JPH03123637A - リポソーム形成剤及びリポソーム組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なリボソーム形成剤及びリボソーム組成物
に関し、更に詳しくは、微細で安定なリボソームを形成
する新規リボソーム形成剤及び容易にこれを形成するこ
とができる新規なリボソーム組成物に関する。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕脂質二
重膜の一重あるいは多重の球殻からなるリボソームは、
薬効成分のキャリアーとして注目されている。リボソー
ムを薬物担体として用い、静脈注射等により生体への投
与を目的とするとき、リボソームの粒径は小さい方が望
ましいことが多い。リボソーム形成剤としては天然リン
脂質がよく知られているが、通常、天然リン脂質を水に
投入しただけでは粒径の大きな（直径１〜５μｍ）多重
膜リボソームを形成し、均一で粒径が小さく安定なリボ
ソーム分散液を得ることはできない。

従来知られている粒径の小さなリボソームの製造法とし
ては、超音波処理による方法、界面活性剤との混合系か
ら透析などにより界面活性剤を除去する方法、脂質のエ
タノール溶液を水中に注入する方法、逆ミセル法などが
ある。これらの方法は、例えば、エル・ニス・ラオ（Ｌ
、　Ｓ、　Ｒａｏ）　ｒ　！Ｊボソーム・テクノロジー
（ｌｉｐｏｓｏｍｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　Ｊ　、ジ
ー・ダレボリアディス（Ｇ。

Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ）ｍ、　ＣＲＣＰｒｅｓｓ　１
Ｆｌｏｒｉｄａ　。

（１９８４）、第１巻、１８章、２４７−２５７にまと
められている。しかし、超音波照射法、界面活性剤除去
法及び逆ミセル法による小さなリボソームの製造法は、
実験室レベルでの調製法にすぎず、工業的大量生産には
適さない。また、脂質のエタノール溶液を水中に注入す
る方法では、低濃度のリボソームしか得られないと共に
、長期間保存しておくと元の大きな多重膜リボソームに
戻ってしまうなどの問題があった。

かかる問題点を解決するための種々の研究がなサレ、例
エバ、ニンハム（Ｎｉｎｈａｍ）及びエバンス（Ｂｖｉ
ｎｓ）　、（ファラデー・ディスカス・ケミカル０ソサ
イエティ−（Ｆａｒａｄａｙ　Ｄｉｓｃｕｓｓ　Ｃｈｅ
ｍ、　Ｓａｃ、）、８１　：　１　（１９８６））には
、水酸イオンあるいは酢酸イオンを対イオンとして有す
るジドデシルジメチルアンモニウムカチオンが、半径線
３０ｒｉｍの小さなリボソームを形成することが報告さ
れている。

しかし、この方法では小さなリボソームを形成するため
に必要なリボソーム形成剤の濃度が狭い範囲に限られて
いる。しかも、リボソーム形成物質がカチオン性界面活
性剤であるので、生体への投与には適さないものであっ
た。

従って、粒径が小さく、安定で、しかも人体に対して安
全なリボソームを工業的有利に大量生産する方法が望ま
れていた。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、このような状況におい−Ｃ鋭意検討を重
ねた結果、特定のリン脂質と多価アルコールとの反応混
合物を使用することにより水に分散させただけで粒径が
小さく、しかも安定なリボソームを形成するリボソーム
形成剤を得ることに成功し、本発明を完成したものであ
る。

すなわち、本発明は、 （ａ）　　ホスホリパーゼＤの存在下、次の一般式％式
％（） ） 〔式（Ｉ＞及び（Ｉ［）中、Ｒ’及びＲ２はそれぞれ、
同−又は異なって一０ＣＯＩｔ３及び／又は−ＯＲ’よ
り選ばれる基（但し、Ｒ３及びＲ４は同−又は異なって
、それぞれ炭素数６〜３２のアルキル又はアルケニル基
を表す）を示すか、又はＲ’とＲ２が一緒になって次の
基 （ここで、ｎは１１〜１９の整数を表す）を形成しても
よく、Ｘは水酸基含有塩基の水酸基１個を除いた後に残
る有機残基を示し、Ｍは水素原子、アルカリ金属、アル
カリ土類金属、アンモニウム、アルキルアンモニウム又
はアルカノールアンモニウムを示す〕 で表されるグリ七ロリン脂質と下記（１）〜（３）（１
）　　）１０−（Ｙ−０）−ｒ−Ｈ［ここでｍは２〜５
０の整数、Ｙは炭素数２〜４のアルキレン基もしくは置
換アルキレン基を示す〕で表わされるモノ又はポリエー
テル （２）縮合度２〜５０のポリグリセリン（３）分子内に
一級アルコール基２個以上を有する炭素数４〜７の単糖
類、三糖類又は糖アルコール類 のいずれかの多価アルコールとを反応させて得られるリ
ン酸エステル混合物と、 （ｂ）　　水溶性塩及び／又は界面活性剤とからなるリ
ボソーム形成剤、及びこれら形成剤を用いて形成するリ
ボソーム内に有効活性成分を包含するリボソーム組成物
を提供するものである。

本発明リボソーム形成剤に用いられるリン酸エステル混
合物（以下、リン酸エステル混合物）（ａ）は、式（Ｉ
）及び／又は（ｎ）のグリ七ロリン脂質と（１）〜（３
）から選ばれる多価アルコールとを反応させて得られる
ものであるが、式（Ｉ）、（ｎ）中、Ｒ３、Ｒ４で示さ
れるアルキル基又はアルケニル基としては、例えば、ヘ
キシル、オクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル、
ヘキサデシル、オクタデシル、エイコシル、トコシル、
テトラデシル、ヘキサデシル、オフタコシル、トリアコ
ンチル、トドリアコンチル、２−エチルヘキシル、オク
タジェニル、デカジェニル、ドデカジェニル、テトラデ
カジェニル、ヘキサデカジェニル、オクタデカジェニル
、エイコサジェニル、ドコサジェニル、テトラコサジェ
ニル、ヘキサコサジェニル、オクタコサジェニル、トリ
アコンタジェニル、ドトリアコンタジェニル、ヘキサコ
サジェニル、オフタデ力トリエニル、エイコサジェニル
、ドコサジェニル、テトラコサジェニル、ヘキサコサジ
ェニル、オクタコサジェニル、トリアコンタジェニル、
ドトリアコンタジェニル、エイコサテトラエニル、ドコ
サテトラエニル、テトラコサテトラエニル、ヘキサコサ
テトラエニル、オクタコサテトラエニル、トリアコンタ
テトラエニル、ドトリアコンタテトラエニル、ドコサテ
トラエニル、テトラコサテトラエニル、ヘキサコサテト
ラエニル、オクタコサテトラエニル、トリアコンタテト
ラエニル、ドトリアコンタテトラエニル、ドコサテトラ
エニル、テトラコサへキサエニル、ヘキサコサへキサエ
ニル、オクタコサへキサエニル、トリアコンタテトラエ
ニル、ドトリアコンタへキサエニル等が挙げられる。

また水素原子、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アン
モニウム、アルキルアンモニウム又ハアルカノールアン
モニウムであるＭとしては、例えば、カリウム、リチウ
ム、ナトリウム、ベリリウム、マグネシウム、カルシウ
ム、ストロンチウム、バリウム、アンモニウム、トリエ
タノールアンモニウム、トリメチルアンモニウム、トリ
エチルアンモニウム等が挙げられる。

一方、（１）に記載の化合物に於いてＹは置換基を有し
てもよい炭素数２〜４のアルキレン基で、例えばエチレ
ン、プロピレン、ブチレン、１−メチルプロピレン等が
挙げられ、ｍは２〜５０の整数であるが、４〜５０、特
に４〜２０が好ましい。

特に好ましいものとしては、例えば、平均分子量４００
のポリエチレングリコール（以下ＰＢ６４００と記す）
、平均分子量６００のポリエチレングリコール（以下Ｐ
Ｂ６６００と記す）、平均分子量２００のポリプロピレ
ングリコール（以下ＰＰＧ２００と記す）等が挙げられ
る。（２）のポリグリセリンの縮合度は２〜５０である
が、４〜５０特に４〜２０が好ましい。特に好ましいポ
リグリセリンとしては例えば、平均分子量５００のポリ
グリセリン（ＰＧ５００と記す）、平均分子量７５０の
ポリグリセリン（ＰＧ７５０と記す）等が挙げられる。

また、（３）に記載の分子内に一級アルコール基２個以
上を有する、炭素数４〜７の多価アルコール類のうち、
単糖類としては、例えばキシルロース、リブロース、フ
ラクトース、ソルボース、プシコース、タガトース、セ
ドヘプツロース、グルコヘプツロース、マンノヘプツロ
ース等を例示でき、また、二糖類としてはスクロース、
マルトース、セロビオース、トレハロース、ラクトース
等が例示でき、また、糖アルコールとしては、例えばエ
リスリトール、リビトール、アラビトール、キシリトー
ル、ソルビトール、マンニトール、ガラクチトール、セ
ドヘプツロース、ベルセイトール等が例示できる。

特に好ましいリン酸エステル混合物（ａ）としては、Ｒ
１及びＲ２が、例えば、ラウロイル、ミリストイル、バ
ルミトイル、ステアロイル、オレオイル、リルオイル、
リルノイル、アラキトノイル、ドコサヘキサノイル、エ
イコサペンタノイル等の組み合わせからなるか、又は、
前記式（Ｉ＞中、Ｒ１゜Ｒ２の組成が、例えば、卵黄組
成又は大豆組成等、天然リン脂質由来の分布を持つホス
ファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、
ホスファチジルセリン及びその塩等と、多価アルコール
として、平均分子量４００のポリエチレングリコール、
平均分子量６００のポリエチレングリコール、平均分子
量２００のポリプロピレングリコール、平均分子量５０
０のポリグリセリン、平均分子量７５０のポリグリセリ
ンやフルクトース、サッカロース、セロビオース、ラク
トース、マルトース、リブロース、フラクトース、ソル
ボース、スクロース、エリスリトール、リビトール、ア
ラビトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトー
ル、ガラクチトール等とをホスファチジル基転移活性を
有するホスホリパーゼＤの存在下、反応させて得られる
生成物等が挙げられる。

ここで示されたリボソーム形成剤を得るためのホスファ
チジル基転移活性を有するホスホリパーゼＤについては
、転移活性を有するものであれば特に限定されず、例え
ば、日本生化学全編、「続生化学実験講座、（東京化学
同人）、第３巻、２３５　（１９８６）Ｊや特開昭６０
−４１４９４号等に記載されているホスホリパーゼＤが
用いられる。

反応に用いられる溶媒としては、エーテル、ベンゼン、
クロロホルム等の有機溶媒と適当な水性溶媒との混合溶
媒を例示することができる。水性溶媒にはホスホリパー
ゼＤの作用を促進したり、酵素の安定化に役立つ適当な
添加剤を加えることができる。例えば、アルブミン、カ
ゼイン等の蛋白質や、酢酸、クエン酸、リン酸等の緩衝
剤、塩化カルシウムその他の中性塩を挙げることができ
る。

反応モル比、ホスホリパーゼＤの使用量、溶媒の使用量
等は、適宜に選択できる。例えば、反応モル比としては
、原料リン脂質１モルに対して通常、多価アルコール約
０．１〜１００倍モルを用いることが好ましい。ホスホ
リパーゼＤの使用量け、原料リン脂質１ｇ当り約１０〜
１０００００単位、好ましくは約１００〜１０００単位
を例示することができる。さらに、溶媒の使用量として
は、原料リン脂質に対して約２〜１００倍程度を例示で
きる。

反応温度、反応時間も適宜に選択できるが、好ましくは
、約２０〜６０℃、約１〜７２時間を例示できる。

本反応においては、前記多価アルコールの一級アルコー
ル基部分に対して、ホスホリパーゼＤによるホスファチ
ジル基の転移が生起する。従って、本反応によって得ら
れたリン酸エステル混合物（ａ）には、次の一般式（１
）で表わされるシリン酸エステル及び一般式（ＴＶ）で
表わされるモノリン酸エステルの両者が含有されている
。

ＯＭ　　　　　ＯＭ １ Ａ−０−Ｐ−０−Ｂ−ＯＨ（ＩＶ　’）０Ｍ 〔式中、Ａは下記（ｉ）及び／又は（ｉｉ　）の基を示
し、 Ｃ１１，−Ｒ，ＣＩ（２−Ｒ。

Ｃ）Ｉ−Ｒ２ＣＨ− ＣＩ＋２−　　　　　　　　　ＣＨ２−Ｒ２（ｉ　）　
　　　　　　　　（ｉｉ　）（ここで、Ｒ，及びＲ２は
前記と同じ意味を有する）Ｂは多価アルコール（１）〜
（３）より２個の水酸基を除いた基を示し、Ｍは前記と
同じ意味を有する〕また、本発明に用いられるリン酸エ
ステル混合物（ａ）においては、前記シリン酸エステル
（ＩＩＩ）とモノリン酸エステル（■）との比は、重量
比で１：９９〜９９：１が好ましい。

本発明において用いるリン酸エステル混合物（ａ）は、
上記反応が終了後何ら精製することなく、例えば反応液
を直接、もしくは濃縮乾固して用いることができるが、
反応液の濃縮乾固物が好ましい。

本発明の目的のための水溶性塩としては、室温において
１０−’Ｍ以上水に溶解する無機塩又は有機塩が好まし
い。無機塩としては、例えば、対イオンとしてアルカリ
金属、アンモニウムイオン等を有する、塩酸、硝酸、硫
酸、リン酸、炭酸、臭素酸、ヨウ酸等の塩、好ましくは
、臭化カリウム、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム
、リン酸水素二カリウム、硫酸カリウム、ヨウ化カリウ
ム、硝酸カリウム、臭化リチウム、塩化リチウム、ヨウ
化リチウム、硝酸リチウム、硫酸リチウム、臭化アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、炭酸アンモニウム、炭酸水
素アンモニウム、リン酸二水素アンモニＬＡ、リン酸７
１ニアンモニウム、ヨウ化アンモニウム、硝酸アンモニ
ウム、硫酸アンモニウム、臭化ナトリウム、炭酸ナトリ
ウム、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸二
水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、硝酸ナトリ
ウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム等が挙げられ
る。有機塩としては、例えば、アルカノールアミンの塩
酸、硫酸、リン酸等の塩、又は、対イオンとしてアルカ
リ金属イオン、アンモニウムイオン等を有する、安息香
酸、酢酸、サリチル酸、シュウ酸、フタル酸、グルコン
酸、１−ナフタレンスルホン酸、２−ナフタレンスルホ
ン酸、酒石酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマ
ル酸、プロピオン酸、アスコルビン酸、マンデル酸、リ
ンゴ酸、クエン酸等の塩、好ましくは、塩化トリエタノ
ールアンモニウム、リン酸二水素トリエタノールアンモ
ニウム、硫酸トリエタノールアンモニウム、安息香酸ナ
トリ、ウム、安息香酸カリウム、安息香酸アンモニウム
、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、
サリチル酸ナトリウム、サリチル酸カリウム、サリチル
酸アンモニウム、シュウ酸カリウム、シュウ酸ナトリウ
ム、シュウ酸アンモニウム、フタル酸ナトリウム、フタ
ル酸カリウム、フタル酸アンモニウム、クルコン酸カリ
ウム、グルコン酸アンモニウム、グルコン酸ナトリウム
、１−ナフタレンスルホン酸アンモニウム、２−ナフタ
レンスルホン酸カリウム、２−ナフタレンスルホン酸ア
ンモニウム、２−ナフタレンスルホン酸ナトリウム、酒
石酸カリウム、マレイン酸ナトリウム、マレイン酸カリ
ウム、マロン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、フマ
ル酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、プロピオン
酸トリエタノールアンモニウム、アスコルビン酸ナトリ
ウム、アスコルビン酸トリエタノールアンモニウム、ア
スコルビン酸カリウム、マンデル酸ナトリウム、リンゴ
酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム
、クエン酸トリエタノニルアンモニウム等が挙げられる
。より好ましい塩としては、塩化ナトリウム、硫酸ナト
リウム、炭酸水素ナトリウム、塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、酢酸ナトリウム等が挙げられる。

リン酸エステル混合物（ａ）によるリボソーム形成はこ
れらの水溶性塩を溶解した水中において形成され得るが
、この時の水溶性塩濃度としては１０−４〜ＬＭ、なか
でも１０−３〜０．１Ｍ濃度で行うのが特に好ましい。

本発明に界面活性剤を用いる場合、界面活性剤としては
、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、非イ
オン性界面活性剤及び両性界面活性剤のいずれでもよく
、その種類及び配合量は、なんら限定されるべきもので
はないが、好ましくは界面活性剤釦）とリン酸エステル
混合物（ａ）とを（（ａ）に含まれるリン原子のモル数
）／（（ｂ）のモル数）が１０−’〜１０３、特に０．
１〜１００程度となるように加えるのが好ましい。

アニオン性界面活性剤としては、例えば、アルキル硫酸
塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、ステアリン酸塩、
パルミチン酸塩、ミリスチン酸塩、オレイン酸塩、ヘキ
サデカジエン酸塩、ヘキサデカジエン酸塩、ヘキサデカ
テトラエン酸塩、リノール酸塩等のオクタデカジエン酸
塩、リルン酸塩等のオクタデカトリエン酸塩、アラキド
ン酸塩等のエイコサテトラエン酸塩、エイコサペンタエ
ン酸塩、ドコサヘキサエン酸塩、アルキルリン酸塩、ポ
リオキシエチレンアルキルエーテルリン酸塩、ポリオキ
シエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ジアルキルリン酸
塩等、好ましくは、ジセチルリン酸ナトリウム、ジセチ
ルリン酸トリエタノールアンモニウム、２−デシルテト
ラデシルリン酸ナトリウム等が挙げられる。

カチオン性界面活性剤としては、例えば、モノアルキル
トリメチルアンモニウム塩やジアルキルジメチルアンモ
ニウム塩等、好ましくは、七チルトリメチルアンモニウ
ムブロマイドやジステアリルジメチルアンモニウムクロ
ライド等が挙げられる。

非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエ
チレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキル
フェニルエーテル、グリセリンアルキルエーテル、ソル
ビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビクン
脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪
酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリ
ン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル
、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエ
チレンアルキルアミン、フラクトース又はグルコース等
の脂肪酸エステル等が挙げられ、好ましくは、９−メチ
ルヘプタデシルグリセリルエーテル、ソルビタンモノス
テアレート、オレイン酸グリセロールエステル、蔗糖脂
肪酸エステル等が挙げられる。また、コレステロール等
非常に疎水性の高い化合物も非イオン性界面活性剤に含
めて考えることができる。

両性界面活性剤としては、例えば、アルキルベタイン、
ホスホベタイン、スルホベタイン、天然及び合成のホス
ファチジルコリンやホスファチジルエタノールアミン等
、好ましくは、ステアリルホスホベタイン、ジパルミト
イルホスファチジルコリン等が挙げられる。

本発明において、リン酸エステル混合物（ａ）並びに水
溶性の塩及び／又は界面活性剤（ｂ）を分散させるべき
水は、リン酸エステル混合物（ａ）に対し、好ましくは
１０〜１０４重量倍程度、より好ましくは２０〜１０３
重量倍程度となるよう使用するのが適している。

本発明における小さなリボソームの形成方法は、リン酸
エステル混合物（ａ）並びに水溶性の塩及び／又は界面
活性剤ら）を適当量の水中に投入し、緩やかに攪拌する
ことによる。リボソーム調製時の温度は室温でよいが、
一般に、４０〜８０℃で行った方が効率はよい。また、
リン酸エステル混合物（ａ）並びに水溶性の塩及び／又
は界面活性剤ら）の水中への投入操作において、その投
入方法及び投入順序は制限されない。例えば、水溶性の
塩及び／又は界面活性剤をあらかじめリン酸エステル混
合物（ａ）と混合しておいてもよいし、まず塩水溶液及
び／又は界面活性剤（ｂ）の分散液をつくり、後からリ
ン酸エステル混合物（ａ）を投入してもよい。

従来の方法により形成されたリボソームの平均直径は、
普通１〜５μｍであるが、本発明のリボソーム形成剤を
用いると、平均直径５００ｎｍ以下の小さなリボソーム
をつくることが可能である。

本発明において、リン酸エステル混合物（ａ）と水溶性
塩及び／又は界面活性剤（ｂ）とを、上記の方法で含有
せしめれば、水溶液中で安定な小粒径リボソームを形成
できるリボソーム組成物を提供することができる。

本発明においてリボソーム中に含有する活性成分は、疎
水性物質でも親水性物質でもよく、または両者の混合物
でもよい。

このような活性成分としては、例えば、ビタミンＡＳＢ
＋　、Ｂ２、Ｂｅ　、Ｂ１２、Ｃ１Ｄ、Ｅ、Ｈ。

Ｋ、ＭＳＱ、パントテニールアルコール、バンドテン酸
カルシウム、ニコチン酸ベンジル、ヘスベリジン、ヘス
ベリチン等のビタミン類とその誘導体、グリセリン、ニ
トログリセリン、ジグリセリド、トリグリセリド等のポ
リオール類とその誘導体、グルコース、フルクトース、
ソルビトール、ガラクトース、マンノース、イノシトー
ル、マルチトール、マルトース、ラクトース、スクロー
ス、トレハロース、セロビオース、アデニルチオメチル
ペントース等の糖類とその誘導体、ヒアルロン酸、コン
ドロイチン硫酸等の多糖類とその誘導体、グルコース−
１−リン酸、グルコース−６−リン酸、マンノース−６
−リン酸、ガラクトース−６−リン酸、フルクトース−
６−リン酸、グルコース−１，６−２リン酸、フルクト
ース−１，６−２リン酸、フルクトース−２，６−２リ
ン酸等、又はそれらのナトリウム、カリウム等のアルカ
リ金属塩等の糖リン酸エステルとその誘導体、アラニン
、ロイシン、リジン、アスパラギン、アスパラギン酸、
システィン、プロリン、グルタミン、セリン、グルタミ
ン酸、グリシン、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン
、バリン等のアミノ酸とその誘導体、コレステロール及
びその誘導体、セラミド及びその誘導体、リノール酸、
リルン酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、プロス
タグランジン、プロスタサイクリン、ロイコトリエン等
の多不飽和脂肪酸及びその誘導体、ピロリドンカルボン
酸、グリチルリチン、ビサボロール、塩化ベンザルコニ
ウム、塩化ベンゼトニウム、パラベンエステル、メント
ール、レゾルシン、ヒノキチオール、スクワレン、アン
トラニル酸、尿素、副腎皮質ホルモン、卵胞ホルモン、
エストロゲン、アンドロゲン、チロキシン、脳下垂体ホ
ルモン、脳下垂体後菓抽出物、胸腺ホルモン、胎盤性ゴ
ナドトロピン、ε−アミノカプロン酸、アラントイン、
ハロカルパン、カンフル、塩化ヒドロキシアンモニウム
、グルタミン酸その誘導体、メチル−２，５−ジイソプ
ロピル桂皮酸エステル、バラアミノ安息香酸エステル、
ビス（２−ピリジルチオール−１−オキシド）亜鉛、ア
ミノフェノール型抗ヒスタミン剤、エストラジオール、
エチルエストラジオール、サリチル酸及びその誘導体、
塩酸シフエンドラミン、イソプロピルメチルフェノール
、塩化クロルヘキシジン、アラントインクロルヒドロキ
シアルミニウム、ホモスルファミン、スコポラミン、ク
ロニジン、硫酸イソソルピド、５−フルオロウラシル、
塩化カプロニウム、アセチルコリン等が挙げられる。

本発明における活性成分の濃度はなんら限定されないが
、リボソーム形成に用いる水に対し、１０−８〜３０重
量％程度が好ましい。

活性成分の投入方法としては、有機リン化合物並びに水
溶性の塩及び／又は界面活性剤の混合物に活性成分を混
合してもよいし、また、水中にあらかじめ活性成分を溶
かしておいてもよい。更に、塩水溶液又は界面活性剤の
分散液中に混合しておいてもよい。

〔実施例〕

次に実施例により本発明を説明するが、これらの実施例
、参考例及び比較例はなんら本発明を限−定するもので
はない。

参考例１ 反応器にジパルミトイルホスファチジルコリン１２ｇ１
塩化す）　ＩＪウム４．８ｇ、平均分子量が４００のポ
リエチレングリコール２５ｇ１ホスフアチジル基転移活
性を持つホスホリパーゼＤ（例えばＡｃｔｉｎｏｍａｄ
ｕｒａ属由来）１２００ユニツト、ジエチルエーテル１
２０ｍｊ！及び水１００ｒｄを入れ、３０℃で２４時間
攪拌混合した。反応終了後、クロロホルムとメタノール
を加えて脂質を抽出した。

得られた沈澱１１．５ｇを２００ｍ１のア七トンに溶解
し、遠心分離して沈澱を除去した後、溶液を濃縮乾固し
て９．９ｇの白色沈澱を得た。

得られた白色沈澱は’）Ｉ−ＮＭＲ，元素分析及びＩＲ
にて分析したところ、シリン酸エステル（Ｉ［Ｉ）体３
７重量％、モノリン酸エステル（■）体５８重量％、ホ
スファチジルコリン４重量％及びホスファチジン酸１重
量％を含有する混合物であった。

参考例２ 反応器にジパルミトイルホスファチジルコリン１５ｇ１
塩化ナトリウム６．０ｇ、平均分子量７５０のポリグリ
セリン７５ｇ１ホスフアチジル基転移活性を持つホスホ
リパーゼＤ１５００ユニツト、ジエチルエーテル１５０
ｍｇ及び水１５０−を入れ、３０℃で２４時間攪拌混合
した。反応終了後、参考例１と同様に抽出、遠心し、１
４．１ｇの反応物を得た。

得られた白色沈澱は’）Ｉ−ＮＭＲ，元素分析及び［Ｒ
にて分析したところ、シリン酸エステル（ＩＩＩ）　体
３８重量％、モノリン酸エステル（ＩＶ）体５５重量％
、ホスファチジルコリン６重量％及びホスファチジン酸
１重量％を含有する混合物であった。

実施例１ ０．０１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液にグルコース濃度が０
．０５６Ｍとなるようにグルコースを溶かし、グルコー
ス−塩水溶液を調製した。参考例１で得られた白色性＃
　６０　ｍｇに前記グルコース−塩水溶液６ｇを加え、
湯浴上駒５０℃に加温しつつマグネティックスターラー
で攪拌した。均一に分散した後、攪拌しつつ室温に戻し
たところ、薄青く濁ってはいるがほとんど透明なリボソ
ーム溶液が得られた。

この溶液について、粒径測定機（サブミクロン粒子分析
装置、Ｃｏｕｌｔｅｒ社製モデルＮ４）を用いて測定し
たリボソームの平均直径は８８ｎｍであった。

また、このリボソーム溶液は室温で約１ケ月間変化せず
、安定であった。

この溶液をセファデックスＧ５０−メヂウムを用いて室
温でゲル濾過し、リボソームとリボソームに保持されな
かったグルコースを分離した。

リボソームの溶出している分画についてグルコース濃度
と有機リン化合物濃度を定量し、得られたリボソームの
トラップ体積を有機リン化合物に含まれるリン原子のモ
ル当りで表すと、０．０２３１／ｍｏｌであった。

実施例２ ０．０２Ｍ　ｍ酸アンモニウム水溶液に、グルコース濃
度が０．０５６Ｍとなるようにグルコースを溶かし、グ
ルコース−塩水溶液を調製した。参考例１で得られた白
色沈澱５０ｍｇに、前記グルコース−塩水溶液５ｇを加
え、湯浴上駒５０℃に加温しつつマグネティックスター
ラーで攪拌した。均一に分散した後、攪拌しつつ室温に
戻したところ、薄く白濁したリボソーム溶液が得られた
。この溶液について測定されたリボソームの平均直径は
１３１ｎｍであった。このリボソーム溶液は室温で約２
週間変化せず安定であった。

この溶液を実施例１と同様にしてゲル濾過を行い、リボ
ソームの溶出している分画について、グルコース濃度と
リン濃度を定量したところ、このリボソームのトラップ
体積はリンのモル当りで０．２２１／ｍｏｌであった。

比較例１ リボソーム形成剤として、ジパルミトイルホスファチジ
ルコリンを用い、これを実施例１と同様にして０．０５
６Ｍグルコース−〇、ＯＩＭ硫酸アンモニウム塩水溶液
に混合し、湯浴上駒５０℃に加温しつつマグネティック
スターラーで攪拌した。均一に分散した後、攪拌しつつ
室温に戻したところ、白濁したリボソーム溶液が得られ
た。

この溶液を室温で約３０分間静置しておくと、白色の沈
澱を生じ、リボソームの安定性に乏しいことが判った。

また、この沈澱を光学顕微鏡で観察すると、粒子直径は
１〜５μｍであり、小粒径のリボソームは形成しなかっ
た。

実施例３ リボソームの形成を電子顕微鏡観察により確認した。３
０＋ｎｇの実施例１で得られた白色沈澱を０、ＯＩＭの
硫酸アンモニウム水溶液３ｄに溶解した。

この溶液について、リン−タングステン酸を染色剤とし
て染色し、透過型電子顕微鏡観察を行ったところ、平均
直径１０１　ｎｍの一重のリボソームが見られた。この
リボソームの直径は、粒径測定機を用いて測定した値と
よく一致していた。

実施例４ ジパルミトイルホスファチジルコリンとＰＢＧ４００か
ら得られた白色沈澱を１重量％相当量、水溶性塩として
Ｏ，０１Ｍ相当量の硫酸ナトリウム、活性成分として０
．０５６Ｍ相当量のビタミンＣを用い、実施例１と同様
にしてリボソーム分散液を得た。

このリボソームの平均粒径は３０５　ｎｍであり、ゲル
濾過による精製後、得られたリボソームのトラップ体積
はリンのモル当り、０．３１１／ｍｏｌであった。

実施例５ 参考例２で得られた白色沈澱を１重量％、水溶性塩とし
て０１０２Ｍ相当の硫酸アンモニウム、活性成分として
１重量％のグリセリンを用い、実施例１と同様にしてリ
ボソーム分散液を得た。

このリボソームの平均粒径は１４５ｎｍであり、得られ
たリボソームのトラップ体積はリンのモル当りで表わす
と、０．２２１　／　ｍｏｌであった。

実施例６ 大豆リン脂質由来の脂肪酸組成を有するホスファチジル
コリンと平均分子量が２００のポリプロピレングリコー
ルからホスファチジル基転移活性を持つホスホリパーゼ
Ｄの反応により得られた混合物を１重量％、水溶性塩と
して０．０２Ｍ塩化トリエタノールアンモニウム、活性
成分として０．０５６Ｍのグルコースを用い、実施例１
と同様にしてリボソーム分散液を得た。

このリボソームの平均粒径は２４７　ｎｍであり、ゲル
濾過による精製後、得られたリボソームのトラップ体積
は、リン当り０．２８１／ｍａｔであった。

実施例７ 参考例１で得られた白色比＃　３０　ｍｇと２−デシル
テトラデシルリン酸ナトリウム２５ｍｇをクロロホルム
−メタノール（２：１）混合溶媒に溶かして均一溶液と
した後、減圧濃縮乾固して有機溶媒成分を完全に除去し
た。こうして得た均一な固型物に、０．１６７Ｍ尿素水
溶液３．５ｇを加え１．湯浴上駒５０℃に加温しつつマ
グネティックスクーラーで攪拌した。均一に分散した後
、攪拌しつつ室温に戻したところ、薄青く濁ってはいる
がかなり透明なリボソーム溶液が得られた。この溶液の
リボソームの平均直径は２７１ｎｍであった。

この溶液を実施例１と同様にしてゲル濾過した。

リボソームの溶出している分画についてリンと尿素の定
量を行いその結果、得られたリボソームのトラップ体積
はリンのモル当り、０．１６１　／　ｍａｔであった。

実施例８ 参考例１で得られた白色沈澱を０．９４重量％、界面活
性剤として０．１８重量％のジセチルリン酸トリエタノ
ールアンモニウム、活性物質として０．５４３Ｍのグリ
セリンを用い、実施例７と同様にリボソーム水溶液を調
製した。

得られたリボソームの平均直径は２３９ｎｍ、）ラップ
体積はリンのモル当り、０．１７１／ｍｏｌであった。

実施例９ 卵黄由来の脂肪酸組成を有するホスファチジルコリンと
平均分子量５００のポリグリセリンを、ホスファチジル
基転移活性を有するホスホリパーゼＤの存在下、反応し
て得られた生成物を０．６１重量％、界面活性剤として
０．３９重量％のジパルミトイルホスファチジルコリン
、活性物質として０．１．３３Ｍのグリシンを用い、実
施例７と同様にリボソーム水溶液を調製した。

得られたリボソームの平均直径は２０６ｎｍ、トラップ
体積はリンのモル当り、０．３７１／ｍｏｌであった。

〔発明の効果〕

本発明のリボソーム形成剤は、水と混合し、攪拌しただ
けで自然に粒径の小さなリボソームを形成することがで
きる。本発明を用いて製造した小さなリボソームは、従
来の方法によって製造したもの（例えば超音波照射によ
り得られたもの）よりも安定である。また、本発明によ
る粒径の小さなリボソームの製造法は、簡便で、従来の
方法に必要な機械的操作や界面活性剤の除去等に煩わさ
れることがない。すなわち、本発明は、従来の課題であ
った、リボソームの大きさ、大量生産性、保存安定性に
たいする問題点をすべて解決しているもので、その利用
価値は太き（、医薬品等に用いることができる。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）ホスホリパーゼＤの存在下、次の一般式（
   I ）及び／又は（II） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（II） 〔式（ I ）及び（II）中、Ｒ＾１及びＲ＾２はそれぞ
   れ、同一又は異なって−ＯＣＯＲ＾３及び／又は−ＯＲ
   ＾４より選ばれる基（但し、Ｒ＾３及びＲ＾４は同一又
   は異なって、それぞれ炭素数６〜３２のアルキル又はア
   ルケニル基を表す）を示すか、又はＲ＾１とＲ＾２が一
   緒になって次の基 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここで、ｎは１１〜１９の整数を表す）を形成しても
   よく、Ｘは水酸基含有塩基の水酸基１個を除いた後に残
   る有機残基を示し、Ｍは水素原子、アルカリ金属、アル
   カリ土類金属、アンモニウム、アルキルアンモニウム又
   はアルカノールアンモニウムを示す〕 で表されるグリセロリン脂質と下記（１）〜（３）（１
   ）▲数式、化学式、表等があります▼〔ここでｍは２〜
   ５０の整数、Ｙは炭素数２〜４のアルキレン基もしくは
   置換アルキレン基を示す〕で表されるモノ又はポリエー
   テル （２）縮合度２〜５０のポリグリセリン （３）分子内に一級アルコール基２個以上を有する炭素
   数４〜７の単糖類、二糖類又は糖アルコール類 のいずれかの多価アルコールとを反応させて得られるリ
   ン酸エステル混合物と、 （ｂ）水溶性塩及び／又は界面活性剤とからなるリボソ
   ーム形成剤。 ２、請求項１記載のリボソーム形成剤を用い、有効活性
   成分を包含せしめたリボソーム組成物。 ３、リボソームの平均直径が５００ｎｍ以下である請求
   項２記載のリボソーム組成物。