JPH0314435B2 - - Google Patents
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- JPH0314435B2 JPH0314435B2 JP59105411A JP10541184A JPH0314435B2 JP H0314435 B2 JPH0314435 B2 JP H0314435B2 JP 59105411 A JP59105411 A JP 59105411A JP 10541184 A JP10541184 A JP 10541184A JP H0314435 B2 JPH0314435 B2 JP H0314435B2
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Description
本発明は、大腸菌と枯草菌のクローニングベク
ターとして有用な新規な複合プラスミドベクター
に関するものである。 更に詳細には、ストレプトコツカス・フエカリ
ス（Streptococcus faecalis）のプラスミド
pAMα1由来のテトラサイクリン耐性遺伝子領域
と、大腸菌（Escherichia coli）のベクター
pACYC177由来のアンピシリン耐性遺伝子領域
と、前記プラスミドのpAMα1由来の複製開始領
域及び前記ベクターpACYC177由来の複製開始
領域を有し、更に両端がそれぞれ制限酵素EcoR
とHindの認識切断配列である多重制限酵素
認識切断配列（以下、ポリリンカーという）を有
し、前記テトラサイクリン耐性遺伝子領域には、
制限酸素Bal、Hpa、EcoRの各々に対す
る前記ポリリンカー内以外の全領域中唯一の認識
切断部位が位置し、更に、前記アンピシリン耐性
遺伝子領域には制限酵素Pvu、Bgl、Pst、
Banの各々に対する前記ポリリンカー内以外の
全領域中唯一の認識切断部位が位置する、大腸菌
と枯草菌のクローニングベクターとして有用な、
複合プラスミドベクターに関するものであり、そ
の代表例として、pHY300PLK、pHY301PLK、
pHY302PLKなどがあげられる。 一般に、In vitro遺伝子操作では、所望の外来
遺伝子を宿主細胞内に移入させて、その遺伝情報
を発現させるためには、宿主細胞に適合したベク
ターを使用することが要請されれている。遺伝子
操作におけるベクターに関しては、研究例の多い
大腸菌の宿主−ベクター系にて最もよく開発され
ているが、最近では、大腸菌以外の微生物、例え
ば、工業的に有用な微生物である枯草菌、抗生物
質の生産菌である放線菌、醸造分野で広く利用さ
れている酵母などに関しても、宿主−ベクター系
の開発研究が活発に行われている。 ところで、ベクターとしての必須条件が、自己
複製に必要な遺伝子配列と、外来遺伝子を挿入す
るための制限酵素の認識切断部位の存在であるこ
とが知られてはいるが、実用化のためには、例え
ば、遺伝子操作を可能にし、且つ、容易にするた
めに利用可能な制限酵素の種類とその認識切断部
位の多様性、形質発現の高効率性、形質転換体の
検出等に必要なマーカー遺伝子の存在、宿主細胞
との適合性と宿主域、宿主細胞内での安定性、更
には、仮想される生物的封じ込めに対する適合性
など、種々の条件を全て満たすような厳しい特性
が要請されることから、大腸菌、枯草菌の宿主−
ベクター系に関しても実際上有用なベクターの開
発例が余り多くはないのが現状である。 かかる現状に鑑み、本発明者らは、これまで
に、その生物学的性状が最もよく解明されている
大腸菌、及びアミラーゼなどの生産菌として工業
的に有用な枯草菌について、その宿主−ベクター
系を確立すべく、有用プラスミドベクターの開発
研究を積重ねてきた。その結果ストレプトコツカ
ス・フエカリス（Streptococcus faecalis）のプ
ラスミドpAMα1と、大腸菌のベクター
pACYC177とから合成した複合プラスミドの誘
導体が、大腸菌及び枯草菌の遺伝子操作における
ベクターとして好適な諸特性を保有していること
を見出し、これまでにも有用な各種誘導体につい
て特許出願を行つてきた（特願昭58−9739号、特
願昭58−9740号、特願昭58−103196号、特願昭58
−159345号、及び特願昭59−2361号）。 そして、本発明者らは、更に、有用なプラスミ
ドベクターを開発すべく鋭意研究を積重ねた結
果、これまでのベクターが有する優れた特性を失
うことなく、かつ多様の制限酵素を利用すること
ができる優れたシヤトルベクターを開発すること
に成功して、本発明を完成することに至つた。 本発明の複合プラスミドベクターは、ストレプ
トコツカス・フエカリス（Streptococcus
faecalis）DS5（ATCC14508）のプラスミド
pAMα1と、大腸菌のベクターpACYC177とを、
上記pAMα1由来のテトラサイクリン耐性遺伝子
領域（Tc）と、上記pACYC177由来のアンピシ
リン耐性遺伝子領域（Amp）と、更に、上記
pAMα1由来の複製開始領域（Ori pAM α1）及
び上記pACYC177由来の複製開始領域（Ori
177）の双方を含むように、酵素的に切断し、両
端がそれぞれ制限酵素EcoRと、Hindの認識
切断部位であるポリリンカーを挿入して、連結す
るとにより、作製した複合プラスミドベクターで
ある。 この複合プラスミドベクターは、そのDNA上
にテトラサイクリン及びアンピシリンに対する耐
性遺伝子領域を有しているので、大腸菌の形質転
換に際しては、宿主細胞に対して両薬剤に関する
耐性形質を付与する特性を備えている。更に、枯
草菌の形質転換に際しては、宿主細胞に対してテ
トラサイクリンに関する耐性形質を付与する特性
を備えている。この特性は、所望の外来遺伝子を
組込んだ組換えプラスミドの保有菌株、すなわ
ち、形質転換体を取得するに際して、その検出及
び選択を行うための選択マーカーの役割を果すも
のである。加えて、この複合プラスミドベクター
のテトラサイクリン耐性遺伝子領域には、制限酵
素Bal、Hpa、及びEcoRの各々に対する
ポリリンカー内以外の全領域中唯一の認識切断部
位が位置し、更に、そのアンピシリン耐性遺伝子
領域には、制限酵素Bgl、Pvu、Pst及び
Banの各々に対するポリリンカー内以外の全領
域中唯一の認識切断部位が位置しているので、か
かる制限酵素により、この発明に係わる複合プラ
スミドベクターを特異的に切断する場合、ポリリ
ンカー内に同一の制限酵素認識切断部位が存在し
ていない限り、該ベクター中に不所望の多数の切
断部位を生じてこれが断片化してしまうことはな
い。 しかして、上記全領域中唯一の切断部位のいず
れかを所望の外来の異種遺伝子の挿入箇所として
使用することができるものである。 更に、この複合プラスミドベクターは両端がそ
れぞれ制限酵素EcoRとHindの認識切断部位
であるポリリンカーを挿入して、各種のクローニ
ングサイトを付加することにより、クローニング
ベクターとして、一層改良されたものとなつてい
る。 本発明に係わる複合プラスミドベクターは、大
腸菌の他に枯草菌中でも、前述の複製開始領域が
適切に作用して、安定に増殖するので、大腸菌と
枯草菌の間を往復できるシヤトルベクター
（Shuttle Vector）としての特質を備えているも
のであり、両菌での形質転換効率がほぼ等しいも
のである。 付言するならば、現在、最も研究開発の進んだ
DNA クローニングシステムは、グラム陰性菌
の大腸菌とそのベクター系（EK系）であつて、
このシステムでは、グラム陰性菌の由来する遺伝
子及びグラム陽性菌に由来するある種の遺伝子を
形質発現させることができる。 ところが、一方、グラム陰性菌の系に関して
は、解明すべき問題点がより多く残されているの
で、今日、多大の関心が払われている。特にグラ
ム陽性菌のうち、枯草菌（Bacillus subtilis）に
関しては、実用上種々の利点を持つ有用な微生物
である反面、その生物学的性状が大腸菌のそれと
は全く異つているので、近年、その遺伝的解析、
更には、遺伝子のクローニングシステムの開発が
非常な関心事となつている。 しかして、かかる現状下で、枯草菌の宿主−ベ
クター系を確立することは切迫した産業上の要請
となつているから、本発明者らが、グラム陰性菌
の代表菌種である大腸菌とグラム陽性菌の代表菌
種である枯草菌の間を往復できる低分子量の新規
シヤトルベクターを開発し得たことは、グラム陽
性菌のDNAクローニングシステムの確立への一
つの段階を克服するものとして意義深く、しかし
て、この発明に係わる複合プラスミドベクターは
産業的に有用なものである。 そればかりか、他のグラム陽性菌、例えば、ラ
クトバチルス属（Lactobacillus）、ビヒドバクテ
リウム属（Bifidobacterium）などに属する微生
物の遺伝子の解析や分子育種の面にも拡張的に活
用できる可能性を有している点で産業上有望なも
のである。 本発明の複合プラスミドベクターの合成経路を
第１図に基づいて説明すれば以下の通りである。 複合プラスミドpHY340（特願昭58−159345号
にて開示）が有する２ケ所の制限酵素EcoR認
識切断部位のうちの一方（第１図中左側）を削除
すべく制限酵素EcoRにより部分切断処理し、
低融点アガロースゲル電気泳動を行つて分子量約
3.4Mdのバンド部分を切り出し、次いでT4ポリ
メラーゼ処理及びT4リガーゼ処理を施すことに
よつて、環状化した。これを大腸菌に導入し、得
られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、
EcoRとSacとの二重切断処理により、約
0.4Mdの小断片の生じるプラスミドをpHY339と
命名した。次にこのpHY339をSacで切断し、
T4ポリメラーゼ処理後、Hindリンカー（dp
CAAGCTTG）を加えてT4リガーゼで処理し、
pHY336を得た。このpHY336のEcoRとHind
認識切断部位にはさまれた領域を切除し、その
部分にポリリンカー、例えばπAN7由来の、 EcoR−Sma Xma−BamH−Sal Acc Hinc−Pst−Bgl−Xba−Hind の制限酵素認識配列を有するDNA断片、を挿入
した。 本発明で使用されるポリリンカーとしては、前
出の、 EcoR−Sma Xma−BamH−Sal Acc Hinc−Pst−Bgl−Xba−Hind の制限酵素認識配列を有するDNA断片、5′−
GAATTCCCGGGGATCCGTCGACCTGCAGA
ＴＣＴＣＴＡＧＡＡＧＣＴＴ−3′のほか EcoR−Sma Xma−BamH−Sal Acc Hinc−Pst−Hind の制限酵素認識配列を有するDNA断片、5′−
GAATTCCCGGGGATCCGTCGACCTGCAGC
ＣＡＡＧＣＴＴ−3′ EcoR−Sst−Sma Xma−BamH−Xba−Sal Acc Hinc−Pst−Hind の制限酵素認識配列を有するDNA断片、5′−
GAATTCGAGCTCGCCCGGGGATCC TCTAGATCGACCTGCAGCCCAAGCTT−
3′などがあるが、それ以外にも任意に合成したも
の等如何なるものであつても、本発明のポリリン
カーになりうることはいうまでもない。 続いて、本発明の実施例について説明すれば以
下の通りである。 実施例 １ (1) pHY340のEcoR切断部位の部分削除
（pHY339の作製）53μ1のpHY340 DNA（100μ
ｇ／ml）に、5.7μの10倍濃度緩衝液（100ｍ
Ｍ Tris−HCl（PH7.6）、70ｍＭ MgClO2、70
ｍＭ β−メルカプトエタノール、500ｍＭ
NaCl）を加えた後、EcoR（6u／μ）を
2μ添加し、これを３等分し、37℃にてそれ
ぞれ15、20、25分間反応させた。70℃で５分間
加熱することにより反応を停止させた後、１％
低融点アガロースゲル（Bethesda Research
Laboratories、Inc.（U.S.A.）社製、1μｇ／ml
エチジウムブロマイドを含む）電気泳動を行
い、EcoRにて１カ所が切断された分子量約
3.4Mdのバンドを切り出した。これに２倍量の
緩衝液（40ｍＭ Tris、20ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、１ｍM2Na−EDTA）を加え、65℃の湯
浴中で溶かした後、室温までさまし、等量のフ
エノールを加えてよく振とうした。次に室温に
て15000rpm3分間遠心分離処理をした後、
DNAを含む水層を採取し、再び等量のフエノ
ールを加え前記操作を繰返し、DNAを含む水
層を採取した。これに200μ緩衝液（50ｍＭ
Tris、10ｍＭ EDTA、100ｍＭ、NaCl（PH
8.0））を加え、更に全量の２倍量の−20℃の冷
エタノールを加え、−20℃にて30分間冷却した。
これを０℃にて15000rpm5分間遠心分離し、
DNA沈澱物を再び−20℃エタノールで洗浄し
た。再び０℃にて15000rpm2分間遠心分離処理
を行い、上清のエタノールを捨て、沈澱に残つ
ているエタノールを完全に蒸発させた。得らた
DNAに5μの減菌水を加えてDNAを溶解し、
10倍濃度のT4ポリメラーゼ緩衝液（670ｍＭ
Tris−HCl（PH8.0）、67ｍＭ MgClO2、70ｍＭ
β−メルカプトエタノール）2μ、減菌水
8μ、2.5ｍＭ dNTPs（dATP、dGTP、
dCTP、TTP）0.8μを加え、更に4u／μの
T4 DNAポリメラーゼを0.5μを加え37℃で
15分間反応させた。200μの50ｍMTris−10
ｍＭ EDTA−100ｍＭ NaClを加え、更に
フエノールを加えて酵素を失活させた。次に前
記の冷エタノール沈澱法によりDNAを回収し
た。得られたDNAに20μの減菌水を加えて
溶解させ、3μの10ｍＭ、ATP、3μの100ｍ
Ｍジチオスレイトール、3μの660ｍＭ Tris
−HCl（PH7.6）−66ｍＭ MgClO2を加え、更に
3u／μのT4リガーゼを1μ加えた。15℃で
３時間反応を行なわせた後、120μの減菌水
を加え全量を150μとした。 (2) 大腸菌の形質転換 (1)で得られたプラスミドDNA150μ（約
0.5μｇ）に150μの大腸菌コンピテント細胞を
加え、０℃で10分間放置した後、0.7mlのＬ−
ブロスを加えて、37℃にて１時間培養した。次
いで、この培養液をＬ−ブロスに1.5％寒天と
20μｇ／mlテトラサイクリンを添加して成る寒
天培地の表面に塗布して、37℃にて一夜培養し
た。この寒天培地上にコロニーを形成した４株
の形質転換体について、保有プラスミドの大き
さを調べた。 (3) プラスミドの抽出と分子量の測定及びEcoR
切断部位の確認 前記(2)で得られた形質転換体を、0.2mlの0.2
mg／mlリゾチーム−0.05mg／ml RNaseに溶解
し、これに0.2mlの0.2％SDS溶液を加え室温で
１〜２分間反応させ、０℃にて10分間放置後、
この溶液を20000rpmで０℃、10分間、遠心分
離処理した。分離された上清に緩衝液Ａ（10ｍ
Ｍ Tris−0.1ｍＭ EDTA（PH7.4））で飽和し
たフエノールを等量加え、よく振とうした。更
にこれを15000rpm、室温、３分間、遠心分離
処理し、DNAを含む水層を採取し、15μづ
つ0.8％アガロースゲル電気泳動させて、その
分子量を測定した。その結果４株の形質転換体
の分子量は、皆、約3.4Mdであつた。 次にこの４株の形質転換体のうち目的どう
り、左側のEcoR切断部位が削除されたもの
をさがすために、泳動に使用した残りの、
DNAを含む水層から冷エタノール法により
DNAを回収した。これに100μの緩衝液Ａを
加えて溶解した。 このプラスミドDNA10μに２倍濃度緩衝
液（20ｍＭ Tris−HCl（PH7.6）、14ｍＭ
MgClO2、14ｍＭ β−メルカプトエタノー
ル、100ｍＭ NaCl）を10μ加えた後、更に
6u／μのEcoRを2μ添加し、これを37
℃、60分間反応させた。そして70℃、５分間で
この反応を停止させ、全量を0.8％アガロース
ゲルで泳動させた。その結果、EcoRで一ケ
所切断されたものが２種類採取された。次にこ
の採取された各々のプラスミドDNA10μに
２倍濃度緩衝液（20ｍＭ Tris−HCl（PH7.6）、
14ｍMMgClO2、14ｍＭ β−メルカプトエタ
ノール、100ｍＭ NaCl）を10μ加え、そこ
に5u／μのSacと6u／μのEcoRを
各々2μ添加し、これを37℃、60分間混合反
応を行い、70℃、５分間で、この反応を停止さ
せ、全量を0.8％アガロースゲルで電気泳動さ
せた。その結果、目的どうりに、左側のEcoR
切断部位が削除されたプラスミドが１つ得ら
れたことを確認した。 これを、pHY339と命名した。 （第１図 pHY339） (4) Hindリンカーの挿入 30μのプラスミドDNA（pHY339約0.1mg／
ml）に5μの10倍濃度処理（100ｍＭ Tris−
HCl（PH7.6）−70ｍＭ MgClO2、70ｍＭ β−
メルカプトエタノール、500ｍＭ NaCl）を加
えた後、8u／μのSacを5μ添加し、これ
を37℃、60分間反応させた。そして70℃、５分
間でこの反応を停止させた後、(1)の１％低融点
アガロースゲル（lμｇ／mlエチジウムブロマイ
ドを含む）電気泳動法により、Sacで切断さ
れた、分子量約3.4MdのDNAのバンドを切り
出し、フエノール処理および冷エタノール沈澱
法によりDNAを回収した。これに20μの緩
衝液Ａを加え溶解した。このうち5μについ
て、0.8％アガロースゲル電気泳動を行つたと
ころ、分子量が約3.4メガダルトンであること
を確認した。残りのDNAフラグメント15μ
について前記(1)と同様の方法でT4ポリメラー
ゼ処理を行なつて、フラツシユエンドにしてか
ら、フエノール処理および冷エタノール沈澱法
によりDNAを回収した。得られたDNAに20μ
の緩衝液Ａを加えて溶解させ、Hindリン
カー（dpCAAGCTTG、宝酒造製；0.010D／
ml）を1μを加えて前記(1)と同様の条件でT4
リガーゼ処理を行ない、リンカーを連結させた
後、120μの減菌水を加えて全量を150μと
した。 (5) 大腸菌の形質転換 前記(4)の処理で得られた150μのプラスミ
ドDNA（約1μｇ）について、前記(2)と同様の
方法で形質転換を行つた。 (6) プラスミドの抽出と分子量の測定及びHind
切断部位の確認 形質転換体について前記(3)と同様の方法で、
プラスミドDNAを抽出し、分子量を測定した
ところ、約3.4Mdであつた。次にこのプラスミ
ドにHindリンカーが挿入されていることを
確認した。即ち、このプラスミドDNA20μ
に、10倍濃度緩衝液（100ｍＭ Tris−HCl（PH
7.6）、70ｍＭ MgClO2、70ｍＭ β−メルカ
プトエタノール、500ｍＭ NaCl）2μを加え
た後、更に10u／μのHindを3μ添加し、
これを37℃、90分間反応させた。そして70℃、
５分間でこの反応を停止させ、全量を0.8％ア
ガロースゲルで泳動した。その結果Hindで
切断されるプラスミドが得られた。これを
pHY336と命名した。（第１図 pHY336） (7) ポリリンカーの調整 (i) ポリリンカー（EcoR−Sma Xma−BamH−Sal Acc Hinc−Pst−Bgl−Xba−Hind） の調整20μのプラスミドπAN7（東京大学応用微
生物学研究所斉藤日向教授研究室所有）（２mg／
ml）に3μの10倍濃度緩衝液（100ｍＭ Tris.
HCl（PH7.6）、70ｍＭ MgCl2、70ｍＭ β−メ
ルカプトエタノール、500ｍＭ NaCl）と、5μ
の減菌水を加え、更に10u／μのHindを3μ
添加し、37℃にし60分間反応した。次いで6u／
μのEcoRを3μ添加し、37℃にて60分間反
応させた。次にポリリンカー以外のDNAフラグ
メントを細かく切断するために、3.5u／μの
Hae2μを添加し、37℃にて60分間反応させ
た。そして、70℃にて５分間加熱して反応を停止
させた。これに前記(1)と同様にフエノール処理、
冷エタノール処理を行ない沈澱したDNAを採取
した。 (ii) ベクターの調製 30μのプラスミドpHY336（約0.1mg／ml）
に3.5μの10倍濃度緩衝液（100ｍＭ Tris
−HCl（PH7.6）、70ｍＭ MgClO2、70ｍＭ
β−メルカプトエタノール、500ｍＭ
NaCl）を加えた後、更に、10u／μの
Hind、3μを添加し、これを37℃、60分
間反応させた。続いて、6u／μのEcoR
、3μを添加し、37℃、60分間反応させ
た。そして、70℃、５分間でこの反応を停止
させた後0.8％アガロースゲルで、5μ電気
泳動させて、HindとEcoRで完全に切断
されたことが確認され、前記(1)と同様の方法
でフエノール処理、冷エタノールに処理を行
ない、DNAを回収した。 (iii) ポリリンカーとベクターの連結 (i)で得られたポリリンカーと、(ii)で得られ
たベクターをそれぞれ10μの減菌水に溶解
し、混合した後、前記(1)と同様の条件で連結
を行ない全量を150μとした。 (8) 大腸菌の形質転換 前記(7)の(iii)で得られたDNA（約1μｇ）につ
いて前記(2)と同様の方法で形質転換を行なつ
た。次に、形質転換体について保有プラスミド
の大きさを調べた。 (9) プラスミドの抽出と分子量の測定及びポリリ
ンカーの存在の確認 任意に抽出した40株の形質転換体より、前記
(3)と同様の方法でプラスミドDNAを抽出し分
子量を測定した。このうち分子量が約3.0Mdに
なつているものを選出し、フエノール処理を行
ない、前記(1)と同様の方法で、DNAを回収し
た。次に、本当にポリリンカーが挿入されたか
否かを確認するために、ポリリンカーの各切断
部位（EcoR、Sma、BamH、Sal、−
Pst、Bgl、Xba、Hind）に対応する
制限酵素でそれぞれの切断部位を切断した。す
なわち、先に得られたプラスミドDNAを100μ
の緩衝液Ａに溶解したものを、10μずつ８
組用意し、そこへ２倍濃度緩衝液（20ｍＭ
Tris−HCl（PH7.6）、14ｍＭ MgCl 14ｍMβ−
メルカプトエタノール、100ｍＭ NaCl）を
10μ加えた後、更に、各制限酵素（6u／μ
）のEcoR、4u／μのSma、1u／μ
のBamH、8u／μのSal、5u／μの
Pst、4.5u／μのBgl、9u／μのXba
、10u／μのHind）をそれぞれ1μ添加
し37℃にて60分間反応させた。そして70℃、５
分間でこの反応を停止させた後、それぞれ、全
量を0.8％アガロースゲルで泳動させた。その
結果、全て完全に切断されていた。このことか
ら、プラスミドDNA pHY336にポリリンカー
が挿入されたということが確認された。そして
これをpHY300PLKと命名した。 (10) 大腸菌と枯草菌の形質転換 前記(9)で得られたDNAが、シヤトルベクタ
ーであることを確認するために大腸菌と枯草菌
の形質転換を行つた。この際コントロールとし
てpHY340とpHY460を使用した。 (i) 大腸菌の形質転換 前記(9)で得られたDNA（1μｇ）とプラス
ミドpHY340（1μｇ）及びpHY460（1μｇ）、
各5μにそれぞれ、100μの大腸菌コンピ
テント細胞を加え、０℃にて15分間吸着導入
処理を行つた後、0.9mlのＬ−ブロスを加え
て、37℃にて１時間培養した。次いで、この
培養液をＬ−ブロスに1.5％寒天と20μｇ／ml
のテトラサイクリンを添加して成る寒天培地
の表面に塗布して、37℃で一夜培養した。そ
の結果を第１表に示す。 (ii) 枯草菌の形質転換 前記(9)で得られたDNA（lμｇ）とプラスミ
ドpHT340（lμｇ）及びpHY460（1μｇ）、各
10μにそれぞれ、500μの枯草菌のコンピ
テント細胞を加え、37℃で、90分間振とう培
養した。次いでこの培養液を(i)と同様の寒天
培地に塗布して37℃で一夜培養した。その結
果を第１表に示す。
ターとして有用な新規な複合プラスミドベクター
に関するものである。 更に詳細には、ストレプトコツカス・フエカリ
ス（Streptococcus faecalis）のプラスミド
pAMα1由来のテトラサイクリン耐性遺伝子領域
と、大腸菌（Escherichia coli）のベクター
pACYC177由来のアンピシリン耐性遺伝子領域
と、前記プラスミドのpAMα1由来の複製開始領
域及び前記ベクターpACYC177由来の複製開始
領域を有し、更に両端がそれぞれ制限酵素EcoR
とHindの認識切断配列である多重制限酵素
認識切断配列（以下、ポリリンカーという）を有
し、前記テトラサイクリン耐性遺伝子領域には、
制限酸素Bal、Hpa、EcoRの各々に対す
る前記ポリリンカー内以外の全領域中唯一の認識
切断部位が位置し、更に、前記アンピシリン耐性
遺伝子領域には制限酵素Pvu、Bgl、Pst、
Banの各々に対する前記ポリリンカー内以外の
全領域中唯一の認識切断部位が位置する、大腸菌
と枯草菌のクローニングベクターとして有用な、
複合プラスミドベクターに関するものであり、そ
の代表例として、pHY300PLK、pHY301PLK、
pHY302PLKなどがあげられる。 一般に、In vitro遺伝子操作では、所望の外来
遺伝子を宿主細胞内に移入させて、その遺伝情報
を発現させるためには、宿主細胞に適合したベク
ターを使用することが要請されれている。遺伝子
操作におけるベクターに関しては、研究例の多い
大腸菌の宿主−ベクター系にて最もよく開発され
ているが、最近では、大腸菌以外の微生物、例え
ば、工業的に有用な微生物である枯草菌、抗生物
質の生産菌である放線菌、醸造分野で広く利用さ
れている酵母などに関しても、宿主−ベクター系
の開発研究が活発に行われている。 ところで、ベクターとしての必須条件が、自己
複製に必要な遺伝子配列と、外来遺伝子を挿入す
るための制限酵素の認識切断部位の存在であるこ
とが知られてはいるが、実用化のためには、例え
ば、遺伝子操作を可能にし、且つ、容易にするた
めに利用可能な制限酵素の種類とその認識切断部
位の多様性、形質発現の高効率性、形質転換体の
検出等に必要なマーカー遺伝子の存在、宿主細胞
との適合性と宿主域、宿主細胞内での安定性、更
には、仮想される生物的封じ込めに対する適合性
など、種々の条件を全て満たすような厳しい特性
が要請されることから、大腸菌、枯草菌の宿主−
ベクター系に関しても実際上有用なベクターの開
発例が余り多くはないのが現状である。 かかる現状に鑑み、本発明者らは、これまで
に、その生物学的性状が最もよく解明されている
大腸菌、及びアミラーゼなどの生産菌として工業
的に有用な枯草菌について、その宿主−ベクター
系を確立すべく、有用プラスミドベクターの開発
研究を積重ねてきた。その結果ストレプトコツカ
ス・フエカリス（Streptococcus faecalis）のプ
ラスミドpAMα1と、大腸菌のベクター
pACYC177とから合成した複合プラスミドの誘
導体が、大腸菌及び枯草菌の遺伝子操作における
ベクターとして好適な諸特性を保有していること
を見出し、これまでにも有用な各種誘導体につい
て特許出願を行つてきた（特願昭58−9739号、特
願昭58−9740号、特願昭58−103196号、特願昭58
−159345号、及び特願昭59−2361号）。 そして、本発明者らは、更に、有用なプラスミ
ドベクターを開発すべく鋭意研究を積重ねた結
果、これまでのベクターが有する優れた特性を失
うことなく、かつ多様の制限酵素を利用すること
ができる優れたシヤトルベクターを開発すること
に成功して、本発明を完成することに至つた。 本発明の複合プラスミドベクターは、ストレプ
トコツカス・フエカリス（Streptococcus
faecalis）DS5（ATCC14508）のプラスミド
pAMα1と、大腸菌のベクターpACYC177とを、
上記pAMα1由来のテトラサイクリン耐性遺伝子
領域（Tc）と、上記pACYC177由来のアンピシ
リン耐性遺伝子領域（Amp）と、更に、上記
pAMα1由来の複製開始領域（Ori pAM α1）及
び上記pACYC177由来の複製開始領域（Ori
177）の双方を含むように、酵素的に切断し、両
端がそれぞれ制限酵素EcoRと、Hindの認識
切断部位であるポリリンカーを挿入して、連結す
るとにより、作製した複合プラスミドベクターで
ある。 この複合プラスミドベクターは、そのDNA上
にテトラサイクリン及びアンピシリンに対する耐
性遺伝子領域を有しているので、大腸菌の形質転
換に際しては、宿主細胞に対して両薬剤に関する
耐性形質を付与する特性を備えている。更に、枯
草菌の形質転換に際しては、宿主細胞に対してテ
トラサイクリンに関する耐性形質を付与する特性
を備えている。この特性は、所望の外来遺伝子を
組込んだ組換えプラスミドの保有菌株、すなわ
ち、形質転換体を取得するに際して、その検出及
び選択を行うための選択マーカーの役割を果すも
のである。加えて、この複合プラスミドベクター
のテトラサイクリン耐性遺伝子領域には、制限酵
素Bal、Hpa、及びEcoRの各々に対する
ポリリンカー内以外の全領域中唯一の認識切断部
位が位置し、更に、そのアンピシリン耐性遺伝子
領域には、制限酵素Bgl、Pvu、Pst及び
Banの各々に対するポリリンカー内以外の全領
域中唯一の認識切断部位が位置しているので、か
かる制限酵素により、この発明に係わる複合プラ
スミドベクターを特異的に切断する場合、ポリリ
ンカー内に同一の制限酵素認識切断部位が存在し
ていない限り、該ベクター中に不所望の多数の切
断部位を生じてこれが断片化してしまうことはな
い。 しかして、上記全領域中唯一の切断部位のいず
れかを所望の外来の異種遺伝子の挿入箇所として
使用することができるものである。 更に、この複合プラスミドベクターは両端がそ
れぞれ制限酵素EcoRとHindの認識切断部位
であるポリリンカーを挿入して、各種のクローニ
ングサイトを付加することにより、クローニング
ベクターとして、一層改良されたものとなつてい
る。 本発明に係わる複合プラスミドベクターは、大
腸菌の他に枯草菌中でも、前述の複製開始領域が
適切に作用して、安定に増殖するので、大腸菌と
枯草菌の間を往復できるシヤトルベクター
（Shuttle Vector）としての特質を備えているも
のであり、両菌での形質転換効率がほぼ等しいも
のである。 付言するならば、現在、最も研究開発の進んだ
DNA クローニングシステムは、グラム陰性菌
の大腸菌とそのベクター系（EK系）であつて、
このシステムでは、グラム陰性菌の由来する遺伝
子及びグラム陽性菌に由来するある種の遺伝子を
形質発現させることができる。 ところが、一方、グラム陰性菌の系に関して
は、解明すべき問題点がより多く残されているの
で、今日、多大の関心が払われている。特にグラ
ム陽性菌のうち、枯草菌（Bacillus subtilis）に
関しては、実用上種々の利点を持つ有用な微生物
である反面、その生物学的性状が大腸菌のそれと
は全く異つているので、近年、その遺伝的解析、
更には、遺伝子のクローニングシステムの開発が
非常な関心事となつている。 しかして、かかる現状下で、枯草菌の宿主−ベ
クター系を確立することは切迫した産業上の要請
となつているから、本発明者らが、グラム陰性菌
の代表菌種である大腸菌とグラム陽性菌の代表菌
種である枯草菌の間を往復できる低分子量の新規
シヤトルベクターを開発し得たことは、グラム陽
性菌のDNAクローニングシステムの確立への一
つの段階を克服するものとして意義深く、しかし
て、この発明に係わる複合プラスミドベクターは
産業的に有用なものである。 そればかりか、他のグラム陽性菌、例えば、ラ
クトバチルス属（Lactobacillus）、ビヒドバクテ
リウム属（Bifidobacterium）などに属する微生
物の遺伝子の解析や分子育種の面にも拡張的に活
用できる可能性を有している点で産業上有望なも
のである。 本発明の複合プラスミドベクターの合成経路を
第１図に基づいて説明すれば以下の通りである。 複合プラスミドpHY340（特願昭58−159345号
にて開示）が有する２ケ所の制限酵素EcoR認
識切断部位のうちの一方（第１図中左側）を削除
すべく制限酵素EcoRにより部分切断処理し、
低融点アガロースゲル電気泳動を行つて分子量約
3.4Mdのバンド部分を切り出し、次いでT4ポリ
メラーゼ処理及びT4リガーゼ処理を施すことに
よつて、環状化した。これを大腸菌に導入し、得
られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、
EcoRとSacとの二重切断処理により、約
0.4Mdの小断片の生じるプラスミドをpHY339と
命名した。次にこのpHY339をSacで切断し、
T4ポリメラーゼ処理後、Hindリンカー（dp
CAAGCTTG）を加えてT4リガーゼで処理し、
pHY336を得た。このpHY336のEcoRとHind
認識切断部位にはさまれた領域を切除し、その
部分にポリリンカー、例えばπAN7由来の、 EcoR−Sma Xma−BamH−Sal Acc Hinc−Pst−Bgl−Xba−Hind の制限酵素認識配列を有するDNA断片、を挿入
した。 本発明で使用されるポリリンカーとしては、前
出の、 EcoR−Sma Xma−BamH−Sal Acc Hinc−Pst−Bgl−Xba−Hind の制限酵素認識配列を有するDNA断片、5′−
GAATTCCCGGGGATCCGTCGACCTGCAGA
ＴＣＴＣＴＡＧＡＡＧＣＴＴ−3′のほか EcoR−Sma Xma−BamH−Sal Acc Hinc−Pst−Hind の制限酵素認識配列を有するDNA断片、5′−
GAATTCCCGGGGATCCGTCGACCTGCAGC
ＣＡＡＧＣＴＴ−3′ EcoR−Sst−Sma Xma−BamH−Xba−Sal Acc Hinc−Pst−Hind の制限酵素認識配列を有するDNA断片、5′−
GAATTCGAGCTCGCCCGGGGATCC TCTAGATCGACCTGCAGCCCAAGCTT−
3′などがあるが、それ以外にも任意に合成したも
の等如何なるものであつても、本発明のポリリン
カーになりうることはいうまでもない。 続いて、本発明の実施例について説明すれば以
下の通りである。 実施例 １ (1) pHY340のEcoR切断部位の部分削除
（pHY339の作製）53μ1のpHY340 DNA（100μ
ｇ／ml）に、5.7μの10倍濃度緩衝液（100ｍ
Ｍ Tris−HCl（PH7.6）、70ｍＭ MgClO2、70
ｍＭ β−メルカプトエタノール、500ｍＭ
NaCl）を加えた後、EcoR（6u／μ）を
2μ添加し、これを３等分し、37℃にてそれ
ぞれ15、20、25分間反応させた。70℃で５分間
加熱することにより反応を停止させた後、１％
低融点アガロースゲル（Bethesda Research
Laboratories、Inc.（U.S.A.）社製、1μｇ／ml
エチジウムブロマイドを含む）電気泳動を行
い、EcoRにて１カ所が切断された分子量約
3.4Mdのバンドを切り出した。これに２倍量の
緩衝液（40ｍＭ Tris、20ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、１ｍM2Na−EDTA）を加え、65℃の湯
浴中で溶かした後、室温までさまし、等量のフ
エノールを加えてよく振とうした。次に室温に
て15000rpm3分間遠心分離処理をした後、
DNAを含む水層を採取し、再び等量のフエノ
ールを加え前記操作を繰返し、DNAを含む水
層を採取した。これに200μ緩衝液（50ｍＭ
Tris、10ｍＭ EDTA、100ｍＭ、NaCl（PH
8.0））を加え、更に全量の２倍量の−20℃の冷
エタノールを加え、−20℃にて30分間冷却した。
これを０℃にて15000rpm5分間遠心分離し、
DNA沈澱物を再び−20℃エタノールで洗浄し
た。再び０℃にて15000rpm2分間遠心分離処理
を行い、上清のエタノールを捨て、沈澱に残つ
ているエタノールを完全に蒸発させた。得らた
DNAに5μの減菌水を加えてDNAを溶解し、
10倍濃度のT4ポリメラーゼ緩衝液（670ｍＭ
Tris−HCl（PH8.0）、67ｍＭ MgClO2、70ｍＭ
β−メルカプトエタノール）2μ、減菌水
8μ、2.5ｍＭ dNTPs（dATP、dGTP、
dCTP、TTP）0.8μを加え、更に4u／μの
T4 DNAポリメラーゼを0.5μを加え37℃で
15分間反応させた。200μの50ｍMTris−10
ｍＭ EDTA−100ｍＭ NaClを加え、更に
フエノールを加えて酵素を失活させた。次に前
記の冷エタノール沈澱法によりDNAを回収し
た。得られたDNAに20μの減菌水を加えて
溶解させ、3μの10ｍＭ、ATP、3μの100ｍ
Ｍジチオスレイトール、3μの660ｍＭ Tris
−HCl（PH7.6）−66ｍＭ MgClO2を加え、更に
3u／μのT4リガーゼを1μ加えた。15℃で
３時間反応を行なわせた後、120μの減菌水
を加え全量を150μとした。 (2) 大腸菌の形質転換 (1)で得られたプラスミドDNA150μ（約
0.5μｇ）に150μの大腸菌コンピテント細胞を
加え、０℃で10分間放置した後、0.7mlのＬ−
ブロスを加えて、37℃にて１時間培養した。次
いで、この培養液をＬ−ブロスに1.5％寒天と
20μｇ／mlテトラサイクリンを添加して成る寒
天培地の表面に塗布して、37℃にて一夜培養し
た。この寒天培地上にコロニーを形成した４株
の形質転換体について、保有プラスミドの大き
さを調べた。 (3) プラスミドの抽出と分子量の測定及びEcoR
切断部位の確認 前記(2)で得られた形質転換体を、0.2mlの0.2
mg／mlリゾチーム−0.05mg／ml RNaseに溶解
し、これに0.2mlの0.2％SDS溶液を加え室温で
１〜２分間反応させ、０℃にて10分間放置後、
この溶液を20000rpmで０℃、10分間、遠心分
離処理した。分離された上清に緩衝液Ａ（10ｍ
Ｍ Tris−0.1ｍＭ EDTA（PH7.4））で飽和し
たフエノールを等量加え、よく振とうした。更
にこれを15000rpm、室温、３分間、遠心分離
処理し、DNAを含む水層を採取し、15μづ
つ0.8％アガロースゲル電気泳動させて、その
分子量を測定した。その結果４株の形質転換体
の分子量は、皆、約3.4Mdであつた。 次にこの４株の形質転換体のうち目的どう
り、左側のEcoR切断部位が削除されたもの
をさがすために、泳動に使用した残りの、
DNAを含む水層から冷エタノール法により
DNAを回収した。これに100μの緩衝液Ａを
加えて溶解した。 このプラスミドDNA10μに２倍濃度緩衝
液（20ｍＭ Tris−HCl（PH7.6）、14ｍＭ
MgClO2、14ｍＭ β−メルカプトエタノー
ル、100ｍＭ NaCl）を10μ加えた後、更に
6u／μのEcoRを2μ添加し、これを37
℃、60分間反応させた。そして70℃、５分間で
この反応を停止させ、全量を0.8％アガロース
ゲルで泳動させた。その結果、EcoRで一ケ
所切断されたものが２種類採取された。次にこ
の採取された各々のプラスミドDNA10μに
２倍濃度緩衝液（20ｍＭ Tris−HCl（PH7.6）、
14ｍMMgClO2、14ｍＭ β−メルカプトエタ
ノール、100ｍＭ NaCl）を10μ加え、そこ
に5u／μのSacと6u／μのEcoRを
各々2μ添加し、これを37℃、60分間混合反
応を行い、70℃、５分間で、この反応を停止さ
せ、全量を0.8％アガロースゲルで電気泳動さ
せた。その結果、目的どうりに、左側のEcoR
切断部位が削除されたプラスミドが１つ得ら
れたことを確認した。 これを、pHY339と命名した。 （第１図 pHY339） (4) Hindリンカーの挿入 30μのプラスミドDNA（pHY339約0.1mg／
ml）に5μの10倍濃度処理（100ｍＭ Tris−
HCl（PH7.6）−70ｍＭ MgClO2、70ｍＭ β−
メルカプトエタノール、500ｍＭ NaCl）を加
えた後、8u／μのSacを5μ添加し、これ
を37℃、60分間反応させた。そして70℃、５分
間でこの反応を停止させた後、(1)の１％低融点
アガロースゲル（lμｇ／mlエチジウムブロマイ
ドを含む）電気泳動法により、Sacで切断さ
れた、分子量約3.4MdのDNAのバンドを切り
出し、フエノール処理および冷エタノール沈澱
法によりDNAを回収した。これに20μの緩
衝液Ａを加え溶解した。このうち5μについ
て、0.8％アガロースゲル電気泳動を行つたと
ころ、分子量が約3.4メガダルトンであること
を確認した。残りのDNAフラグメント15μ
について前記(1)と同様の方法でT4ポリメラー
ゼ処理を行なつて、フラツシユエンドにしてか
ら、フエノール処理および冷エタノール沈澱法
によりDNAを回収した。得られたDNAに20μ
の緩衝液Ａを加えて溶解させ、Hindリン
カー（dpCAAGCTTG、宝酒造製；0.010D／
ml）を1μを加えて前記(1)と同様の条件でT4
リガーゼ処理を行ない、リンカーを連結させた
後、120μの減菌水を加えて全量を150μと
した。 (5) 大腸菌の形質転換 前記(4)の処理で得られた150μのプラスミ
ドDNA（約1μｇ）について、前記(2)と同様の
方法で形質転換を行つた。 (6) プラスミドの抽出と分子量の測定及びHind
切断部位の確認 形質転換体について前記(3)と同様の方法で、
プラスミドDNAを抽出し、分子量を測定した
ところ、約3.4Mdであつた。次にこのプラスミ
ドにHindリンカーが挿入されていることを
確認した。即ち、このプラスミドDNA20μ
に、10倍濃度緩衝液（100ｍＭ Tris−HCl（PH
7.6）、70ｍＭ MgClO2、70ｍＭ β−メルカ
プトエタノール、500ｍＭ NaCl）2μを加え
た後、更に10u／μのHindを3μ添加し、
これを37℃、90分間反応させた。そして70℃、
５分間でこの反応を停止させ、全量を0.8％ア
ガロースゲルで泳動した。その結果Hindで
切断されるプラスミドが得られた。これを
pHY336と命名した。（第１図 pHY336） (7) ポリリンカーの調整 (i) ポリリンカー（EcoR−Sma Xma−BamH−Sal Acc Hinc−Pst−Bgl−Xba−Hind） の調整20μのプラスミドπAN7（東京大学応用微
生物学研究所斉藤日向教授研究室所有）（２mg／
ml）に3μの10倍濃度緩衝液（100ｍＭ Tris.
HCl（PH7.6）、70ｍＭ MgCl2、70ｍＭ β−メ
ルカプトエタノール、500ｍＭ NaCl）と、5μ
の減菌水を加え、更に10u／μのHindを3μ
添加し、37℃にし60分間反応した。次いで6u／
μのEcoRを3μ添加し、37℃にて60分間反
応させた。次にポリリンカー以外のDNAフラグ
メントを細かく切断するために、3.5u／μの
Hae2μを添加し、37℃にて60分間反応させ
た。そして、70℃にて５分間加熱して反応を停止
させた。これに前記(1)と同様にフエノール処理、
冷エタノール処理を行ない沈澱したDNAを採取
した。 (ii) ベクターの調製 30μのプラスミドpHY336（約0.1mg／ml）
に3.5μの10倍濃度緩衝液（100ｍＭ Tris
−HCl（PH7.6）、70ｍＭ MgClO2、70ｍＭ
β−メルカプトエタノール、500ｍＭ
NaCl）を加えた後、更に、10u／μの
Hind、3μを添加し、これを37℃、60分
間反応させた。続いて、6u／μのEcoR
、3μを添加し、37℃、60分間反応させ
た。そして、70℃、５分間でこの反応を停止
させた後0.8％アガロースゲルで、5μ電気
泳動させて、HindとEcoRで完全に切断
されたことが確認され、前記(1)と同様の方法
でフエノール処理、冷エタノールに処理を行
ない、DNAを回収した。 (iii) ポリリンカーとベクターの連結 (i)で得られたポリリンカーと、(ii)で得られ
たベクターをそれぞれ10μの減菌水に溶解
し、混合した後、前記(1)と同様の条件で連結
を行ない全量を150μとした。 (8) 大腸菌の形質転換 前記(7)の(iii)で得られたDNA（約1μｇ）につ
いて前記(2)と同様の方法で形質転換を行なつ
た。次に、形質転換体について保有プラスミド
の大きさを調べた。 (9) プラスミドの抽出と分子量の測定及びポリリ
ンカーの存在の確認 任意に抽出した40株の形質転換体より、前記
(3)と同様の方法でプラスミドDNAを抽出し分
子量を測定した。このうち分子量が約3.0Mdに
なつているものを選出し、フエノール処理を行
ない、前記(1)と同様の方法で、DNAを回収し
た。次に、本当にポリリンカーが挿入されたか
否かを確認するために、ポリリンカーの各切断
部位（EcoR、Sma、BamH、Sal、−
Pst、Bgl、Xba、Hind）に対応する
制限酵素でそれぞれの切断部位を切断した。す
なわち、先に得られたプラスミドDNAを100μ
の緩衝液Ａに溶解したものを、10μずつ８
組用意し、そこへ２倍濃度緩衝液（20ｍＭ
Tris−HCl（PH7.6）、14ｍＭ MgCl 14ｍMβ−
メルカプトエタノール、100ｍＭ NaCl）を
10μ加えた後、更に、各制限酵素（6u／μ
）のEcoR、4u／μのSma、1u／μ
のBamH、8u／μのSal、5u／μの
Pst、4.5u／μのBgl、9u／μのXba
、10u／μのHind）をそれぞれ1μ添加
し37℃にて60分間反応させた。そして70℃、５
分間でこの反応を停止させた後、それぞれ、全
量を0.8％アガロースゲルで泳動させた。その
結果、全て完全に切断されていた。このことか
ら、プラスミドDNA pHY336にポリリンカー
が挿入されたということが確認された。そして
これをpHY300PLKと命名した。 (10) 大腸菌と枯草菌の形質転換 前記(9)で得られたDNAが、シヤトルベクタ
ーであることを確認するために大腸菌と枯草菌
の形質転換を行つた。この際コントロールとし
てpHY340とpHY460を使用した。 (i) 大腸菌の形質転換 前記(9)で得られたDNA（1μｇ）とプラス
ミドpHY340（1μｇ）及びpHY460（1μｇ）、
各5μにそれぞれ、100μの大腸菌コンピ
テント細胞を加え、０℃にて15分間吸着導入
処理を行つた後、0.9mlのＬ−ブロスを加え
て、37℃にて１時間培養した。次いで、この
培養液をＬ−ブロスに1.5％寒天と20μｇ／ml
のテトラサイクリンを添加して成る寒天培地
の表面に塗布して、37℃で一夜培養した。そ
の結果を第１表に示す。 (ii) 枯草菌の形質転換 前記(9)で得られたDNA（lμｇ）とプラスミ
ドpHT340（lμｇ）及びpHY460（1μｇ）、各
10μにそれぞれ、500μの枯草菌のコンピ
テント細胞を加え、37℃で、90分間振とう培
養した。次いでこの培養液を(i)と同様の寒天
培地に塗布して37℃で一夜培養した。その結
果を第１表に示す。
【表】
第１表の結果から明らかなように(9)で得られた
プラスミドは、大腸菌と枯草菌との間のシヤトル
ベクターであることが確認された。この複合プラ
スミドベクターをpHY300PLKと命名し（第１
図）このpHY300PLKを保有する大腸菌及び枯草
菌はそれぞれEscherichia coli C600
（pHY300PLK）及び、Bacillus subtilis
（pHY300PLK）の名称で、それぞれ微工研条寄
第744号及び微工研条寄第753号として工業技術院
操作工業技術研究所に寄託済みである。 実施例 ２ 実施例１のポリリンカーに代えて EcoR−Sma Xma−BamH−Sal Acc Hinc−Pst−Hind （アマーシヤム社製、コード番号M13mp8）を使
用した以外は実施例１と同様の方法により
pHY301PLKを作製した。この複合プラスミドベ
クターも、シヤトルベクターであることを確認し
た。 実施例 ３ 実施例１のポリリンカーに代えて EcoR−Sst−Sma Xma−BamH−Sal Acc Hinc−Pst−Hind （アマーシヤム社製、コード番号M13mp10）を
使用した以外は実施例と同様の方法により
pHY302PLKを作製した。この複合プラスミドベ
クターもシヤトルベクターであることを確認し
た。
プラスミドは、大腸菌と枯草菌との間のシヤトル
ベクターであることが確認された。この複合プラ
スミドベクターをpHY300PLKと命名し（第１
図）このpHY300PLKを保有する大腸菌及び枯草
菌はそれぞれEscherichia coli C600
（pHY300PLK）及び、Bacillus subtilis
（pHY300PLK）の名称で、それぞれ微工研条寄
第744号及び微工研条寄第753号として工業技術院
操作工業技術研究所に寄託済みである。 実施例 ２ 実施例１のポリリンカーに代えて EcoR−Sma Xma−BamH−Sal Acc Hinc−Pst−Hind （アマーシヤム社製、コード番号M13mp8）を使
用した以外は実施例１と同様の方法により
pHY301PLKを作製した。この複合プラスミドベ
クターも、シヤトルベクターであることを確認し
た。 実施例 ３ 実施例１のポリリンカーに代えて EcoR−Sst−Sma Xma−BamH−Sal Acc Hinc−Pst−Hind （アマーシヤム社製、コード番号M13mp10）を
使用した以外は実施例と同様の方法により
pHY302PLKを作製した。この複合プラスミドベ
クターもシヤトルベクターであることを確認し
た。
第１図は、pHY300PLKの合成経路で示すもの
であり、また、第２図〜第４図はそれぞれ
pHY300PLK、pHY301PLK及びpHY302PLKの
制限酵素認識切断部位の配列を示すものである。
であり、また、第２図〜第４図はそれぞれ
pHY300PLK、pHY301PLK及びpHY302PLKの
制限酵素認識切断部位の配列を示すものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ストレプトコツカス・フエカリス
（Streptococcus faecalis）のプラスミドpAMα1
由来のテトラサイクリン耐性遺伝子領域と、大腸
菌（Escherichia coli）のベクターpACYC177由
来のアンピシリン耐性遺伝子領域と、上記プラス
ミドpAMα1由来の複製開始領域及び上記ベクタ
ーpACYC177由来の複製開始領域を有し、更に、
両端がそれぞれ制限酵素EcoRとHindの認識
切断配列である多重制限酵素認識配列（ポリリン
カー）を有し、前記テトラサイクリン耐性遺伝子
領域には、制限酵素Bal、Hpa、EcoRの
各々に対する前記ポリリンカー内以外の全領域中
唯一の認識切断部位が位置し、更に、前記アンピ
シリン耐性遺伝子領域には、制限酵素Pvu、
Bgl、Pst、Banの各々に対する前記ポリ
リンカー内以外の全領域中唯一の認識切断部位が
位置することを特徴とする複合プラスミドベクタ
ー。 ２ 約3.0メガダルトンの分子量と、下記の制限
酵素認識切断部位の配列により特徴づけられる特
許請求の範囲第１項記載の複合プラスミドベクタ
ーpHY300PLK。 ３ 約3.0メガダルトンの分子量と、下記の制限
酵素認識切断部位の配列により特徴づけられる特
許請求の範囲第１項記載の複合プラスミドベクタ
ーpHY301PLK。 ４ 約3.0メガダルトンの分子量と、下記の制限
酵素認識切断部位の配列により特徴づけられる特
許請求の範囲第１項記載の複合プラスミドベクタ
ーpHY302PLK。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59105411A JPS60248184A (ja) | 1984-05-24 | 1984-05-24 | 複合プラスミドベクタ− |
| EP85303682A EP0162725B1 (en) | 1984-05-24 | 1985-05-24 | Chimeric plasmid vector |
| DE8585303682T DE3585844D1 (de) | 1984-05-24 | 1985-05-24 | Chimerer plasmidvektor. |
| AT85303682T ATE74965T1 (de) | 1984-05-24 | 1985-05-24 | Chimerer plasmidvektor. |
| CA000482316A CA1235080A (en) | 1984-05-24 | 1985-05-24 | Chimeric plasmid vector |
| US07/125,396 US4876202A (en) | 1983-01-24 | 1987-11-18 | Chimeric plasmids |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59105411A JPS60248184A (ja) | 1984-05-24 | 1984-05-24 | 複合プラスミドベクタ− |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60248184A JPS60248184A (ja) | 1985-12-07 |
| JPH0314435B2 true JPH0314435B2 (ja) | 1991-02-26 |
Family
ID=14406863
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59105411A Granted JPS60248184A (ja) | 1983-01-24 | 1984-05-24 | 複合プラスミドベクタ− |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0162725B1 (ja) |
| JP (1) | JPS60248184A (ja) |
| AT (1) | ATE74965T1 (ja) |
| CA (1) | CA1235080A (ja) |
| DE (1) | DE3585844D1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5290691A (en) * | 1985-10-01 | 1994-03-01 | Banyu Seiyaku Kabushiki Kaisha | Safe and versatile cloning vector |
| JPS63291585A (ja) * | 1987-05-22 | 1988-11-29 | Fujitsu Ltd | 融合遺伝子発現ベクタ− |
| JP2524794B2 (ja) * | 1988-01-27 | 1996-08-14 | 株式会社ヤクルト本社 | 複合プラスミドベクタ― |
-
1984
- 1984-05-24 JP JP59105411A patent/JPS60248184A/ja active Granted
-
1985
- 1985-05-24 CA CA000482316A patent/CA1235080A/en not_active Expired
- 1985-05-24 EP EP85303682A patent/EP0162725B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-24 DE DE8585303682T patent/DE3585844D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-24 AT AT85303682T patent/ATE74965T1/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60248184A (ja) | 1985-12-07 |
| ATE74965T1 (de) | 1992-05-15 |
| EP0162725A2 (en) | 1985-11-27 |
| CA1235080A (en) | 1988-04-12 |
| EP0162725B1 (en) | 1992-04-15 |
| EP0162725A3 (en) | 1987-12-02 |
| DE3585844D1 (de) | 1992-05-21 |
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