JPH03147794A

JPH03147794A - Ｌ‐トリプトファンの分離法

Info

Publication number: JPH03147794A
Application number: JP28827489A
Authority: JP
Inventors: Yasunori Kaiho; 海宝　益典
Original assignee: Showa Denko KK
Current assignee: Resonac Holdings Corp
Priority date: 1989-11-06
Filing date: 1989-11-06
Publication date: 1991-06-24

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は固体状のＬ−トリプトファン及び微生物菌体を
含む反応液（醗酵プロセスに於ける菌体培養液、酵素反
応液等）からのＬ−トリプトファンの分離法に関する。

〔従来技術〕

Ｌ−）リブトファンは必須アミノ酸の１つであり、医薬
品、飼料添加物として重要であり、その安価な製造方法
が望まれている。Ｌ−トリプトファンの製造法は有機合
成による方法と生化学的な方法に大別され、後者には更
に直接醗酵法、前駆体醗酵法及び酵素法がある。化学合
成法では生成物としてＤＬ体が得られるため、更に光学
分割手段、ラセミ化が必要であるため、現在商業的には
専ら後者の方法が採られており、工程的には醗酵又は酵
素反応の工程と反応液即ち、培養液又は酵素反応液から
の目的物（Ｌ−トリプトファン）の分離、精製工程から
戊っている。

Ｌ−トリプトファンのより安価な生産を目指すにはこれ
らの工程の改良が必須であり、前者の工程で言えば、遺
伝子工学的手法等を用いた高生産菌の開発、高活性、安
定性の良い酵素の開発、培地、反応基質の改良、培養条
件、反応条件の検討等がそれである。しかし、菌や酵素
の開発は必ずしも容易ではなく、また培地や培養条件は
どちらかと言えば副次的なものである。これに対し、分
離・精製工程には改良の余地が多分にあり、また、その
改良のもたらす経済的効果は非常に大きなものがある。

但し、分離・精製工程は当然のこと乍ら前段の醗酵又は
酵素反応工程と密接な関連があり、例えば、醗酵法で言
えば、従来は菌の生産性が余り高くはなかったため、生
成したＬ−）リプトファンは培養液中に溶解しており、
従って、培養液からの分離法としては、まず、微生物菌
体を主体とする固形分を分離した後、液中よりＬ−トリ
プトファンを取り出すことになるが、近時、菌の改良が
進み、高い生産性を有する菌を用いて醗酵を行ないＬ−
トリプトファンの培養液中の蓄積量が増大した結果、醗
酵工程からの液中には生成したＬ−トリプトファンの一
部が析出した状態で微生物菌体等の固形分と混在してお
り、従来の方法では見られなかった新たな問題を提供す
るようになった。

このような生成したＬ−）リブトファンの一部が析出し
、微生物菌体等の固形分と混在した液中よりＬ−トリプ
トファンを分離する方法について、従来公知の方法及び
公知の技術から考えられる方法を紹介すれば、例えば、
醗酵液中で一部析出したＬ−）リプトファンを含む液を
加水、加熱、又は、酸・アルカリ等を添加して一旦Ｌ−
）リプトファンを全て溶解した後、該溶液より菌体を分
離し、更にイオン交換樹脂にて処理する方法がある。

イオン交換処理をした液は、濃縮又は、ｐｌＥａｌ整（
等電点中和）を行って、Ｌ−トリプトファンの粗結晶を
得る。その後更に精製のため活性炭、脱色樹脂、脱色膜
等の方法を適宜組成させ、再結晶を行うことにより高純
度のＬ−トリプトファンが得られる。

しかし、これらの方法には以下に述べるような難点があ
り、経済的な方法として実際の商業的生産に採用するに
は問題がある。

例えば、Ｌ−トリプトファン醗酵液からの菌体分離方法
としては、通常分離板型遠心分離機を用いる方法、分離
膜、例えば、精密濾過（ＭＦ膜）、限外濾過（ＵＦ膜）
等による膜分離方法、また濾過助材を使用して、通常の
濾過機を使用する方法等がある。分離板型・遠心分離機
は、スラッジの排出が不安定になり易く、ボウル内に堆
積するため、メンテナンスに手間がかかる。膜分離では
菌体を高濃度まで濃縮することは不可能であり、加水し
つつ、運転を継続するため、分離液が希釈され、後工程
の処理コストが増大する。多量の水の同伴を伴う菌体の
処分も問題となる。

濾過助材を用いる濾過操作は一般に清澄濾過の目的で行
われるものであり、菌体のような剛性を有せず、かつ微
細な粒径の物質のケーキ濾過を行うためには、多量の助
材を必要とし、廃ケーキの処分も困難を伴う。

又、菌体分離後のイオン交換樹脂処理についても、下記
のような問題がある。

■吸着、溶離、再生をバッチで行うため、工程が長く複
雑である。

■イオン交換樹脂塔運転のために、アルカリ・酸等の薬
液を多量に使用する。

■廃液量が多い。

■イオン交換樹脂処理の精製度が低いため、粗結晶析出
率が低く、前工程へのリサイクルが多いケースがある。

■得られた粗結晶の品質が充分でなく、含液率も高いた
め、同伴母液による不純物の同伴量も多い。そのため、
再結系の負荷が高くなり、脱色のための活性炭等の使用
量が増大するケースがある。

■　以上により、生産性が低下すると共に、ユーティリ
ティーコスト及びイオン交換樹脂状が増大する。

等々。

一方、醗酵液中で析出したＬ−トリプトファン結晶に着
目すると、これを先に述べた工程にて得られる粗結晶に
対比させて考えた時、同等以上の品質を有しているなら
ば、むしろこれを溶解せずに、積極的に活用し、効果的
に分離することが可能であれば、プロセスが著しく簡略
化されることになる。醗酵液を冷却、濃縮、ｐＨ調整（
等電点中和）により、更に多くの結晶を取得することも
可能である。

Ｌ−）リブトファンが析出したスラリー液中には固体成
分としてはＬ−トリプトファンの結晶の他に微生物菌体
も存在しているので、工学的には液−固一固系からＬ−
トリプトファンの結晶のみを分離し、精製工程へ送るこ
とになる。

ところで、一般に、固−岐の分離については、濾過、遠
心分離等の原理に基づく各種の機械、装置が知られてお
り、広く用いられる。しかし、これを単純に上記の系に
適用すると、分離された固体は、Ｌ−トリプトファン結
晶のみならず菌体との混合物となり、Ｌ−トリプトファ
ンのみを取り出すには更に固体一固体の分離を行なわな
ければならない。異種の固体混合物の分離方法としては
、比重差を利用する方法（沈降分離）、粒子径の差を利
用する方法（篩分）、浮遊選鉱法、風篩法、磁気的性質
の差を利用する方法、荷電粒子を利用する方法（電気集
塵）等が知られている。しかし、沈降分離法、浮遊選鉱
法を固液分離の工程後に実施するのは不合理であり、篩
分法、風篩法、電気集塵法については、その前に乾燥処
理が必要であり、その過程で凝集を生ずるため、分離は
不可能である。また、Ｌ−トリプトファン結晶も菌体も
非磁性体であり、磁気分離も適用できない。

〔発明の課題及びその解決手段〕

そこで、本発明者らは固体状のＬ−トリプトファン及び
微生物菌体を含む液からＬ−トリプトファン及び菌体を
同時に効率良く、しかも液中に共存する夾雑物の同伴を
できるだけ排除し高い純度をもったＬ−トリプトファン
を分離する方法について種々検討した結果、本発明の方
法を開発することに成功した。

即ち、本発明は、溶解度以上に濃度が蓄積され、一部析
出したＬ−トリプトファンを含んだ醗酵液、酵素反応液
のスラリーを、更に必要に応じて結晶析出を増すよう処
理した後、直接デカンタ−型遠心沈降機にかけて、特定
の条件下で粗結晶を分離し、次いで、膜処理、再結晶処
理等公知の方法により二次精製を行うＬ−）リブトファ
ンの簡略化された分離方法を提供せんとするものである
。

以下に本発明の方法について更に詳しく説明する。

原液スラリーを直接沈降分離にかけ、Ｌ−トリプトファ
ン結晶のみを沈降させるための装置としては、遠心分離
機、例えば、分離板型、円筒型または、デカンタ−型等
の使用、液体サイクロンの使用等が考えられるが、微細
結晶と菌体の高濃度のスラリーにおいては、干渉沈降に
より充分な分離は達成できないものと思われた。

デカンタ−型遠心沈降機についても、固−液分離、固−
液一液分離系に用いられて、汚泥の遠心脱水、合成樹脂
の脱液、油の精製等に適用されるのが一般的であり、時
として、スラリーの濃縮、同一種固体の分級等にも用い
られるが、本発明の如き使用法は非常に珍しい例である
と言える。

本発明に於いても、Ｌｉミリブトファン酵液スラリーを
、被処理液とした場合、特定の条件下で初めて、（液−
固）−固の分離が可能となり、目的であるＬ−トリプト
ファン結晶と菌体とを分離することが可能となったので
ある。デカンタ−型遠心沈降機の運転条件の要因として
、遠心力（回転数）、滞留時間（フィード速度、プール
深さ）、固形分搬送速度（ボウルとスクリューの回転差
）が挙げられるが、これらの要因のうち特に、遠心力２
．０００〜３５００Ｇ　、滞留時間０．５〜２．５分間
、回転差速５〜１０ｒｐ−という運転条件下を採用する
ことにより、結晶回収率９５％以上、菌体の流出率９５
％以上、結晶の含水率５５％以下、結晶純度７０％以上
（ｄｒｙベース）という良好な結果が得られた。

因みに、上記運転条件の範囲外、例えば、遠心力を小さ
くすると、結晶含水率の低下、大きくすると、結晶純度
の低下が起こる。また、滞留時間を小さくすると結晶回
収率の低下、大きくすると、結晶純度の低下となる。回
転差については、被処理液の結晶濃度によって、最適ポ
イントがあるが、大きくすると、結晶含水率の低下、小
さくすると、結晶回収率の低下傾向が見られた。

被処理液としてはＬ−トリプトファンの一部が析出し、
更に微生物菌体を含有する醗酵液や酵素反応液をそのま
ま用いる他、或いはこれらを冷却、濃縮、ｐｎ調整（等
電点中和）等の処理をしてＬ−トリブトファンの析出量
を増加させた液を用いても良い。

また分離結晶の純度を向上させる目的で水にょるリンス
操作を行うことにより、後工程の精製負荷を軽減するこ
とができる。方法は、結晶回収率を向上させるため多段
向流法が良いが、もちろん１〜２回の単純なリンス操作
でも充分である。

リスラリ−後の脱液操作にもデカンタ−型遠心沈降機が
好適であり、同一デカンタ−を粗結晶分離及びリスラリ
−リンスの両方に用いることもできる。

その運転条件は、醗酵液スラリーからの結晶分離と同条
件の範囲で良い。

こうして得られた粗結晶には、巻き込まれた少量の菌体
、及び醗酵液由来の微量の不純物がまだ含まれている。

分離されたＬ−トリプトファン粗結晶を再溶解し、菌体
を除去した後、公知の方法（例えば活性炭処理後、再結
）により精製することにより高純度り一トリブトファン
製品が得られる。巻き込み菌体等の分離は、膜による濾
過等、その他公知の方法により、行えば良い。デカンタ
−分離液は、殺菌後、公知の分離方法で回収すれば良い
。

この菌体、蛋白等が除去された液は、従来のイオン交換
樹脂処理した溶解液から得られた粗結晶溶解液に比べ、
色素、有機酸、塩類等の夾雑不純物の量が極めて少ない
。従って後工程で活性炭、又は、脱色樹脂により、脱色
する場合、その使用量が少なくてよい。

再晶析方法については、特に問わないが、方法は、回分
または連続及び、冷却、濃縮、中和方法、いずれでも良
い。、ただし留意する点として固液分離性の良い結晶を
得ること、及び晶析率を上げるための晶析条件（温度、
速度等）があげられる。

また、膜分離と晶析とを組み合わせて、結晶を分離した
母液を膜分離工程へ循環しても良い。

実施例　ＩＬ−トリプトファン４８．０ｇ／ｆｌ（内析出分２５．
０ｇ　／　１　、平均粒径４０μ）、Ｂ・ズブチリス菌
体２０ｇ／ｌ、無機塩（培地由来）や蛋白質（副生物）
の一部が析出し、外の培地成分やアミノ酸（副生物）の
溶解した醗酵液４００ｊ！　　（温度３５℃、　ｐｔ１
６．７）を８時間かけて冷却し、Ｌ−トリプトファンの
析出量を３３．５ｇ／ｌとした後、スクリュウデカンタ
−（巴工業■製、シャープレスＰ　−８６０）にて処理
した。

液供給量：１０（ＩＱ　／ｈｒ、遠心カニ３．０００Ｇ
、差束：５　ｒｐ１％回転体内の液帯留時間；１．２分
。

４０．２）ｃｇ（ｗｅｔベース）の結晶が得られたが、
その分析値は以下の通りであった。

含水率：　５３．５％、Ｌ−トリプトファン回収率：９
Ｂ％、純度：　７３．６％（ｄｒｙベース）上記結晶を
ｗｅｔケーキ量の２倍の水でスラリー化した後、上記と
同じ条件下でスクリュウデカンタ−にてリンス処理をし
た結果は以下の通りであった。

１回　５１，６％　　　　７９．７％２回　　４５．３％　　　　８５．２％尚、結晶回収率は１゜２回共に約９２％であつた。

実施ＰＪ２〜５及び比較例１〜３実施例１と同じ被処理液を同じスクリュウデカンタ−を
用いて、条件を変えて処理した結果を以下に示す。

〔効　　果〕

現在、主流であるイオン交換樹脂処理法と比較した場合
以下の点で、特長がある。

■プロセスがシンプルになる。

■イオン交換で使用する薬液が必要ないため、大幅なコ
ストダウンとなる。

■廃液量も大幅に削減できる。

■プロセスフロー上、スラリー及び高濃度液での流れが
大部分となり、設備がコンパクトでプラント建設費が安
くなる。

Claims

【特許請求の範囲】

デカンター型遠心沈降機を用いて遠心力２，０００〜３
，５００Ｇ及び回転体内の滞留時間０．５〜２．５分間
の条件下に分離することを特徴とする固体状のＬ−トリ
プトファン、及び微生物菌体を含む反応液よりのＬ−ト
リプトファンの分離法