JPH03133901A - 生体細胞の凍結保存方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、生体細胞を、高い生存率で生存させたままで
凍結保存するための方法に間する。

従来の技術 従来から、生体細胞を凍害保護剤を用いずに凍結保存す
るためには、細胞内水分を非晶質として凍結するか、あ
るいは水晶ができても極めてｒＲ細であるように凍結し
、細胞が凍害な受けずに凍結することを目的として、極
めて急速な冷却速度つまり６０００℃／分以上の超急速
で冷却する方法が試みられている。

高速度で生体細胞を冷却するために、従来では、その生
体細胞を液体窒素のスラッシュに浸漬する方法、および
生体細胞を液体フロンに浸漬する方法がある。これらの
方法では、冷却速度が遅く、そのため血球細胞などのよ
うに含水率の高い細胞には適応することができない、実
際、赤血球に対し、この方法を用いた場合、許容される
大きさ以上の氷晶が多数生成し、生体細胞が生存不可能
な状芯であることが、本件発明者によって確認された。

゛生体細胞を高速度で冷却する池の従来がらの方法は、
生体細胞を、冷却された金属塊上に噴霧する方法、およ
び生体細胞を液体ヘリウム蒸気中に噴霧する方法がある
。このような方法では、試料である生体細胞を、ｍｓ粒
子として凍結するので、求める冷却速度が得られている
がどうかを確認することが困難であり、たとえ生体細胞
の生存が確認することができても、真に超急速凍結によ
る生存を確認するには至っていない。

発明が解決しようとする課題 本発明の目的は、生体細胞を高速度で冷却して、その生
存率を格段に向上することができるようにした新規な生
体細胞の凍結保存方法を提供することである。

課題を解決するための手段 本発明は、生体細胞を保持部材に保持し。

この生体細胞を、極低温に冷却された熱良導体から成る
冷却部材に、当接させて、 １０３℃／分以上の冷却速度で冷却し、その冷却後に、
保持部材とともに、生体細胞を、−１３０℃未満の温度
範囲で、極低温液化ガスに浸漬すること、あるいは当該
ガス雰囲気中に保持することを特徴とする生体細胞の凍
結保存方法である。

作　　用 本発明に従えば、冷却部材は極低温液化ガス、たとえば
液体窒素および液体ヘリウムなどで冷却しておき、この
冷却部材は熱良導体から成る。生体細胞は保持部材に保
持しておき、この生体細胞を冷却部材に当接させる。こ
れによって、固体である冷却部材と生体細胞とが直接に
接触し、こうして固体から液体へ、または固体から固体
への直接の熱伝導現象を行わせることができ、これによ
って生体細胞の熱移動速度を高めることができ、したが
って生体細胞の生存率が高い１０３°Ｃ／分以上の冷却
速度で、生体細胞の冷却を行うことができる。

生体細胞を冷却した後には、保持部材とともに、生体細
胞を一１３０℃未満の温度範囲で極低温液化ガスに浸漬
するようにしたので、生体細胞中の水は常に非晶質の氷
となっており、結晶の氷には転移せず、したがって生体
細胞を高い生存率で凍結したままで、保存することが可
能である。

生体細胞は、たとえば赤血球および血小板などの血液細
胞、骨髄細胞、精子、卵子ならびに培養細胞などであっ
てもよい。

実施例 第１図は、本発明の一実施例の全体の構成を示す断面図
である。基台１上に立設された支柱２の上部には、案内
ローラ３が設けられ、案内棒４が鉛直方向に昇降可能と
なっている。この案内棒４の下部には取付体５が固定さ
れており、この取付体５の下端部には試料台である取付
部材６が着脱可能に取付けられる。取付体５にはまた、
強磁性材料、たとえば鉄などから成る環状の吸着部材７
が固定される。

基台１上には、寒剤である極低温液化ガス、たとえば液
体ヘリウム８が貯留された容器９が設けられており、こ
の容器９には接続口１０からヘリウムガスが供給される
。容器９内に設けられた筒体１１の下端部は液体ヘリウ
ム８に浸漬されており、その上端部は、断熱材から成る
コンテナ１２の下部に開口している。このコンテナ１２
内には冷却部材１３が配置され、この冷却部材１３の外
周面とコンテナ１２の内周面との間の空間１４から気化
したヘリウムガスが放散される。

冷却部材１３は、熱良導体である高純度の銀、銀などの
金属であってもよく、あるいはまたサファイアなどの材
料から成ってもよく、その熱容Ｉは生体細胞である試料
２５（次に述べる第２図参照）などよりら充分に大きく
選ばれ、したがって冷却部材１３は常に極低温、たとえ
ば−２６９℃付近に保たれる。液体ヘリウムに代えて、
液体窒素を用いることもでき、そのとき冷却部材１３は
一１９６℃付近に冷却されて保たれる。

冷却部材１３の上端面１６は、水平であり、鏡面仕上げ
が施される。

コンテナ１２は取付片１７によって支柱２に固定されて
おり、この取付片１７には永久磁石片１８が固定されて
おり、これによって吸着部材７を磁気吸着することがで
きる。コンテナ１２の上部は、Ｍ１９によって開閉可能
とされる。

第２図は、取付部材６付近の分解斜視図である。

取１寸部材６の下部は環状にくびれな係止部２０となっ
ており、その下端面２１は水平である。この下端面２１
上には、生木細胞である試料２５を保持する保持部材２
２が着脱可能に収付けられる。

第３図は、保持部材２２付近の拡大断面図である。保持
部材２２は、環状の合成樹脂材料などの断熱材から成る
スペーサ２３と、熱良導体、たとえばアルミニウムフォ
イルなどから成るシート２４とを有し、スペーサ２３と
シート２４とは接着剤によって固定される。シート２４
の厚みは、たとえば１０μｍとし、その熱容量を充分に
小さく選ぶ。このシート２４のスペーサ２３によって囲
まれた下面は、試料２５がたとえばマイクロピペットな
どによって載置されて、保持するための領域２４ａとな
っており、この試料は第３図において参照符２５で示さ
れる。シート２４の外周部には、係止片２６が周方向に
間隔をあけて形成されており、この係止片２６を仮想線
２７で示す状態から矢符２８のように折曲げて、取付部
材６の係止部２０に係止し、こうして保持部材２２を取
付部材６に取付けることができ、またこの係止片２６を
矢符２８の逆方向に開いて、保持部材２２を取付部材６
から取外すことができる。

シート２４と取付部材６の下端面２１との間には、温度
検出素子としての熱電対２９が介在される。このような
熱電対２９は、接着層４３に部分的に埋込まれて取付部
材６の下端面２１に取付けられる。接着層４３は、たと
えば粘着性を有する、いわゆる合成開眼などから成るい
わゆる両面テープであってもよく、熱電対２９の接続部
分２１は接着層４３から露出して、シート２４に当接す
る。

接着１４３は、断熱層としての働きを兼ねており、試料
２５およびシート２４の高速度の冷却を確実にする。こ
の熱電対２９は、熱容量が充分に小さくなるようにする
ために、異種金属から成る細線３０から成り、その接続
部分３１はシート２４の前記領域２４ａとは反対側の表
面２４ｂに接触する。こうして領域２４ａ、したがって
試料２５の温度を高精度で検出することができる。細線
３０は、たとえばコンスタンタンと銅とからそれぞれ成
ってもよい、細線３０間の熱起電力を電圧計たとえばオ
シロスコープ３２によって測定することによって、試料
２５の温度を測定することができる。

案内棒４には、突起３４が形成されており、電磁プラン
ジャ３５によって駆動されるストッパ３６が突起３４に
当接している状態では、案内棒４は上方位置で保たれ、
電磁ソレノイド３５が励磁されることによって、突起３
４とストッパ３゛６とが外れて、案内棒４がその自重で
、取付体５および取付部材６などとともに、落下するこ
とができる。

試料２５の凍結保存の手順を述べると、先ず取付部材６
を取付体５から取外した状態で、取＋＝１部材６には保
持部材２２を固定しておき、領域２４ａを上方に向けた
姿勢で、前述のようにマイクロピペットによって、生体
細胞である試料２５を領域２４ａに付着して保持する。

コンテナ１２は、蓋１つによって閉じたままとしておき
、これによって冷却部材１３は一１３０℃未満の極低温
に保っておく。

そこで、取付部材６を取付体５に固定する１塁１っは、
コンテナ１２を閉じているので、冷却部材１３の上端面
１６に空気中の酸素、窒素および水分等（たとえばＣＯ
２＞が結露して付着することを防ぐことができるととも
に、液体ヘリウムの気化したガスが試料２５に接触して
、その試料２５が不所望に冷却されるのを防ぐ。

そこで次に、謔１９ｆ！：移動してコンテナ１２の上部
を開き、その状態で電磁ソレノイド３５を励磁して、突
起３４からストッパ３６を外す、これによって、案内棒
４はローラ３によって案内されて取付体５、取付部材６
および保持部材２２などが自重で落下する。これによっ
て、スペーサ２３の下面２３ａは、第４図に明らかに示
されるように、冷却部材１３の上端面１６に衝突し、試
料２５は鏡面仕上げされている上端面１６に当接して圧
着される。スペーサ２３は、試料２５が過大な圧力で圧
縮されることを防いで、試料２５を保護する。吸着片７
は、永久磁石片１８によって磁気吸着され、こうして保
持部材２２のスペーサ２３が冷却部材１３の上端面１６
に衝突したときにおける上下の変動を防ぎ、試料２５を
上端面１６に圧着させる。これによって、試料２５は１
０３°Ｃ／分以上の冷却速度で、好ましくは１０４℃／
分以上の冷却速度で急速に冷却される。そのため、試料
２５の生存率を高くすることができる。

第５図は、試料２５の冷却速度と生存率との関係を示す
本件発明者の実験結果を示すグラフである。生存率は、
ライン１１，１２間の範囲内にある１本件発明に従って
、試料２５の冷却速度を１０３°Ｃ／分以上とすること
によって、生存率を高めることができ、特にその冷却速
度１０４℃／分以上とすることによって生存率をほぼ１
００％とすることができることが判る。

冷却部材１３の上端面１６は、前述のように鏡面仕上げ
されているので、試料２５の熱伝導が極めて良好であり
、しかもこの冷却部材１３の熱容量は、試料２５、シー
ト２４および温度検出素子２９の各熱容量に比べて充分
に大きいので、その上端面１６の温度はほぼ一定であり
、このことによって、試料２５を確実に、高速度で冷却
することができ、その試料２５に含まれている水分は非
晶質で凍結され、たとえ氷晶が生成されても、それは臣
めて［Ｈｌ　４１であって、生体細胞が凍害を受けるこ
とはない、試料２５と冷却部材１３の上端面１６との接
触状懸は、たとえば２〜３秒間保ってもよい。

そこで次に、案内棒４を上昇して試料２５と冷却部材１
３の上端面１６とを離間し、ソレノイド３５を消磁して
ストッパ３６によって突起３４を支えた状悪どし、この
状態で、次回の試料の凍結のために、取付体５から取付
部材６を取外し、第６図で示されるように、デユワ−ピ
ンまたは合成樹脂製容器などの禮３８内に貯留されてい
る液体窒素３つ内に浸漬する。この液体窒素３９内ζ、
ビ〉′セットを用いてシート２４の係止片２６を前述の
第３図の仮想線２７で示すように開いて、試ｒ１２５と
一体的となっている保持部材２２を取付部材６から取外
す。そこで、試料２５および保持部材２２を、き成樹脂
製容器４０内に液体窒素３つ内で、収納し、第７図に示
されるようにして断熱保存容器４１に貯留されている液
体窒素４２内に貯留する。こうして生体細胞を高い生存
率で、１３０℃未満の温度範囲で、その生体細胞の水分
が結晶に転移しない状態で、保存することができる。

試料２５の温度は熱電対２つによって測定され、この試
料２５は、熱容量の小さい熱良導体であるシート２・１
の領域２４ａに広い面積で接触し、したがって試料２５
の温度を間接的に、高精度で測定することができる。そ
のため、生木細胞である試料２５の急速凍結時における
温度変化を観察することができる。

保持部材２２のスペーサ２３の厚みｔ（前述の第３図参
照）を、たとえば１５．２５および５０μｍに変化して
、熱電対２つを用いてその試料２５の温度の時間経過を
観察することによって、試料２５の厚み方向の各部位の
組織が、どの程度の冷却速度で冷却されているかを正確
に知ることができ、これによって液体ヘリウムなどの寒
剤すなわち冷媒の違い、冷却部材１３の材質の違い、〜
冷却部材１３の上端面１６からの試料２５の深さの違い
によって冷却速度に及ぼす影響を知ることができる。こ
れによって、最適な冷却方法を見つけることが可能にな
る。

水な始めとする液体は、冷却速度を上げることによって
、生成する結晶の大きさが小さくなり、やがては非晶質
、すなわちアモルファス状となる。

生体細胞は、生成する氷晶の大きさが１０ｎｍ未満、ま
たは非晶コ状であれば、凍結解凍後も生存していると考
えられており、そういった状態含確実に遺りだすために
本発明を実施することができる。

本件発明者の実験によれば、液体ヘリウム８を用いて、
試［［２５を一２６９℃け近まて冷却したとき、その試
ｆ１２５は１１００Ｊｉ以上の厚みに亘って、６Ｘ１０
’°Ｃ／分以上の冷却速度が達成された。また、液体ヘ
リウム８の代りに液体窒素を用いて、試「Ｉ２５を一１
９０℃１」近まで冷却した場合、５０μ「１１以上の厚
みに亘って、６×１０″°Ｃ７′分以上の冷却速度が達
成された。このときの試料２５は、たとえば赤血球細胞
である。このようにして、生体細胞を凍結することによ
って、含水率が低く、容易に非晶質で凍結可能な細胞は
もとより、血球細胞のような高含水率の細胞においてら
、凍害保護剤を用いることなしに、凍結保存可能となり
、熱電対２９によってその温度をｆｌ！察することによ
って、生存率の予測を行うことができる。

第８図は、本発明の他の実施例の断面図である。

この実施例では、前述の熱電対２つに代えて、熱電対４
４が用いられる。この熱電対４４は、コンスタンクンの
薄膜４５の表面に銅の層４６を、蒸着またはスパッタリ
ングなどの薄膜技術を用いて形成し、こうしてコンスタ
ンタンと銅との接続部分の全体の形状を扇子にし、コン
スタンタンおよび銅の素線４７，４８を電圧計４９に接
続する。

層４６にはスペーサ２３が介在され、試料２５が層４６
の領域４６ａに保持される。この層４６とスペーサ２３
とは、試料２５を保持するための保持部材としての働き
を兼ねる。このような構成によれば、熱電対４４の熱容
量をさらに小さくして、試「Ｉ２５が冷却部材１３の上
端面１６に接触したときにおける温度計測における精度
の向上を、さらに図ることができる。

第９図は、第１図〜第７図の実施例の本件発明者による
実験結果を示すグラフである。熱電対２つの熱起電力は
電圧計３２としてのオシロスコープによってａＳされ、
スペーサ２３の厚みｔは５０μｍとし、試料２５は血液
３０μ！であり、第９１１２１（１）によって得られた
温度の時間変化は、時間Ｗ１が拡大されて第９図（２）
で示されている。この実験によれば、冷却速度２、Ｉ　
Ｘ　１０’℃／分が得られたことが確認された。

本発明では、熱電対２９．４４は省略されてもよく、こ
のとき保持部材２２の一シート２４は、熱不良４体、す
なわち断熱材、たとえばテフロン（商品名）などの合成
樹脂から成ってもよい。

スペーサ２３は前述のように合成樹脂などの断熱材から
成り、たとえばテフロンがら成ってもよい 試料としてマイクロピペットによる液体状のものの付着
保持以外に、固体試料（たとえば肉片、細胞塊）をピン
セットで付着保持することもありうる。生木細胞の高速
冷却後、それを極低温液化ガスの気化した極低温ガス雰
囲気中に保持してもよい。

発明の効果 以上のように本発明によれば、釜水率の高い生体細胞を
、高い生存率で、凍結保存することが始めて可能になる
。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例の全体の構成を示す断面図、
第２図は取（＝ｆ部材６付近の分解斜視図、第３図は保
持部材２２付近の拡大断面図、第４図は試料２５を冷却
部材１３の上端面１６に圧着している状態を示す断面図
、第５図は生体細胞である試「１２５とその生存率との
関係を示すグラフ、第６図は試料２５の急速冷凍後に保
持部材２２ｆ！：収ｆ・を部材６がら取外ず作業を示す
斜視図、第７図は試ｆ：ｌ　２５を保存凍結した状態て
保存するときの構造３示す断面図、第８図は本発明の池
の実施例の断面図、第９［２Ｉは第１図〜第７図の実施
例の本件発明者による実験結果を示すグラフである。 ５・・・取付体、６・・・取付部材、８・・・液体ヘリ
ウム、１２・コンテナ、１３・・・冷却部材、１６・・
・上端面、２２・・・保持部材、２３・・・スペーサ、
２４・・・シート、２５・・試料、２９．４４・・・熱
電対、３２．４９電圧計、４３・・・接着層

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 　生体細胞を保持部材に保持し、 この生体細胞を、極低温に冷却された熱良導体から成る
   冷却部材に、当接させて、 １０＾３℃／分以上の冷却速度で冷却し、 その冷却後に、保持部材とともに、生体細胞を、−１３
   ０℃未満の温度範囲で、極低温液化ガスに浸漬すること
   、あるいは当該ガス雰囲気中に保持することを特徴とす
   る生体細胞の凍結保存方法。