JPH03130074A - マイコプラズマ含有細胞培養物の汚染除去方法 - Google Patents
マイコプラズマ含有細胞培養物の汚染除去方法Info
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- JPH03130074A JPH03130074A JP2134256A JP13425690A JPH03130074A JP H03130074 A JPH03130074 A JP H03130074A JP 2134256 A JP2134256 A JP 2134256A JP 13425690 A JP13425690 A JP 13425690A JP H03130074 A JPH03130074 A JP H03130074A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はマイコプラズマ含有細胞物の汚染除去方法に関
する。本方法において、マイコプラズマに感染しＩ；細
胞培養物は第一段階で抗生物質処理を受け、そして依然
として感染を受けている細胞は第二段階で６−メチルゲ
リンデオキシリボンド溶液によって除去される。
する。本方法において、マイコプラズマに感染しＩ；細
胞培養物は第一段階で抗生物質処理を受け、そして依然
として感染を受けている細胞は第二段階で６−メチルゲ
リンデオキシリボンド溶液によって除去される。
マイコプラズマは細胞壁も細菌莢膜も合成し′１
ない細菌様微生物である。それらは細胞培養物中でも増
殖するしく細胞吸着しくｃｙｔｏａｂｓｏｒｂｅｄ））
また細胞不含培地中でも増殖する。マイコプラズマは典
型的にはコレステロールおよびその他のステロイド化合
物を要求する。
殖するしく細胞吸着しくｃｙｔｏａｂｓｏｒｂｅｄ））
また細胞不含培地中でも増殖する。マイコプラズマは典
型的にはコレステロールおよびその他のステロイド化合
物を要求する。
細胞培養物のマイコプラズマ汚染は細胞技術において広
く生じている問題である。それは最初にロビンソン（Ｌ
、 Ｂ、 Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ、。
く生じている問題である。それは最初にロビンソン（Ｌ
、 Ｂ、 Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ、。
（１９５６）、 ５ｃｉｅｎｃｅ、 １２４．１１４７
）により報告された。実験室規模で永続的に増殖してい
る細胞培養物に認められる平均汚染率は約１５％である
。
）により報告された。実験室規模で永続的に増殖してい
る細胞培養物に認められる平均汚染率は約１５％である
。
工業的培養では、すべての培養物のうち９０％にも及ぶ
ものがマイコプラズマ感染を受ける可能性がある。この
ことは組換えタンパク質のバイオテクノロジー的生産に
とって重要な問題である。何故ならば動物細胞で合皮さ
れる薬品類はマイコプラズマ抗原を絶対的に含んでいて
はならないからである。
ものがマイコプラズマ感染を受ける可能性がある。この
ことは組換えタンパク質のバイオテクノロジー的生産に
とって重要な問題である。何故ならば動物細胞で合皮さ
れる薬品類はマイコプラズマ抗原を絶対的に含んでいて
はならないからである。
最も重要な感染源は汚染された血清および既に感染した
細胞培養物である。大抵の場合、伝搬は空気伝染または
エアロゾルによって行われる。感染培養物は培地の濁り
または特有の臭いが検出され得ない調整された培地のｌ
ｍＱあたり１０’〜１０９コロニ一形成単位（ＣＦＵ
）を含有している。
細胞培養物である。大抵の場合、伝搬は空気伝染または
エアロゾルによって行われる。感染培養物は培地の濁り
または特有の臭いが検出され得ない調整された培地のｌ
ｍＱあたり１０’〜１０９コロニ一形成単位（ＣＦＵ
）を含有している。
ある種のマイコプラズマ株の存在は、活発な酸産生によ
り細胞培養物の変質を招く。最も頻繁に存するマイコプ
ラズマ株、例えばＭ、アルギニーニ（Ｍ、 ａｒｇｉｎ
ｉｎｉ） 、Ｍ 、オラール（Ｍ。
り細胞培養物の変質を招く。最も頻繁に存するマイコプ
ラズマ株、例えばＭ、アルギニーニ（Ｍ、 ａｒｇｉｎ
ｉｎｉ） 、Ｍ 、オラール（Ｍ。
ｏｒａｌｅ） 、Ｍ 、 ヒオリニス（ＩＪ、 ｈｙ
ｏｒｈｉｎｉｓ）およびＡ、レイドラライ（Ａ、 ｌａ
ｉｄｌａｗｉｉ）は、汚染されたセルラインにおいて形
態変化を伴わずに増殖する。しかしながら、マイコプラ
ズマ汚染培養物においては染色体異常および細胞代謝変
化がしばしば認められる。
ｏｒｈｉｎｉｓ）およびＡ、レイドラライ（Ａ、 ｌａ
ｉｄｌａｗｉｉ）は、汚染されたセルラインにおいて形
態変化を伴わずに増殖する。しかしながら、マイコプラ
ズマ汚染培養物においては染色体異常および細胞代謝変
化がしばしば認められる。
実際には現在、マイコプラズマ汚染検出に使用できる多
くのテストシステムが利用可能である。非細胞吸着性マ
イコプラズマの検出にも使える簡単にして感度の高い検
出方法は、マイコプラズマが介在する６−メチルプリン
誘導体の細胞傷害作用に基づいている。
くのテストシステムが利用可能である。非細胞吸着性マ
イコプラズマの検出にも使える簡単にして感度の高い検
出方法は、マイコプラズマが介在する６−メチルプリン
誘導体の細胞傷害作用に基づいている。
この細胞傷害作用は、マイコプラズマでは合皮されるが
動物細胞では合皮されない酵素であるアデノシンホスホ
リラーゼに起因している。
動物細胞では合皮されない酵素であるアデノシンホスホ
リラーゼに起因している。
この酵素が存在すると、６−メチルプリンデオキシリボ
シド（５−ＭＰＤＲ）が分解されそして細胞傷害性物質
である６−メチルプリン（６−ＭＰ）が遊離されてくる
（Ｇ、 Ｊ、 ＭｃＧａｒｒｉｔｙ、 ｅｔ ａｌ。
シド（５−ＭＰＤＲ）が分解されそして細胞傷害性物質
である６−メチルプリン（６−ＭＰ）が遊離されてくる
（Ｇ、 Ｊ、 ＭｃＧａｒｒｉｔｙ、 ｅｔ ａｌ。
（１９８２）、 Ｅｘｐ、 Ｃｅ１ｌ Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ、 １３９．１９９） 。分解生成物の６−ＭＰはそ
の濃度が５μＭ以下であってさえも細胞に対し有毒であ
るため、その結果マイコプラズマで汚染された細胞培養
物の溶解が検出される。すべての関連のマイコプラズマ
株はアデノシンホスホリラーゼを含んでいることから、
すべてのあり得る汚染源はこのテストシステムによって
検出される。
ｈ、 １３９．１９９） 。分解生成物の６−ＭＰはそ
の濃度が５μＭ以下であってさえも細胞に対し有毒であ
るため、その結果マイコプラズマで汚染された細胞培養
物の溶解が検出される。すべての関連のマイコプラズマ
株はアデノシンホスホリラーゼを含んでいることから、
すべてのあり得る汚染源はこのテストシステムによって
検出される。
マイコプラズマ含有培養物の汚染除去は従来より困難か
つ面倒なこととされている。一つの可能性は汚染培養物
をヌードマウスで継代することである。この方法はハイ
プリドーマ培養物に用いられるが大変な技巧を必要とす
る。その他の細胞種（ＢＨＫ細胞など）を用いた場合に
は細胞がこの方法により失われてしまうかもしれないと
いう危険も存在する。もう一つの可能性は各種抗生物質
による処理である。動物細胞により比較的よ〈許容され
また、少くとも短時間、マイコプラズマの除去に用いる
ことのできる多くの物質が存在する。しかしながら、各
種マイコプラズマ株の増殖の抑制しか起こらないことが
しばしばであり、その為、数代継代後には培養物は再び
汚染されてしまう。更に、繰り返し投与するうちに各種
抗生物質に対する抵抗性が生じてくる危険がある。
つ面倒なこととされている。一つの可能性は汚染培養物
をヌードマウスで継代することである。この方法はハイ
プリドーマ培養物に用いられるが大変な技巧を必要とす
る。その他の細胞種（ＢＨＫ細胞など）を用いた場合に
は細胞がこの方法により失われてしまうかもしれないと
いう危険も存在する。もう一つの可能性は各種抗生物質
による処理である。動物細胞により比較的よ〈許容され
また、少くとも短時間、マイコプラズマの除去に用いる
ことのできる多くの物質が存在する。しかしながら、各
種マイコプラズマ株の増殖の抑制しか起こらないことが
しばしばであり、その為、数代継代後には培養物は再び
汚染されてしまう。更に、繰り返し投与するうちに各種
抗生物質に対する抵抗性が生じてくる危険がある。
それ故、本発明は、マイコプラズマ含有細胞培養物の汚
染除去方法に関し、そして第一段階ではマイコプラズマ
に対して有効な抗生物質が用いられる。次の段階では、
依然としてマイコプラズマを含有する細胞まＩ；は細胞
クローンは、真にマイコプラズマ不含の細胞または細胞
クローンだけが残る、すなわち生存する、ように６−メ
チルプリンデオキシリボシドの存在下に培養することに
よって除去される。好ましくは、チアムリン（ｔｈｉａ
ｍｕｌｉｎ） ８よびミノサイクリン（ｍ １ｎｏｃｙ
ｃ Ｉ １ｎｅ）が抗生物質として用いられ、モして６
−メチルプリンデオキシリボシドは５０μＭの濃度で用
いられる。
染除去方法に関し、そして第一段階ではマイコプラズマ
に対して有効な抗生物質が用いられる。次の段階では、
依然としてマイコプラズマを含有する細胞まＩ；は細胞
クローンは、真にマイコプラズマ不含の細胞または細胞
クローンだけが残る、すなわち生存する、ように６−メ
チルプリンデオキシリボシドの存在下に培養することに
よって除去される。好ましくは、チアムリン（ｔｈｉａ
ｍｕｌｉｎ） ８よびミノサイクリン（ｍ １ｎｏｃｙ
ｃ Ｉ １ｎｅ）が抗生物質として用いられ、モして６
−メチルプリンデオキシリボシドは５０μＭの濃度で用
いられる。
本発明はこのようにして得られるマイコプラズマ不含細
胞培養物、およびそれらの特にこれら細胞における異タ
ンパク質の遺伝子工学的生産へ使用にも関する。本発明
は更に特許請求の範囲および実施例においても開示され
る。
胞培養物、およびそれらの特にこれら細胞における異タ
ンパク質の遺伝子工学的生産へ使用にも関する。本発明
は更に特許請求の範囲および実施例においても開示され
る。
実施例：
マイコプラズマ含有ハムスター細胞の汚染除去げっ歯動
的細胞は異種組換えタンパク質の発現に好ましい系であ
る。ＣＨＯ（チャイニ″−ズハムスター卵巣）およびＢ
ＨＫ（新生児ハムスター腎臓）細胞は極めて頻繁に用い
られる。いずれのセルラインも確立された培養物であり
、組換えタンパク質の工業的生産に既に用いられている
。
的細胞は異種組換えタンパク質の発現に好ましい系であ
る。ＣＨＯ（チャイニ″−ズハムスター卵巣）およびＢ
ＨＫ（新生児ハムスター腎臓）細胞は極めて頻繁に用い
られる。いずれのセルラインも確立された培養物であり
、組換えタンパク質の工業的生産に既に用いられている
。
特定のタンパク質（例えばファクター■：ＣまたはＡＴ
ＩＩＩ）を分泌するＢＨＫおよびＣＨＯクローンを、ト
ランスフェクション、選抜およびクローニングを含む面
倒な方法により単離した。マイコプラズマ汚染がこれら
クローンの一部に検出された。
ＩＩＩ）を分泌するＢＨＫおよびＣＨＯクローンを、ト
ランスフェクション、選抜およびクローニングを含む面
倒な方法により単離した。マイコプラズマ汚染がこれら
クローンの一部に検出された。
マイコプラズマ不含細胞を用いる上に時間を消耗するト
ランスフェクションおよび選抜を反復することを避ける
ために次の方法を汚染除去に用いた：まず、汚染細胞培
養物を抗生物質チアムリンおよびミノサイクリン（Ｓｅ
ｂｉｏ、濃度は製造元の教示による）を用いて各々２継
代にわたって交互に処理した。次いでそれら細胞を完全
に抗生物質なしで４継代にわたり維持した。
ランスフェクションおよび選抜を反復することを避ける
ために次の方法を汚染除去に用いた：まず、汚染細胞培
養物を抗生物質チアムリンおよびミノサイクリン（Ｓｅ
ｂｉｏ、濃度は製造元の教示による）を用いて各々２継
代にわたって交互に処理した。次いでそれら細胞を完全
に抗生物質なしで４継代にわたり維持した。
マイコプラズマ試験で点検後、マイコプラズマ不含培養
物の単一クローンが得られた。そのｔ；めに、限界希釈
を用いて細胞を９６ウエルプレートに２細胞／ウエルお
よび１０細胞／ウエルの細胞密度で分布させた。各培養
物につき１希釈段階あたり５個のウェルを用いれば十分
であることが判明していた。１〜２日間の初期増殖期の
後、各培養物に５μＱ／ウエルの１ｍＭ６−メチルプリ
ンデオキシリボシド溶液（６−ＭＰＤＲ）を添加した（
最終濃度５０μＭ／ウェル）。次にそれら細胞をこの溶
液中で５〜６日間（それらがコンフルエンス（ｃｏｎｆ
１ｕｅｎｃｅ）に達するまで）インキュベートした。
物の単一クローンが得られた。そのｔ；めに、限界希釈
を用いて細胞を９６ウエルプレートに２細胞／ウエルお
よび１０細胞／ウエルの細胞密度で分布させた。各培養
物につき１希釈段階あたり５個のウェルを用いれば十分
であることが判明していた。１〜２日間の初期増殖期の
後、各培養物に５μＱ／ウエルの１ｍＭ６−メチルプリ
ンデオキシリボシド溶液（６−ＭＰＤＲ）を添加した（
最終濃度５０μＭ／ウェル）。次にそれら細胞をこの溶
液中で５〜６日間（それらがコンフルエンス（ｃｏｎｆ
１ｕｅｎｃｅ）に達するまで）インキュベートした。
これらの条件下では、細胞吸着されたマイコプラズマで
なおも動ずかに汚染されていた細胞は死滅しＩ；。それ
ら細胞を次いで２４ウエルプレートに移し、そしてその
後６ウエルプレートに移し６− ＭＰＤＲなしの状態で
維持した。
なおも動ずかに汚染されていた細胞は死滅しＩ；。それ
ら細胞を次いで２４ウエルプレートに移し、そしてその
後６ウエルプレートに移し６− ＭＰＤＲなしの状態で
維持した。
この処理の後、各種マイコプラズマ試験を再び行った（
微生物培養およびマイコプラズマ介在細胞傷害作用）。
微生物培養およびマイコプラズマ介在細胞傷害作用）。
結果が陰性の場合に、クローンの一部を凍結し、そして
一部を培養状態に維持した。各個につき５、ｔｏ、 １
５および２０代継代後、細胞のマイコプラズマ汚染を再
び試験し、そして前記方法により処理された培養物はす
べて例外なく陰性であることが認められた。並行的に、
細胞を前述の抗生物質だけで処理し、単一クローンを得
、そして６− ＭＰＤＲを共存させないで維持した。そ
れら細胞を次いで凍結し、そして一部をコントロールと
して培養状態に維持した。５．１０％１５および２０代
継代後、マイコプラズマ試験を再び行った。培養物の約
３０％においテｌＯ継代代後にマイコプラズマを再び検
出することができた。このため細胞をマイコプラズマに
よる再感染を排除する条件下に維持することが必要であ
った。
一部を培養状態に維持した。各個につき５、ｔｏ、 １
５および２０代継代後、細胞のマイコプラズマ汚染を再
び試験し、そして前記方法により処理された培養物はす
べて例外なく陰性であることが認められた。並行的に、
細胞を前述の抗生物質だけで処理し、単一クローンを得
、そして６− ＭＰＤＲを共存させないで維持した。そ
れら細胞を次いで凍結し、そして一部をコントロールと
して培養状態に維持した。５．１０％１５および２０代
継代後、マイコプラズマ試験を再び行った。培養物の約
３０％においテｌＯ継代代後にマイコプラズマを再び検
出することができた。このため細胞をマイコプラズマに
よる再感染を排除する条件下に維持することが必要であ
った。
この方法をヒト細胞培養物（ＨｅＬａおよびＫＢ細胞）
およびザル細胞（ＣＯＳ細胞）に用いた場合にも同様の
成功をおさめた。
およびザル細胞（ＣＯＳ細胞）に用いた場合にも同様の
成功をおさめた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）第一段階でマイコプラズマに対して有効な抗生物質
で処理しそして次の段階で６−メチルプリンデオキシリ
ボシドで処理することより成るマイコプラズマ含有細胞
培養物の汚染除去方法。 ２）使用抗生物質がチアムリンおよびミノサイクリンで
ある請求項１に記載の方法。 ３）６−メチルプリンデオキシリボシドが５０μＭの最
終濃度で用いられる請求項１または２に記載の方法。 ４）抗生物質処理の後、６−メチルプリンデオキシリボ
シド処理が単一クローン培養物に対し適用される請求項
１、２または３に記載の方法。 ５）請求項１、２または３に記載の方法によりマイコプ
ラズマ不含とされた細胞培養物。６）マイコプラズマ不
含細胞培養物の生産のための請求項１、２または３に記
載の方法の使用。 ７）汚染されたセルラインがヒトまたは動物に由来する
請求項１、２または３に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3917163.9 | 1989-05-26 | ||
| DE3917163A DE3917163A1 (de) | 1989-05-26 | 1989-05-26 | Verfahren zur dekontamination mycoplasmenhaltiger zellkulturen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03130074A true JPH03130074A (ja) | 1991-06-03 |
| JP2934482B2 JP2934482B2 (ja) | 1999-08-16 |
Family
ID=6381444
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2134256A Expired - Lifetime JP2934482B2 (ja) | 1989-05-26 | 1990-05-25 | マイコプラズマ含有細胞培養物の汚染除去方法 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5902740A (ja) |
| EP (1) | EP0399545B1 (ja) |
| JP (1) | JP2934482B2 (ja) |
| KR (1) | KR100220988B1 (ja) |
| AT (1) | ATE121131T1 (ja) |
| AU (1) | AU617052B2 (ja) |
| CA (1) | CA2017568A1 (ja) |
| DE (2) | DE3917163A1 (ja) |
| DK (1) | DK0399545T3 (ja) |
| ES (1) | ES2072331T3 (ja) |
| IE (1) | IE66910B1 (ja) |
| PT (1) | PT94145B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007222155A (ja) * | 2006-01-27 | 2007-09-06 | Shinshu Univ | ヒトリンパ管由来細胞株およびそれを用いた診断キット |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102018003906A1 (de) * | 2018-05-07 | 2019-11-07 | Smart Material Printing | Verwendung von Polyoxometallaten gegen den Befall von Eukaryotenkulturen, Virenkulturen und Mikroorganismenpopulationen durch Mollicuten sowie mollicutenhemmende und -abtötende polyoxometallathaltige Stoffe und Verfahren |
| CN111117962A (zh) * | 2019-12-24 | 2020-05-08 | 武汉博士德生物工程有限公司 | 一种有效去除支原体污染的方法 |
| KR102368575B1 (ko) | 2021-08-17 | 2022-02-28 | 주식회사 퀀텀바이오닉스 | 항 마이코플라즈마 기능을 제공하는 배양용기 및 그 제조방법 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4387161A (en) * | 1981-07-16 | 1983-06-07 | Institute For Medical Research | Detection of mycoplasma infection in cell cultures |
| DE3617803A1 (de) * | 1985-11-07 | 1987-11-19 | Bayer Ag | Verwendung von gyrasehemmern zur dekontamination von mycoplasma-infizierten zellkulturen |
| JP2709604B2 (ja) * | 1988-06-29 | 1998-02-04 | 大日本製薬株式会社 | マイコプラズマ汚染の防止または除去 |
-
1989
- 1989-05-26 DE DE3917163A patent/DE3917163A1/de active Granted
-
1990
- 1990-05-24 KR KR1019900007513A patent/KR100220988B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1990-05-24 AU AU55900/90A patent/AU617052B2/en not_active Ceased
- 1990-05-24 PT PT94145A patent/PT94145B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-05-25 DE DE59008875T patent/DE59008875D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-05-25 DK DK90109939.0T patent/DK0399545T3/da active
- 1990-05-25 EP EP90109939A patent/EP0399545B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-05-25 IE IE189390A patent/IE66910B1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-05-25 AT AT90109939T patent/ATE121131T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-05-25 JP JP2134256A patent/JP2934482B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-05-25 CA CA002017568A patent/CA2017568A1/en not_active Abandoned
- 1990-05-25 ES ES90109939T patent/ES2072331T3/es not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-02-03 US US08/012,985 patent/US5902740A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007222155A (ja) * | 2006-01-27 | 2007-09-06 | Shinshu Univ | ヒトリンパ管由来細胞株およびそれを用いた診断キット |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3917163C2 (ja) | 1991-04-25 |
| PT94145B (pt) | 1996-12-31 |
| EP0399545A3 (de) | 1991-01-02 |
| ES2072331T3 (es) | 1995-07-16 |
| JP2934482B2 (ja) | 1999-08-16 |
| US5902740A (en) | 1999-05-11 |
| AU617052B2 (en) | 1991-11-14 |
| KR100220988B1 (ko) | 1999-10-01 |
| DE3917163A1 (de) | 1990-12-06 |
| IE901893L (en) | 1990-11-26 |
| ATE121131T1 (de) | 1995-04-15 |
| AU5590090A (en) | 1990-11-29 |
| DE59008875D1 (de) | 1995-05-18 |
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