JPH03127984A - 小麦ジヒドロジピコリネート・シンターゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ 本発明は、ジヒドロジビコリネート・シンターゼ（以下
ＤＨＤＰＳと省略）活性を有するタンパク質、該クンバ
ク質をコードするＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を含む組換
えベクター、該組換えベクターにより形質転換された微
生物、さらには該微生物を培養することにより該タンパ
ク質を遺伝子工学的に生産する方法に関する。

［従来の技術］ コムギやトウモロコシなどの禾穀類は１人間や家畜等に
とって重要な栄養源であるが、一方これらの種子は、必
須アミノ酸の一つであるリジンの含量が低く、栄養面で
劣っている。しかしながら、現在まで、リジンの含量が
高く、且つ農業上作物としての欠点のない品種は得られ
ていない。

高等植物のリジン生合成系は大腸菌と同じく、ジアミノ
ピメリン酸（ＤＡＰ）を経由するジアミノピメリン酸経
路によると考えられ、各種の高等植物から、その経路の
いくつかの酵素に関しては活性が確認されている。

この生合成系の最終産物であるリジンの細胞内での存在
量はリジン生合成系の複数の酵素の内。

アスパルテート・キナーゼ、およびＤＨＤＰＳによって
制御されていることが報告されている。さらには、これ
ら２つの酵素の酵素的性質（リジンによるフィードバッ
ク・インヒビジョン）から、後者のＤＨＤＰＳが主に制
御を担っていると考えられている（　Ｒ，Ｋｕｍｐａｉ
ｓａｌ　ｅｔ　ａｌ、　、　　（１９８７１。

Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　８５．　ｐｐ、１４５
−１５１１゜しかし、近年の大腸菌及び高等植物のＤＨ
ＤＰＳ酵素タン酵素タンパ素質的研究の知見を比較する
と、両者には差異ら多く、例えば高等植物ＤＨＤＰＳは
葉緑体中に局在することなどを挙げることができる（Ｒ
，Ｍ、　Ｗａｌｌｓｇｒｏｖｅ　ｅｔ　ａｌ、、　（１
９８１）Ｐｈｙｔｏｃｈｅ＋ａｉｓｔｒｙ　２０．　ｐ
ｐ、２６５１−２６５５　）　。

一方、植物における遺伝子工学的研究の近年の進展によ
り、植物に外来遺伝子を導入することが可能になってい
る。

従って、高等植物のリジン生合成系を解明し、これに関
与する酵素タンパク質あるいはこれをコードするＤＮＡ
の塩基配列に関する知見を基にしてリジン含量の改良さ
れた品種を作製することが期待される。

しかし生体中においてはＤＨＤＰＳは存在量の極少ない
酵素であり、特に高等植物からの単離精製は非常に困難
である。さらに酵素的性質を研究するために４＞ＤＨＤ
ＰＳをコードするＤＮＡ配列の解明、さらにはＤＨＤＰ
Ｓを発現生産する手段の確立が期待されている。

従って、高等植物のＤＨＤＰＳ酵素蛋白、及びこれをコ
ードするＤＮＡ配列に関する研究は非常に重要であるが
、高等植物のＤＨＤＰＳに関しては、これまでに部分的
精製に関する報告はあるが、単離、または、アミノ酸配
列、あるいはこれをコードするＤＮＡ配列に関する報告
はない。

遺伝子工学的手法として、タンパク質の一次配列の情報
、あるいはタンパク質に対する特異抗体をもとにすれば
、ｃＤＮＡあるいはゲノムのクーロン遺伝子を得ること
ができる。

現在までに、ＤＨＤＰＳの遺伝子としては、大腸菌のも
ののみが知られている（　Ｆ、　Ｒｉｃｈａｕｄ　ｅｔ
ａｌ、　（１９１１６１Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　
１６６、　ｐｐ、２９７−３００１　。

しかし、一般に大腸菌と高等植物とでは、同−酵素間に
おいても、アミノ酸配列あるいはこれらをコードするＤ
ＮＡの塩基配列の相同性は低く、大腸菌遺伝子の塩基配
列を基にして、核酸をプローブとしてｃＤＮＡやゲノム
のＤＮＡ配列をライブラリーから選択することは通常不
可能であり、また、大腸菌の該タンパク質に対する特異
抗体と高等植物の該タンパク質との免疫交差性も特異性
が低いと推定される。

［発明が解決しようとする問題点１ 本発明の目的は、従来より単離することができなかった
高等植物由来のＤＨＤＰＳを単離し、そのアミノ酸配列
を決定し、それをコードするＤＮＡを作製し、該ＤＮＡ
を組み込んだ組換えベクターを構築し、該組換えベクタ
ーで微生物を形質転換してＤＨＤＰＳ生産能を有する微
生物を創製し、さらに、該微生物を培養してＤＨＤＰＳ
を生産する方法を提供することである。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、鋭意研究の結果、コムギＤＨＤＰＳの単
離精製法を確立し、該タンパク質のＮ−末端アミノ酸配
列を決定し、該タンパク質をコードするＤＮＡ配列を明
らかにし、この知見を基に遺伝子工学的にＤＨＤＰＳ活
性を有するタンパク質を生産する手段及び方法を完成し
た。

すなわち、本発明は、下記の式（■）＝（Ｎ−末端） ｕｅｔ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｔ
ｈｒ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｐｒ。

Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｌ
ｙｓ　ＡＬａ　Ｐｒｏ　ＧｌｙＡｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ
　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　
ＬｅｕＳｅｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌ
ａ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　５ｅｒＨｉｓ　Ａｒｇ　
Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｓ
ｅｒ　ＡｌａＡｌａ　Ａｌａ　ｌｉｅ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ
　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒ。

Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｌ
ｙｓ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　ＴｈｒＳｅｒ　Ｖａｔ　Ａｓｐ
　Ｇｌｙ　ｌｉｅ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　
Ｌｅｕｌｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｖａｔ　Ｌｙｓ　Ｔｈ
ｒ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒ。

Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇ
ｌｕ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　ＡｓｐＳｅｒ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ
　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　
ＧｌｙＡｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｖａ
ｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　ＴｈｒＧｌｙ　Ｇｌｕ　
Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ａ
ｓｐＧｌｕＨｉｓ　　１ｉｅ Ｃｙｓ　　Ｐｈｅ Ａｓｎ　　Ｔｈｒ １１ｅ　　Ｈｉｓ Ｇｌｙ　　Ｍｅｔ Ｔｙｒ　　Ｔｙｒ ｌｉｅ　　５ｅｒ Ｇｌｙ　　Ｐｒ。

Ａｒｇ　　Ｔｈｒ １１ｅ　　Ｇｌｕ Ａｌａ　　Ｇｌｙ Ａｒｇ　　Ｖａｌ Ｔｈｒ　　ＩＬｅ Ｈｉｓ　　Ａｓｐ Ｇｌｙ　　Ｖａｌ Ｐｒｏ　　Ｇｌｙ Ｇｌｙ　　Ｇｌｕ Ｌｅｕ　　Ｐｒ。

Ｐｒｏ　　Ａｓｎ Ａｌａ　　Ｇｌｎ Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　ｒｌｅ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ｖ
ａｔＧｌｙ　　Ｔｈｒ　　Ａｓｎ　　ｌｉｅ　　Ｌｙｓ
　　Ｖａｌ　　ｌ１ｅＧｌｙ　　Ｓｅｒ　　Ａｓｎ　　
Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ａｒｇ　　ＧｌｕＡｌａ　　Ｓｅ
ｒ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｎ　　Ｇｌｙ　　Ｐｈｅ　　Ａｌ
ａＨｉｓ　　Ａｌａ　　Ａｌａ　　Ｌｅｒ　　Ｈｉｓ　
　Ｖａｌ　　ＡｓｎＧｌｙ　　Ｌｙｓ　　Ｔｈｒ　　Ｓ
ｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ａｌａ　　ＧｌｙＨｉｓ　　Ｐｈｅ
　　Ａｓｐ　　Ｇｌｕ　　Ｖａｔ　　Ｌｅｕ　　Ｐｒ。

丁ｈｒ　　ｌｉｅ　　ｌｉｅ　　Ｔｙｒ　　Ａｓｎ　　
Ｖａｌ　　Ｐｒ。

Ｇｌｙ　　Ｇｉｎ　　Ａｓｐ　　Ｉｌｅ　　Ｐｒｏ　　
Ｐｒｏ　　ＡｌａＡｌａ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ｓｅ
ｒ　　丁ｙｒ　　Ｐｒｏ　　ＡｓｎＶａｌ　　Ｌｙｓ　
　Ｇｌｕ　　Ｃｙｓ　　Ｖａｌ　　Ｇｌｙ　　ＨｉｓＬ
ｙｓ　　Ｃｙｓ　　Ｔｙｒ　　Ｔｈｒ　　Ａｓｐ　ｔｙ
ｓ　　ＧｌｙＴｒｐ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｎ　
　Ａｓｐ　　Ａｓｐ　　ＧｌｕＳｅｒ　　Ａｒｇ　　Ｔ
ｒｐ　　Ｌｙｓ　　Ｔｙｒ　　Ｇｌｙ　　Ａｌａｌｌｅ
　　Ｓｅｒ　　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　　Ａｓｎ
　　ＬｅｕＬｅｕ　　Ｍｅｔ　　Ａｒｇ　　Ｓｅｒ　　
Ｌｅｕ　　Ｍｅｔ　　ＰｈｅＡｓｎ　　Ａｌａ　　Ａｌ
ａ　　Ｌｅｕ　　Ａｓｎ　　Ｇｌｕ　　ＬｙｓＬｅｕ　
　Ｍｅｔ　　Ｌｙｓ　　Ｔｒｐ　　Ｌｅｕ　　Ｐｈｅ　
　５ｅｒＰｒｏ　　Ｉｌｅ　　Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ　　Ａ
ｓｎ　　Ｔｈｒ　　ＡｌａＬｅｕ　　Ｇｌｙ　　Ｖａｌ
　　Ｖａｔ　　Ａｒｇ　　Ｐｒｏ　　Ｖａｔｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒ。

Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｇｌｕ １ｅ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｒｇ　　Ａｒｇ　　Ｐｒｏ　　Ｔｙｒ　　Ａｌａ　　
Ｐｒｏ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　　ＧｌｕＬｙ
ｓ　　Ａｒｇ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｕ　　Ｐｈｅ　　Ｖａ
ｌ　　Ａｒｇ　　ｌｉｅ　’Ｖａｌ　　ＧｌｕＡｌａ　
　Ｉｌｅ　　Ｇｌｙ　　Ａｒｇ　　Ｇｌｕ　　Ａｓｎ　
　Ｐｈｅ　　Ｖａｌ　　Ｇｌｙ　　ＧｉｎＬｙｓ　　Ｇ
ｌｕ　　Ｖａｌ　　Ａｒｇ　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　　Ａ
ｓｐ　　Ａｓｐ　　Ａｓｐ　　ＡｓｐＰｈｅ　　Ｖａｌ
　　Ｌｅｕ　　ｌｉｅ　　Ｓｅｒ　　Ａｒｇ　Ｔｙｒ（
Ｃ−末ｒＡ） （ただし、式中Ａｌａはアラニン、Ａｒｇはア（ただし
、式中Ａｌａはアスパラギン、ＡＳｐはアルギニン、Ａ
ｓｎはアスパラギン、Ａｓｐはアスパラギン酸、Ｃｙｓ
はグルタミン酸、ｃｉｔｙはグリシン、Ｆ（ｉｓはヒス
チジン、Ｉｌｅはインロイシン、Ｌｅｕはヒスチジン、
Ｉｌｅはイソロイシン、Ｌｅｕはロイシン、Ｌｙｓはフ
ェニルアラニン、Ｐｒｏはフェニルアラニン、Ｐｒｏは
プロリン、Ｓｅｒはセリン、Ｔｈｒはスレオニン、Ｔｒ
ｐはチロシン、そしてＶａｌはバリン残基を示す）で表
されるアミノ酸配列又はこれと実質的に同一の配列を有
し、且つアスパルテート・セミアルデヒドとピルビン酸
を縮合結合することによりジヒドロジピコリン酸を生成
する能力を保持していることを特徴とする、ジヒドロピ
コリネート・シンターゼ活性を有するタンパク質を提供
する。

また、本発明は、該タンパク質をコードするＤＮＡ配列
を提供する。

さらに本発明は、該ＤＮＡ配列を含み、宿主微生物中で
複製可能で、前記本発明のタンパク質を宿主微生物中で
発現することができる組換えベクターを提供する。

本発明はさらに、該組換えベクターにより形質転換され
、上記本発明のタンパク質を産生ずることができる微生
物を提供する。

さらに本発明は、該微生物を培養し、上記本発明のタン
パク質を回収する工程を含む１本発明のタンパク質の製
造方法を提供する。

【発明の詳細な説明］ 以下１本発明をより具体的に説明する。

１、ジヒドロジピコリン酸ト・シンターゼ本発明のタン
パク質は、アスパルテート・セミアルデヒドとピルビン
酸を縮合結合させることによりジヒドロジピコリン酸を
生成する、ＤＨＤＰＳ活性を有するクンバク質であり、
上記式（１）で表わされるアミノ酸又はそれと実質的に
同一のアミノ酸配列を有する。

ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、前記ア
ミノ酸配列中の１個若しくは複数個のアミノ酸が他のア
ミノ酸に置換されており、モして／又は１個若しくは複
数個のアミノ酸が欠失しており、そして／又は１個若し
くは複数個のアミノ酸が前記アミノ酸配列中に付加され
たアミノ酸配列であって、アスパルテート・セミアルデ
ヒドとピルビン酸を縮合結合することによりジヒドロジ
ピコリン酸を生成する能力を有する。すなわちＤ）（Ｄ
ＰＳ活性を有するアミノ酸配列を意味する。すなわち、
一般に、生理活性を有するタンパり質において、そのア
ミノ酸配列のうち、少数のアミノ酸が置換し、欠失し又
は少数のアミノ酸が付加された場合であって６その生理
活性が維持されることがあることは当業者に広く認識さ
れている０本発明には、このようにアミノ酸配列は式（
Ｉ）の６のとは多少異なるが、ＤＨＤＰＳ活性を有する
ものも含まれる。

さらに、特に酵素タンパク質において、活性部位を構成
するアミノ酸配列が同一であれば、その活性部位を構成
するアミノ酸配列以外の部分のアミノ酸配列が大きく異
なっていても、欠失していて６、また、かなり大きなア
ミノ酸配列が付加されたような場合であってちその酵素
活性が失われないことも当業者によって広く認識されて
いることである。従って、本願発明においては、このよ
う々もの６「実質的に同一のアミノ酸配列」に含めるこ
とを意図している０例えば、下記実施例で具体的に示さ
れるように１式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列は、その
ＤＨＤＰＳ活性を発揮することに採ってＮ−末端近傍の
配列が重要なものではなく、この部分が大きく異なった
配列になっていても、あるいは全く欠失していてｔＤＨ
ＤＰｓ活性を発揮することができるのでそのようなもの
ら式（１）と実質的に同一のアミノ酸配列を有するらの
と定義する。このようなちのの具体例として下記式（＋
１　）で示されるアミノ酸配列を有するものを挙げるこ
とができる。

（Ｎ−末端） Ｓｌｅｔ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　
Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　ＨｉｓＰｒｏ　Ｈｉｓ　Ｆ’
ｒｏ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｌｅ
ｕ　ＳｅｒＡｒｇ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　
Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　ＰｈｅＰｈｅ　Ｐｒ
ｏ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ
　Ｇｌｙ　ＡｒｇＬｅｕ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｖａｔ　Ｐ
ｒｏ　Ｖａｔ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　５ｅｒＡｌａ
　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　
Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　ＡｌａＶａｌ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｖａ
ｌ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ
Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　ＡｒｇＳｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｖａ
ｌ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　ＡｒｇＴｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　
Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａ
ｒｇＬｅｕ　　Ｉｌｅ　　Ｔｈｒ　　Ａｌａ　　Ｖａｌ
　　Ｌｙｓ　　Ｔｈｒ　　Ｐｒｏ　　丁ｙｒ　　Ｌｅｕ
Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｌ
ｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　ＴｙｒＡｓｐ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ
　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　
ＧｌｙＧｌｙ　　Ａｌａ　　Ｇｌｕ Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｕ Ｇｉｌｌ　　ｌｉｓ　　ｌ１ｅ Ａｓｎ　　Ｃｙｓ　　Ｐｈｅ Ｇｌｙ　　Ａｓｎ　　丁ｈｒ Ａｌａ　　Ｖａｌ　　Ｈｉｓ Ｖａｌ　　Ｇｌｙ　　１Ｊｅｔ Ｐｒｏ　　Ｔｙｒ　　Ｔｙｒ Ｌｅｕ　　ｌｉｅ　　Ｓｅｒ Ｍｅｔ　　Ｇｌｙ　　Ｐｒ。

Ｓｅｒ　　Ａｒｇ　　Ｔｈｒ Ｖａｔ　　ｌｉｅ　　Ｇｌｕ Ｍｅｔ　　Ａｌａ　　Ｇｌｙ Ｇｌｕ　　Ａｒｇ　　Ｖａｌ ｌｉｅ　　Ｓｅｒ　　１ｉｅ Ｃｙｓ　　Ｈｉｓ　　Ａｓｐ Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　　Ｖａｌ Ｖａｌ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｙ Ｇｌｕ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｕ Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｐｒ。

Ｇｌｙ　　Ｖａｌ　　ｌ１ｅ Ｇｌｙ　　Ｈｉｓ　　Ｌｅｕ Ｍｅｔ　　Ｌｅｕ　　ｉｌｅ にｌｙ　　Ａｌａ　　Ａｓｎ Ｇｌｙ　　Ｓｅｒ　　Ａｓｎ Ａｌａ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｕ Ｈｉｓ　　Ａｌａ　　Ａｌａ Ｑｌｙ　　ｌｙｓ　　Ｔｈｒ Ｈｉｓ　　Ｐｈｅ　　Ｌｙｓ Ｔｈｒ　　Ｉｌｅ　　ｌ１ｅ Ｓｅｒ　　Ｇｉｎ　　Ａｓｐ Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　５ｅｒ Ｖａｌ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｕ Ｌｙｓ　　Ｃｙｓ　　Ｔｙｒ Ｔｒｐ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ Ｓｅｒ　　Ａｒｇ　　Ｔｒｐ １１ｅ　　Ｓｅｒ　　Ｖａｌ Ｌｅｇ　　Ｍｅｔ　　Ｈｉｓ Ａｓｎ　　Ａｌａ　　Ａｌａ Ｌｅｕ　　Ｍｅｔ　　Ｌｙｓ Ｖａｌ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｙ ｌＪｅｔ　　Ｓｅｒ　　Ｔｒｐ Ｇｌｙ　　Ｈｉｓ　　Ｔｈｒ １１ｅ　　Ｌｙｓ　　Ｖａｔ Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ａｒｇ Ｇｌｎ　　Ｇｌｙ　　Ｐｈｅ Ｌｅｕ　　Ｈｉｓ　　Ｖａｌ Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｕ Ｇｌｕ　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ Ｔｙｒ　　Ａｓｎ　　Ｖａｔ １１ｅ　　Ｐｒｏ　　Ｐｒ。

（：ｙ３　７ｙｒ　　５ｅｒ Ｃｙｓ　　Ｖａｌ　　Ｇｌｙ Ｔｈｒ　　Ａｓｐ　　Ｌｙｓ Ａｓｎ　　Ａｓｐ　　Ａｓｐ Ｌｙｓ　　Ｔｙｒ　　Ｇｌｙ Ａｌａ　　Ｓｅｒ　　Ａｓｎ ５ｅｒ　　Ｌｅｕ　　Ｍｅｔ Ｌｅｕ　　Ａｓｎ　　Ｇｌｕ Ｔｒｐ　　Ｌｅｕ　　Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｖａｌ １ｅ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｓｎ １ｙ Ｐｒ。

Ｐｒ。

Ｐｒ。

Ａｓｎ １ｉｓ Ｇｌ、ｙ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｇｌｕ　　Ｐｒｏ　　Ａｓｎ　　Ｐｒｏ　　Ｉｌｅ　　
Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ　　Ａｓｎ　　Ｔｈｒ　　ＡｌａＬｅ
ｕ　　Ａｌａ　　Ｇｉｎ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ　　Ｖａ
ｌ　　Ｖａｔ　　Ａｒｇ　　Ｐｒｏ　　ＬｅｕＰｈｅ　
　Ａｒｇ　　Ｌｅｕ　　Ｐｒｏ　　Ｔｙｒ　　Ｔｈｒ　
　Ｐｒｏ　　Ｌｅｕ　　Ｐｒｏ　　ＬｅｕＧｌｕ　　Ｌ
ｙｓ　　Ａｒｇ　Ｖａｌ　　Ｇｌｕ　　Ｐｈｅ　　Ｖａ
ｌ　　Ａｒｇ　　Ｉｌｅ　　ＶａｌＧｌｕ　　Ａｌａ　
　ｌｉｅ　Ｇｌｙ　　Ａｒｇ　　Ｇｌｕ　　Ａｓｎ　　
Ｐｈｅ　　Ｖａｌ　　ＧｌｙＧｉｎ　　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ
　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　　Ａｓ
ｐ　ＡｓｐＡｓｐ　　Ｐｈｅ　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　　
Ｉｌｅ　　Ｓｅｒ　　Ａｒｇ　Ｔｙｒ（Ｃ−末端） 式（ＩＩ　）で示されるアミノ酸配列は、その第６７番
目（Ｎ−末端から数えて、以下同じ）以降のアミノ酸配
列が１式（Ｉ）のアミノ酸配列の第５６番目以降のアミ
ノ酸配列と完全に同一であるが、１〜６７番目のアミノ
酸配列は式（Ｉ）のアミノ酸配列の１〜５５番目のアミ
ノ酸配列とは大きく異なっている。このようなちのも式
（Ｉ）のアミノ酸配列と実質的に同一の配列を有する６
のに包含される。

さらに、下記実施例で明らかになるように１式（Ｉ）で
示されるアミノ酸配列の１番目及び５〜４９番目のアミ
ノ酸が欠失した下記式。（１１）　）で示されるアミノ
酸を有する６の４ｐＤＨＤＰＳ活性を有し、これ６式（
Ｉ）と実質的に同一のアミノ酸配列を有するものに含ま
れる。

（Ｎ−末端） Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｉ
ｌｅ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　ＡｓｐＡｓｐ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ
　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　
ＶａｔＬｙｓ　　Ａｓｎ　　Ａｒｇ　　丁ｈｒ　　Ｓｅ
ｒ　　Ｖａｔ　　Ａｓｐ　　Ｇｌｙ　　Ｉｌｅ　　Ｌｙ
ｓＳｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　ｌｉｅ　Ｔｈｒ　
Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　ＴｈｒＰｒｏ　Ｔｙｒ　Ｌｅ
ｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ
　ＬｅｕＧｌｕ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｌ
ｅｕ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｇ１ｎ１１ｅ　Ａｓｎ
　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　
Ｉｌｅ　ＶａｌＧｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌ
ｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　ＭｅｔＳｅｒ　
　丁ｒｐ　　Ａｓｐ　　Ｇｌｕ　　Ｈｉｓ　　Ｉｌｅ　
　１Ｊｅｔ　　Ｌｅｕ　　Ｉｌｅ　　ＧｌｙＨｉｓＴｈ
ｒ　Ｖａｔ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ
　Ａｓｎ　ｌ１ｅＬｙｓ　Ｖａｌ　ｌｉｅ　Ｇｌｙ　Ａ
ｓｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　５ｅｒＴｈｒ
　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　
Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　ＧｉｎＧｌｙ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｖａ
ｌ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ
Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｇ
ｌｙ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　５ｅｒＴｈｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ
　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　）ＩＬｓ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ
　ＧｌｕＶａｔ　　Ｌｅｕ　　Ｐｒｏ　　Ｍｅｔ　　Ｇ
ｌｙ　　Ｐｒｏ　　丁ｈｒ　　Ｉｌｅ　　Ｉｌｅ　　Ｔ
ｙｒＡｓｎ　　Ｖａｌ　　Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　　Ａｒｇ
　Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　　Ｇｉｎ　　Ａｓｐ　　ｌ１ｅＰ
ｒｏ　　Ｐｒｏ　　Ａｌａ　　Ｖａｔ　　ｌｉｅ　Ｇｌ
ｕ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　５ｅｒＴｙｒ　
　Ｐｒｏ　Ａｓｒ＋　　Ｍｅｔ　　Ａｌａ　　Ｇｌｙ　
　Ｖａｌ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｕ　　ＣｙｓＶａｌ　Ｇｌ
ｙ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ
　Ｔｙｒ　ＴｈｒＡｓｐ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ｉｌ
ｅ　Ｔｈｒ　　Ｉｌｅ　Ｔｒｐ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ　
　ＡｓｎＡｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　Ａ
ｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　ＬｙｓＴｙｒ　　Ｇｌ
ｙ　　Ａｌａ　Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　　Ｖａｌ　　ｌｉｅ
　　Ｓｅｒ　　Ｖａｔ　　ＴｈｒＳｅｒ　　Ａｓｎ　　
Ｌｅｕ　　Ｖａｔ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ　　
Ｍｅｔ　　Ａｒｇ　　５ｅｒＬｅｕ　　Ｍｅｔ　　Ｐｈ
ｅ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｕ　　Ａｓｎ　　Ａｌ
ａ　　Ａｌａ　　ＬｅｕＡｓｎ　　Ｇｌｕ　　Ｌｙａ　
　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｐｒｏ　　Ｌｅｕ　　Ｍｅｔ　
　Ｌｙｓ　　ＴｒｐＬｅｕ　　Ｐｈｅ　　Ｓｅｒ　Ｇｌ
ｕ　　Ｐｒｏ　　Ａｓｎ　　Ｐｒｏ　　Ｉｌｅ　　Ｇｌ
ｙ　　ＬｅｕＡｓｎ　　Ｔｈｒ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　
　Ａｌａ　Ｇｉｎ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ　　Ｖａｌ　　
ＶａｔＡｒｇ　　Ｐｒｏ　　Ｖａｌ　　Ｐｈｅ　　Ａｒ
ｇ　Ａｒｇ　　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　　Ａｌａ　　Ｐｒ。

Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　　
Ａｒｇ　Ｔｈｒ　　Ｇｌｕ　　Ｐｈｅ　　ＶａｔＡｒｇ
　　Ｉｌｅ　　Ｖａｌ　　Ｇｌｕ　　Ａｌａ　　Ｉｌｅ
　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　　Ｇｌｕ　　ＡｓｎＰｈｅ　　Ｖａ
ｌ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｎ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ｖａ
ｌ　　Ａｒｇ　　Ｖａｌ　　ＬｅｕＡｓｐ　　Ａｓｐ　
Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　　Ｉｌ
ｅ　　Ｓｅｒ　　Ａｒｇｒｙ （Ｃ−末ｒＡ） さらに、下記実施例で明らかになるように１式（Ｉ）で
示されるアミノ酸のｌ〜５１番目のアミノ酸が欠失した
ちの及び式（１１）で示されるアミノ酸の１〜６２番目
のアミノ酸が欠失したものもＤＨＤＰＳ活性を有し、こ
れらち本発明の範囲内に含まれる。

さらに、上記した本発明のタンパク質が他のタンパク質
又はポリペプチドと結合していわゆる融合タンパク質の
形態にあるちのであってｕＤＨＤＰＳ活性を有する限り
本発明の範囲内に含まれる０例えば、大腸菌中での発現
効率を高めるためにしばしば、外来タンパク質をヒト成
長ホルモンとの融合タンパク質の形態で発現させること
があるが、このようなものら本発明の範囲内に含まれる
。

本発明のタンパク質は、例えば、下記実施例２に詳細に
示す、各種クロマトグラフィーを組合わせた精製方法に
よりコムギ細胞から単離することができる。また、後述
のように、本発明の組換えベクターを用いて遺伝子工学
的手法により生産することもできる。

また、下記実施例で得られたタンパク質は全てコムギに
由来するちのであるが、本発明のタンパク質は必ずし６
コムギに由来するちのに限定されるりのではなく、他の
高等植物に由来するものであってもよい。

２、旦さコロに劃 本発明はまた。上記した本発明のタンパク質をコードす
るＤＮＡ配列を提供する０本発明の種々のアミノ酸配列
をコードするＤＮＡは種々の方法で得ることができる１
例えば上記のアミノ酸配列に基づいて塩基配列を設計し
、常法に従ってＤＮＡを化学合成することができる。ま
た、下記実施例において詳細に述べるように、高等植物
から常法に従ってメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）
　を抽出し、次にこれに基づいて常法にしたがってＣＤ
ＮＡライブラリーを作製し、これを種々の方法によりス
クリーニングして目的のタンパク質のアミノ酸配列をコ
ードするｃＤＮＡを選択することができる。

この様にして得られたコムギＤＨＤＰＳをコードするｃ
ＤＮ （５°） ＡＴＧ　ＡＴＧ ＧＧＧ　ＧＴＣ ＧＣＴ　（：ＴＡ ＴＣＴ　ＣＧＣ ＣＡＣＡＧＧ ＧＣＧ　ＧＣＣ ＡＴＧ　ＣＧＡ ＴＣＡ　ＧＴＡ ＡＴＣＡＣＡ ＧＡＴ　ＧＧＡ ＴＣＴ　ＴＴＧ ＧＣＣＧＡＡ ＧＧＡ　ＧＡＡ ＣＡ（：　ＡＴＣ ＴＧＣＴＴＴ ＡＡＣＡＣＧ ＡＴＴ　ＣＡＣ ＧＧ（：　ＡＴＧ Ａは下記の式 ％式％ ） （： ： （： （： （１： （３） で表される塩基配列（これは上記式（１）で示されるア
ミノ酸配列をコードする）、及び下記の式（）： （５） ％式％ （： （： （： ＧＡＧ　　ＡＡＧ　　ＡＧＧ　　ＧＴＧ　　ＧＡＧ　　
ＴＴＴ　　ＧＴＣＣＧＧ　　ＡＴＴ　　ＧＴＣＧＡＡ　
　ＧＣＣＡＴＴ　　ＧＧＡ　　ＣＧＴ　　ＧＡＧ　　Ａ
ＡＣＴＴＴ　　ＧＴＧ　　ＧＧＡＣＡＧ　　ＡＡＧ　　
ＧＡＧ　　ＴＣＣＣＧＧ　　ＧＴＴ　　ＣＴＧ　　ＧＡ
Ｔ　　ＧＡＣＧＡＴＧＡ丁　ＴＴ（：　　ＧＴＧ　　Ｔ
ＴＧ　　ＡＴＣＡＧＣＡＧＧ　　ＴＡＴ　　ＴＧＡ（３
°　） で表される塩基配列（これは上記式（ＩＩ）で表わされ
るアミノ酸配列をコードする）を有するものである。

本発明のＤＮＡ配列は、式（１ｖ）及び式（Ｖ）のＤＮ
Ａ配列の他、上記した本発明の種々のタンパク質をコー
ドするいずれのＤＮＡ配列をも包含する６例えば、言う
までちなく、上記式。（１１）　）で示されるアミノ酸
をコードするＤＮＡ配列も本発明のＤＮＡ配列に包含さ
れる。

例えば前記のごとく短縮されたＤＨＤＰＳタンパク質を
コードするＤＮＡは、前記の塩基配列（ｒＶ）を有しＤ
ＨＤＰＳタンパク質の全体をコードするＤＮＡを、適当
な制限酵素で切断して塩基配列の一部を除去した後必要
であれば適当なリンカ−を介して、結合することにより
得ることができる。

また、例えば前記（１ｖ）の塩基配列を有するＤＮＡを
含有するベクターを実施例９に記載する方法で操作する
ことにより、式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列の内のア
ミノ酸５０から３７７から成るタンパク質をコードする
ＤＮＡを含有するベクターを作製することができる。

遺伝子工学的にＤＨＤＰＳ活性を有するタンパク質を生
産するには前記したようなりＮＡ配列にこのＤＮＡ配列
を発現させ得るＤＮＡ配列を結合させることが必要であ
る。ＤＨＤＰＳ活性を有するタンパク質をコードするＤ
ＮＡ配列を組替微生物または組替植物中で発現させ得る
ＤＮＡ配列は選定された微生物あるいは植物の宿主との
関係において適宜選定して使用すればよい、このような
りＮＡ配列として、例えばプロモーター系、開始コドン
、終止コドン、転写終止領域等のＤＮＡ配列が知られて
いるにの様なりＮＡ配列をＤＨＤＰＳ活性を有するタン
パク質をコードするＤＮＡ配列に結合させるには、例え
ば結合させようとするＤＮＡ配列間に相補的な付着末端
を形成せしめる等して行う公知の方法等を用いればよい
、ＤＮＡ配列を発現させ得るＤＮＡ配列の結合は１本発
明で提供されるＤＨＤＰＳ活性を有するタンパク質をコ
ードするＤＮＡ配列に対し、その読み取りが可能なよう
に、即ちＤＮＡ配列が翻訳された場合に目的とするＤＨ
ＤＰＳ活性を有するクンバク質が生産されるようであれ
ば良い。

ＤＮＡ配列を発現させ得るＤＮＡ配列を結合させる以外
にも本発明で提供されるＤＨＤＰＳ活性を有するタンパ
ク質をコードするＤＮＡ配列を他の、例えばヒト成長ホ
ルモンを生産させるために作製されたＤＮＡ配列の下流
（３″側）に読み取り可能に結合させてちよい。

ＤＮＡ配列を発現させるためのＤＮＡ配列の中でも、プ
ロモーター系は重要であり、しかも選定した宿主との関
係において適宜選定する必要がある０例えば近年の遺伝
子工学でよく使用される大腸菌等の細菌菌株を用いる場
合にはβ−ラクタマーゼ、及び乳糖プロモーター系、ト
リプトファンプロモーター系等、さらにはこれらのハイ
ブリッドブロモ−クー系を用いればよい、宿主として酵
母を用いる場合などにはＧＡＬＬ／１０プロモーター系
などを用いればよい、また例えば植物を用いる場合には
ＮＯ３，ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター等が知られている
。

なお１本発明のＤＮＡ配列を発現させ得るＤＮＡ配列と
読み取り可能に結合したＤＨＤＰＳ活性を有するタンパ
ク質をコードするＤＮＡ配列は、プロモーター系、開始
コドン、終止コドン等の他に選定した宿主でのＤＨＤＰ
Ｓ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列の発
現のために必要な例えばリポソーム結合部位等を含んで
いても良い。

３、　　　ベクター 本発明で提供されるＤＨＤＰＳ活性を有するタンパク質
をコードするＤＮＡ配列を発現即ち生産し得る複製可能
な発現ベクターは前記２で説明された様なりＮＡ配列を
発現させ得るＤＮＡ配列と読み取り可能に結合している
Ｄｒ（ＤＰＳ活性を有するタンパク質をコードするＤＮ
Ａ配列及び宿主中でベクターＤＮＡを複製するための複
製起点を有し、選定された宿主を形質転換出来るもので
あれば制限なく適宜選定して使用できる０例えば宿主と
して大腸菌等の細菌菌株を用いる場合には、ｐＢＲ３２
２，ｐＢＲ３２５等のプラスミド等を例示できるが、こ
れら以外の６のであっても特別の制限はない、またこれ
らベクターは、これらベクターを用いて選定された宿主
を形質転換させる操作に当り、ベクターが導入されなか
った宿主と導入された宿主との選別を可能にするため例
えばアンピシリン等の薬剤に対する耐性を宿主に付与す
るためのＤＮＡ配列を含んでいることが好ましい。

±−」４主 本発明では特別の制限なしに通常の遺伝子工学的にタン
パク質を生産するために用いられる微生物が使用できる
。たとえばに−１２誘導体であるχ−１７７６、Ｗ−３
１１０，ＭＣ１００９等の種々の大腸菌類、枯草菌類、
好熱菌属細菌類、さらにはサルモネラ・チフィリウム、
セラチア・マンセサンス等の種々の腸内細菌類またさら
にはシュードモナス等の微生物あるいは酵母等を例示す
ることができる。また例えば、既知の方法を用いれば植
物を形質転換することち可能である。

前記３で説明したベクターにより形質転換された前記４
で説明されたような宿主を培養し、ベクターＤＮＡ中の
ＤＨＤＰＳ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
配列を発現させることによりＤＨＤＰＳ活性を有するタ
ンパク質を生産することが出来る。これはＤＩ（ＤＰＳ
活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列と結合
した該ＤＮＡ配列を発現させ得るＤＮＡ配列中のプロモ
ーター系の活性化により実現される。ブロモ−クー系の
活性化は、使用したプロモーター系により異なった条件
下で起こる１通常の遺伝子工学的なタンパク質の生産に
おいては、形質転換した宿主を目的タンパク質を生産し
ない状態、即ちプロモーター系を不活性化した状態で培
養し、宿主当りのベクター量及び総宿主量（総画体数）
を増加させた後、プロモーター系を活性化してタンパク
質を生産させる。このため、通常プロモーター系は例え
ばＩ　ＰＴＧ、ＩＡＡ等の発現誘導剤の添加などの公知
の操作により人為的に活性化可能なものを選定するが、
本発明においても１人為的に制御可能なプロモーター系
を用いることが好ましい、培養菌体からの本発明のタン
パク質の単離は例えば下記実施例２に記載する方法によ
り行なうことができる。

［実施例］ 以下本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示す
が本発明はこれら実施例に限定されるらのではない。

１、ＤＨＤＰＳの　　の確認 ＤＨＤＰＳは、アスパルテート・セミアルデヒドとピル
ビン酸を特異的に縮合結合してジヒドロジピコリン酸を
生成する。ジヒドロジピコリン酸は酸性条件下でオルト
−アミノベンズアルデヒドと反応させることにより呈色
し、５４５ｎｍ付近にピークを持つ吸光度の変化を示す
ので、これを利用して以下のような方法により活性（力
価）を測定することができる。すなわち、１１００ＩＩ
トリス塩Ｍ　（ｐＨ８，０）　−２０ｍｕピルビン酸ナ
トリウム−〇、８　ｍＭＬ−アスパラギン酸セミアルデ
ヒド−１ｍｇ／ｍｌθ−アミノベンズアルデヒドの組成
を有する溶液１ｍｌに適当量の酵素を加え、３０℃で３
０分間インキュベートする０次いで０．２　ｍｌの６％
トリクロロ酢酸−１，５Ｎ塩酸を加えて反応を停止させ
、３０℃で３０分間インキュベートする０次いで、　５
４０　ｎｍの吸光度を測定し、吸光度０．（１０１を１
分間に上げる活性を１単位と定義する。

この方法を用いて、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔ
ｉｖｕｍ　ｃｖ、　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｐｒｉｎｇｌ未
熟胚から誘導した培養細胞抽出液中のＤＨＤＰＳ活性を
測定することができる。尚、ＤＨＤＰＳ活性はリジンの
存在により阻害されるので該抽出液は硫安沈殿さらには
ゲルろ過により、低分子を除去しておくことが好ましい
。

この方法により、コムギ培養細胞中にＤＨＤＰＳ活性が
確認された。

施例２．コムギＤＨＤＰＳの　製 温重量６００ｇの上記コムギ培養細胞を液体窒素で凍結
後、グラインダーで破砕した。細胞１００ｇ当り、　５
０　ｒｍＭ　リン酸ナトリウム（ｐＨ７，０１−１０ｍ
Ｍピルビン酸（Ｐｙｒｌ　−２ｔｎＭジエチルジチオカ
ルバミン酸−２１ｔｌ＆Ｉジチオスレイトール（ＤＴＴ
Ｉ　−１ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸ｆＥＤＴＡ）
の組成を有する溶液１８０　ｍｌを加え、懸濁した。少
量の海砂を加えた乳鉢でこれを破砕し、失活防止剤とし
て細胞１００　ｇ当り５０　ｇの水不溶性のポリビニル
ピロリドン（和光紬薬社製ｐｏｌｙｃｌａｒ　ＡＴ）を
加え、さらに破砕を行ない、ガーゼでろ過し、８０００
　ｘ　ｇ、　４０分間遠心した。上清に最終濃度が３０
％飽和になるように固体硫酸アンモニウムを加え、遠心
し、上清に最終濃度が６０％飽和になるように固体硫酸
アンモニウムを加え、遠心した。沈殿を５０　ｏ＋Ｍリ
ン酸ナトリウム（ｐＨ７，０１−１０ｒｍｖピルビン酸
（Ｐｙｒｌ　−２ｍＬｌジエチルジチオカルバミン酸−
２ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）　−１ｍｋＡエチ
レンジアミンテトラ酢酸ｆＥＤＴＡ）　−１，２５Ｍ硫
酸アンモニウムの組成を有する溶液に！２！濁し、３０
分間放置した。

これを８００（ｌ　ｘ　ｇで２０分間遠心した。

得られた上清を以下のようにして疎水クロマトグラフィ
ーにかけた。市販の疎水クロマトグラフィー用カラム（
東ソー社製Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒ１６５０Ｍ、
２２　ｍ＋ｗ　ｘ　３００　ｍｍｌ　を５０　ｍｌｌリ
ン酸ナトリウム（ｐｌ＋　７．０）　−１０ｍＭ　Ｐｙ
ｒ−２ｍｕ　ＤＴＴ　−１ｍｕＥＤＴＡ−１，２５Ｍ＠
酸アンモニウムで平衡化しく流速１〜２ｍ１７分）、上
記上清をカラムにかけ、３００　＋ｍｌ〜４００　ｍｌ
の上記溶液で洗浄した０次いで、上記溶液の硫酸アンモ
ニウム濃度を０，８Ｍにした溶出液で溶出を行なったと
ころ、ＤＨＤＰＳ活性が溶出された。

次いで、活性画分をゲルろ過クロマトグラフィーにかけ
た。すなわち、セファデックスＧ−２５（ファルマシア
社製）カラムを用い、２０　ｎＭ　）リス塩酸（ｐＨ７
，５）　−１０ｍＭ　Ｐｙｒ　−２ｍＭ　ＤＴＴ　−１
１１ＭＥＤＴＡ−１）、Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１で平衡化、展
開してゲルろ過を行ない、タンパク質含有画分を分取し
た。

得られたタンパク質含有画分を次いで陰イオン交換クロ
マトグラフィーにかけた。すなわち。

０εＡＥ−セファロースＦＦカラム（２２＋ａ＋ｍ　ｘ
　２００　ｇｎｍ）（ファルマシア社製）を用い、２０
　ｍｕ　トリス塩酸（ｐＨ７，５）　　１０　ｍＭＰｙ
ｒ　−２ｍＭ　ＤＴＴ　−１ｍＭ　ＥＤＴＡ−０、Ｉ　
Ｍ　ＮａＣ１及び２０　ｍｕ　トリス塩酸（ｐＨ７，５
）　−１０ｍＭ　Ｐｙｒ　−２ｎＭ　ＤＴＴ　−１ｎ＋
ＬＩ　ＥＤＴＡ−０，３５Ｍ　ＮａＣ１の各５００　ｍ
ｌを用いたリニアグラジェントで溶出したところ、ＤＨ
ＤＰＳ活性はおよそ０．　ｔｉｌｌ〜［１，２６ＭＮａ
Ｃ１画分に溶出された。ＤＨＤＰＳ活性画分の液量な減
らすために、活性画分を８０％飽和硫酸アンモニウムで
沈殿させ（−夜装置）、遠心して沈殿を回収した。

次いで、これを亜鉛キレートクロマトグラフィーかけた
。すなわち、キレ−ティングセファロースカラム（ファ
ルマシア社製、２２　ｇｅｍ　ｘ　１５０ＩＩＩ１１）
に塩化亜鉛水溶液を通して亜鉛で飽和させた後、５０　
ｍｕ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，５）−１０ｍＭ　Ｐｙｒ−
１ｍＭ　ＤＴＴ−０，５Ｍ　ＮａＣ１で平衡化した。一
方、上記沈殿を、５ｍＭの同緩衝液に懸濁し、これを上
記のように平衡化したカラムにかけた。ＤＨＤＰＳ活性
は、素通り画分の第１ピーク中に存在した。活性画分に
固体硫酸アンモニウムを最終濃度１．２５　Ｍになるよ
うに加え、さらにＩ　ＭＤＴＴを最終濃度２ｍＭになる
ように加えた。

次いで、上清を液体クロマトグラフィーにかけた。すな
わち、東ソー社製Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷを用い、Ｓｏ　
ｍ−リン酸ナトリウム（ｐＨ７，０］−１０ｍＭ　Ｐｙ
ｒ−２ｔｓＭ　ＤＴＴ−ｆ　ｍｕ　ＥＤＴＡ−１，２５
１４硫酸アンモニウムと５〇−リン酸ナトリウム（ｐＨ
７，０１−１０＋ａＬＩ　Ｐｙｒ−２ｍＭＤＴＴ−１ａ
＋Ｍ　ＥＤＴＡ−ＯＭ　Ｂｉ酸アンモニウムノリニアク
ラジエントで流速１　ｍｌ／分で１５０分間かけて溶出
した。ＤＨＤＰＳ活性は硫酸アンモニウム濃度的０．７
　Ｍ〜０．８Ｍの間で溶出した。

次いで、活性画分をゲルろ過クロマトグラフィーにかけ
、脱塩した。すなわち、ファルマシア社製ＰＤ−１０カ
ラム（セファデックスＧ−２５を詰めた小型カラム）を
用い、　２０　ｍｕ　トリス塩酸（ｐＨ７，５１−１０
ｗａＭ　Ｐｙｒ−２ｍ＆４ＤＴＴ−１ｔｓＭ　ＥＤＴＡ
−０，１Ｍ　ＮａＣ１で展開し、タンパク質溶出画分を
回収した。

次いでこの両分を陰イオン交換クロマトグラフィーにか
けた。すなわち、　ＭｏｎｏＱ　ｔ（Ｒ５１５カラム（
ファルマシア社製）を用い、２０−トリス塩酸（ｐＨ７
，５１−１０ｍＭ　　Ｐｙｒ−２ｍｕ　　ＤＴＴ−１＋
＋ｉｌ　　ＥＤＴＡ−０，１１４Ｎａ（：ｌ　と２０　
ｍｌＪ　トリス塩酸（ｐＨ７，５］　−１０ｍＭ　Ｐｙ
ｒ−２ｗＬＩ　ＤＴＴ−１ｍＭ　ＥＤＴＡ−０，５ＬＩ
　ＮａＣ１の２００分間のリニアグラジェントで流速０
．５　ｍ１７分で溶出した。ＤＨＤＰＳ活性は、　０．
２５　Ｍ　ＮａＣ１付近をピークとして溶出された。試
料を１ｍｌ以下にまで濃縮した。

次いで、活性画分をゲルろ過クロマトグラフィーにかけ
た。すなわち、　５ｕｐｅｒｏｓｅ　６　ＨＲＩＯ／３
０（ファルマシア社製）を用い、２０　ｍＭリン酸ナト
リウム（ｐＨ７，Ｑｌ　−１０ｍｌＪ　Ｐｙｒ−２ｍＭ
　ＤＴＴ−１ｍＭＥＤＴＡで展開した。第８図に示すよ
うに、タンパク質のピークとＤＨＤＰＳ活性のピークと
が相似形をしていたので、この段階でＤＨＤＰＳが精製
されたちのと考えられる（もつと６、後述のように、こ
の段階ではアミノ酸配列が若干異なる複数のＤ　ＨＤＰ
Ｓが含まれている）、なお、第８図中、実線は２８０　
ｎｍにおける吸光度を、破線はＤ　ＨＤ　Ｐ　Ｓ活性を
示す。

さらに、後述のようにＮ末端のアミノ酸配列を決定する
場合には、以下の逆相クロマトグラフィーを２回行なっ
た。すなわち、Ｃｏ５Ｉ＠ｏｓｉ　１５Ｃ，、−３００
カラム（ナカライテスク社製）を用い、３０％アセトニ
トリル−０，１％トリクロロ酢酸と６５％アセトニトリ
ル−０，１％トリクロロ酢酸の７５分間のリニアグラジ
ェントで０．７　ｍ１７分の流速で溶出した。その結果
、ＤＨＤＰＳ活性を有する４つのピークが得られ、この
段階でＤＨＤＰＳはタンパク質レベルで単離された。

単離されたことを確認するためにＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動ｆｓＤｓ−ＰＡＧＥＩを行なった。　
５Ｏ３−ＰＡＧＥはＬａｅｍｌｉの方法に基づいて行な
った（Ｕ、に、　Ｌａｅｍｌｉ、　Ｎａｔｕｒｅ　２２
７巻、６８０頁、　１９７０年）、すなわち、先ず、を
気泳動装置を用いて、泳動用ガラス板間に１０％　（ｗ
／ｖｌ　アクリルアミド−０，２６％　［ｗ／ｖ）　ビ
スアクリルアミド−０，３７５１リス塩酸（ｐＨ８，８
１−０，１％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳＩよりな
る分離ゲルを作製し、さらに２．５１［ｗ／ｖｌアクリ
ルアミド００．６％　ｆｗ／ｖ）とビスアクリルアミド
０．１２５　Ｍ　）リス塩酸（ｐＨ６，８１−０，１％
ＳＯＳからなる濃縮ゲルを重層した。タンパク質試料を
、　（１０６２５トリス塩酸（ｐＨ６，８１−２％　５
Ｏ３−５％２−メルカプトエタノール中に溶解した後、
ゲル上に展開した。泳動用緩衝液としては、０．０２５
Ｍトリス塩酸（ｐＨ８，３１−０，１９２Ｍグリシン−
０，１％ＳＯ５を用いた０通電はゲルの大きさにより２
０〜２００　ｍＡで実施した。マーカーとしては試料中
にブロムフェノールブルーを使用した。泳動後のタンパ
ク質の染色には銀染色法を行なった（バイオランド・ラ
ボラトリーズ社製の測定キットを使用）。

結果を第９図に示す、第９図に示すように、逆相クロマ
トグラフィーの４つのピークについてはそれぞれ単一の
バンドが得られ（レーン１〜４）、逆相クロマトグラフ
ィーを行なう前の段階（レーン５）のものについてはこ
れらのバンドに対応する太目のバンドが得られた。この
ことからＤＨＤＰＳはタンパク質レベルで単離されたと
判断される。

３　　ＤＨＤＰＳの 実施例２で精製されたＤＨＤＰＳの酵素的性質を調べた
ところ、以下の結果が得られた。

（ｉｌ至適ｐＨ８，０付近 安定ｐＨ６，０〜８．５ ［ｉｉｌ力価の測定法 実施例１に記載。

（ｉｉｉｌ熱安定性 ６０℃１分間で５０％失活 ６０℃３分間で１００％失活 （ｉｖｌ失活条件 ｐＨ９，５、トリス緩衝液中１６時間４℃で５０％失活
。

６０℃３分間の熱処理で１００％失活 （Ｖｌ阻害剤 Ｌ−リジン０．０５　ｍＭで５０％阻害ｐ−クロロ安息
香酸第二水銀０．０１　ｍＭで約９０％阻害 ｐ〜ジクロロェニルスルホン酸水銀−ナトリウム＋１．
（１１ｍＭで約９０％阻害 ＺｎＣ１ｚ　　ｌ　ｍＭで約８６％阻害ＣｄＣ１□　ｌ
ｎＬ＋で約９５％阻害 Ｈｇ（：Ｉｔ　１　＋＋＋ｋｌで約８８％阻害ｆｖｉｌ
安定剤 ＤＴＴ等のＳＲ基保護剤 ピルビン酸 実施例２のようにして得たＤＨＤＰＳタンパク質を気相
法アミノ酸配列分析計（アプライド・バイオシステムズ
）を用いて、各々のＮ−末端アミノ酸配列を決定した。

決定したＮ−末端アミノ酸配列を第１図に示す。

実施例５．プローブの 実施例４で得られたアミノ酸配列をコードし得るＤＮＡ
配列に対して相補的なりＮＡ配列をＤＮＡ合成機（アプ
ライド・バイオシステムズ）を用いて合成した。合成し
たＤＮＡの配列を第１図に示す。

施例６．ｍＲＮＡの単離 ｍＲＮＡの単離は既知の方法（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌ
ｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ１９８２）に記載された方法に
基づいて行なった。

コムギ培養細胞を５０％グアニジンイソチオシアネート
溶液に悲濁破砕し、５Ｍ塩化セシウム溶液に重層し、３
２０００ｒｐｍ、２０時間の遠心分離にかけ、沈殿に種
々のＲＮＡを得た。これらをフェノール抽出、エタノー
ル沈殿後オリゴｄＴセルロースを用いたクロマトグラフ
ィーにかけ、ｍＲＮＡを単離した。

７、ｃＤＮＡライブラリーの 実施例６の様にして得たｍＲＮＡを鋳型として、これら
に相補的なｃＤＮＡを常法に従い、ガプラー・ホフマン
の方法に基づいて調製した（ｕ。

Ｇｕｂｌｅｒ、　Ｂ、Ｊ、　Ｈｏｆｆｒｒｒａｎ　！１
９８３１　Ｇｅｎｅ、　２５．２６３１１施　８．ＤＨ
ＤＰＳをコードするｃＤＮＡの選担 ベクターとしてＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　（ストラドジー
ン社製）を用いた。このベクターのマルチクローニング
・サイト中に実施例６の様にして作製したｃＤＮＡを挿
入し、このプラスミドを用いて大腸菌５Ｃ５−１（スト
ラドジーン社より人手）を形質転換した。

この様にして得られる大腸菌を用いて、実施例４で説明
したプローブによりコロニー・ハイブリダイゼーション
を行って目的とするｃＤＮＡによって形質転換された大
腸菌を選択した（Ｐ、　ＪＭａｓｓｏｎ、　Ｊ、　Ｇ、
　Ｗｉｌｌｉａａａｓ　（１９８５１Ｎｕｃｌｅｉｃ　
Ａｃ１ｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、　ＩＲＬ　Ｐｒ
ｅｓｓ、　ｐｐ、１１３−１３７）。

この様にして得られたＤｉ−ＩＤＰＳをコードするｃＤ
ＮＡを含むプラスミドベクターをＰＤＡ２６およびｐＤ
Ａ　１７と称する。

施　９．ＤＨＤＰＳをコードするｃＤＮＡの肩板 この様にして得られたＤＮＡの制限酵素地図と塩基配列
を決定した（Ｆ、　Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　（
１９８１１Ｓｃｉｅｎｃｅ、　　２１４．　１２０５１
゜制限酵素地図を第２図、及び第３図に示す、また、塩
基配列を第４図及び第５図に示す。

前記プラスミドベクターｐＤＡ２６と５゜３°の両末端
の長さのみが異なるｃＤＮＡを含有するプラスミドベク
ターｐＤＡＯ８（ｐＤＡ２６のポリＡの上流に余剰の塩
基配列を含み、ｐＤＡ２６の５°末端からタンパク質コ
ード領域までの配列が欠失しているが、発現ベクターに
組込めばｐＤＡ２６と同一のタンパク質が発現する）を
制限酵素Ｐｖｕ　ＩＩ　、　Ｘｈｏ　Ｉで断片化した後
、修飾酵素クレノー断片を用いて平滑末端化し、１２塩
基の長さを持ツＮｃｏｌ　リンカ−（５°−ＣＡＧＣＣ
ＡＴＧＧＣＴＧ−３°）を両末端に結合させ、制限酵素
Ｎｃｏ　Ｉで切断した。この様にして得られる両末端に
制限酵素Ｎｅｏ　Ｉの付着末端を持ち、ＤＨＤＰＳ蛋白
質のアミノ酸配列５１から３７７をコードするＤＮＡ配
列を、ｐＴＶｌ　１８Ｎ　（宝酒造株式会社）のＮｃｏ
　Ｉ切断部位に挿入した。この作製方法の手順を第６図
に示す、この様にして得られたプラスミドベクターを用
いて大腸菌株ＪＥ７６２７（国立遺伝学研究所）を形質
転換した。前記大腸菌ＪＥ７６２７はＤＨＤＰＳ活性を
失った変異株であり、ジアミノピメリン酸を含まない培
地、たとえばＬＢ培地上では増殖することができない、
しかし該プラスミドベクターにより形質転換されたＪＥ
７６２７はＬＢ培地上で増殖を示した。

該プラスミドのプロモーター下流付近について実施例８
と同様に塩基配列を決定し開始コドンからＤＨＤＰＳの
アミノ酸配列５０以降が読み取り可能に結合されている
ことを確認した。これを第７図に示す。

該プラスミドベクターをｐＥＤＯ８０１と称する。

１　１、　　ＤＨＤＰＳ　　　　　を　　　　る　　　
　　　の遣 実施例１０に示すｐＥＤＯ８０１を用いて形質転換され
た大腸菌Ｍ　Ｖ　１１８４　（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ、　１５３、宝酒造株式会
社から市販）をｌｏｏｕｇ／ｍｌのアンピシリンを含む
２ＹＴ培地で一夜培養した後、同様の培地に３００分の
１になるように植菌した。１時間の培養後、最終０．３
　ｔｒ＋ＨになるようにＩ　ＰＴＧを添加し、さらに３
時間培養した。この菌体を遠心分離により回収し、実施
例１に示す方法でＤＨＤＰＳ活性を測定した。尚、対照
として、形質転換されていないＭＶｌ１８４を同様にし
て測定した。その結果、ベクターＤＮＡのみによって形
質転換されたＭＶ１１８４ではＤＨＤＰＳの比活性が４
５０単位／ｍｇ蛋白質であったのに対し、ＤＨＤＰＳの
発現ベクターであるｐＥＤＯ８０１で形質転換したＭＶ
１１８４では４５６０単位／ｍｇ蛋白質であり、通常の
大腸菌での発現に対し１０倍の値を示した。

［発明の効果］ 本発明は高等植物ＤＨＤＰＳ蛋白質、該蛋白質をコード
するＤＮＡ配列、該蛋白質を発現させる方法を提供する
ものであり、ＤＨＤＰＳ蛋白質の性質の研究、また該蛋
白質をコードするＤＮＡ配列を用いて微生物あるいは植
物を形質転換することを可能にしたものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は精製されたＤＨＤＰＳから決定されたＮ−末端
アミノ酸配列と、これを基に合成されたＤＮＡの配列を
示す。 第２図はｃ　ＤＮＡライブラリーより得られたＤＮＡ　
（ｐＤＡ２６）の制限酵素地図を示す。 第３図はｃＤＡ１７ＤＮＡライブラリーれたＤＮＡ　（
ｐＤＡ１７）の制限酵素地図を示す。 第４図はｃＤＮＡライブラリーより得られたＤＮＡ　（
ｐＤＡ２６）の塩基配列とコードされるアミノ酸配列を
示す。 第５図はｃＤＮＡライブラリーより得られたＤＮＡ　（
ｐＤＡ　ｌ　７）の塩基配列とコードされるアミノ酸配
列を示す。 第６図はｐＤＡＯ８より、ＤＨＤＰＳの発現ベクターＰ
ＥＤＯ８０１を作製した手順を示す。 第７図はＤＨＤＰＳ発現ベクターｐＥＤＯ８０１の虐基
配列とコードされるアミノ酸配列を示す。 第８図は単離された本発明のＤＨＤＰＳのゲルろ過クロ
マトグラムとＤＨＤＰＳ活性のピークを示す。 第９図はタンパク質レベルで単離されたＤＨＤＰＳのＳ
ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を模式的に
示す。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の式（ I ）： （Ｎ−末端） 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 （Ｃ−末端） （ただし、式中Ａｌａはアラニン、Ａｒｇはアルギニン
   、Ａｓｎはアスパラギン、Ａｓｐはアスパラギン酸、Ｃ
   ｙｓはシステイン、Ｇｌｎはグルタミン、Ｇｌｕはグル
   タミン酸、Ｇｌｙはグリシン、Ｈｉｓはヒスチジン、Ｉ
   ｌｅはイソロイシン、Ｌｅｕはロイシン、Ｌｙｓはリジ
   ン、Ｍｅｔはメチオニン、Ｐｈｅはフェニルアラニン、
   Ｐｒｏはプロリン、Ｓｅｒはセリン、Ｔｈｒはスレオニ
   ン、Ｔｒｐはトリプトファン、Ｔｙｒはチロシン、そし
   てＶａｌはバリン残基を示す）で表されるアミノ酸配列
   又はこれと実質的に同一の配列を有し、且つアスパルテ
   ート・セミアルデヒドとピルビン酸を縮合結合すること
   によりジヒドロジピコリン酸を生成する能力を保持して
   いることを特徴とする、ジヒドロピコリネート・シンタ
   ーゼ活性を有するタンパク質。
2. （２）式（ I ）のアミノ酸配列の内、Ｎ末端近傍が欠
   けているアミノ酸配列を有する請求項１に記載のタンパ
   ク質。
3. （３）下記の式（II）：（Ｎ末端） 【遺伝子配列があります】 （Ｃ−末端） で表されるアミノ酸配列を又はこれと実質的に同一のア
   ミノ酸配列を有する請求項１に記載のタンパク質。
4. （４）式（II）のアミノ酸配列の内、Ｎ−末端近傍が欠
   けているアミノ酸配列を有する請求項３に記載のタンパ
   ク質。
5. （５）下記の式（III）： （Ｎ−末端） 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 （Ｃ−末端） で表されるアミノ酸配列又はこれと実質的に同一のアミ
   ノ酸配列を有する請求項１に記載のタンパク質。
6. （６）式（III）に記載のアミノ酸配列の内、Ｎ末端近
   傍が欠けているアミノ酸配列を有する請求項５に記載の
   タンパク質。
7. （７）請求項１ないし６のいずれかに記載のタンパク質
   をコードするＤＮＡ配列。
8. （８）下記の式（IV）： （５′） 【遺伝子配列があります】 （３′） で表される塩基配列を有する請求項７記載のＤＮＡ配列
   。
9. （９）下記の式（Ｖ）： （５′） 【遺伝子配列があります】 （３′） で表される塩基配列を有する請求項７記載のＤＮＤＡ配
   列。
10. （１０）請求項７ないし９のいずれか１項に記載のＤＮ
    Ａ配列を保持し、宿主微生物中で複製可能で請求項１な
    いし６のいずれか１項に記載のタンパク質を宿主微生物
    中で発現することができる組換えベクター。
11. （１１）請求項１０記載の組換えベクターにより形質転
    換され、請求項１ないし６のいずれか１項に記載のタン
    パク質を産生することができる微生物。
12. （１２）請求項１１に記載の微生物を培養し、請求項１
    ないし６のいずれか１項記載のタンパク質を回収する工
    程を含む、請求項１ないし６のいずれか１項に記載のタ
    ンパク質の製造方法。