JPH03128397A - インターロイキン１インヒビター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はインターロイキン１　（以下ＩＬ−１と略記す
る）の活性を阻害する実質的に純粋なタンバク質に関す
る。

〔従来の技術〕

インビトロにおいて、この約５２ｋＤタンパク質はＩＬ
−１細胞表面レセプターに結合し、そしてマウス胸腺細
胞の同時細胞分裂促進性（ｃｏｍｉｔｏｇｅｍｉｃ）ア
ッセイにおいてＩＬ−１の作用を阻害する。インビボに
おいては、哺乳動物の発熱、白血球増多症および局所的
なリンパ節膨脹のＩＬ−１による誘発を阻害する。

このインヒビターはヒトの骨髄単球性白血病由来の細胞
系により分泌される。これらの細胞により馴化された培
地をイオン交換クロマトグラフィー、イオン交換ＨＰＬ
Ｃおよびゲル濾過ＨＰＬＣにより精製してこのインヒビ
ターを単離する。抗炎症剤として有用性にカロえ、この
インヒビターは癌および自己免疫疾患の治療に有用であ
ろう。

このインヒビターのそれ以外の用途は臓器移植のような
分野における免疫抑制剤として見出されうる。提供者組
織および受容宿主の両者をこのインヒビターで予備処置
すると組織の拒絶および／または対宿主移植片病を回避
できよう。

インターロイキン１（ＩＬ−１）は微生物侵入、炎症、
免疫反応および組織創傷に対する身体応答の重要なメデ
イエータ−の１種である。マクロファージはｌ−１の主
要な供給源であるが、他の細胞例えば、皮膚の滑液繊維
芽細胞、ケラチン生成細胞およびランゲルハンス細胞；
腎臓の脈管膜細胞；脳のＢリンパ球、ナチュラルキラー
細胞、星状細胞およびミクロリジアル（＋＋＋ｉｃｒｏ
ｌｉｇｉａｌ）細胞；血管内皮細胞および平滑筋細胞−
角膜、歯肉および胸腺上皮細胞；およびいくつかのＴリ
ンパ球細胞系からも分泌される。それにもかかわらず、
単球はその戦略的位置および大量のＩＬ−１を合成でき
かつ他の細胞よりも効果的にＩＬ−１前駆体を処理しう
るのでＩＬ−１の重要な供給源の位置にある。

ＩＬ−１はまたホルモンと同様に作用して神経系、代謝
系、血液系および内分泌系に広範囲の全身的変化を誘発
させる。ＩＬ−１はまた間葉性組織変化中の破壊性およ
び修復性の両過程にも影響する。ＩＬ−１の主要な生物
学的活性の一つばＴリンパ球の成熟と分化を誘発させる
ことで、この活性はＴ−細胞により仲介された免疫にお
けるＩＬ−１活性と関連している。

炎症におけるＩＬ−１の役割はアラキドン酸代謝産物の
生成を刺激づることにより仲介される。

ＩＬ−１はまた他のサイト力イン類、特に腫瘍壊死因子
（ＴＮＦ）と相乗作用する。事実、ＩＬ−１およびＴＮ
Ｆは幾種かの生物学的性質を共有しており、そしてこれ
ら２種の別個のサイトカイン作用を合わせたものはしば
しばいずれか一方単独の作用より大きくなる。　ＩＬ−
１はまたインターロイキン−２（Ｉ　Ｌ−２）およびイ
ンターフェロン類の応答をも増強する。ＩＬ−１は血清
、培養上清および尿中に主たる寸法１７ｋＤで見出され
、より大きい３０ｋＤおよび６４ｋＤ形およびより小さ
い２〜ｄｋＤ形も見出される。ＩＬ−１の２種の形態す
なわちα（ρＩ＝５）およびβ（ｐｌ＝７）が単離され
ている。これら両形態をコードする遺伝子をマウスおよ
びヒトからクローンし、そしてこの両者はより小さい生
物学的活性形に開裂されるものである３１ｋＤの不活性
前駆体タンパク質をコードしている。

膜結合Ｉ　Ｌ　−１（２２ｋＤ）は生物学的に活性であ
ると思われ、そして主にα形からなるが、一方細胞から
放出されたＩＬ−１は主にβ形である。

インビトロにおけるＩＬ−１産生は多種類の不活性な免
疫学的および微生物性薬削により増大される。リポポリ
サッカライド（Ｌ　Ｐ　Ｓ）がヒトマクロファージによ
るＩＬ−１産生の最も強力な刺ｌ剤である。マクロファ
ージはその分化の全段階で！Ｌ−１を産生ずる能力を有
すると思われる。

ＩＬ−１に対するレセプターは数種の異なる種類の細胞
で見出される。インターナリゼーションされ、それゆえ
ＩＬ−１をダウンレギュレーションする高アフィニテイ
レセブター、のみならずＩＬ−１をより低い程度にダウ
ンレギュレートする低アフィニティレセプターも証明さ
れている。

ＩＬ−１の機能に関し入手しうる大量のデータは莫大で
？Ｊ［ｍであるが、ＩＬ−１活性の調節に関してははる
かに少ししか知られていない。コルチコステロイドのみ
が！Ｌ−１転写を遮断してその産生を減少させるＩＬ−
１による副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）の誘発も負
のフィードバックループでありうる。しかしながら、身
体はその分子に結合することによるか、ｒＬ−１を妨害
することによるか、または種々の細胞に及ぼすＩＬ−１
の作用を抑制することによりＩＬ−１の生物学的活性を
阻害するそれ自身の物質を生成しうる。

特異的にｌ−１活性を阻害する幾つかの因子は記載され
ている。これらの因子は異なる源に由来しておりそして
生化学的構造が相異する。

多数の研究室が血清、尿および培養細胞の上清中に存在
する因子によるＩＬ−１の胸腺増殖誘発作用の阻害につ
いて記載している。Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ等（Ｊ、Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ、　１２７：２５１７．１９８１）はエンドト
キシン投与３〜４時間後にヒトの血清中に存在するかか
る因子について記載している。これは透析できずそして
７０’Ｃで破壊されるが５６°Ｃではその活性を保持し
ていた。その上、この因子は同定化された抗−１−１抗
体に結合されかつそれから溶離でき、このことはこのも
のがＩＬ−１に構造的に関連があるかまたはＩＬ−１に
結合することを示唆している。

多数の異なる細胞種からの培養上清もまたＩＬ−１のイ
ンヒビターを生成することが見出されている。　Ａｍｅ
ｎｔｏ等（荊ｙＬ７９　：　５３０７．１９Ｈ２）は、
ヒトマクロファージ様細胞系であるＵ９３７がＩＬ−１
のインヒビターを生成しうることを報告している。

５ｃａｌａ等（□、　１５９：１６３７，１９８４）は
エプスタイン−バールウィルスにより形質転換されたＢ
細胞系であるＲＯＨＡ−９により生成されたＩＬ−１イ
ンヒビターについて記載している。このインヒビターは
他のＴ細胞増殖因子の作用を遮断せずそして胸腺細胞に
より吸収されうるので、ＩＬ−１に特異的であると思わ
れる。Ｗｉｌｋｉｎｓ等（如上ＬＩｍｍｕｎｏ１．７５
：３２８．１９８３）はコンカナバリンＡ　（ＣｏｎＡ
）で刺激されたＵ９３７細胞の上清中に存在づるインヒ
ビターについて記載している。しかしながら、この因子
はマイトジェンにより誘発された末梢血液リンパ球増殖
を阻害しそしてＩＬ−１阻害活性について直接試験され
ていない。このものは６５ｋＤの見かけの分子量を有し
そして５６°Ｃで部分的に不活化された。このものは細
胞毒性でなく、そしてその作用はリンパ球と２４時間イ
ンキュベーション後ですらも可逆的であった。Ｆｕｊ　
ｉｗａｒａおよびＥｌｌｎｅｒ　（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ
、　１３６：１ＢＬ１９８６）はＵ９３７細胞がＩＬ−
１およびＩＬ−２により誘発され胸腺の増殖を両方共阻
害する８５ｋＤサプレツサー因子を自然発生的に生成す
ることを示している。同様の活性は培養されたヒト単核
細胞の上清中に５ｈｏｕ等（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ　ＵＳＡ）　７７：６０９６，１９８０）
により見出されている。Ｕ９３７、ＲＯ）ＩＡ−９、お
よびこの正常な単核細胞由来の因子との間の関連は決定
されるべきままである。

幾つかの研究室は尿中におけるＩＬ−１阻害因子につい
ても記載している。Ｌｉａｏ等（ＬｈＬ１封。

Ｅ汲：　１２６．１９８４）は熱性患者の尿にはＩＬ−
１により誘発される胸腺細胞増殖を阻害する物質の含有
量が高まっていることに注目している。この物質はＩＬ
−２により誘発される胸腺細胞増殖を遮断せずかつこれ
ら細胞にとって細胞毒性を有しないので、明らかにＩＬ
−１特異的である。

Ｋｉｍｂａｌｌ等（Ｊ、ｌａ＋ｎｕｎｏ１．　ＬｌＪｌ
：２５６．１９８４）はヒトの尿中における同様のイン
ヒビターについて記載しているが、この因子はＩＬ−１
により誘発されるもう一つの作用である繊維芽細胞増殖
の誘発を遮断しなかったことに注目している。Ｂａ１ａ
ｖｏｉｎｅ等（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、ｒｎｖｅｓｔ、　７８：
１１２０．．１９８Ｇ）は急速単球性白血病患者の尿中
に存在する４５５ＩＬ−１により誘発された胸腺細胞増
殖の２５−３５ｋＤインヒビターについて記載している
。インビトロにおいて、このインヒビターも繊維芽細胞
中におけるＩＬ−１により誘発されたプロスタグランジ
ンおよびコラ−ゲナーゼ産生を遮断した。

終りに、ＭｕｃｈｍｏｒｅおよびＤｅｃｋｅｒ　（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ　２２９：４７９．１９８５）は妊娠中のヒ
トの尿から単離され、破傷風トキソイドにより誘発され
るヒトのリンパ球増殖をインビトロで遮断する８５ｋＤ
ＩＩタンパク賞（ウロモジュリン（ｕｒｏｏ＋ｏｄｕｌ
ｉｎ）について最近記載している。Ｂｒｏｗｎ等（Ｐｒ
ｏｃ　　Ｎａｔ　　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ剋鎖）競：９１
１９，１９８６）はウロモジュリンがＴＬ−１により誘
発される胸腺細胞増殖のインヒビターであることを最近
示しているウロモジュリンがＮ。

−２により誘発される増殖を高めることは発熱インヒビ
ターに比較したその生物学的機能から明白である。さら
に、前出のｌ’１ｕｃｔ＋ｍｏｒｅおよびＤｅｃｋｅｒ
はヒトの尿が他の免疫抑制因子を含有しており、そのい
くつかはＣｏｎ　Ａに結合しそしてセファデックスＧ−
７５で尿タンパク質と一緒にクロマトグラフィーされる
ことに注目した。現在、尿ＩＬ−１インヒビターと血清
中および培養上清中に見出されるものとの間の関連に関
しては何の情報もない。

ザイモサンにより刺激された正常マクロファージおよび
単核細胞から得られる他のインヒビターはＴｉｋｕ等（
Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３６：３６８６．１９８６）
により記載されている。阻害活性のピークは２つあり、
１つは４５−７０ｋＤそしてもう一方は１６０ｋＤより
大きい。

免疫複合体で刺激されたヒト単球はＡｒｅｎｄ等Ｕ、Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、　１３４：３６８６，１９８５）により
　ＩＬ−１の２２ｋＤインヒビターを分泌することが見
出された。

レスピラトリイ・シンシチアルウイルスまたはインフル
エンザウィルスに感染させた単球はＲｏｂｅｒｔｓ等　
（Ｐｒｏ　　ｒｅｓｓ　　ｉｎ　　Ｌｅｕｋｏｃ　　ｔ
ｅ　　Ｂｉｏｌｏ　　　　ｖｏｌ、２＋　　ｐｐ。

４０９−１８．　Ｒｏｂｅｒｔｓ等編、１９８５）によ
り記載されるようにＩＬ−１およびＩＬ−１の４５−６
０ｋＤインヒビターの両方を分泌した。

エイズ患者も、ＩＬ−１の高度な生産を遮断づるもので
ある、分子量５０−１００ｋＤを有するＩＬ１インヒビ
ターを分泌することがＢｅｒｍａｎ　（Ｉｍｍｕｎ。

葭■虹、　４２：１３３，１９８７）により見出された
。

Ｂａｒａｋ等（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１６：
］４４９．１９８６）は骨髄単球細胞系Ｍ２０により分
泌される因子の単離について報告しており、このものは
ＩＬ−１活性をインビトロで特異的に一阻害した。この
因子は５２ｋＤのタンパク質であることが判明しそし゛
ζイオン交換クロマトグラフィーにおいて１個のピーク
として単離された。

〔発明が解決するための手段〕

本発明はＩＬ−１の活性を阻害する実質的に純粋な約５
２ｋＤタンパク質に関づる。本発明はまた、このタンパ
ク質を生成する連続細胞系およびその精製法をも提供す
るものである。本発明はまた白血球増殖および炎症の軽
減におけるインビトロおよびインビボ両方でのこの阻害
性タンパク質の使用、ならびに免疫抑制および癌の治療
における使用にも関する。

〔図面の説明〕

第１図：　Ｍ２Ｏ−２細胞からの上清のＤＥＡＥイオン
交換クロマトグラフィー（０，０〜０．　（３Ｍ　Ｍａ
Ｃ１グラジェント）のフラクションにおいてマウスの胸
腺細胞コマイトジエネシティーアッセイにおけるＩＬ−
１阻害を試験したものである。データーポイントは４通
りの培地での取り込まれたチミジンのＣＰＭを示し、そ
して、水平線はインヒビターの不存在下でのＩＬ−１の
みを有する対照培地における活性を示す。

第２図：イオン交換ＨＰ　Ｌ　Ｃ（０〜ＬＭ　ＮａＣｌ
グラジェント）からのフラクションについて、マウスの
白血球コマイトジエネシティーアッセイにおけるＩＬ−
１阻害を試験した。データーポイントは３通りの培地で
の取り込まれたチミジンのＣＰＭを示し、水平線はＩＬ
−１単独のみを含む培地における活性を示す。

第３図：イオン交換ＦＰＬＣからのフラクションについ
て前記の如く、コマイトジェネシティーにおけるＩＬ−
１阻害を試験した。

第４図：第３図に示されるイオン交換ＦＰＬＣフラクシ
ョンのコマイトジェネシティーアッセイからのフラクシ
ョン番号１０および１８については、インヒビトリー活
性におけるそれらの変化をフラクションＩＯによる減少
した濃度を用いて決定するため滴定した。クローズド細
胞分裂促進性アッセイ。

白抜き四角：菱形：フラグ４５２１８ ６５図：イりン交換クロマトグラフィーからのフラクシ
ョンをゲル濾過ＨＰＬＣにがける。得られるフラクショ
ンについてコマイトジェネシティーアッセイにおけるＩ
Ｌ−１阻害を試験した。インヒビトリー活性のピークは
分子量約５０ｋＤにおいて示された。斜線はインヒビト
リーのピークを示す。

第６図：Ｈ，、−１インヒビトリーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ
、レーン１：分子量マーカー（ＢＳＡ、６７ｋＤ：卵白
アルフ゛ミン、４５ｋＤ：べブシン、　３４．７ｋＤ二
トリプシノーゲン、２４ｋＤ：リゾチーム、　１４．３
ｋＤ）、レーン２：細胞分裂促進性アッセイに基づく、
ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーからのインヒビ
トリー活性のピーク。レーン３：従来のイオン交換クロ
マトグラフィーからの原料を用いたその後のゲル濾過ク
ロマトグラフィーからのインヒビトリー活性のピーク。

第７図：熱処理ＩＬ−１レセプターとＩＬ−ルセプター
への結合能の保持との関係はインビトロ結合アッセイに
より決定した。白抜きの角二５６°Ｃで２０分間さらし
たインヒビトリー、黒丸：１００゛Ｃで２分間さらした
インヒビトリー、白丸：対照のインヒビター（熱処理し
ていない）。

第８図：　　［Ｌ−１とＩＬ−１インヒビターのインビ
トロ結合アッセイによる比較およびそれらのＩＬ−１レ
セプターから解離能。白丸：インヒビターのブレインキ
ュベーション、十字：ブレインキュベーションしないも
の。

第９図：　　ＴＬ−１およびインヒビターの種々の量を
同時にマウスに注射し、発熱の阻害パーセントを異なっ
た時点で決定した。白抜き四角：同時注射後０．５時間
後の阻害、十字：注射１時間後、菱形：注射１．５時間
後、三角：注射２時間後。

Ｍ１Ｏ図：　　ＩＬ−１がマウスにインヒビター投与後
、０〜２４時間後に注射され、発熱の阻害パーセントが
二つの異なった時点で決定された。右上り斜線：　　Ｉ
Ｌ−１注射１．５時間後の阻害、左上り斜線：　　ＩＬ
−１注射１時間後の阻害。

第１１図：インヒビターを有し、または有しないＩＬ−
１の種々の量がマウスに注射され、白血球増多症の阻害
％が異なった時点で決定された。実験の各ラインは注射
１．２．３または４時間後でのそれぞれの白血球増多症
の指数の決定を示す。

自抜きの棒はＩＬ−１のみ、斜線棒はＩＬ−１プラスイ
ンヒビタ一２単位。

Ｍ１２図：　　ＩＬ−１がマウスにインヒビター投与０
〜２４時間後に白血球増多症の阻害％が二つの異なった
時点で決定された。右上りの斜線：ＩＬ−１注射２時間
後の阻害、左上り斜線：■Ｌ−１注射３時間後の阻害。

〔発明の説明〕

このタンパク質は、従来技術に記載されていない臨床的
に有用な多数の性質を示すＩＬ−１インヒビターである
。問題のタンパク質は４．１±０．２の等電点を有し、
ゲル濾過及びＳＤＳ−ＰＡ（１，Ｅの手段により決定さ
れた分子量５２±４ｋＤを有する。

タンパク質は、Ｍ２Ｏ−２と称せられる骨髄単球細胞系
の上清からのイオン交換クロマトグラフィーおよびＨＰ
ＬＣ精製により得ることができる。細胞系Ｍ２０からの
ＩＬ−１インヒビトリータンパク質は従来記載されてい
るが（Ｂａｒａｋ等、　Ｅｕｒ、Ｊ、　［ｍｍｕｎｏｌ
。

１６：１４４９−１４５２．１９８６）、Ｍ２Ｏのサブ
系（ｓｕｂｌｉｎｅ）由来の本発明のＩＬ−１インヒビ
トリータンパク質はＭ２Ｏからのタンパク質で見出され
るものより高いレベルの活性を有する。

以下に要約するごと（、クレームされたタンパク質は高
いレベルの抗炎症活性を有する。３種の技術的に承認さ
れた試験が、与えられた化合物の炎症応答能を決定する
ために典型的に用いられた。

即ち、発熱、白血球およびリンパ腺腫張の効果。

これら試験のそれぞれにおいて、本発明のインヒビター
はこれらの特異な炎症応答の各々その軽減においてイン
ビボで十分な効果を有した。これらの結果は新規なイン
ヒビターが十分な治療効果を持つことを示している。

ＩＬ−１インヒビターのアイデンティティ−はそのよう
に限定されず記載されたＩＬ−１インヒビターのアミノ
酸配列に対する種々の他のアミノ酸置換体、付加物又は
削除物を包含するものと理解されるべきである。

本発明の他の実施態様はＩＬ−１インヒビターの組換え
製法である。そのような製法にはＩＬ−１インヒビター
をコードするＤＮＡ配列を使用し、組換えＤＮＡ分子で
の形質転換を含むものであり、それは、これら配列、Ｉ
Ｌ−１インヒビターを産生ずる種々のも単細胞宿主又は
形質転換された宿主の発酵によるそれらの部分により特
徴ずけられるものである。

本発明はまたＩＬ−１インヒビターの活性部位の位置お
よび分子構造を決定するための上記記載のＩＬ−１イン
ヒビターを用い、そして、Ｉｌ、−１インヒビターとし
ての使用のためおよび本発明の上記使用及び方法におい
て記載されている組換え製法のためのフラグメント及び
ヘプタイドを設計する情報を使用することである。

以下に、この発明に含まれる技術の概要を説明する。

（１）精製の方法 Ｍ２Ｏ−２細胞系の上清から本願のＩＬ−２インヒビタ
ーを精製するのに、多くの方法がこれまでに有効である
ことが確認されている。要約すれば、精製の満足できる
レベル、即ち、タンパク質３μｇ当たりの１活性単位の
ものは、イオン交換クロマトグラフィー、それに次ぐさ
らなる精製または、イオン交換ＨＰＬＣｔたはＦＰＬＣ
により得ることができる。別な方法として、イオン交換
ＨＰＬＣ単独によっても実質的に純粋な精製物が得られ
る。好ましい態様としては、阻害性タンパク質は、等電
点電気泳動によって精製される。各手法について以下に
おいて簡単に説明づる。これらのより詳細については、
実施例を参照されたい。

（１，１）　　イオン交換クロマトグラフィーＩＬ−１
を含んでいるＭ２Ｏ−２細胞からの上清を、上記のよう
にイオン交換クロマトグラフィーにかけ、得られたフラ
クションをコマイトジェニシティアッセイにおいて阻害
性について試験した。インヒビター活性のピーク（第１
図）を有するフラクション１１−１５　（１１−１５）
を更なる特性決定のために、プールし、凍結乾燥し、凍
結した。

（１，２）イオン交換ＨＰＬＣ ピークのＩＬ−１インヒビター活性を持つ、イオン交換
クロマトグラフィーからのプールされたフラクションを
、さらにイオン交ｅ）ｆＰＬｃにより精製した。

イオン交換クロマトグラフィーからのフラクション１１
−１５を、ＨＰＬＣおよびＦＰＬＣの双方にかけた。前
者において、３００ｍｇの凍結乾燥されたＩＬ−１イン
ヒビターを２．０　ｍの水の中で　再構築し、ＴＳＫ　
ＤＥＡｉＥ−５ＰＷ）ＩＰＬＣカラム（Ｂｉｏｒａｄ）
に負荷し、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ７，５）中０．
０から０．１１１　ＮａＣｌグラジェントで毎分１成の
フラクションを得た。第２図は、コマイトジェニシティ
アッセイを少し変えて測定した、２つの連続した部分の
プールされた組における、フラクションの阻害活性を示
している。後者においては、同一のインヒビター１．０
■を１００Ｉｄの水中で再構築し、同一条件（ただし、
ｐＨ８，０，）のもとで、Ｍｏｎｏ　Ｑ　）ｌＲ５１５
ＦＰＬＣカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に９荷した。フ
ラクションの阻害活性は上記と同様にして決定した（第
３図）。

ＦＰＬＣからのＩＬ−１インヒビター活性を、上記と同
一の条件のもとてのコマイトジエニシティアッセイを用
いて滴定した（第４図）。双方のフラクション１０およ
び１８の増加量は、ＩＬ−１のコマイトジエニシティ作
用の阻害におけると同様な増加を示した。

（１，３）ゲル濾過ＨＰＬＣ イオン交換クロマトグラフィーからの凍結乾燥された物
質を、５ｏｒｂａｘ　ＧＦ　２５ＯＨＰＬＣカラム（Ｄ
ｕｐｏｎＬ）にかけた。第５図において、ＴＬ−１イン
ヒビター活性のピーク（上記のコマイトジェニシティア
ッセイに基づく）は、ＢＳＡ標準物である６８ｋＤより
もわずかに少ない分子量において示されており、このこ
とは、還元されていない状態においてインヒビターはほ
ぼ５０ｋＤであることを示唆している。

この場合において、より低い阻害活性は、Ｍ２Ｏ−２由
来の同様の大きさの増殖因子が存在していることにより
説明される。この因子は、アッセイしたときに、ＩＬ−
１またはＩＬ−２のいずれかによって置換することがき
ないので、この因子は、明らかに他のタイプの成長因子
である。

（１，４）等電点電気泳動 Ｍ２Ｏ−２細胞からの粗上清を、あらかじめ何の精製も
することなしに、直接、等電点電気泳動にかけた。生成
した２０のフラクションのうち、コマイトジェニシティ
アッセイにより定められたインヒビター活性のピークは
、−Ｈして９番目のフラクジョン中に現れており、それ
は、４．１のｐｉポイントに対応している。このフラク
ションは３００単位の活性、またはタンパク質３　ｍｇ
当たり１単位の活性を含むことが認められた。このフラ
クションはクーマ、シーブルーで染色された非変性１０
％ゲル上でほぼ５２ｋＤの一個のバンドを生成した。分
子量の範囲に対応したこのゲルのスライスを区分して、
コマイトジェニシティアッセイで個々にテストすると、
９番目のフラクションにより生成したバンドは、正確に
ＩＬ−１インヒビター活性と対応した。他の分子量に対
応した他のいかなるゲルのスライスにも、ゲルの底部の
非常に低い分子量域の部分をのぞき、阻害活性は存在し
なかった。等電点電気泳動からのいかなるフラクション
も含まない対照操作に対しても、この領域では活性がみ
られなかったので、それはＩＬ−１インヒビターの分解
によるものではなかったこととなる。この現象は、多分
、ゲルそれ自体の分解生成物によるものであろう。

（２）生化学的特性決定 この発明のインヒビターは、マウス胸腺細胞においてｌ
−１のコマイトジェネニック作用を阻害するコマイトジ
ェニシティアッセイにおいて、効果があることが示され
た。　ＩＬ−１レセプター結合アッセイにおいて、その
インヒビターがＩＬ−１αとβのレセプターへの結合を
遮断する能力があることもまた示された。しかしこの阻
害活性は、インヒビターを短時間１００°Ｃで処理づる
ことにより低下し、このことは、インヒビターがタンパ
ク性を存することを示している。インヒビターとＩＬ−
１のレセプタ一部位との結合も、ＩＬ−１それ自体の結
合と同様に可逆可能である。

類似したインヒビター例えば細胞系Ｍ２０由来のインヒ
ビターとの比較は、本発明のインヒビターが、コマイト
ジヱニシティアッセイ中で比較したときに、Ｍ２Ｏから
のインヒビターよりも実質的により活性があることを示
す。

（３）　　インビボ活性 すべてのインビボアッセイのために、組換えヒトＩ　Ｌ
　−１（Ｃｉｓｔｒｏｎ）および組換えマウスＩＬ−１
（Ｏｒ、Ｉｖａｎ　０ｔｔｅｒｎｅｓｓ、　Ｐｆｉｚｅ
ｒ）を、Ｐ　Ｂ　Ａ　（ｐＨ７，２）に溶解し、１０単
位／ｄの原液を一２０°Ｃで貯蔵した。

ＩＬ−１に関する「１活性単位」は、コマイトジェニシ
ティアフセイにおいてマウス胸腺細胞のＰＨＡに対する
応答を５０％増加させるのに必要な量として定義される
。加えて、イオン交換クロマトグラフィーにより精製さ
れたＩＬ−１インヒビター（グラジェント０．０から０
．４　Ｍ　Ｎ、ａＣｌ）をすべてのインビボアッセイに
おいて用いた。フラクションをＲＢＭＩ　１６４０で透
析し、−２０’Ｃで貯蔵した。ｒＬ−１のインヒビター
に関する「１活性単位」は、１単位のＩＬ−１のコマイ
トジェニシティ活性を５０％を阻害するのに必要な量と
して定義される。

ＩＬ−１とそのインヒビターの双方ならびにコンＡ（Ｃ
ｏｎ　Ａ）およびＬＰＳに関して、使用した単位数を決
定するために、活性の滴定を２倍希釈で行った。阻害％
の計算式は次の通りである。

すべてのインビボ実験において、６ないし８週齢の雄Ｂ
ａ１ｂ／ｃマウスに、Ｃｏｎ　Ａ、　ＬＳＰまたはＩＬ
−１のＰＢＳ溶液を単独でまたはｆＬ−１インヒビター
と同時に注射した。各実験群は、通常４匹のマウスから
なる。

発熱誘発の阻害をアッセイする実験は、各マウスで３回
の連続的かつ同様の基準温度読みが示された後にのみ開
始した。直腸温度は、Ｎα４０２０Ｔｈｅｒｍｉｓｔｏ
ｒ　Ｐｒｏｈｅ　（Ｙｅｌｌｏｗ　Ｓｐｒｉｎｇｓ　Ｉ
ｎｓｔｒｕｍｅｎｔ＋Ｙｅｌｌｏｗ　Ｓｐｒｉｎｇｓ＋
　０ｈｉｏ）を用い、２ｃｕ＋の距離に約３０秒挿入し
て測定し、Ｙｅｌｌｏｗ　Ｓｐｒｉｎｇｓ　Ｔｅｌｅｔ
ｈｅｒ−ｍｏｍｅｔｅｒで記録した。マウスは操作の間
、適合した大きさのかつ換気装置が付けられたチューブ
内に拘束した形で緩やかに閉込めた。実験はＩＬ−１イ
ンヒビター０．２５．０．５．　１．　１．０および２
．０単位のいずれか、ならびにヒトＩＬ−１の１５０単
位を同時に静脈中に注射することにより、そしてＩＬ−
１インヒビターの２単位を、ｌ−１の１５０単位を投与
する２から２４時間前に静脈内に注射することにより行
った。

白血球増多症誘発の阻害を測定するために、血液試料を
尾静脈穿刺によりマウスから採取し、ヘパリン処理した
管中に貯蔵した。総出血球数はＣｏｕｌｔｅｒ　Ｍｏｄ
ｅｌ　５−Ｐｌｕｓ　（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅｌｅｃｔｒ
ｏｎｉｃｓ。

１１ｉａｌｅａｈ、　Ｆｌｏｒｉｄａ）により測定した
。一つの実験において、ヒト１４．−１の５０．１００
．１５０または２００単位のいずれかを単独でまたはイ
ンヒビタ−２単位とともに静脈内に注射し、他の実験に
おいては、ＩＬ−１の１５０単位を投与する２から２４
時間前にインヒビタ−２単位を静脈内に注射した。

リンパ節腫脹の阻害についてのアッセイのために、試験
すべき試料の０．０５ｄをマウスの左右両方の足の裏に
皮下注射して、局所ドレイニング（ｄｒａ　ｉｎ　ｉｎ
ｇ）リンパ節内に応答を起こさせ、これをリンパ節の重
量の増加により測定した。３日後に、マウスにエーテル
麻酔し、頚部をひねって死亡させた。左右の側部の双方
からしっかりリンパ節を取り除き、脂肪を除去したのち
計量した。最適のリンパ節腫脹の為の投与応答及びカイ
ネティクをあらかじめ定めた後に、１２．５μｇのＣｏ
ｎ　Ａ、　５０ｄｇのＬＰＳ、１２５単位のマウスＩＬ
−１および１００単位のヒトＩＬ−１を、個々にまたは
ＩＬ−１インヒビタ一２単位とともに注射した。また、
ＩＬ−１インヒビタ一１単位を、マウスＩＬ−１の１２
５単位を投与する２時間から４日前、あるいはそのＩＬ
−１の投与の２時間から１日後のいずれかに注射した。

（４）　　Ｉ　Ｌ−１インヒビターの治療上の使用以下
に示すデータは、恐ら＜　　ＩＬ−１に及ぼすその阻害
効果の結果としての、本発明のインヒビターの抗炎症剤
としての有効性を示す。従って、本発明は、望ましくな
い炎症応答の予防あるいは治療のための方法をも提供す
る。■Ｌ−１とその天然のインヒビターとの不均衡が病
気の状態をもたらす種類の病気が特に重要である。望ま
しくない炎症応答を伴う条件としては、アレルギー反応
、慢性炎症性疾患、自己免疫疾患（例えば、リュウマチ
性関節炎）および癌または感染条件と関連した高熱など
がある。活性成分は、好ましくは、薬理学的に許容され
うる担体と組合せて組成物に調製される。この組成物の
投与は、経口的、あるいは局所的及び非経口的注射のい
ずれであってもよい。本発明の組成物の有効単位剤形は
、体重１ｋｇあたり、活性成分を約０．０００１から１
．０μｇ含む。

しかしながら、患者の必要度及び処置すべき状況にした
がってその投与量を調整することは、経験を積んだ医師
の技術の範囲内である。

（５）その他の用途 本願のインヒビターはまた遺伝子配列の同定における手
段として重要な非治療的用途をも有する。

他のヒトタンパク質から実質上精製された大量のＩＬ−
１インヒビターを、ＤＮＡ配列で形質転換された単細胞
宿主中に包含されるＤＮＡ分子を含めたそのＤＮＡ配列
を用いて生成させることは本発明の範囲内である。精製
されたＩＬ−１インヒビターは本発明のＩＬ−１をコー
ドするＤ　Ｎ　Ａ配列を単離および選択するのに使用で
きるＤＮＡプローブの設計に使用するためのアミノ酸配
列データ源として使用できる。

特に、精製されたＩＬ−１の種々の部位およびフラグメ
ントのアミノ酸配列を決定してそれらをコードしている
と推定されるＤＮＡ配列を用いて、ＩＬ−１をコードす
るＤＮＡ配列に関して種々のＤＮＡライブラリーをスク
リーニングするのに使用できる可能性のあるＤＮＡプロ
ーブを設計することができる。かかるライブラリーの源
には染色体遺伝子バンクおよび本発明のＩＬ−１インヒ
ビターを産生ずる組織またはづべての細胞系のＤＮＡま
たはｃＤＮＡライブラリーが包含される。

ｃＤＮＡのクローニングおよびＩＬ−１インヒビターの
発現、ＩＬ−１挿入物用クローンのライフラリ−のスク
リーニング、および宿主／ベクター組み合せ物における
発現でのＤＮＡ配列の使用はＰＣＴ国際出願公開番号−
０８９１０１９４６に記載されている。

要約すれば、ｃＤＮＡの調製はＩＬ−１インヒビター産
生性細胞源からのポリＡ″ｍＲＮＡの単離に続くこの単
離されたポリＡ″ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリー
の作製からなる。次にクローンのライブラリーをＩＬ−
１インヒビター挿入物を含有する組換えＤＮＡ分子に関
し種々の手段を用いてスクリーニングする。その方法の
一つはＤＮＡプローブを使用して、　ＩＬ−１インヒビ
ターをコードするｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを
スクリーニングすることである。このＤＮＡプローブは
当業上よく知られた技術により決定された精製ＩＬ−１
インヒビターの部分′７ミノ酸配列に基づき作製された
一連の合成りＮＡフラグメントからなる。次に選択され
た配列を用いて形質転換して本発明のＩＬ−１を原核生
物宿主および真核生物宿主において発現させることがで
きる。また本発明のＤＮＡ配列は染色体性、非染色体性
および合成性ＤＮＡのセグメントからなるベクターにお
いて使用して種々の宿主／ベクター組み合せ物中で発現
させてＩＬ−１インヒビターを生成させることもできる
。挿入ＩＬ−１ゴー１インヒビターＤＮＡ配 ベクターとしてのＳＶ４０および知られた細菌性プラス
ミドの誘導体、並びに原核生物および真核生物宿主で発
現しうる他のベクターを用いることができる。したがっ
て本発明は任意の手段で作られた５２ｋＤタンパク質ま
たはその同等物を包含するものであり、Ｍ２Ｏ−２から
単離されたタンパク質のみに限定されるものではない。

〔実施例］ インヒビターの精製および活性 以下にＭ２Ｏ−２細胞からのＩＬ−１インヒビターに関
する精製過程、特性決定および活性度アッセイを例示す
る。

（１）精製法 精製の各段階で、Ｂａｒａｋ等、ヒｕｒ．　Ｊ．　Ｉｍ
ｍｕｎｏ１１６：１４４９−１４５２．　１９８６）に
記載されるようにしてマウス胸腺細胞におけるＰＨＡに
対するマイトジェン応答のＩＬ−１増大の阻害によりＩ
Ｌ−１インヒビター活性を測定した。このＩＬ−１コマ
イトジエニツク活性の阻害は、インヒビターの存在下に
おける増殖細胞への３Ｈ−チミジンとり込みの減少をＩ
Ｌ−１単独の存在下における増殖細胞へのとり込みと比
較することにより示した。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス胸腺細
胞を１ウェル当り細胞１．０Ｘ１０６個、組み換えヒト
ＩＬ　−１　（Ｃｉｓｔｒｏｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ。

Ｐｉｎｅ　Ｂｒｏｏｋ，　ＮＪ　）　１単位およびＲＰ
ＭＩ　１６４０培地（１０％ウシ胎児血清および５Ｘ１
０−’Ｍβーメルカプトエタノール補添）１５０μｌ中
の植物赤血球凝集素（Ｐ　ＨＡ）　５００ｎｇを含有す
る９６ウエルプレート中で４８時間培養した。ＰＨＡマ
イトジェン濃度は胸腺細胞アッセイで滴定することによ
り予め測定された。培養物を１．０μＣの３（Ｈ）−チ
ミジンでパルス標識し次に２４時間後に収穫しそしてデ
ータは３通りまたは４通りの培養物の１分当りのカウン
ト数（ＣＰＭ）に基づく。

イオン交換クロマトグラフィーによる精製の第１の工程
において、Ｍ２Ｏのサブ系（Ｂａｒａｋ等ＥｕｎＪ．　
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：　１１４９−１４５２．　１９
８６）である骨髄単球細胞系Ｍ２Ｏ−２の培養培地から
の上清１００ａｄ！をＢａｒａｋ等（同上書）に記載し
ている如く、ＤＥＡＥ　５ｅｐｈａｃｅｌ（Ｐｈａｒｎ
＋ａｃｉａ．　Ｕｐｐｓａｌｓ，　Ｓｗｅｄｅｎ）のカ
ラム（２．５Ｘ２０ｃｍ）にかけた、二〇カラムを５０
ｍＭ　）リス塩酸緩衝液１，）８７．　４　（２００ｍ
）で流出し、それからＮａＣ１（０．１〜０．６Ｍ）の
直線状グラジェントで展開した。

フラクションを集めてＲＰＭＩ　ｌＧ４０で透析し、濾
過し、そして、ウェル当り２０．　５０および１００μ
λずつについて、ＰＭＡを用いたマウス胸腺細胞のコマ
イトジェネシティーアッセイにおけるＩＬ−１活性の阻
害を試験した。

イオン交換ＨＰＬＣによる精製の次の工程において、イ
オン交換クロマトグラフィーからの最初の凍結乾燥タン
パク質はＰＤＩＯ“脱塩カラム”にかけた復水で再構成
されそしてＨＰＬＣまたはＦＰＬＣカラムにかけられる
。それぞれ得られたフラクションからの１Ｏｕｌずつの
ＩＬ−１阻害活性が増殖中の胸腺細胞中に取り込まれ３
（Ｈ）−チミジンの低下量を測定することによりコマイ
トジエニシティアッセイにおいて決定された。

Ｉｔ−１インヒビターを精製する別の方法として、Ｍ２
Ｏ−２細胞の培養培地からの上清を何らの精製をするこ
となくイオン交換ＨＰＬＣカラムに直接かけることがで
きる。

さらに特徴ずけるため、イオン交換クロマトグラフィー
からのＩＬ−１インヒビター凍結乾燥物が５ｏｒｂａｘ
　ＧＦ　２５０カラム（Ｄｕｐｏｎｔ）を用いてゲル濾
過ＨＰＬＣにかけられた。リン酸塩緩衝食塩水（Ｐ　Ｂ
　Ｓ、　ｐＨ７，４）が緩衝液として用いられ、そして
原料の２５■をＰＢ３２５０μ！中で再構成し、試料と
して加え、１分間当り０．５ｍｌで流した。各フラクシ
ョン０．５厩からの３０ｇ℃ずつをコマイトジェネシテ
ィーアッセイにおいて前記の如＜　　ＩＬ−１阻害活性
を分析した。

本発明の好ましい態様において、ロトフォール細胞（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）を用いた
。これはＥｇｅｎら　（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉ
ｓ　’８３＋　Ｈ，ｔｌｉｒａｉ　ｅｄ、。

Ｗａｉｔｅｒ　ｄｅ　ＧｒｕｙＬｅｒ　＆　Ｃｏ、、Ｂ
ｅｒｌｉｎ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐｐ。

５４７−５５０　（１９８４））により記載されたプロ
トタイプに基づく、調製用等電点電気泳動における新し
い発展である。この方法においてタンパク質は遊離溶液
中で等電点電気泳動によって分離された。インヒビター
単離用の出発物質は、細胞系Ｍ２Ｏ−２から得られた粗
上清であった。この上清を凍結乾燥し、得られた粉末（
１５ｇ）をＲＰ？ｊＩ　１６４０に溶解し、１　：１５
０に希釈した１ｏｏｏ容量部のＲＲＭＩ　１６４０に対
して透析した。操作に先立って、ｌ、２５〜１．８５■
／ｄのタンパク質を含有する試料を、１０Ｍ尿素で２０
倍希釈し、最終濃度５ｎ尿素になるようにした。　７８
体両性電解質旧ｏ−Ｌｙｔｅ　３１５を加えて２％（Ｗ
／Ｖ）の最終濃度を得た。この混合物の量は５０ｄであ
った。陽極液として０．１　Ｍ　ＭｇＰＯａを、陰極液
として０．１４ＮａＯＨを用いた。試料を操作温度（４
’Ｃ）にするために、電流をかける前に細胞を１５分間
回転した。

操作条件は次のとおり典型的であった。〜定電流１２ワ
ット；４６６ボルトおよび２６ミリアンペア。４時間後
（そのとき操作は完結している）、電圧は６９８ボルト
に達し、電流は１７ミリアンペアであった。操作の完結
時に、新たに沸騰させた２回蒸留水で１：１０に希釈し
た２０の収穫フラクション（各２ｄ）についてｐｉ（グ
ラジェントを測定した。再分画づるために阻害活性を示
し４．０３〜４．２１のｐｉｔを有するフラクションを
プールし、１０Ｍ尿素で希釈して最終濃度５ｈ尿素にし
た。両性電解質を追加しないで、上記のようにして操作
を行った。開始操作条件は次のとおりである。一定電力
１２ワット；１０８７ボルトおよび１２ミリアンペア。

操作終了とき、電圧は１８２８ボルトに達し、電流は７
ミリアンペアであった。

担体両性電解質を除去づるために、収穫したフラクショ
ンをｌ　Ｍ　ＮａＣ１に対して透析し、続いてＲＰＭＩ
　１６４０に対して透析した。コマイトジェネシティ゛
７ツセイで活性を示すフラクションの純度を、１、ＫＢ
　２１１７　Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍを用い
、そしてＢｉｏ−Ｒａｄの旧ｎ１−Ｐｒｏｔｅｉｎ　１
１スラブ細胞を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、０．
５　ｔｔｍ薄層ポリアクリルアミドでの分析的等電点電
気泳動により測定した。

（２）生化学的特性決定 ＩＬ−１インヒビターをコマイトジェニシティアッセイ
によりＭ２０細胞からのインヒビターと直接比較した０
両インヒビターを同じ条件下にイオン交換クロマトグラ
フィー（グラジェント０．０〜０、４　Ｍ　ＮａＣ１）
により精製しそして種々の希釈度でのそれらの阻害活性
について試験した。

別に、イオン交換クロマトグラフィーから得られた、ピ
ーク阻害活性を有するＩＬ−１インヒビターフラクシゴ
ンをセファデックスＧ−２００スーパーフアイン（Ｓｕ
ｐｅｒｆ　１ｎｅ）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）での
ゲル濾過クロマトグラフィーにより分析した。試料を透
析し、凍結乾燥し、少量の緩衝液中に溶解させそして２
．　Ｏｄを操作に用いた。前と同様に、各新フラクシゴ
ンをマウス胸腺細胞に及ぼすＩＬ−■のコマイトジェニ
ック作用を阻害する能力に関してア・ンセイした。

イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマト
グラフィーからのＩＬ−１インヒビター活性のピークフ
ラクション（すなわちＧ−２００カラムの前および後）
を分子量マーカーを有するＳＤＳ−ポリアクリルアミド
電気泳動ゲル上の隣接レーンで操作した。

ＩＬ　−１レセプター結合アッセイは以下のようにして
行われた。マウス胸腺細胞を２４ウエルプレートに塗布
し、集密となるまで培養した。細胞を結合９Ｎ　ｆｉｉ
液（ダルベツコ改良イーグル培地に　０゜１％ウシ血清
アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）、ＩＯＲＩＭＨＥＰＥＳ８よ
び０．１％アジドを補添したもの）を用いて１回洗い、
３７°Ｃで合計５または６時間インキュベートし、次に
細胞を結合緩衝液で２回洗い、ｌＮ　ＮａＯＨを用いて
可溶化した。イオン交換ＨＰＬＣから得られたＩＬ−１
インヒビターのフラクションを種々の希釈度および種々
の条件下にアッセイした。得られた溶解物をガンマ計数
器で計測して特異的結合％を計算した。用いられた標識
は１×１１０６ＣＰのヒト”’（１）−１−１、αおよ
びβ両方（Ｃｉｓｔｒｏｎ）　　であり、そして１０　
ｕ　ｇｏｄのヒト　ｒＬｌ、αおよびβ両方（（：１ｓ
ｔｒｏｎ）が「競合」インヒビターとして用いられた。

（２，１）　Ｍ２０インヒビターとの比較６１表におけ
るコマイトジェニシティ結果から判るように、このＩｔ
、−１インヒビターは試験されたすべての希釈度でＭ２
０インヒビターより活性が高かった。

（本頁以下余白） 第　　Ｉ　　表 コマイトジェニシティアッセイによるＭ２Ｏ−およびＭ
２Ｏ−２−産生ＩＬ−１インヒビターの比較ＩＬ−１（
１単位） ＩＬ−１（２単位） ５０ ４２００　　　６．４６ ９５００　　１４．６２ ＩＬ−１（２単位） インヒビター　　　　　　　　　　　　　　２２８０　
　　　　　　　　　　７６　　　　　８８１：８希釈　
　６８４０　　　　　２８　　３９１：２希釈　　６４
３’　　　　　　０　　　０両Ｍ２Ｏ−およびＭ２Ｏ−
２−由来のインヒビターは同じ精製段階（ＤＥＡＥイオ
ン交換カラムからのピーク）でヒト組換えＩＬ−１の２
単位までの同じ濃度で用いた。

阻害％は、ＩＬ−１によるＣＰＭで除したＩＬ−１＋イ
ンヒビターによるＣＰＭと定義される。

活性の指数は、ＩＬ−１無添加のバックグラウンドＣＰ
Ｍで除したＩＬ−１によるＣＰＭと定義される。

表に示すように、ＩＬ−１インヒビターはＩＬ−１の不
在で細胞に影響を与えず、従ってその特異性を示してい
る。

（２，２）ゲル濾過クロマトグラフィーイオン交換クロ
マトグラフィーからのピーク１−１阻害活性を有するフ
ラクションを、ゲル濾過クロマトグラフィーにより特性
決定し、それからのフラクションをマウス胸腺細胞にお
けるＩＬ−１のコマイトジェニック作用の阻害について
アッセイした。

（２，３）ＳＤＳ−ＰＡ（１，Ｅ イオン交換クロマトグラフィーおよびそれに続くゲル濾
過クロマトグラフィーの両方からのＩＬ−１インヒビタ
ーのフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（
第６図）。

（２，４）　インビトロ結合アッセイ 光のイオン交換ＨＰＬＣ（グラジェント０．０〜０．４
　Ｍ）からのＩＬ−１インヒビターを、３種類のレセプ
ター結合アッセイによって分析した。最初に、ＨＰ　Ｌ
　Ｃ（９、１５，１０−１６ＸＣ１５，および４３−４
５）からの１：５０または１　：　１００に希釈したフ
ラクションを、マウス胸腺細胞とともに３７°Ｃで１時
間プレイキュベートした。比較として、同一の細胞の組
を結合性緩衝液（まだインヒビターを含存していない）
の同じ希釈物を用いて同じ条件下で処理した。次に、ブ
レインキュベートしたアッセイの部分および他の部分の
両方を、１０ｂＣＰＭの”’（１）−１Ｌ−１、αまた
はβに３７°Ｃで４時間露出し、そして以前は緩衝液の
みであったセグメントも、ＩＬ−１インヒビターの同じ
希釈の同じフラクションとともに同時にインキュベート
した。

一方のコントロールでは１０μ／ｄのＩＬ−１、αまた
はβを用いて、あるいは他方のコントロールでは標識１
０’ＣＰＭの”’（１）−１Ｌ−１、αまたはβを用い
て両方のコントロールを同様の方法で処理し、アッセイ
のブレインキュベートしたフラグメントおよび同時フラ
グメントにおけるインヒビターのフラクションを交換し
た。特異的結合％は次式により計算された。

その結果を第■表に示づ。

（本頁以下余白） これらの結果は、試験されたフラクションのうちＩＬ−
１レセプター結合インヒビターを含有するｌＯ〜１６　
ＸＣ１５のみの結果を示す。このインヒビターはＩＬ−
１αおよびβの両方の結合を遮断し、その作用はブレイ
ンキュベーションによっていく分増大するが、この阻害
を具体的に示すためには、”’（Ｉ）−１Ｌ−１を添加
する前に細胞とともにブレインキュベーションする必要
がなかった。

残りの２のアッセイには、”’（１）　−Ｉ　Ｌ　−１
αおよびＩＬ−１αのみを用い、試験した唯一のフラク
ションは１０−１６　ＸＣ１５であった。

次の種類のレセプター結合アッセイにおいて、インヒビ
ターの結合能力の保持を観察するために、インヒビター
の多重梶釈物を、種々の処理後に阻害活性について試験
した。プロトコルは以前のアッセイの同時セグメントに
ついてのそれと同じであった。結合の阻害％は下記のと
おりである。

１００−　（特異的結合％） 結果を第■表に示す。

第■表 熱にさらした後のＬＬ−１インヒビターのインビトロ結
合 希釈 結合ＣＰＭ 阻害％ １：１０ １：２０ １：４０ １：８０ １　：１６０ １：３２０ １：１０ １：２０ １：４０ １：８０ １：１６０ １：３２０ １：１０ １：２０ １：４０ １：８０ １：１（ｉ。

１：３２０ ５９７ ６２０ Ｏ２０ ６１３ ０１５ ３０７ ３６１ ５５７ ６０１ ７７８ ０３７ １０８ ５９４ ９３８ ４０７ ００７ ３９７ １４５ ＩＬ−１（１０μｇ／ａｆ） インヒビター皺し ５４２ １１２ 第７図からも知られるように、未処理のインヒビターに
対するインヒビターの活性はそれを１００°Ｃで２分間
インキュベートすると破壊されたが、５６°Ｃで２０分
間のインキュベーションは、阻害活性に対してもしあっ
たとしてもほとんど影響を及ぼさず、このことはインヒ
ビターの活性の原因物質はタンパク性であることを意味
する。

最後の種類のレセプター結合アッセイにより、インヒビ
ターの結合の可逆変を試験した。プロトコルは、多重希
釈のインヒビターを３７°Ｃで２時間（１時間だけの代
わりに）ブレインキュベートし、その後過剰の未結合Ｉ
Ｌ−１インヒビターを各希釈物において細胞の半分から
除去した以外は、最初のアッセイのブレインキュベート
したセグメントについてのそれと同じであった。結果を
第■表に示す。

（本負以下余白） 第■表 ＩＬ−１インヒビターのインビトロ結合の可逆性１：１
０ １：３０ １：９０ １：２７０ １：８１０ １：２４３０ １ニア２９０ １：２１８７０ １：６５６１０ １０μｇ／−の　［Ｌ−１ インヒビターなし 宰　１０μｇ／ｍｌ　の 対する。

３１８５　　　　　　　９５ １９３２　　　　　　　９８ ３５０８　　　　　　　８７ １６９７　　　　　　１００ ３７５３　　　　　　　　Ｂ１ ２７６４　　　　　　　７８ ５２３５　　　　　　　４６ ３４８３　　　　　　　６０ ５１Ｇ４　　　　　　　３１ ４１２２　　　　　　　４５ ５４７６　　　　　　　３８ ５３７２　　　　　　１４ ６５６１　　　　　　１１ ５６３０　　　　　　　８ ７５９９　　　　　　　０ ５０４６　　　　　　　２２ １Ｇ２２　　　　　　　　０ ５４９９　　　　　　１２ ２９８２　　　　　　１００ ［１４８１００ ７０２００ ６０５５０ を用いる細胞の同一処理に これらの結果は、第８図にも示すように、ＩＬ−１イン
ヒビターがＩＬ−ルセプターから、　ＩＬ−■自体が解
離するのと同じくらい容易に解離することを示唆してい
る。なぜならばインヒビターが標識ＩＬ−１との競合に
おいて除去されるかまたは保持されるかは、競合度に差
を生じさせないからである。したがってＩＬ−１および
そのインヒビターはＩＬ−ルセプターに対するのと同様
の親和性を有すると思われる。

（３）インビボ活性 Ｍ２Ｏ−２細胞から得られた培地のイオン交換クロマト
グラフィーからの阻害活性のピークから得られたＩＬ−
１インヒビターは、３種の認められた試験によって抗炎
症活性を有することが示された。

（３，１）発熱の阻害 上記のように、ＩＬ−１インヒビターの発熱を阻害する
能力をマウスで試験して、同じ化合物を注射した２匹の
マウスの各群について、「平均体温上標準誤差（ＳＥ）
Ｊで表される結果を得た。

各群内の時間に関づる温度細胞は△Ｔ値として与えられ
る。１５０単位のＩＬ−１と１または２単位のインヒビ
ターとの同時注射に続く経過時間を漸増させて体温を測
定し、対照群にはＰＢＳまたはヒトＨ，−１のみを注射
した。結果を６７表に示す。

（本頁以下余白） ４′）のすべての実験において、体温上昇のピークはＩ
Ｌ−１単独の注射１時間後に観察されたが、温度上昇の
完全阻害は、ＩＬ−１インヒビターを同時注射した場合
に４つのすべての実験においてすべての４つの時点で観
察された。

次に、ＩＬ−１およびインヒビターの同時注射後の異な
る時点で体温を測定することにより、ＩＬ−１発熱に対
する種々の量のインヒビターの影響を試験した（第９図
）。時間と無関係に、インヒビター量が増加するにつれ
て熱の阻害が次第に増大することが、１％のインヒビタ
ーで得られる約５０％の阻害の範囲で観察された。

最後に、１５０単位のＩＬ−１注射と２単位のインヒビ
ター注射との時間感覚が体温に及ぼ１影響を、ＴＬ−１
注射の１．０および１．５時間後に試験した（第１０図
）。その結果は、ＩＬ−１を注射する２ないし１６時間
前にインヒビターを注射した場合に熱阻害を示し、イン
ヒビターを２４時間前までに注射した場合に阻害が増大
することを示している。したがってＩＬ−１の２４時間
前に注射したとしても、インヒビターはＩＬ−１によっ
て誘発された熱を元に戻した。

（３，２）白血球増多症誘発の阻害 ＩＬ−１がマウスにおける白血球増多症のＩＬ−１によ
る誘発を阻害する能力を、白血球増多症の指数によって
アッセイした。この指数は、ＰＢＳのみを注射した群の
平均（±ＳＥ）白血球数で除した、ヒトＩＬ−１のみま
たはＩＬ−１インヒビターと一緒に注射した群の平均（
±ＳＥ）白血球数と定義される（標準誤差は１べてのデ
ータに関し０．０３５０と０．０１２７の間にあった）
。

一般に、白血球数のピーク増加は、マウス１匹あたり１
５０〜２００単位のＩＬ−１注射の２〜３時間後に観察
された（第１１図）。２単位のインヒビターの同時注射
は常に、このＩＩ、−１の作用の低下を生じさせ、最大
阻害は注射の２〜３時間後に得られた。発熱に関して見
られたように、白血球増多症阻害も、種々の時間間隔で
ＩＬ−１およびインヒビターを別個に注射したときに観
察された（第１２図）。インヒビターは、　Ｈ，−１注
射の２〜２４時間前に注射した場合でも、ＩＬ−１によ
って誘発された白血球増多症を軽減したが、４時間のピ
ーク阻害作用は時間間隔を増加する場合に低下した。

（３，３）局所的リンパ節腫張誘発の阻害ＩＬ−１イン
ヒビターが局所的リンパ節腫張の種々の薬剤による誘発
に影響する能力をアッセイするために、ＰＢＳを注射し
たマウスの左リンパ節の平均（±ＳＥ）重量で除した、
（ＩＬ−１のみまたはインヒビーと一緒に注射した）マ
ウスの右リンパ節の平均（±ＳＥ）重量によって腫張の
指数を測定した。

（重置以下余白） 第■表 局所的リンパ節腫張へのｒＬ−１インヒビターの作用１
２．５μｇ　　　　　　　　　　　３．７３±０．０７
Ｃｏｎ　　Ａ　　　　　　　１２．５＃ｇ　　　　　　
　　＋　　　　　　１．１７±０．０４ＰＳ ５０μｇ　　　　　　　　　　　　　４．８５±０４２
７５０μｇ　　　　　　　　　＋　　　　　　１．１９
±０．０７マウス　ＩＬ−１１２５ｕｎｉｔｓ　　　　
　　　　　　　　　　　　４．０９±０．１１１２５ｕ
ｎｉｔｓ　　　　　　＋　　　　　１．２６±０．１１
七トＩＬ−１ １００ｕｎｉｔｓ　　　　　　　　　　　　３．７６±
０．０６１００ｕｎｉｔｓ　　　　　　＋　　　　　０
．８９±０．０９第■表の結果は、Ｃｏｎ　ＡおよびＬ
ＰＳのようなマイトジェンならびにヒトおよびマウスＩ
Ｌ−１の両方により誘発された最適なリンパ節腫張を表
わしている′。これら１べての場合に、２単位のＩＬ−
１インヒビターの同時注射は、リンパ節応答の有意な低
下を生じさせた。

また、マウスＩＬ−１によるリンパ節腫張誘発における
阻害作用を、ＩＬ１＃よびインヒビターを別個に種々の
時間間隔で注射した場合に試験した。結果を６４表に示
す。

（重置以下余白） ６４表 局所的リンパ節腫張へのＩＬ−１インヒビターの作用１
．０７ ３．８８ ３．６２） ４日前 ０．８６　　３．５３ １．０８　　３．７８ ４．１０）３．８０±０．２１ ３．５０） ０ １２５単位のＩＬ−１の注射の２時間、１日または２日
前に１単位のインヒビターを注射すると、依然として有
意な阻害が生じた。この阻害は、時間間隔を３日に延ば
１と低くなり、そして４日では僅差にすぎなかった。有
意な阻害は、インヒビターがＩＬ−１注射後２時間に注
射した場合にも観察されたが、間隔を１日に短縮したと
きにこれは減少した。

微生物の寄託 下記のＭ２Ｏ−２細胞系は１９９０年４月４日にｔｈｅ
八ｍへｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　
Ｃｏ１１ｅｃｔｉｎ、　　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。

Ｍａｒｙｌａｎｄに寄託され、下記受託番号−槻血糸一
　　　−一受圧且豆−− Ｍ２０−２　　　　　ＡＴＣＣＣＲＬ　１０４０９が割
当られている。

本発明は寄託された細胞系による範囲に限定されるもの
ではない。なぜならば寄託された態様は本発明の個々の
態様のうちの一つ例示であるので、本発明は寄託された
細胞系による範囲に限定されるものでなく、機能的に同
等である１べての細胞系は本発明の範囲内にある。ここ
に示されかつ記載されたものに加えて発明を種々変更す
ることは、前記記載および添付の図面から当業者に明ら
かになるであろう。このような変更は付属している請求
の範囲に包含されるものとする。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｍ２Ｏ−２細胞からの上清のＤＥＡＥイオン
交換クロマトグラフィーのフラクションについて、マウ
スの胸腺細胞コマイトジェニシティアッセイにおけるＩ
Ｌ−１阻害を検討した図、第２図は、イオン交換ＨＰＬ
Ｃからのフラクションについてマウスの白血球コマイト
ジェニシティアッセイにおけるｘｔ、−ｔｌｌ害を試験
した図、第３図は、イオン交換ＦＰＬＣからのフラクシ
ョンについてコマイトジエニシティにおけるＩＬ−１阻
害を試験した図、第４図は、第３図に示されるイオン交
！Ｉ４Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃフラクションのコマイトジェニシ
ティアッセイからのフラクションについての、それらの
インヒビトリー活性における変化を決定づるための滴定
値を示す図、第５図は、イオン交換クロマトグラフィー
からのフラクションをゲルろ過ＨＰＬＣにかけて得られ
るフラクションについてコマイトジエニシティアッセイ
におけるＨ、−１阻害を検討した図、第６図は、ＩＬ−
１インヒビトリーのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図、第７図
は、熱処理ＩＬ−１レセプターとＩＬ−１レセプターへ
の結合能の保持との関係を示す図、第８図：ＩＬ−１と
ＩＬ−１インヒビターのインビトロ結合アッセイによる
比較およびそれらのＩＬ−１レセプターから解離能を示
１図、第９図は、ＩＬ−１及びインヒビターの種々の量
を同時にマウスに注射し、発熱の阻害％を異なった時点
で決定したものを示す図、第１０図は、ＩＬ−１を、マ
ウスにインヒビター投与Ｏから１２時間後に注射し、発
熱の阻害％を異なった時点で測定したものを示す図、第
１１図は、インヒビターを有しまたは有しない１Ｌ−１
の種々の量をマウスに注射し、白血球増多症の阻害％が
異なった時点で測定したものを示１図及び第１２図は、
インヒビター投与０から２４時間後にマウスにＩＬ−１
を注射し、白血球増多症の阻害％を二つの異なった時点
で測定したものを示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、細胞系Ｍ２０−２の上清から単離でき、炎症性応答
   を阻害または軽減させうることを特徴とする５２±４ｋ
   Ｄ分子量タンパク質。 ２、慣用のイオン交換クロマトグラフィーにより上清か
   ら単離されうる請求項１記載のタンパク質。 ３、さらにイオン交換、高性能液体クロマトグラフィー
   により精製された請求項２記載のタンパク質。 ４、イオン交換、高性能液体クロマトグラフィーにより
   上清から単離されうる請求項１記載のタンパク質。 ５、等電点電気泳動により上清から単離されうる請求項
   １記載のタンパク質。 ６、医薬上受容されうる担体と組み合せた請求項１、２
   、３、４および５のいずれか１項記載のタンパク質の抗
   炎症的に有効な量を含有する治療用組成物。 ７、炎症性応答の阻止または軽減を必要とする個体に請
   求項１、２、３、４および５のいずれか１項記載のタン
   パク質の有効量を投与することからなる炎症性応答の阻
   止または軽減法。 ８、その量が体重１ｋｇ当り約０．０００１〜１．０μ
   ｇである請求項７記載の方法。 ９、インターロイキン阻害活性を有しており、かつ等電
   点４．１±０．２を有するＭ２０−２細胞から得られた
   ５２ｋＤインターロイキン阻害性タンパク質と同じアミ
   ノ酸配列ならびに等電点を有するタンパク質であって、
   ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける１個のバンドの存在により示
   されるように不純物の大部分を含まない実質的に純粋な
   タンパク質およびその活性フラグメント。