０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ８，０、Ｎａ１ｌ　
０．２　Ｍ、　ＭＭｇＣｌ２１０１ｏ、　Ｔｒｉｔｏｎ
−Ｘ−１０００，８ｍＭ、　　カテプシンＧ（出発溶液
：カテブシン０４μＭ、酢酸ナトリウム５０Ｍ、　ｐｉ
（４，０、ＮａＣ１Ｏ，７Ｍ　　及びＴｒｉＬｏｎ−Ｘ
−１００１６ｍＭ）　１００　ｎＭ　　及びキモトリプ
シン基質０．４　ｍＭである。試験すべき各インとビタ
ーの濃度を順に高くなるように変えて　これと　１００
　ｎＭのカテブシンＧとの含まれた混合物を２５℃にお
いて２０分間インキュベーションし、次いで反応を開始
させるためにキモトリプシン基質を加え、そして２５℃
において２０分間培養した後に反応停止のために０．６
Ｍ　の酢酸濃度に調節する。２０分の間の吸収の変化を
４０５　ｎｍにおいて測定する。カテプシンＧを含まな
い対照混合物、もう一つのインヒビターを含まない混合
物をこれと並行にインキュベーションする。

更に酸化的失活に対しての本発明に従う種々の蛋白質の
抵抗性をＡＬＰ　　のそれと比較して試験するが、その
際一方においてクローラミンＴの作用により、もう一方
において活性化された白血球を用いたインキュベーショ
ンによって行なう。実験の実施方法は下記のとおりであ
る。

ａ）クローラミンＴの− それぞれの試験しようとするインヒビターの定量を、次
第に増大する量の化学的酸化剤としてのクローラミンＴ
と共にインキュベーションした後、ＨＬＥ阻害能力を測
定する。各インヒビターのクローラミンＴによる処理及
びＩＩＬＥ−測定は、トリス−ＨＣｌ　５０　ｍＭ、　
　ｐＨ８，５、Ｎａ１ｌ　１００　ｍＭ及びＴｒｉｔｏ
ｎ−Ｘ−１０００，８ｍＭの組成の緩衝液０．７　ｍｌ
中で３７℃において行なう。ＡＬＰ　　又は式（Ｉ）　
　の化合物の０．１　　μｇ　（８，５ｐｍｏｌ）　　
を０．０５−３μｍｏｌのクローラミンＴと共に　１５
分間インキュベーションする。ＨＬＥ　　阻害活性を測
定するために０．２　　μｇ　（８，３ｐｍｏｌ）　　
のＨＬＥ　　を加えて５分間インキュベーションし、次
いで反応をｒ　ＨＬＥ基質Ｊ　　（Ｐｒｏｔｏｇｅｎ　
　社：上記）によって開始させる。５分間の後に０．５
Ｍ　酢酸に調節することによって反応を停止させる。吸
収の変化を４０５　ｒ＋＋＋＋において測定する。対照
試験としてはイ）インヒビター、ＨＬＥ　＆びクロラミ
ンＴを含まない反応混合物（比較実験）、口）インヒビ
ター及びクローラミンＴを含まない反応混合物（ＨＬＥ
活性１００％のもの）及びハ）クローラミンＴを含まな
い反応混合物（酸化的影響のない場合のインヒビター活
性）を並行してそれぞれインキュベーションする。もう
一つの対照実験において０．０５ないし３μｍｏｌのク
ローラミンＴが）ＩＬＥ　　活性に対してなんらの影響
を持たないことを示すことができた。

ＡＬＰ及び式（１）　　の種々の化合物のクローラミン
Ｔによる処理の影響を第１１図に示す。

ｂ）性　　血　を　いるインキュベーション自然的条件
によりよく合致させたこの実験において、新しく分離さ
れた白血球を試験管中でＡＬＰ又は式（１）　　の種々
のインヒビターの存在のもとにホルボールミリスチルア
セテート（Ｐ）４Ａ）　　により、スーパー酸化物ラジ
カルを形成させるように刺激する。最初の活性及び失活
後の抑制された活性をＨＬＥ−試験において測定する。

各試験混合物において０．５Ｘ　１０６個の分離された
ひと白血球を種々のインヒビターの一定量（０，３μｇ
）と共にｒＨＢｓｓ緩衝液４　　（Ｎａ（：１８　ｇ／
Ｉ、■ＥＰＥＳ　６ｇ／ｌ、にＣＩＯ，４ｇ／ｌ、　Ｎ
ａＨＣＯ＋　０．３５　ｇ／ｌ、　Ｎａ２１＋Ｐｏ４０
．０６　ｇ／ｌ、にｌ＋２Ｐｏ、　０．０６　ｇ／ｌ、
　グルコース１　ｇ／Ｉ、　ｐｔ（７，４）の中で３７
℃において１０分間インキュベーションする。白血球を
ＰＭＡ　（３０ｎｇ／ｍｌ）の添加によって刺激し、３
７℃　において３０分間インキュベーションし、そして
遠心分離　（４℃において２５００ｇ、５分間）によっ
て沈殿させる。白血球を含まない上澄液を阻害作用の測
定のために０．４μｇ（１６，６ｐｍｏｌ）のＨＬＥ　
　を用いるＨＬＥ−試験に供する（上記参照）。各並行
実験において同じ量のインヒビターを刺激されなかった
白血球と共に、又は白血球を用いずに試験する。更にイ
ンヒビターを含まないそれぞれの対照試験を実施する（
第１２図参照）。

これらの実験及びその他の実験において天然のＡＬＰは
予想されたようにＨＬＥ、キモトリプシン、カテブシン
Ｇ及びトリプシンを阻害するけれどもクローラミンＴの
作用又は活性化された白血球の作用を受けた場合は著し
く失活されてしまうことが示された。驚くべきことに、
例えば天然ＡＬＰの第７３番位置のメチオニン残基をロ
イシンと置き換えた場合、すなわち式（Ｉ）　　におい
てＷ　がチロシンであり、Ｘ２、×２　　及び×３がメ
チオニンであってＹ　がプロリンであり、そしてＺ　が
ロイシンである蛋白質（ＡＬＰ　２４２　）を形成させ
たときはＨＬ　Ｅ　　に対して極めて僅かな阻害作用の
変化しかもたらさず（第９図参照）、またキモトリプシ
ンに対する阻害作用は全く変化しなかった（第１０図参
照）。この式（１）　　の化合物（ＡＬＰ　２４２）を
クローラミンＴ又は活性化した白血球の作用にさらした
場合にこのものは真正ＡＬＰ　　よりも僅かしか失活し
なかったく第１１及び１２図参照）。

このことはその生成物の生物学的安定性がこれを治療用
として使用できるほどに優れていることを示している。

本発明に従うセリンプロテアーゼインヒビターの若干の
ものの試験結果は第９ないし第１２図に詳細に示しであ
る。下記の表に１０７　　個のアミノ酸を含む式（１）
　　の蛋白質の若干のものについてのこれら及びその他
の結果をまとめてあげる。

表の註記： １）表中のインヒビターは式　（Ｔ）　　の下記の化合
物である ２）試験におけるＨ　Ｌ　Ｅ　　濃度は３０　ｎＭ　　
である。

ここに記載する値はｆｉＯｎＭ　　の濃度の各インヒビ
ターの作用を受けた後に残有するエラスターゼ活性の％
割合である。

３）キモトップシン濃度は２．８拒である。ここに記載
する値は４．８　ｎＭの濃度の各インヒビターの作用を
受けた後に残有するキモトリプシン活性の％割合である
。

４）カテブシンＧの濃度は１００　ｎＩＩ＋である。こ
こに記載する値は　１００　ｎＭの濃度の各インヒビタ
ーの作用を受けた後に残有するカテブシンＧの活性の％
割合である。

５）ここにあげた値は０．１μｇのインヒビターと３μ
ｍｏｌのクローラミンＴとの、　３７℃において１５分
間インキュベーションした反応混合物の作用の後に残有
するエラスターゼ（使用＋１ＬＥ０．２μｇ）の残存活
性の％割合である。

６）ここにあげた値は、予めホルボールミリスチルアセ
テートによって活性化させた多形核白血球（０，５ｘ１
０６個）とともにインキュベーションした０、３μｇの
インヒビター蛋白質の存在のもとての０．４μｇのエラ
スターゼの残存活性の％割合である。

この表は新規なセリンプロテアーゼインヒビターの２　
がロイシンであって×３がフェニルアラニンと異なって
いる限りこのものがキモトリプシンに対して良好な阻害
作用とともにひと白血球エラスターゼに対する阻害作用
が良好であることを示す。この表からはまた、×１、×
２、×３　　及びＺの基の少なくとも一つ以上がロイシ
ンである場合に酸化的な失活に対して、それが化学的影
響によるものであれ（クローラミンＴ）、又は酵素の作
用によるものであれ、優れた安定性によって際立ってい
ることがわかる。

特に驚くべきことはそわらの化合物において×１、×２
、ｘ３　　及び２　がロイシンであるときに、そして中
でもＡＬＰ　２３１　　の化合物（Ｗ　−Ｔｙｒ、　Ｙ
　＝Ｐｒｏ　）において１１　Ｌ　Ｅ　　及びキモトリ
プシンに対してＡＬＰ　　と同程度に高い活性を有する
こと、及びこれらの化合物が酸素ラジカルを形成させる
ための最も強い刺激剤、すなわちＰＭ八　　により処理
された０、５Ｘ　１０６個の白血球とともに３０分間イ
ンキュベーションすることによって全く、又はしλずれ
にしてもほんの僅かしか失活しないと言うことである。

この酸化による失活に対する高し＼抵抗性と高い阻害活
性との組合わせは中でもインヒビター　ＡＬＰ　２３１
　　を治療用の、中でも上述した種々の疾病の治療のた
めの価値ある生成物としている。

更にこの表かられかるように、化合物ＡＬＰ　２３２は
２　がイソロイシン残基であることにおいてのみＡＬＰ
　２３１　　と異なるものであるが、このものも価値あ
る種々の性質を有している。ＡＬＰ　２３２　　はＡＩ
Ｐ　２３１と同様に活性化された白血球による酸化的失
活に対する優れた抵抗性を有しているけれども、しかし
ながらこのものは変化した基質特異性を有するインヒビ
ターである。これはＨＬＥ　　に対しては依然としてこ
れを阻害するけれども、キモトリプシン及びカテブシン
Ｇに対しては作用を持たない。ＡＬＰ　２３１　　にお
いてＸ、だけをロイシンからフェニルアラニンに変えた
時にも良好な酸化安定性を有する高い活性の選択的な）
ＩＬＥ−インヒビター、すなわちＡＬＰ　２３７　　が
得られる。エラスターゼは疾病的条件のもとての組織の
障害に対して支配的影習を持つプロテアーゼと考えられ
るので、そのような、より選択的なインヒビターはその
優れた生物学的安定性の考慮のもとに更にもう・′一つ
の治療上の進歩性を有する。

従って本発明に従う新規なセリンプロテアーゼインヒビ
ターは予防的及び治療的用途のための価値ある作用物質
である。例えばそれらは慢性的及び急性的な種々の炎症
性機転の治療のために、また肺気腫及び肺水腫の形成の
抑制のために、或はまた腫瘍の浸潤に対する予防のため
にも適している。更にまたそれらは種々のショック状態
の治療及び予防のため、及び例えば過フィブリン溶解に
基づく術後出血の処置のために適している。リューマチ
性関節炎や骨関節炎のような組織変質性の諸疾病も式（
Ｉ）　　又は　（Ｉａ）の化合物或はこのもののセリン
プロテアーゼインヒビターとして有効な部分領域を用い
て治療することができる。

上述の諸疾病の治療に用いられるべき本発明に従うセリ
ンプロテアーゼインヒビター蛋白質の適用量は、（適用
技術や適用形態を無視すれば）中でもその治療の開始時
の病状段階によって左右され、そして医師によって個別
的に決定することができる。基準としては、腸管外適用
のためには考えられる適用量範囲は１回の適用当り　１
００　ｍｇないし５ｇ、好ましくは１００［Ｉｌｇない
し３ｇ　程度の量のセリンプロテアーゼインヒビター蛋
白質を用いると言うことより出発することができよう。

これは例えばＥｇｂｒｉｎｇ　　等〔”旧ｏｏｄ″４９
．　（＋９７７）２１９−２３１　）により報告された
発見とも一致しており、すなわちそれによれば成−大患
者の場合に１日間の間に少なくとも１ｇの量の白血球エ
ラスターゼが遊離されると言うことを推定することがで
きるが、従って本発明に従う蛋白質による治療のために
は約６ないし１０倍モル量の過剰で投与することにより
阻害させなければならない。

従って本発明は、式　（１）　　又は　（Ｉａ）のアミ
ノ酸配列或はその部分領域（少なくとも第５３−１０１
　　番位置の配列）を含む蛋白質の有効量と通常の担体
物質及び／又は稀釈剤及び／又は助剤とを含有する医薬
をも対象とするものである。

治療目的には本発明に従う蛋白質は滅菌された等浸透圧
性溶液の形で筋肉内、静脈内又は皮下注射によってその
炎症部分中に、又は場合により注入によフて送り込むこ
とができる。しかしながらまたこれら新規な蛋白質のス
プレー又は吸入用の形の調剤も考えられ、これらはその
作用物質を毛細気管支及び肺の該当部分へ直接送り込む
ことによって呼吸路の種々の疾病を処置するのに特に適
している。

添付の第１ａ−１ｃ図に記号式であげたオリゴデオキシ
リボヌクレオチドはＡｄａｍｓ　　等（Ｊ、Ａｍ。

Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　１０５．　（１９８３）　６６
１）の固相法に従いＤＮＡ−シンセサイザ　（Ｎｅｗ　
Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｏ、社の
モデルＢｉｏｓｅａｒｃｈ　８６００）　　を用いて１
μｍｏ１尺度で作ったものである。モノマーのシントー
ネ（５ｙｎｔｈｏｎｅ）としては市販の、それぞれ必要
なデオキシリボヌクレオシドのβ−シアノエチルで保護
されたジイソプロピルアミノ−ホスホルアミダイトを用
いた。担体から分離した後に末端がなおトリチルで保護
されている線状分子を滅菌条件のもとてゲルフィルトレ
ージョンにより脱塩して予備精製し、次いで「逆相Ｊ　
ＨＰＬｔｌ：　　による第１の分離過程を２度行なりた
。それぞれの主生成物を脱トリチル化し、そして更に２
つの「逆相」ＨＰＬＣＭ製段階の後で所望のオリゴヌク
レオチドがゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）による分析で示
されたように高い純度で得られた。

〔実施例〕

以下に幾つかの実施例をあげるがこれらの実施例におい
て用いた制限酵素は市販品である（例えば”Ｎａｃｈｒ
、Ｃｈｅｍ、　Ｔｅｃｈｎ、　Ｌａｂ、”　３５．　　
（１９８７）　９３９参照〕。他の各酵素についてもそ
れぞれの起源を示す記号をあげる。

各実施例において式（Ｉ）　　部分量の発現ベクターを
構築するためにプラスミドｐｔａｃｓＤＴ（ＤＳＭ　５
０１８）　　を用いたが、これは効率的な発現収率のた
めの全ての制御要素を含んでいる。ここではｐＢＲ３２
２誘導体を用いたが、このもののＮｄｅＩ制限切断部位
（前のものの第２２９６番位置）は、Ｎｄｅｌ　　によ
る切断、ＤＮＡ−ポリメラーゼＩ　（Ｋｌｅｎｏｗ断片
、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｈｅｉｍ　　社）によ
る「嵌込み」及びＴＡ−ＤＮＡ−リガーゼ（Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂ　、の”ＢＲＬ”）に
よる再連結によつイ除去した。

更に、ＥｃｏＲＶ−Ｎｒｕ　Ｉ−断片（前の第１８９　
　番ないし９７３番位置）を両方の酵素による切断と引
き続いてのＴ４−ＤＮＡ−リガーゼによる再連結によっ
て除去した。出発プラスミド　ｐｔａｃＳＤＴ　　は更
に１個のｔａｃ−プロモータ（へｍａｎｎ等：　”Ｇｅ
ｎｅ”　２５．　　（１９８３）１６７−１７８、ｄｅ
　Ｂｏｅｒ等”Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ｌノＳＡ″１１０　（＋９８：］）　２１−
２５）、１個のシャインダルガルノ配列、ｔｅｔＡ１０
ｒｆＬターミネータ（Ｊｏｒｇｃｎｓｅｎ　　等：前出
）及びアンピシリン抵抗性遺伝子を打している。各制御
要素の側面にそれぞれ１つの制限切断部位を並べて個々
の要素が交換できるようにする。このプラスミドｐｔａ
ｃｓＤＴ　　の図式的説明図を第１３図にあげる。

本発明に従い得られる種々のプラスミドを発現させた後
で対応する宿主生物中に形成される式（１）又は　（Ｉ
ａ）の蛋白質は例７ｂにおいてインヒビター蛋白質ＡＬ
Ｐ　２３１　　について記述する態様で宿主細胞質から
分離し、再生過程にかけ、次いで積装する。好都合には
鯖密精製のために透析終了の前になお追加的なＮｕｃｌ
ｅｏｓｉｌ　Ｃ１８（１＋ｔ’ａｃｈｅｒｅｙｕｎｄ　
Ｎａｇｅ１社）の上でアセトニトリル／トリフルオロ酢
酸中のある勾配を用いて追加的な「逆相」ＨＰＬＣを行
なう。このＨＰＬに精製のための条件としては例えば下
記のような条件があげられる：カラム寸法　　　０．７
２　ｘ　２５　ｃｍ温度　　　　　　　２５℃ 流量　　　　　　１．６　ｍｌ／ｍｉｎ緩衝液Ａ　　　
　水中の０．０５９６濃度トリフルオロ酢酸 緩衝液Ｂ　　　　アセトニトリル中の０．０２５ｔトリ
フルオロ酢酸 勾配　　　０−５６　分　　緩衝液Ｂ４２！ｋ（残余は
緩衝液Ａ） ５６−７０　　分　　緩衝液Ｂ６２＊ ７０−７５　　分　　緩衝液Ｂ　Ｏ主 検出波長２１４　ｎｍ インヒビター蛋白質の含まれているフラクシヨンを真空
中で蒸発濃縮させた後、更に処理するに先立って例えば
ｐＨ５，４の酢酸ナトリウム緩衝液の２Ｏｍｌ　　中に
取り入れる。

そのようにして９０　！ｖ１以上の純度を有する各イン
ヒビター蛋白質が得られる。

以下、いくつかの例によって本発明を更に詳細に説明す
るが、これらの記述によって本発明はなんら制限される
ものではない。

桝↓ 本願明細書に記述した目的に沿って先ず最初プラスミド
ｐＡＬＰ　２３　　をプラスミドｐｔ、ａｃｓＤＴ　（
ＤＳＭ５０１８）の中で構築し、又はＡＬＰ遺伝子２３
０をクローンする。

ａ）このために、第１４ａ　　図に示す合成計画により
先ず最初プラスミドｐｔａｃＳＤＴ　　を制限エンドヌ
クレアーゼＢａｍｔ＋１　　及び５ｐｅｌによって切断
し、そして仔牛腸管からのアルカリ性フォスファターゼ
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｈｅｉｍ　　社）を用
いて脱ポスボリル化する。各オリゴヌクレオチド　Ｄ２
１、Ｄ２２、Ｄ２３及びＤ２１ａ、　Ｄ２２ａ、　Ｄ２
３ａをその５−末端側でＴ４−ポリヌクレオチドキナー
ゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｈｅｉｍ社）によりホ
スホリル化し、互いにハイブリド化し、そして予め調製
した断片ｐｔａｃｓＤＴ／Ｂａｍ［ｘ　５ｐｅｌ　　と
共に連結させる。この場合に各オリゴヌクレオチド及び
上記断片は１０：１のモル比で用いる。この連結反応生
成物をコンピーテント　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ　１０３　
　の細胞の形質転換のために使用する。アンピシリン培
地の上で選択した後にそれら　＋８９　ｂｐのＢａｍＨ
Ｉ−５ｐｅＩ　ＤＮＡ断片の含まれている正しく組換え
られたプラスミドを有するクローンをＤＮＡの制限分析
によって同定する。

ｂ　）　　ｒｐＡＬＰ　２２　」の記号で表わしたその
ようにして得られたプラスミド中間生成物を次に制限エ
ンドヌクレアーゼＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ　　によフて
切断し、そしてアルカリ性ホスファターゼで処理する。

各オリゴヌクレオチドＤｌｌ、　Ｄ１２、ＤＩ３　　及
びＤｌｌａ、　Ｄ１２ａ、　Ｄ１３ａ　　をその５°−
末端側において第４−ポリヌクレオチドキナーゼによっ
てホスホリル化し、互いにバイブリド化し、そしてｐＡ
ＬＰ２２／Ｂａｍ１−１１　Ｘ　ＮｄｅＩ　　及び第４
−ＤＮＡ−リガーゼとの連結反応のために使用する。コ
ンピーテント　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０３細胞の形質転
換とアンピシリン培地の上での選択との後でそれら正し
く組換えられたプラスミド（これらは　１４８　ｂｐの
ＮｄｅＩ−ＢａｍｔｌＩ−ＤＮＡ断片又は３３７　ｂｐ
のＮｄｅＩ−５ｐｅｌ−ＤＮＡ　　断片を含んでいる）
を制限分析によフて同定する。そのようにして得られた
プラスミドはｐＡＬＰ　２３　　と名付ける。

この新しくクローンされたＤＮＡ配列ＡＬＰ　２３０（
第２ａ図参照）の確認はプラスミドｐＡＬＰ　２３から
の＋８９　ｂｐのＢａｍＨＩ−５ｐｅｌ−ＤＮＡ断片又
は１６７ｂｐのＸｂａＩ−Ｒａｍ旧−ＤＮＡ断片のＭ１
３　ｍｐ　１８−及びＭ１３　ｍｐ１９／　ＸｂａｌＸ
　ＢａｍＨＩ　ヘのサブクローニングの後でジデオキシ
配列化（Ｓａｎｇｅｒ　　等：　”Ｐｒｏｃ。

Ｎａｌ：１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪＳＡ”　７
４　（＋９７７）　５４６３）により標準ブライマー（
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｈｅｉｍ　　社のプライ
マＭ１３″Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ”）　　を用いて行な
った。

但ノ 第１４ｂ　　図に示す合成計画に従い、プラスミドｐＡ
ＬＰ　２４の構築を行なう。このために第１ｂ図におい
て得られるプラスミドｐＡＬＰ　２３　　を制限エンド
ヌクレアーゼ５ｔｕｌ及び５ｐｅｌによって切断した後
説ホスホリル化する。各オリゴヌクレオチドＤ２４、Ｄ
２５、Ｄ２４ａ、及びＤ２５ａをその５゛−末端側で第
４−ポリヌクレオチドキナーゼによりホスホリル化し、
互いにバイブリド化させ、そして断片ｐＡＬＰ　２３／
５ｔｕｌＸ　５ｐｅＩ　　と共に１０＝１のモル比で連
結反応させる。その連結反応生成物をコンピーテントＥ
、ｃｏｌｉ　ＪＭ　１０３　　の細胞の形質転換のため
に使用する。アンピシリン培地の上で選択した後に正し
く組換えられたｐＡＬＰ　２４　　プラスミドを同定し
、その際このものの＋８９　ｂｐのＢａｍＨＩ−５ｐｅ
Ｉ断片を例１ｂに記述したようにＭ１３　ｍｐ１８及び
Ｍ１３　ｍｐ１９　　中にサブクローニングして配列化
させる。そのようにして合成されたＤＮＡ配列　ｒＡＬ
Ｐ２４０」　　すなわちＡＬＰ　２４０遺伝子は第２ｂ
図に記号式で示しである。

桝１ ａ）ベクターｐＡＬＰ　２３　　を用いて　ｒＡＬＰ　
２３１．　　の蛋白質〔式（ｒ）において胃　がチロシ
ンであり、Ｘ１、Ｘ２、×３　　及び２　がロイシンで
あってＹ　がプロリンである化合物）のた゛めにコード
するＡＬＰ２３１遺伝子（第３図参照）を合成する。こ
のために発現ベクターｐＡＬＰ　２３　　を制限エンド
ヌクレアーゼＢｓｔＥＩＩ及び５ｔｕｌにより切断した
後説ホスホリル化する。例１と同様に実施するオリゴヌ
クレオチドＭｌ及びＭ２　　（本文中にあげである）の
断片ｐＡＬＰ　２３／ＢｓｔＥＩＩ　Ｘ５ｔｕＩ　　ヘ
のクローニングによってプラスミドｐＡＬＰ　２３１が
得られたが、このものは上記ＡＬＰ２３１遺伝子をその
出発プラスミドｐｔ、ａｃＳＤＴのＮｄｅｌ切断位置と
５ｐｅｌ切断位置との間に有している。

ｂ）オリゴヌクレオチドＭ３及びＭ４　　（本文中にあ
げである）の前記例３ａにより作り出された断片ｐＡＬ
Ｐ　２３／ＢｓｔＥＩＩ　’ｘ　５ｔｕｌ　　ヘのクロ
ーニングによってプラスミドｐＡＬＰ　２３２又はＡＬ
Ｐ２３２遺伝子が得られるが、このものは蛋白質ｒＡＬ
Ｐ　２３２．、すなわち式　（１）　　においてＷ　が
チロシンであり、Ｘｌ、×２、およびＸ、がロイシンで
あってＹ　がプロリンであり　Ｚ　がイソロイシンであ
る化合物（第４図参照）のためにコードする。

Ｃ）例３ｂと同様に行なうが、但し上記の断片へのクロ
ーニングはオリゴヌクレオチドＭ５及びＭ６（本文中に
あげである）を用いて行ない、それによってプラスミド
ｐＡＬＰ　２３６又はＡＬＰ２３６遺伝子が得られ、こ
のものは　ｒＡＬＰ　２３６．　　のインヒビター蛋白
質、すなわち式（１）　　においてＷ　がグルタミン酸
であり、×１、×２、×３　　及び２　がロイシンであ
ってＹ　がプロリンである化合物（第５図参照）のため
にコードする。

例Ａ− 蛋白質ｒＡＬＰ　２３７．、すなわち式（Ｉ）　　にお
いてＷがチロシンであり、×１、×２、および２　がロ
イシンであって×３はフェニルアラニンを、モしてＹは
プロリンを表わすような化合物（第６図参照）のために
コードするＡＬＰ　２３７遺伝子を、前記例３ａにおい
て得られたプラスミドｐＡＬＰ　２３１を用いて次のよ
うに構築する。すなわち発現プラスミドｐＡＬＰ　２３
１を制限エンドヌクレアーゼ５ａｃｒ及び５ｐｅｌによ
って切断した後説ホスホリル化する。例１に記述したと
同様に行なって各オリゴヌクレオチド　Ｅｌ、Ｅ２及び
Ｅ３　　（本文中にあげである）をホスホリル化し、バ
イブリド化し、次いで予め調製された断片ｐＡＬＰ　２
３１／５ａｃＩ’ｘ　５ｐｅｌ　　と共に連結反応させ
る。ククローニング反応生成物ｐＡＬＰ　２３７　　は
切断部位Ｎｄｅｌと５ｐｅｌとの間に上記ＡＬＰ　２３
７遺伝子を含んでいる。この配列はＤＮＡ配列基分析に
よって確認された。

形 ａ）例３ａにおけると同様に行なうが、但しベクターｐ
ＡＬＰ　２３　（又はその断片ｐＡＬＰ　２３／Ｂｓｔ
ＥＩｌ　ｘＳｔｕｌ）の代りに例２において得られたベ
クターｐＡＬＰ　２４　　（又はこのものの脱ホスホリ
ル化した切断生成物ｐＡＬＰ　２４／ＢｓｔＥＩＩ　Ｘ
５ｔｕｌ）を用い、そしてこの中にオリゴヌクレオチド
Ｍｌ及びＭ２をクローンする。そのようにしてプラスミ
ド′　ｐＡＬＰ２４２又は蛋白質ｒＡＬＰ　２４２．　
（すなわち式（Ｉ）　　においてＷ　がチロシンであり
、×１、×２、および×３　　がメチオニンであってＹ
　がプロリンであり２がロイシンである化合物のために
コードするＡＬＰ　２４２遺伝子（第７図参照）か得ら
れる。

ｂ）例５ａにおけると同様に行なうが、但し断片ｐＡＬ
Ｐ　２４／ＢｓｔＥＩ　ＩＸ　５ｔｕｌ　　の中にオリ
ゴヌクレオチドＭ５及びＭ６　　（本文中にあげである
）′テをクローンし、そのようにしてプラスミドｐＡＬ
Ｐ　２４６又はＡＬＰ　２４６遺伝子が得られ、このも
のはインヒビター蛋白質ＡＬＰ　２４６、すなわち式（
１）　　においてＷがグルタミン酸であり、×１、×２
、および×３がメチオニンであってＹ　がプロリンであ
り　２　がロイシンである化合物（第８図参照）のため
にコードする。

形 本発明の好ましい実施形態の一つにおいて　Ｌａｃプロ
モータの後方に対応する各遺伝子を二重に備えているよ
うな発現プラスミドを構築し、そしてこれを式（１）の
化合物の高い収率での発現のために使用する。

ａ）第１５図に図式的に示しであるプラスミドｐＡＬＰ
　２３１２を構築するために、発現プラスミド１）ＡＬ
Ｐ　２３１　（例３ａにおいて得られた）より出発し、
これを制限エンドヌクレアーゼＰｓｔｒ及び５ｐｅｌ　
　によって切断する。準備的ゲル電気泳動及び引き続く
ゲル溶離によって断片が分離され、このものはアンピシ
リン抵抗遺伝子の始点と、ｔａｃプロモータと、シャイ
ンダルガルノ配列と及びＡＬＰ　２３１遺伝子とを有し
ている。第２の反応混合物中でプラスミドｐＡＬＰ　２
３１を制限エンドヌクレアーゼＰｓｔｌ及びＸｂａｌに
より切断し、仔牛の腸管からのアルカリ性ホスファター
ゼによってその５゛−末端側で脱ホスホリル化し、そし
て予め分離しておいたＰｓｔｌ−５ｐｅｌ　　断片及び
酵素Ｔ４−［ＩＮＡ−リガーゼと一緒に連結反応させる
。形質転換はコンピテント　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ　１０
３　　細胞を用いて行なう。

選択をアンピシリン含有培地の上で行なう。制限分析に
よっていくつかのクローンが同定されるがこれらは２個
のＡＬＰ−２３１遺伝子を前後して含んでいる。この場
合にそれぞれ５°−末端側で両方の遺伝子は７個のヌク
レオチドの間隔をおいて同じシャインダルガルノ配列を
存している。第１の遺伝子の両方の終止コドンの後で１
６個のヌクレオチドの間隔をおいてその第２のシャイン
ダルガルノ配列には更に７個のヌクレオチドの間隔をお
いて第２の遺伝子が後続している。この新規な発現ブラ
スミドはｐＡＬＰ　２３１２　　と名付けられる。

ｂ）プラスミドｐＡＬＰ　２３２　　（例３ｂに従い得
られた）より出発して例６ａにあげたと同様に行ない、
そのようにして発現プラスミドｐＡＬＰ　２３２２が得
られるが、このものはＡＬＰ　２３２Ｊ伝子を２個含ん
でいる。

Ｃ）例６ａ及び例６ｂと同様にしてプラスミドｐＡＬＰ
　２３　（例１ｂ）、同ｐＡＬＰ　２４　（例２）、同
ｐＡＬＰ　２３６　（例３Ｃ）、同ｐＡＬＰ　２３７　
（例４）、同ｐＡＬＰ　２４２　（例５ａ）又は同ｐＡ
ＬＰ　２４６　　（例５ｂ）から出発する。この場合に
発現プラスミドｐＡｔ−ｐ２３０２、同ｐＡＬＰ　２４
０２、同ｐＡＬＰ　２３６２、同ｐＡＬＰ２３７２、同
ｐＡＬＰ　２４２２又は同ｐＡＬＰ　２４６２　　がそ
れぞれ得られるが、これらは遺伝子ＡＬＰ　２３０、同
ＡＬＰ２４０、同ＡＬＰ　２３６、同ＡＬＰ　２３７、
同ＡＬＰ　２４２又は同ＡＬＰ　２４６　　を２個づつ
有している。

桝ユ ａ　）　Ｆ、ｃｏｌｉ　８１２　ＪＭ　１０３株（ＡＴ
ＣＣ３９４０３）のコンビ−テント細胞を例６ａにおい
て得られたプラスミドｐＡＬＰ　２３１２　　により形
質転換させる。そのようにして得られたＥ、ｃｏｌｉに
１２　ＪＭ　１０３／ｐＡＬＰ　２３１２株を１２のＳ
Ｍ−培地（ｆｔ酸アンモニウム５　ｇ／Ｉ、燐酸水素ジ
カリウム６ｇ／Ｉ　、燐酸２水素ナトリウム３ｇ／Ｉ、
酵母抽出液１０　ｇ／Ｉ、硫酸マグネシウム０．２５　
ｇ／ｌ、　グルコース１０　ｇ／ｌ　）の中でアンピシ
リン選択圧力（１００ｍｇ／Ｉ）のもとに２２℃におい
てＢｉｏｓｔａＬ−Ｍ−培養器（Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ、
　Ｂｒａｕｎ社）中で培養する。５８７　ｎｍ　　で測
定して光学密度５においてイソプロピルチオ−β−Ｄ−
ガラクトピラノシドの７５　ｍｇ／Ｉ　　の添加によっ
て発現相を開始させる。この発現相の間にその培地に各
５ｇの酵母抽出物を何度も補給（それぞれ１時間毎の間
隔で）する。誘導開始後５時間の後にＥ、ｃｏＨの細胞
を遠心分離によって集める。発現収率はＥ、ｃｏｌｉ　
　の全蛋白質に対して約３％のインヒビター蛋白質であ
る。

ｂ）インヒビター蛋白質ＡＬＰ　２３１　　を分離し、
再生（Ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）　Ｌ／、そして精製するた
めに上記の細胞の沈殿物（約２５ｇ）　　を５０　ｍＭ
　　のトリスＨＣＩ　（ｐｔ＋　７．５）、５　ｍＭ　
　のＥＤＴＡ及び５　ｍＭのＤＴＴの含まれている混合
物３５０　ｌｌｌ１中に懸濁させ、そして高圧ホモジナ
イザ中で２回砕解する。不溶性成分を分離するために４
℃で１５０００　　ｇにおいて２０　　分間遠心分離す
る。蛋白質ＡＬＰ　２３］　　の約８０−９０　＄が可
溶性部分（上澄液）中に存在している。酵素活性型への
再生を導入するためにその上澄液のＤＴＴ　　を２０　
ｍＭ　　に調節し、４℃において１時間インキュベーシ
ョンし、そして予め５０ｍＭ　　のトリス−）ＩＣＩ　
（ｐＨ７，５）、５　ｍＭのＥＤＴＡ及び２０　ｍＭ　
　のＤＴＴ　　を含む混合物で平衡化させておいた５０
　ｍｌ　　のベツド容積のＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ−Ｃ
２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ　Ｉｎｃ、社）の上でクロマトグラフ精製する。こ
のカラム充填材をカラム体積の３倍量の、　５０　ｍＭ
のトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、５　ｍＭのＥＤＴ
Ａ及び５ｍＭ　　のＤＴＴ　　の溶液で、次いでカラム
体積の２倍量の、５０＋ｎＭのトリス−ＨＣＩ（ｐｌ（
７，５）、１　ｍＭ　　のＥＤＴＡ、５　ｍＭのＤＴＴ
　　及び１３０　ｍＭ　　の溶液で洗浄し、そして次に
蛋白質ＡＬＰ２３１をカラム体積の２倍量の、５０ｍＭ
のトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、ｌ　ｍＭのＥＤＴ
Ａ　、　５　ｍＭのＤＴＴ及び３００　ｍＭのＮａ１ｌ
の含まれた混合物で溶離させる。このＡＬＰ　２３１　
　の溶液を３．５Ｍ　の塩酸グアニジニウム濃度に調節
して２２℃において１時間インキュベーションし、１０
０　ｍＭ　　のトリス−ＨＧＩ（ｐＨ９）　　の溶液で
１＝７に稀釈し、システィン濃度３　ｍＭに調節し、そ
して２２℃において６時間インキュベーションする。５
Ｐ−５ｅｐｈａｄｅｘ−Ｃ２５の上でもう一度クロマト
グラフ特製するためにこの反応混合物を５０　ｍＭ　　
のトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）で１４に稀釈し、Ｈ
Ｃｌでｐｕ　７．５に中和し、そして１０　ｍｌのカラ
ム充填材（５０１１１Ｍのトリス−ＨＣｌ、　（ｐｌ（
７，５）及び１２５　ｄのＮａ１ｌで平衡化させた〕の
上でクロマトグラフ精製する。カラム充填材をカラム体
積の５倍量の５０　［１１Ｍ　　のトリス−ＨＣｌ　（
ｐＨ７，５）及び１２５　ｍＭのＭａｉｌの溶液で洗浄
し、モしてカラム体積の２倍量の５０　ｍＭ　　のトリ
ス−ＨＣｌ（ｐｌ＋　７．５）　　及び５００　ｍＭの
Ｎａ１ｌを含む混合物によって溶離させる。その蛋白質
フラクションを〔場合により逆相１１ＰＬ（：　　（前
出）によって蹟密に精製した後で）　５０　ｍＭのトリ
ス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）に対して４℃において１夜
透析する。

ＡＬＰ　２３１の濃度の決定は二重のｒサンドイッチＥ
ＬＩＳ＾」により行なう（Ｋｒａｍｐｓ　　等：　”’
Ａｍ、　Ｒｅｖ。

Ｒｅ５ｐｉｒ、　Ｄｉｓ、”　１２９　（１９８４）　
９５９−９６３）。

別にＡＬＰ　２３１　　の定量（式（Ｉ）　　のその他
の各蛋白質も同様に）は例えば定量的アミノ酸分析によ
っても可能である。得られた式（Ｉ）　　の化合物ｒＡ
ＬＰ　２３１．の均質性及び同一性はＮ−末端側の配列
分析並びにアミノ酸組成の検出によって確認される。こ
の生成物のＨＬＥ　　及びキモトリプシンに対する阻害
活性及びこのものの高い酸化安定性は例えば第９−第１
２図から明らかである。

健旦 Ｃ−末端側のＡＬＰ−２３１ドメインを切断除去するた
めに例７ｂにおいて分離された、式（１）　　において
胃　がチロシンであり、Ｘ、、　Ｘ２、×３　及び２が
ロイシンであり、モしてＹ　がプロリンである、　１０
７　　個のアミノ酸の含まれた蛋白質を７０％濃度の蟻
酸中に溶解する。酸に対して不安定なアスパラギン酸−
プロリン間の結合の存在〔式（Ｉ）の第４９−５０　　
番位置参照〕によって室温において２４−３６　　時間
の反応時間の後にこのＣ−末端側のＡＬＰ−２３１−ド
メインの少なくとも２０％以上の切断除去がもたらされ
る。この完全ドメインはこの酸処理の後でＨＰＬＣによ
って分離し、特製することができる。そのアミノ酸配列
は全ＡＬＰ−２３１−蛋白質の第５０−１０７番位置の
それと同一である。

０ Ｐｒｏ−Ｖａｔ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−へｓｎ−Ｐ
ｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−へｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−ＧＪ
ｙ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｔｒｙ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−
Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｇ
ｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｌｙ
ｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−上にあげた各寄託された微生物を
総括する：

【図面の簡単な説明】

第１ａ−１ａ図は ＤＮＡ配列ＡＬＰ遺伝子２３０及びＡＬＰ遺伝子２４０
の合成に用いた１６個のオリゴヌクレオチドの配列を示
す。 第２ａ図は このアミノ酸配列で表わされる蛋白質ＡＬＰ　２３０の
ためにコードし、そして第３．４及び５図に示したＤＮ
Ａヌクレオチド配列のための「前駆体遺伝子」として用
いられるＡＬＰ−遺伝子２３０のＤＮＡ−ヌクレオチド
配列を示す。 第２ｂ図は このアミノ酸配列で表わされる蛋白質ＡＬＰ　２４０の
ためにコードし、そして第７及び８図に示したＤＮＡヌ
クレオチド配列のための「前駆体遺伝子」として用いら
れるＡＬＰ−遺伝子２４０のＤＮＡ−ヌクレオチド配列
を示す。 第３図は このアミノ酸配列で表わされる蛋白質ＡＬＰ　２３１の
ためにコードし、そして第６図に示したＤＮＡヌクレオ
チド配列を構築するために用いられるＡＬＰ−遺伝子２
３１のＤＮＡ−ヌクレオチド配列を示す。 第４図は このアミノ酸配列で表わされる蛋白質ＡＬＰ　２３２の
ためにコードするＡＬＰ−遺伝子２３２のＤＮＡ−ヌク
レオチド配列を示す。 第５図は このアミノ酸配列で表わされる蛋白質ＡＬＰ　２３６の
ためにコードするＡＬＰ−遺伝子２３６のＤＮＡ−ヌク
レオチド配列を示す。 第６図は このアミノ酸配列で表わされる蛋白質ＡＬＰ　２３７の
ためにコードするＡＬＰ−Ｊ伝子２３７のＤＮＡ−ヌク
レオチド配列を示す。 第７図は このアミノ酸配列で表わされる蛋白質ＡＬＰ　２４２の
ためにコードするＡＬＰ−遺伝子２４２のＤＮＡ−ヌク
レオチド配列を示す。 第８図は このアミノ酸配列で表わされる蛋白質ＡＬＰ　２４６の
ためにコードするＡＬＰ−遺伝子２４６のＤＮＡ−ヌク
レオチド配列を示す。 第９図は 真正ＡＬＰ　　によるＩＤＬＥ　　阻害効果及び式（１
）の化合物によるそれを示す。 第１０図は 真正ＡＬＰ　　によるキモトリプシン阻害効果及び式（
１）の化合物によるそれを示す。 第１１図は ３７℃においてクローラミンＴを１５分間作用させた後
の真正ＡＬＰ　　及び式（Ｉ）　　の種々の化合物の活
性の変化を示し、　０．２μｇのＩＩＬＥ　　について
３７℃において残存しているＨＬＥ　　阻害活性をあげ
る。 第１２図は 多形核白血球による真正ＡＬＰ　　と式（Ｉ）　　の種
々の化合物とのＨＬＥ　　阻害活性に対する酸化的影響
を示し、その際１回の試験について０．４μｇのＩＩＬ
Ｅ　　の活性を対照実験における　１００　！ｋＨＬＥ
活性（対照ａ）とする。対照すの値はＰＭＡによって刺
激されていない白血球の場合を超える相対的ＨＬＥ　　
活性を、そして対照ＣはＰＭＡにより刺激された白血球
の相対的ＨＬＥ　　活性を示す。作用物質を用いた試験
については失活されなかったインヒビターの存在のもと
（１）、刺激されていない白血球と共にインキュベーシ
ョンしたインヒビターの存在のもと（２）及びＰＭＡ　
　で刺激した白血球とともにインキュベーションしたイ
ンヒビターの存在のもと（３）にそれぞれ残存した相対
的１１ＬＥ　　活性を示す。 第１３図は プラスミドｐｔａｃＳＤＴ　（ＤＳＭ　５０１８）の配
列地図である。 第１４ａ図は プラスミドｐＡＬＰ　２３　　又はＡＬＰ遺伝子２３０
の合成方法を略解し、右上方にあげた各オリゴヌクレオ
チドがホスホリル化及びバイブリド化の後でＢａｍＨＴ
　　及び５ｐｅｌにより切断されてアルカリ性ホスファ
ターゼにより説ホスホリル化されたプラスミドｐｔａｃ
ＳＤＴ　　とともに結合されることを示し、得られた中
間生成物ｐＡＬＰ　２２　　は中でも黒く塗りつぶした
１８９　ｂｐのＢａｍＨＩ−５ｐｅｌ−ＤＮＡ断片を含
んでおり、これがＮｄｃＴ及びＢａｍＨＩで切断し、脱
ホスホリル化した後にその５°−末端側でホスホリル化
されて互いにバイブリド化されたオリゴヌクレオチドＤ
Ｉ＋　　ないしＤＩ３ａ　　と連結反応し、そのように
して得られたプラスミドｐＡＬＰ　２３　　がＡＬＰ遺
伝子２３０を含んでいることをボす。 第１４ｂ図は プラスミドｐＡＬＰ　２４　　又はＡＬＰ遺伝子２４０
の合成方法を略解し、右上方にあげた各オリゴヌクレオ
チドＤ２４　　ないしＤ２５　　が５°−末端側でホス
ホリル化され、互いにバイブリド化されて５ｔｕｌ　　
及び５ｐｅｌにより切断された脱ホスホリル化されたプ
ラスミドｐＡＬＰ　２３　　の断片とともに結合され、
得られた中間生成物ｐＡＬＰ　２４　　が黒く塗りつぶ
したＡＬＰ遺伝子２４０を含んでいることを示す。 第１５図は プラスミドｐＡＬＰ　２３１２　　配列地図を表わし、
これがＡＬＰ遺伝子２３１をｔａｃ−プロモータと第１
のシャインダルガルノ配列との後方に７個のヌクレオチ
ドの間隔をおいて有している。第１の遺伝子の両終止コ
ドンの後方に１６個のヌクレオチドの間隔で第２のシャ
インダルガルノ配列が後続し、これに再び７個のヌクレ
オチドの間隔をおいて第２の遺伝子が後続している。こ
の第２の遺伝子にはｔｅｔ、Ａ１０ｒｆＬターミネータ
が最後にその側面に並ぶ。

Claims (44)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記式（ I ） 【遺伝子配列があります】 （但しＷはチロシン又はグルタミン酸であり、Ｘ＿１及
   びＸ＿２は同一であっても異なっていてもよいがこれら
   の残基のおのおのはメチオニン又はロイシンであり、Ｘ
   ＿３はメチオニン、ロイシン又はフェニルアラニンであ
   り、Ｙはプロリン又はアルギニンを表わし、そしてＺは
   ＷがチロシンでＸ＿１、Ｘ＿２及びＸ＿３がロイシンで
   あるときはイソロイシンをも意味する）の新規なセリン
   プロテアーゼインヒビター蛋白質又はこのものの、少な
   くともその第５３−１０１番の配列を含む部分領域、及
   びこの新規なセリンプロテアーゼインヒビター蛋白質の
   種々の融合蛋白質。
2. （２）Ｗがチロシンである、式（ I ）の新規なセリン
   プロテアーゼインヒビター蛋白質又はこのものの、少な
   くともその第５３−１０１番の配列を含む部分領域。
3. （３）下記式（ I ａ） 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 （但しＸ＿１、Ｘ＿２、Ｙ及びＺは請求項１におけると
   同じ意味を有し、そしてＸ＿３′はメチオニン又はロイ
   シンを表わす）の、請求項１及び２記載の新規なセリン
   プロテアーゼインヒビター蛋白質又はこのものの、少な
   くともその第５３−１０１番の配列を含む部分領域、及
   びこの新規なセリンプロテアーゼインヒビター蛋白質の
   種々の融合蛋白質。
4. （４）式（ I ）又は（ I ａ）の種々の部分領域であっ
   て第５３−１０１番の種々の配列領域ないし第４８−１
   ０７番の種々の配列領域を包含する、請求項１ないし３
   に記載の新規なセリンプロテアーゼインヒビター蛋白質
   。
5. （５）式（ I ）又は（ I ａ）の第１−１０７番のアミ
   ノ酸位置、又は第４８−１０７、第４９−１０７又は第
   ５０−１０７番の部分配列を含む、請求項１ないし３に
   記載の新規なセリンプロテアーゼインヒビター蛋白質。
6. （６）下記式 【遺伝子配列があります】 （但しＷ、Ｘ＿１、Ｘ＿２、Ｘ＿３、Ｙ及びＺは請求項
   １におけると同じ意味を有する）の請求項１、４及び５
   記載の新規なセリンプロテアーゼインヒビター蛋白質。
7. （７）Ｘ＿１、Ｘ＿２、Ｘ＿３及びＺがロイシンである
   、請求項１ないし６に記載の新規なセリンプロテアーゼ
   インヒビター蛋白質。
8. （８）第３図にあげたアミノ酸配列を有する新規なセリ
   ンプロテアーゼインヒビター蛋白質。
9. （９）第４図にあげたアミノ酸配列を有する新規なセリ
   ンプロテアーゼインヒビター蛋白質。
10. （１０）第５図にあげたアミノ酸配列を有する新規なセ
    リンプロテアーゼインヒビター蛋白質。
11. （１１）第６図にあげたアミノ酸配列を有する新規なセ
    リンプロテアーゼインヒビター蛋白質。
12. （１２）第７図にあげたアミノ酸配列を有する新規なセ
    リンプロテアーゼインヒビター蛋白質。
13. （１３）第８図にあげたアミノ酸配列を有する新規なセ
    リンプロテアーゼインヒビター蛋白質。
14. （１４）下記式 【遺伝子配列があります】 のアミノ酸配列を有する新規なセリンプロテアーゼイン
    ヒビター蛋白質。
15. （１５）請求項１ないし１４記載の新規なセリンプロテ
    アーゼインヒビター蛋白質のためにコードすることを特
    徴とする、ＤＮＡ配列。
16. （１６）第２ａ又は２ｂ図或いは第３ないし８図にあげ
    たヌクレオチド配列を有する、請求項１５記載のＤＮＡ
    配列。
17. （１７）請求項１５又は１６記載のコーディングＤＮＡ
    配列を有することを特徴とする、組換えベクター。
18. （１８）プラスミドｐｔａｃＳＤＴ（ＤＳＭ５０１８）
    の誘導体である、請求項１７記載の組換えベクター。
19. （１９）プラスミドｐＡＬＰ２３及びｐＡＬｐ２４であ
    る、請求項１７及び１８記載の組換えベクター。
20. （２０）プラスミドｐＡＬＰ２３１、ｐＡＬＰ２３２、
    ｐＡＬＰ２３６、ｐＡＬＰ２３７、ｐＡＬＰ２４２及び
    ｐＡＬｐ２４６である、請求項１７及び１８記載の組換
    えベクター。
21. （２１）プラスミドｐＡＬＰ２３１、ｐＡＬＰ２３２及
    びｐＡＬＰ２４２である、請求項１７及び１８記載の組
    換えベクター。
22. （２２）請求項１５又は１６記載のコーディングＤＮＡ
    配列を２重に有している、請求項１７及び１８記載の組
    換えベクター。
23. （２３）両コーディングＤＮＡ配列（請求項１５又は１
    ６記載の）がそれぞれ５′末端側に約７個のヌクレオチ
    ドの間隔を置いて同一のシャインダルガルノ配列を有し
    ており、その際第一のコーディングＤＮＡ配列の両方の
    終止コドンの後に約１６個のヌクレオチドの間隔を置い
    て第二のシャインダルガルノ配列が続いており、これに
    約７個のヌクレオチドの間隔を置いて第二のコーディン
    グＤＮＡ配列が続いている、請求項２２記載の組換えベ
    クター。
24. （２４）プラスミドｐＡＬＰ２３０２、ｐＡＬＰ２３１
    ２、ｐＡＬＰ２３２２、ｐＡＬＰ２３６２、ｐＡＬＰ２
    ３７２、ｐＡＬＰ２４０２、ｐＡＬＰ２４２２及びｐＡ
    ＬＰ２４６２である、請求項１７、１８、２２又は２３
    記載の組換えベクター。
25. （２５）プラスミドｐＡＬＰ２３０２、ｐＡＬＰ２３１
    ２、ｐＡＬＰ２３２２、ｐＡＬＰ２４０２及びｐＡＬＰ
    ２４２２である、請求項１７、１８及び２２ないし２４
    記載の組換えベクター。
26. （２６）第１５図に示すプラスミドｐＡＬＰ２３１２で
    ある、請求項１７、１８及び２２ないし２５記載の組換
    えベクター。
27. （２７）請求項１６ないし２６記載の組換えベクターで
    形質転換された宿主生物体。
28. （２８）バクテリア、中でもＥ．ｃｏｌｉ又はＢ．ｓｕ
    ｂ−ｔｉｌｉｓの種の一つの株、顕微鏡的微小菌類の一
    つ、中でもＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ、Ａｓ
    ｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ又はＳａｃｃｈａｒｏｍ
    ｙｃｅｓｓｅｒｅｖｉｓｉａｅの種のそれ、又は動物や
    ひとの細胞である、請求項２７記載の宿主生物体。
29. （２９）Ｅ．ｃｏｌｉの一つの株、中でも亜族Ｋ１２の
    それである、請求項２７及び２８記載の宿主生物体。
30. （３０）Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ＪＭ１０１（ＡＴＣＣ３３
    ８７６）、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ＪＭ１０３（ＡＴＣＣ３
    ９４０３）、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ＪＭ１０５（ＤＳＭ４
    １６２）及びＥ．ｃｏｌｉＫ１２ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３
    ８４９）よりなる群から選ばれる、請求項２７ないし２
    ９記載の宿主生物体。
31. （３１）請求項１５及び１６記載の新規なＤＮＡ配列を
    合成するにあたり、プラスミドｐｔａｃＳＤＴ（ＤＳＭ
    ５０１８）より出発して公知の方法により、第１ｂ図に
    従うオリゴヌクレオチドＤ２１ないしＤ２３ａを用い、
    そしてもう一つの段階において第１ａ図にあげたオリゴ
    ヌクレオチドＤ１１ないしＤ１３ａを用いて第２図にあ
    げるＤＮＡ配列の含まれているプラスミドｐＡＬＰ２３
    を構築し、このものを場合により第１ｃ図に示すオリゴ
    ヌクレオチドＤ２４ないしＤ２５ａを一緒に用いて第２
    ｂ図に示すＤＮＡ配列の含まれているプラスミドｐＡＬ
    Ｐ２４を構築するために使用し、次いで場合によりその
    ようにして得られたプラスミドｐＡＬＰ２３又はｐＡＬ
    Ｐ２４の中に次のようなオリゴヌクレオチド類、すなわ
    ちその得られるプラスミド類が、式（ I ）においてＸ
    ＿３がメチオニンかロイシンであってＷ、Ｘ＿１、Ｘ＿
    ２、Ｙ及びＺが前述と同じ意味を有する蛋白質のために
    コードするＤＮＡ配列を含んでいるようなオリゴヌクレ
    オチド類をそれぞれ対としてクローンし、そしてこれら
    を場合により更に別な種々のオリゴヌクレオチドによっ
    てこれらが、式（ I ）においてＸ＿３がフェニルアラ
    ニンであってＷ、Ｘ＿１、Ｘ＿２、Ｙ及びＺが前記と同
    じ意味を有する蛋白質のためにコードするＤＮＡ配列を
    有するように修飾することを特徴とする、上記合成方法
    。
32. （３２）下記式の各オリゴヌクレオチドＭ１とＭ２、Ｍ
    ３とＭ４又はＭ５とＭ６をそれぞれ対としてプラスミド
    ｐＡＬＰ２３又はプラスミドｐＡＬＰ２４の中にクロー
    ンし、そのようにして式（ I ）においてＸ＿３がメチ
    オニン又はロイシンであってＷ、Ｘ＿１、Ｘ＿２、Ｙ及
    びＺが前記と同じ意味を有する各化合物のためにコード
    する各ＤＮＡ配列を作り出す、請求項３１記載の方法。 ３′−ＧＣＣＣＡＡＧＴＣＧＴＣＧＴＣＣＧＴＧＡＣＴ
    ＧＧＣＡＴＣＣＡＴＴＧ−５′（Ｍ１） ３−ＧＡＴＧＣＣＡＧＴＣＡＣＧＧＡＣＧＡＣＧＡＣＴ
    ＴＧＧＧＣ−５′（Ｍ２） ３−ＧＣＣＣＡＡＧＴＣＧＴＣＣＴＡＣＧＴＧＡＣＴＧ
    ＧＣＡＴＣＣＡＴＴＧ−５′（Ｍ３） ３′−ＧＡＴＧＣＣＡＧＴＡＡＣＧＴＡＧＧＡＣＧＡＣ
    ＴＴＧＧＧＣ−５′（Ｍ４） ３′−ＧＣＣＣＡＡＧＴＣＧＴＣＧＴＣＣＧＴＧＡＣＴ
    ＧＧＡＡＧＣＣＡＴＴＧ−５′（Ｍ５） ３′−ＧＣＴＴＣＣＡＧＴＣＡＣＧＧＡＣＧＡＣＧＡＣ
    ＴＴＧＧＧＣ−５′（Ｍ６）
33. （３３）式（ I ）においてＸ＿３がフェニルアラニン
    であるようなセリンプロテアーゼインヒビター蛋白質の
    ためにコードするＤＮＡ配列を合成するために、請求項
    ３２によって得られたＤＮＡ配列の中に式（ I ）の第
    ９６番位置にフェニルアラニンの発現をもたらすような
    オリゴヌクレオチドをクローンする、請求項３１及び３
    ２記載の方法。
34. （３４）式（ I ）においてＸ＿１及びＸ＿２がロイシ
    ンであり、Ｘ＿３がフェニルアラニンであってＷ、Ｙ及
    びＺが前述と同じ意味を有するような化合物のためにコ
    ードするＤＮＡ配列を作るために、プラスミドｐＡＬＰ
    ２３の中に前記Ｍ１とＭ２、Ｍ３とＭ４又はＭ５とＭ６
    のオリゴヌクレオチドをそれぞれ対としてクローンし、
    得られたプラスミドを制限エンドヌクレアーゼＳａｃ
    I 及びＳｐｅ I によって切断し、次いで通常の方法で
    脱ホスホリル化し、そしてそのようにして得られた断片
    の中にその（ホスホリル化された）下記式 ３′−ＡＧＡＡＣＧＣＡＡＴＣＧＧＧＣＣＡＡＴＴＣＣ
    ＧＡＡＣＴＡＴＣＣＴＡＧＴＴＧＡＴＣ−５′（Ｅ１） ３′−ＴＣＧＡＧＣＴＡＣＣＧＧＴＣＡＣＧＴＴＴＧＣ
    ＴＣＴＡＧＡＣＴＴＴＡＣＧＡＣＧＧＡＣＣＡＡＡＧＡ
    ＣＧＣＣＡＴＴＴ−５′（Ｅ２） 及び ３′−ＡＡＣＴＡＧＧＡＴＡＧＴＴＣＧＧＡＡＴＴＧＧ
    ＣＣＣＧＡＴＴＧＣＧＴＴＣＴＡＡＡＴＧＧＣＧＴＣＴ
    ＴＴＧＧＧＴＣＣＧＴＣＧＴＡＡＡＧＴＣＴＡＧＡＧＣ
    ＡＡＡＣＧＴＧＡＣＣＧＧＴＡＧＣ−５′ の式の各オリゴヌクレオチドＥ１、Ｅ２及びＥ３のハイ
    ブリダイゼーション生成物を連結反応させる、請求項３
    １ないし３３記載の方法。
35. （３５）セリンプロテアーゼインヒビター蛋白質ＡＬＰ
    ２３７のためにコードする新規な、第６図にあげたＤＮ
    Ａ配列を合成するに当り、プラスミドｐＡＬＰ２３中に
    オリゴヌクレオチドＭ１及びＭ２をクローンすることに
    よって得られたプラスミドｐＡＬＰ２３１を制限エンド
    ヌクレアーゼＳａｃ I 及びＳｐｅ I によって切断し、
    次いで通常のように脱ホスホリル化し、そしてそのよう
    にして得られた断片ｐＡＬＰ２３１／Ｓａｃ I ×Ｓｐ
    ｅ I の中に前記（ホスホリル化された）オリゴヌクレ
    オチドＥ１、Ｅ２及びＥ３のハイブリダイゼーション生
    成物を連結反応させることを特徴とする、合成方法。
36. （３６）式（ I ）又は（ I ａ）の化合物を発現させる
    ための組換えベクターを製造するに当り、請求項３１な
    いし３５によって得られたＤＮＡ配列を、これが或る発
    現制御配列、好ましくはｔａｃ−プロモータで開始され
    て或るターミネータ配列によって終止する発現制御配列
    と機能的に結合されてしまうようにベクター分子中に挿
    入することを特徴とする、製造方法。
37. （３７）式（ I ）又は（ I ａ）の化合物を発現させる
    ための組換えベクターを製造するに当り、請求項３６に
    より得られた発現ベクターを公知の方法で制限エンドヌ
    クレアーゼの種々異なった対を含む部分量に切断し、得
    られた断片を場合により脱ホスホリル化し、そして次に
    、式（ I ）又は（ I ａ）の化合物のためにコードする
    ＤＮＡ配列をｔａｃ−プロモータの後方に二重に、２個
    の終止コドンによって分離されて、約１６個のヌクレオ
    チドを含む１つの配列及び１個のシャインダルガルノ配
    列及び約７個のヌクレオチドを含むもう１つの配列を有
    している発現ベクターに導くような各断片を連結反応さ
    せることを特徴とする、製造方法。
38. （３８）式（ I ）又は（ I ａ）の化合物の発現のため
    の組換えベクターを製造するための請求項３７記載の方
    法において、請求項３６により得られた発現ベクターの
    一つの部分量を制限エンドヌクレアーゼＰｓｔ I 及び
    Ｓｐｅ I によって、そしてこのベクターのもう一つの
    部分量を制限エンドヌクレアーゼＰｓｔ I 及びＸｂａ
    I によって切断し、そしてその際得られた、式（ I ）
    又は（ I ａ）の化合物のためにコードするＤＮＡ配列
    の含まれている各断片を場合により脱ホスホリル化の後
    に連結反応させることを特徴とする方法。
39. （３９）請求項１ないし１４記載の新規なセリンプロテ
    アーゼインヒビター蛋白質を製造するに当り、請求項２
    ７ないし３０のいずれかに従う宿主生物体を通常の培地
    の中で培養し、場合によりその所望の蛋白質の発現を誘
    導し、そして次にその培養物から発現生成物を分離し、
    還元剤の作用及び引き続く酸化剤の作用による再生過程
    にかけ、そして引き続いてその得られた式（ I ）の生
    物学的に活性なセリンプロテアーゼインヒビター蛋白質
    を公知の方法により分離し、精製することを特徴とする
    、製造方法。
40. （４０）式（ I ）又は（ I ａ）に従うアミノ酸配列の
    部分領域を包含する請求項１ないし７及び１４に記載さ
    れた新規なセリンプロテアーゼインヒビター蛋白質を製
    造するに当り、請求項３９に従い操作する際に生じた発
    現生成物を培養物から分離し、そして次にこれをその第
    ４９−５０番の位置においてそのアスパラギン酸−プロ
    リン間の結合を切断するように制御された酸性加水分解
    にかけるか、又は第１０７−１０２番の１ないし５個だ
    けのアミノ酸か又は全てのアミノ酸の制御された酵素分
    解にかけ、そしてそのようにして得られた加水分解生成
    物をその加水分解反応物から回収することを特徴とする
    、製造方法。
41. （４１）式（ I ）又は（ I ａ）においてＸ＿１及びＸ
    ＿２がロイシンであり、そしてＸ＿３がロイシン又はフ
    ェニルアラニンであるアミノ酸配列の少なくとも第５３
    −１０１番のアミノ酸位置の部分領域を包含する請求項
    １ないし５記載の新規なセリンプロテアーゼインヒビタ
    ー蛋白質を製造するに当り、そのインヒビター蛋白質の
    ためにコードするＤＮＡ配列に５′末端側でコドンＡＴ
    Ｇを結合させ、そして次いでその発現に際して形成され
    る、その作り出そうとする蛋白質のＮ−末端の前に追加
    的なアミノ酸メチオニンを有する生成物において通常の
    方法で、好ましくはブロムシアンによって、メチオニン
    とその所望のインヒビター蛋白質の第１の（Ｎ−末端側
    の）アミノ酸との間の結合を切断することを特徴とする
    、製造方法。
42. （４２）請求項１ないし１４記載の新規なセリンプロテ
    アーゼインヒビター蛋白質と、及び通常の担体物質及び
    ／又は稀釈剤及び／又は助剤物質とを含有することを特
    徴とする、医薬。
43. （４３）凝血障害、腫瘍の浸潤性増殖、肺気腫、関節炎
    、腎炎及び中でも多外傷性又は敗血性のショックや膵炎
    及び他の、セリンプロテアーゼとセリンプロテアーゼイ
    ンヒビターとの間の平衡の乱れを伴う種々の病型におけ
    る過剰の炎症を処置し、及び／又は予防するための医薬
    を製造するために請求項１ないし１４のいずれかに記載
    のセリンプロテアーゼインヒビター蛋白質を使用する方
    法。
44. （４４）凝血障害、腫瘍の浸潤性増殖、肺気腫、関節炎
    、腎炎及び中でも多外傷性又は敗血性のショックや膵炎
    及び他の、セリンプロテアーゼとセリンプロテアーゼイ
    ンヒビターとの間の平衡の乱れを伴う種々の病型におけ
    る過剰の炎症を処置するために請求項１ないし１４のい
    ずれかに記載のセリンプロテアーゼインヒビター蛋白質
    を使用する方法。