JPH03147799A - 新規なオリゴヌクレオチドプローブ - Google Patents
新規なオリゴヌクレオチドプローブInfo
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- JPH03147799A JPH03147799A JP1284909A JP28490989A JPH03147799A JP H03147799 A JPH03147799 A JP H03147799A JP 1284909 A JP1284909 A JP 1284909A JP 28490989 A JP28490989 A JP 28490989A JP H03147799 A JPH03147799 A JP H03147799A
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- Japan
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- dna
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- human
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
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- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は遺伝子診断のＤＮＡプローブとして使用できる
新規なミニサテライトＤＮＡに関する。
新規なミニサテライトＤＮＡに関する。
近年ＤＮＡプローブを用いた種々の遺伝子診断法が開発
されてきている。遺伝子診断の目的にはｌ）遺伝病の早
期診断、２）いわゆるＤＮＡフィンガープリント法とよ
ばれる親子鑑別や犯罪捜査への応用、３）ウィルスや細
菌感染症の原因菌の高感度の診断などがあげられる。
されてきている。遺伝子診断の目的にはｌ）遺伝病の早
期診断、２）いわゆるＤＮＡフィンガープリント法とよ
ばれる親子鑑別や犯罪捜査への応用、３）ウィルスや細
菌感染症の原因菌の高感度の診断などがあげられる。
これらのうち、ＤＮＡフィンガープリント法はひろく個
人識別に用いることができる。その方法としては、目的
の遺伝子の全部又は一部をＤＮＡプローブとして、その
遺伝子上の変異を直接検出する方法、遺伝子周辺の部位
の制限酵素部位の変異を利用した制限酵素断片多形（Ｒ
ＦＬＰ：ｒｅｓｔｒｌｃｔｌｏｎ ｆ’ｒａｇＩｌｅｎ
ｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｌｓａ）解析法
があげられ、また遺伝子の非コード部分にしばしば見い
出される反復配列ＤＮＡをプローブとして利用すること
もできる。
人識別に用いることができる。その方法としては、目的
の遺伝子の全部又は一部をＤＮＡプローブとして、その
遺伝子上の変異を直接検出する方法、遺伝子周辺の部位
の制限酵素部位の変異を利用した制限酵素断片多形（Ｒ
ＦＬＰ：ｒｅｓｔｒｌｃｔｌｏｎ ｆ’ｒａｇＩｌｅｎ
ｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｌｓａ）解析法
があげられ、また遺伝子の非コード部分にしばしば見い
出される反復配列ＤＮＡをプローブとして利用すること
もできる。
このような、いわゆるミニサテライトＤＮＡは、個人識
別や家系識別にも利用できることが報告されている（例
えば、Ｎｕｃｌｅｌｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。
別や家系識別にも利用できることが報告されている（例
えば、Ｎｕｃｌｅｌｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。
ｖｏｌ、ｔａ、 １０９５３−１０９７１．１９１１８
； ５ｃｉｅｎｃｅ、 Ｖｏｌ、２３５゜１６１Ｂ−１
６２２，１９８７）。ミニサテライトＤＮＡとは、１０
から１００塩基配列が一つの反復単位で、それらがタン
デムに繰り返したいわゆる反復配列ＤＮＡである。反復
度は、多いものでは１０００回にも及び、この反復度が
個々の対立遺伝子で異なることにより、バリエーション
を獲得している（総説：小南凌、実験医学、 Ｖｏｌ、
７． Ｎ（Ｌ２． ｐ、２Ｂ−３０１９８９）。
； ５ｃｉｅｎｃｅ、 Ｖｏｌ、２３５゜１６１Ｂ−１
６２２，１９８７）。ミニサテライトＤＮＡとは、１０
から１００塩基配列が一つの反復単位で、それらがタン
デムに繰り返したいわゆる反復配列ＤＮＡである。反復
度は、多いものでは１０００回にも及び、この反復度が
個々の対立遺伝子で異なることにより、バリエーション
を獲得している（総説：小南凌、実験医学、 Ｖｏｌ、
７． Ｎ（Ｌ２． ｐ、２Ｂ−３０１９８９）。
これらのＤＮＡフィンガープリント法によって検出可能
な遺伝子上の変異のパターンはメンデル遺伝により親か
ら子に伝えられていく。これを利用して、より正確な親
子診断が可能とされ、またＤＮＡポリメラーゼ増幅（ｐ
ｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ：
ＰＣＲ）と組み合わせた高感度測定法により、毛根や精
液、血液、皮膚片等の微量サンプルからこれら個人ごと
に異なるパターンを利用して犯罪者や被害者の同定がで
きる犯罪捜査への応用が可能となる。
な遺伝子上の変異のパターンはメンデル遺伝により親か
ら子に伝えられていく。これを利用して、より正確な親
子診断が可能とされ、またＤＮＡポリメラーゼ増幅（ｐ
ｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ：
ＰＣＲ）と組み合わせた高感度測定法により、毛根や精
液、血液、皮膚片等の微量サンプルからこれら個人ごと
に異なるパターンを利用して犯罪者や被害者の同定がで
きる犯罪捜査への応用が可能となる。
本発明により提供されるミニサテライトＤＮＡはヒト血
漿中に含まれる、線溶系の制禦に関与するプロテアーゼ
インヒビターの一種である、α２−プラスミンインヒビ
タ−の遺伝子の近傍に本発明者により見い出された塩基
配列である。
漿中に含まれる、線溶系の制禦に関与するプロテアーゼ
インヒビターの一種である、α２−プラスミンインヒビ
タ−の遺伝子の近傍に本発明者により見い出された塩基
配列である。
ヒトα２−プラスミンインヒビタ−は、正常人の血液中
に通常６■／ｄＡ程度検出され、血栓溶解作用を持つプ
ラスミンを阻害して、血栓溶解の昂進を抑え、ひいては
炎症や癌の転移などの様々な異常な生理現象の防止に寄
与していると考えられている。
に通常６■／ｄＡ程度検出され、血栓溶解作用を持つプ
ラスミンを阻害して、血栓溶解の昂進を抑え、ひいては
炎症や癌の転移などの様々な異常な生理現象の防止に寄
与していると考えられている。
本発明者等は、ヒトα２−プラスミンインヒビタ−の遺
伝子を単離し、その発現を調節する上流領域を解析した
ところ、４５ヌクレオチドのＤＮＡ配列がタンデムに繰
り返している頭載を見い出した。さらに、その領域を含
むＸｂａｌ／ＢａｍＨＩ断片をＣＡＴアッセイ用のプラ
スミドベクターにクローニングし、ヘルペス単純ウィル
スのチミジンキナーゼのプロモーター活性に与える影響
を調べたところ、その活性を抑制するサイレンチー様の
機能を見い出した。その配列は、 ＣＮＧＧＡ ＣＡＧＴＧＡＧＧＧＴＧＧＧＡＸＧＹ Ｘ
ＧＣＹＴ ＧＡＴＧＣＡＧＧＧＡＧＴＧＡＧＧ Ｉ Ｘ
（式中、Ｎは、Ａ、Ｇ！たはｃ、Ｘは、Ａまタハ、Ｘ１
．ｔ、ＣまたはＧＳＺ、Ｉｔ、ＡまたはＣである） である。
伝子を単離し、その発現を調節する上流領域を解析した
ところ、４５ヌクレオチドのＤＮＡ配列がタンデムに繰
り返している頭載を見い出した。さらに、その領域を含
むＸｂａｌ／ＢａｍＨＩ断片をＣＡＴアッセイ用のプラ
スミドベクターにクローニングし、ヘルペス単純ウィル
スのチミジンキナーゼのプロモーター活性に与える影響
を調べたところ、その活性を抑制するサイレンチー様の
機能を見い出した。その配列は、 ＣＮＧＧＡ ＣＡＧＴＧＡＧＧＧＴＧＧＧＡＸＧＹ Ｘ
ＧＣＹＴ ＧＡＴＧＣＡＧＧＧＡＧＴＧＡＧＧ Ｉ Ｘ
（式中、Ｎは、Ａ、Ｇ！たはｃ、Ｘは、Ａまタハ、Ｘ１
．ｔ、ＣまたはＧＳＺ、Ｉｔ、ＡまたはＣである） である。
この配列を持つオリゴヌクレオチドを標識してプローブ
とし、ヒト染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で清化してア
ガロースゲル中で電気泳動したものとサザンブロッドハ
イプリダイゼーションを行うことにより、制限酵素切断
断片のパターンの違いを検出したり、この反復配列のコ
ピー数を／Ｉｐ１定することができる。
とし、ヒト染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で清化してア
ガロースゲル中で電気泳動したものとサザンブロッドハ
イプリダイゼーションを行うことにより、制限酵素切断
断片のパターンの違いを検出したり、この反復配列のコ
ピー数を／Ｉｐ１定することができる。
本発明者等がヒトα２プラスミンインヒビタ−遺伝子の
近隣に見い出したミニサテライト配列は、４５ヌクレオ
チドからなり、その中には少なくとも７か所のヘテロガ
スな部位がみられる。これは、ポリメレースチェインリ
アクシッン法によって、直接的に配列を決定することに
より、より特λ性の高い個人、家系識別に利用できる可
能性もある。
近隣に見い出したミニサテライト配列は、４５ヌクレオ
チドからなり、その中には少なくとも７か所のヘテロガ
スな部位がみられる。これは、ポリメレースチェインリ
アクシッン法によって、直接的に配列を決定することに
より、より特λ性の高い個人、家系識別に利用できる可
能性もある。
ヒトα２−プラスミンインヒビタ−の遺伝子断片として
特開昭６４−２５７７ （昭和６４年１月６日公開）が
開示されているが、この出願において開示されている塩
基配列はｃＤＮＡのそれでありリーダ配列の最初のメチ
オニン残基（成熟α２−プラスミンインヒビタ−蛋白の
アミノ末端のアスパラギン残基を＋１としたとき一３９
番目のアミノ酸残基に相当する）から下流に関する。本
発明者はα２−プラスミンインヒビタ−の染色体の遺伝
子をクローニングし、第１エクソンのさらに上流に本発
明で開示されたミニサテライトＤＮＡ配列を見い出し、
本発明を完成させたものである。
特開昭６４−２５７７ （昭和６４年１月６日公開）が
開示されているが、この出願において開示されている塩
基配列はｃＤＮＡのそれでありリーダ配列の最初のメチ
オニン残基（成熟α２−プラスミンインヒビタ−蛋白の
アミノ末端のアスパラギン残基を＋１としたとき一３９
番目のアミノ酸残基に相当する）から下流に関する。本
発明者はα２−プラスミンインヒビタ−の染色体の遺伝
子をクローニングし、第１エクソンのさらに上流に本発
明で開示されたミニサテライトＤＮＡ配列を見い出し、
本発明を完成させたものである。
これらのＤＮＡプローブの標識は、一般にはラジオアイ
ソトープ（Ｒ１）が感度の良さから最も用いられている
が、最近では酵素や化学ルミネッセンス発光体で標識す
る非Ｒ１法も操作上の安全の高さ、特別な施設を必要と
しないことなどから用いられるようになった。Ｒ１標識
俵としてはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて３２
ｐを５′ 一端に標識する方法、あるいはＤＮＡポリメ
ラーゼＩとＤＮａｓｅＩを組み合わせて３２Ｐ−標識デ
オキシトリメクレオチドを標識するニックトランスレー
ション法があり、これらの標識方法は市販の専用キット
（例えばアメリカのＢｃｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ
ｔ、ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 日本ではコスモノ
くイオ株式会社より市販されている）を用いて実施でき
る。また、非Ｒ１標識および検出方法にはホースラデイ
ツシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ ： ｈｏｒｓｅｒａ
ｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｌｄａｓｅ）でＤＮＡを標識しＨ
ＲＰにより触媒されるルミノール酸化反応に伴なうケミ
カルルミネッセンスを検出する方法、ビオチン化ｄＵＴ
Ｐで標識したＤＮＡをアビジン−アルカリフォスファタ
ーゼコンプレックスによる化学呈色反応で検出する方法
があげられ、これら標識方法は市販のキット（例えばア
マジャム社より市販されている）を用いて実施すること
ができる。
ソトープ（Ｒ１）が感度の良さから最も用いられている
が、最近では酵素や化学ルミネッセンス発光体で標識す
る非Ｒ１法も操作上の安全の高さ、特別な施設を必要と
しないことなどから用いられるようになった。Ｒ１標識
俵としてはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて３２
ｐを５′ 一端に標識する方法、あるいはＤＮＡポリメ
ラーゼＩとＤＮａｓｅＩを組み合わせて３２Ｐ−標識デ
オキシトリメクレオチドを標識するニックトランスレー
ション法があり、これらの標識方法は市販の専用キット
（例えばアメリカのＢｃｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ
ｔ、ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 日本ではコスモノ
くイオ株式会社より市販されている）を用いて実施でき
る。また、非Ｒ１標識および検出方法にはホースラデイ
ツシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ ： ｈｏｒｓｅｒａ
ｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｌｄａｓｅ）でＤＮＡを標識しＨ
ＲＰにより触媒されるルミノール酸化反応に伴なうケミ
カルルミネッセンスを検出する方法、ビオチン化ｄＵＴ
Ｐで標識したＤＮＡをアビジン−アルカリフォスファタ
ーゼコンプレックスによる化学呈色反応で検出する方法
があげられ、これら標識方法は市販のキット（例えばア
マジャム社より市販されている）を用いて実施すること
ができる。
またこれらのプローブＤＮＡは、数１０個の塩基長を有
する比較的短いオリゴヌクレオチドの場合は市販のＤＮ
Ａ合成機（例えば米国アプライドバイオシステム社のＡ
Ｂ １３８１Ａ）により化学合成もできる。また塩基
鎖が長い場合には適当な遺伝子の断片をクローン化して
分離精製することもできる。標識ＤＮＡプローブが、安
定したハイブリダイズを形成し、特異的なシグナルを発
生させるためには、１２個以上のオリゴヌクレオチドで
あれば、検出可能だが、より非特異的な反応のバックグ
ラウンドをおさえて、シャープで正確なパターンを検出
させるためには１２〜１７個以上、好ましくは２０個以
上の長さを有するオリゴヌクレオチドが使用できる。
する比較的短いオリゴヌクレオチドの場合は市販のＤＮ
Ａ合成機（例えば米国アプライドバイオシステム社のＡ
Ｂ １３８１Ａ）により化学合成もできる。また塩基
鎖が長い場合には適当な遺伝子の断片をクローン化して
分離精製することもできる。標識ＤＮＡプローブが、安
定したハイブリダイズを形成し、特異的なシグナルを発
生させるためには、１２個以上のオリゴヌクレオチドで
あれば、検出可能だが、より非特異的な反応のバックグ
ラウンドをおさえて、シャープで正確なパターンを検出
させるためには１２〜１７個以上、好ましくは２０個以
上の長さを有するオリゴヌクレオチドが使用できる。
したがって、本発明のプローブは、
の塩基配列またはその相補鎖のうち、
どこを開始
点としてもよいが少なくとも１２個の塩基配列を含んで
いればよい。
いればよい。
本発明をより具体的に説明するために以下に実施例を示
す。しかし、本大施例は、本発明を限定するものではな
い。
す。しかし、本大施例は、本発明を限定するものではな
い。
実施例 １
ヒトα２−プラスミンインヒビタ−遺伝子のクローニン
グおよび同遺伝子上流域による繰り返しＤＮＡ配列の決
定 ヒト肝臓ＤＮＡから調製したＤＮＡからファージλＬ４
７．１を用いて、ヒト遺伝子ライブラリーを作成し、ヒ
トα２−プラスミンインヒビタ−ｃＤＮＡをプローブと
し、スクリーニングを行った。得られたポジティブクロ
ーンの制限酵素マツピング、塩基配列の決定を行い、ヒ
トα２プラスミンインヒビタ−ｃ Ｄ Ｎ Ａ （Ｔｏ
ｎｅら、ｊ。
グおよび同遺伝子上流域による繰り返しＤＮＡ配列の決
定 ヒト肝臓ＤＮＡから調製したＤＮＡからファージλＬ４
７．１を用いて、ヒト遺伝子ライブラリーを作成し、ヒ
トα２−プラスミンインヒビタ−ｃＤＮＡをプローブと
し、スクリーニングを行った。得られたポジティブクロ
ーンの制限酵素マツピング、塩基配列の決定を行い、ヒ
トα２プラスミンインヒビタ−ｃ Ｄ Ｎ Ａ （Ｔｏ
ｎｅら、ｊ。
Ｂ１ｏｃｈｅａ＋、 １０２．１０３３−１０４１（１
９８７））の配列と比較し、ヒトα２−プラスミンイン
ヒビタ−遺伝子のエクソンの位置を決定した。エクソン
のＤＮＡ配列はｃＤＮＡのそれと１か所を除いて完全に
一致した。
９８７））の配列と比較し、ヒトα２−プラスミンイン
ヒビタ−遺伝子のエクソンの位置を決定した。エクソン
のＤＮＡ配列はｃＤＮＡのそれと１か所を除いて完全に
一致した。
その１か所とは、コーディング領域の１番目のＡＴＧの
Ａから数えて２２番目のヌクレオチドで、ｃＤＮＡでは
Ｔであるのが、染色体遺伝子ではＣであった。この領域
は、リーダーペプチドに相当する部分である。また、同
遺伝子の上流域に４５ｂｐを１反復単位としてタンデム
に繰り返している領域を見い出した。その位置は、コー
ディング領域の１番目のＡＴＧのＡを＋１とすると、−
３８６１から−２８８７にかけての領域であった。図１
に、Ｇ２−プラスミンインヒビタ−遺伝子の制限酵素地
図、エクソンの位置、４５ｂｐ反復配列の位置及びその
塩基配列を示した。
Ａから数えて２２番目のヌクレオチドで、ｃＤＮＡでは
Ｔであるのが、染色体遺伝子ではＣであった。この領域
は、リーダーペプチドに相当する部分である。また、同
遺伝子の上流域に４５ｂｐを１反復単位としてタンデム
に繰り返している領域を見い出した。その位置は、コー
ディング領域の１番目のＡＴＧのＡを＋１とすると、−
３８６１から−２８８７にかけての領域であった。図１
に、Ｇ２−プラスミンインヒビタ−遺伝子の制限酵素地
図、エクソンの位置、４５ｂｐ反復配列の位置及びその
塩基配列を示した。
ＤＮＡの調製
ヒト肝臓から、Ｍａｎｉａｔｌｓ、 Ｔ、ら、 ＭＯＩ
ＯｅｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｌｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ、（１９８２）に記載された
方法に従って調製した。
ＯｅｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｌｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ、（１９８２）に記載された
方法に従って調製した。
ヒト遺伝子ライブラリーの作成
ヒト肝臓から調製したＤＮＡを制限酵素５ａｕ３ＡＩで
部分消化し、ショ糖密度勾配遠心法により分画した。１
０ｋｂから２０ｋｂに相当するＤＮＡ断片をλＬ４７．
１ベクター（アマジャムより購入）に組み込み、Ｍａｎ
ｌａｔｉｓ、 Ｔ、ら、 ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎ
ｌｎｇ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｌｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂ、、（１９８２）に記載されている方法に従って、
１ｎ ｖｌｔｒｏ ｐａｃｋａｇｉｎｇを行った。タイ
トレージョンの結果、約ｌＸｌ０Ｂ個の独立なファージ
が存在した。
部分消化し、ショ糖密度勾配遠心法により分画した。１
０ｋｂから２０ｋｂに相当するＤＮＡ断片をλＬ４７．
１ベクター（アマジャムより購入）に組み込み、Ｍａｎ
ｌａｔｉｓ、 Ｔ、ら、 ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎ
ｌｎｇ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｌｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂ、、（１９８２）に記載されている方法に従って、
１ｎ ｖｌｔｒｏ ｐａｃｋａｇｉｎｇを行った。タイ
トレージョンの結果、約ｌＸｌ０Ｂ個の独立なファージ
が存在した。
スクリーニング
プラークハイブリダイゼーション法によって前記のヒト
遺伝子ライブラリーのスクリーニングを行った。基本的
には、ＭａｎｌａＬｉｓ、 Ｔ、ら。
遺伝子ライブラリーのスクリーニングを行った。基本的
には、ＭａｎｌａＬｉｓ、 Ｔ、ら。
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｌｎｇ、 Ｃｏ１ｄ Ｓ
ｐｒｌｎｇ ｌ１ａｒｂｏｒ Ｌａｂ、。
ｐｒｌｎｇ ｌ１ａｒｂｏｒ Ｌａｂ、。
（１９１１２）に記載されている方法に従った。プロー
ブは、Ｔｏｎｅら、 Ｊ、 Ｂｌｏｃｈｅｉ、 １
０２．１０３３−１０４１（１９８７）に記載されてい
る、ヒトα２−プラスミンインヒビタ−ｃＤＮＡを使用
した。プローブの標識は、〔α−３２Ｐ）ｄＣＴＰを用
いたニックトランスレーションにより行った。約１×１
０６個のプラークをニトロセルロースフィルターに転写
した後、プローブとハイブリダイゼーションを行い、洗
浄後、オートラジオグラフィーを行うことによって、ポ
ジティブクローンを検出した。
ブは、Ｔｏｎｅら、 Ｊ、 Ｂｌｏｃｈｅｉ、 １
０２．１０３３−１０４１（１９８７）に記載されてい
る、ヒトα２−プラスミンインヒビタ−ｃＤＮＡを使用
した。プローブの標識は、〔α−３２Ｐ）ｄＣＴＰを用
いたニックトランスレーションにより行った。約１×１
０６個のプラークをニトロセルロースフィルターに転写
した後、プローブとハイブリダイゼーションを行い、洗
浄後、オートラジオグラフィーを行うことによって、ポ
ジティブクローンを検出した。
ＤＮＡ塩基配列の決定
上記のポジティブクローンよりＤＮＡを調製し、適当な
制限酵素で消化し、制限酵素マツピングを行った後、各
々の制限酵素による断片をｐＵｃｌｌｌ ｐＵｃ１１
９． ｐＨ３Ｇ３９ｇ、またはｐＨ３Ｇ３９９（全て
宝酒造社製）のポリリンカ一部位にクローニングした。
制限酵素で消化し、制限酵素マツピングを行った後、各
々の制限酵素による断片をｐＵｃｌｌｌ ｐＵｃ１１
９． ｐＨ３Ｇ３９ｇ、またはｐＨ３Ｇ３９９（全て
宝酒造社製）のポリリンカ一部位にクローニングした。
キロシーフェンス用デレージョンキット（宝酒造社製）
を用いて、前記リコンビナントプラスミドのデレーショ
ンミュータントを作成し、ｐＵｃｌｌｇまたハｐ Ｕ
Ｃ１１９１，：クローニングしたものに関しては、Ｖｉ
ｅｌｒａ、 Ｊ、ら。
を用いて、前記リコンビナントプラスミドのデレーショ
ンミュータントを作成し、ｐＵｃｌｌｇまたハｐ Ｕ
Ｃ１１９１，：クローニングしたものに関しては、Ｖｉ
ｅｌｒａ、 Ｊ、ら。
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 １５
２．３−１１（１９８７）に記載されている方法に従っ
て１本鎖ＤＮＡを調製し、ｐＨＳＧ３９ｇまたはｐ Ｈ
Ｓ Ｇ ３９９にクローニングしたものに関しては、Ｍ
１３ｍｐ１ｇまたはＭ １３＊ｐ１９（宝酒造社製）
に再クローニングした後１本鎖ＤＮＡを：Ａ製し、Ｓａ
ｎｇｃｒ、 Ｆ、、 ５ｃｉｅｎｃｅ、 ２１４゜１２
０５−１２１０（１９８１）に記載された方法に従って
、ＤＮＡの塩基配列を決定した。
２．３−１１（１９８７）に記載されている方法に従っ
て１本鎖ＤＮＡを調製し、ｐＨＳＧ３９ｇまたはｐ Ｈ
Ｓ Ｇ ３９９にクローニングしたものに関しては、Ｍ
１３ｍｐ１ｇまたはＭ １３＊ｐ１９（宝酒造社製）
に再クローニングした後１本鎖ＤＮＡを：Ａ製し、Ｓａ
ｎｇｃｒ、 Ｆ、、 ５ｃｉｅｎｃｅ、 ２１４゜１２
０５−１２１０（１９８１）に記載された方法に従って
、ＤＮＡの塩基配列を決定した。
実施例 ２
ミニサテライトＤＮＡ配列をプローブとしたヒト遺伝子
の解析 ヒトα２−プラスミンインヒビタ−遺伝子塩基配列の解
析により、４５ｂｐミニサテライトＤＮＡの９９ｂｐ上
流と１５ｂ、下流にＢｓｔＸＩ２！２部位が存在するこ
とがわかった。血漿中のＧ２−プラスミンインヒビタ−
濃度に関する健常者で血縁関係の知られていない者９人
の染色体ＤＮＡをＢ ５ｔＸＩで消化した後、４５ｍａ
ｒの核酸プローブを用い、サザンブロットハイブリダイ
ゼーションを行い、コピー数および制限酵素切断断片の
電気泳動パターンを解析した。
の解析 ヒトα２−プラスミンインヒビタ−遺伝子塩基配列の解
析により、４５ｂｐミニサテライトＤＮＡの９９ｂｐ上
流と１５ｂ、下流にＢｓｔＸＩ２！２部位が存在するこ
とがわかった。血漿中のＧ２−プラスミンインヒビタ−
濃度に関する健常者で血縁関係の知られていない者９人
の染色体ＤＮＡをＢ ５ｔＸＩで消化した後、４５ｍａ
ｒの核酸プローブを用い、サザンブロットハイブリダイ
ゼーションを行い、コピー数および制限酵素切断断片の
電気泳動パターンを解析した。
ＤＮＡの調製
デキストラン比重差遠心により、３０ｍ１の血液から得
られた白血球を、１００ｍＭ ＥＤＴ、Ａ、５０ｍＭ
ＴｒｉｓｌＩＨＣＮ ｐ）Ｉｇ、ｏ、 ５００１
／ｍｌプロティンキナーゼに、 ０．５％ ＳＤＳ溶液
中に懸濁し、５５℃で一晩インキユベーションした。フ
ェノール及びクロロホルムで抽出した後、ＤＮＡをエタ
ノールで沈澱させ、ＴＥ緩衝溶液中に溶解した。
られた白血球を、１００ｍＭ ＥＤＴ、Ａ、５０ｍＭ
ＴｒｉｓｌＩＨＣＮ ｐ）Ｉｇ、ｏ、 ５００１
／ｍｌプロティンキナーゼに、 ０．５％ ＳＤＳ溶液
中に懸濁し、５５℃で一晩インキユベーションした。フ
ェノール及びクロロホルムで抽出した後、ＤＮＡをエタ
ノールで沈澱させ、ＴＥ緩衝溶液中に溶解した。
核酸プローブ
下記の塩基配列を有する４５ｓｅｒのオリゴヌクレオチ
ド ＣＡＧＧＡＣＡＧＴＧＡＧＧＧＴＧＧＧＡＡＧＧＡＧＣ
ＣＴＧＡＴＧＣＡＧＧＧＡＧＴＧＡＧＧＣＧをＤＮＡ合
成機（ＡＢ Ｉ、 ３８０Ａ）で合成した。
ド ＣＡＧＧＡＣＡＧＴＧＡＧＧＧＴＧＧＧＡＡＧＧＡＧＣ
ＣＴＧＡＴＧＣＡＧＧＧＡＧＴＧＡＧＧＣＧをＤＮＡ合
成機（ＡＢ Ｉ、 ３８０Ａ）で合成した。
この４５ｓｅｒ、 ５０ｐＩＩｏＮを、（γ−３２ｐ）
ＡＴＰ３．７ＭＢｑ （１８５Ｔ Ｂｑ／ｍｗｏｊ７
） 、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ１０単位、５０ｍ
Ｍ Ｔｒｌｓ−ＨＣＲｌ）Ｈ８，０，１０ｍＭ Ｍ
ｇ（ｊ！ ５ｍＭジチオスレ２゜ イトールを含む最終審ｆｆ１３０μｇの溶液中で、３７
℃。
ＡＴＰ３．７ＭＢｑ （１８５Ｔ Ｂｑ／ｍｗｏｊ７
） 、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ１０単位、５０ｍ
Ｍ Ｔｒｌｓ−ＨＣＲｌ）Ｈ８，０，１０ｍＭ Ｍ
ｇ（ｊ！ ５ｍＭジチオスレ２゜ イトールを含む最終審ｆｆ１３０μｇの溶液中で、３７
℃。
１時間インキュベーションすることによって、５′末端
を３２Ｐで標識した。標識後、この溶液を５ｅｐｈａｄ
ｅｘ Ｇ５０カラムクロマトグラフイにかけ、遊離のヌ
クレオチド及び〔γ−３２Ｐ）ＡＴＰを、標識した４５
ｓｅｒと分離した。
を３２Ｐで標識した。標識後、この溶液を５ｅｐｈａｄ
ｅｘ Ｇ５０カラムクロマトグラフイにかけ、遊離のヌ
クレオチド及び〔γ−３２Ｐ）ＡＴＰを、標識した４５
ｓｅｒと分離した。
サザンプロットハイプリダイゼーション前記、白血球か
ら調製したゲノムＤ Ｎ Ａ １５■をＢ ５ｔＸＩで
消化し、０．８％アガロースゲル板中で電気泳動し、Ｂ
ｌｏｄｙｎｅナイロン膜（Ｐａｌｌ Ｂｉ。
ら調製したゲノムＤ Ｎ Ａ １５■をＢ ５ｔＸＩで
消化し、０．８％アガロースゲル板中で電気泳動し、Ｂ
ｌｏｄｙｎｅナイロン膜（Ｐａｌｌ Ｂｉ。
５ｕｐｐｏｒｔ、 Ｅａｓｔ Ｈｌｌｌｓ、 Ｎ、Ｙ、
）へ、その説明書に記載された方法に従って移した。ｌ
）０℃で２時間インキュベーションし、ナイロン膜にＤ
ＮＡを固定した後、同説明書に従って、４５ｓｅｒの核
酸プローブと４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行
った。
）へ、その説明書に記載された方法に従って移した。ｌ
）０℃で２時間インキュベーションし、ナイロン膜にＤ
ＮＡを固定した後、同説明書に従って、４５ｓｅｒの核
酸プローブと４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行
った。
洗浄及び露出
ナイロン膜を同説明書に記載された方法に従って洗浄し
、サランラップで覆った後、フィルム、増感スクリーン
と共に一８０℃で２４〜６６時間露出下においた。
、サランラップで覆った後、フィルム、増感スクリーン
と共に一８０℃で２４〜６６時間露出下においた。
結 果
Ｂｓｔ）Ｑで消化したゲノムＤＮＡのパターンとして、
各サンプルそれぞれ２本のバンドが見られた。
各サンプルそれぞれ２本のバンドが見られた。
バンドの位置からその長さを算出すると、鎖長が約８．
０．３．８．３．４．１．６．１．５ｋｂの５ＦＩｉ類
であった（図２に示した）。４５ｂｐのコピー数は以下
のようにして計算した。４５ｂｐミニサテライトＤＮＡ
の両末端からＢｓｔｘＩ切断部位までの長さ（上流側９
０ｂｐ。
０．３．８．３．４．１．６．１．５ｋｂの５ＦＩｉ類
であった（図２に示した）。４５ｂｐのコピー数は以下
のようにして計算した。４５ｂｐミニサテライトＤＮＡ
の両末端からＢｓｔｘＩ切断部位までの長さ（上流側９
０ｂｐ。
下流側２２ｂｐ）をそれぞれの鎖長から引いて、これを
４５で割った。この計算によると、コピー数は大きい方
から、約１７５．８２．７３．３３．３１となり、これ
らの値は、それぞれのバンドのＸ線フィルム上の黒化度
とほぼ一致した。
４５で割った。この計算によると、コピー数は大きい方
から、約１７５．８２．７３．３３．３１となり、これ
らの値は、それぞれのバンドのＸ線フィルム上の黒化度
とほぼ一致した。
検体（ａ −ｉ ）のそれぞれの鎖長及びコピー数を表
１に示す。
１に示す。
表 １
結果は、父親及び母親由来のミニサテライトのコピーが
各１種類づつ存在することを示している。
各１種類づつ存在することを示している。
また、各個人から得られた制限酵素切断断片のパターン
は各々いくつかのグループに分かれた。
は各々いくつかのグループに分かれた。
図１はα２−プラスミンインヒビタ−遺伝子の制限酵素
マツプ、エクソンの位置、４５ｂｐミニサテライトＤＮ
Ａの位置及びその塩基配列を示しており、黒い長方形は
エクソンを、白い長方形はミニサテライトＤＮＡを表し
ている。 図２は、９人の染色体ＤＮＡをＢ ５ｔＸＩで消化した
後、４５ｓｅｒの核酸プローブを用い、サザンプロット
ハイプリダイゼーションを行ったときのオートラジオダ
ラムである。矢印はバンドの位置を、数字はその長さを
示している。
マツプ、エクソンの位置、４５ｂｐミニサテライトＤＮ
Ａの位置及びその塩基配列を示しており、黒い長方形は
エクソンを、白い長方形はミニサテライトＤＮＡを表し
ている。 図２は、９人の染色体ＤＮＡをＢ ５ｔＸＩで消化した
後、４５ｓｅｒの核酸プローブを用い、サザンプロット
ハイプリダイゼーションを行ったときのオートラジオダ
ラムである。矢印はバンドの位置を、数字はその長さを
示している。
Claims (5)
- （１）下記の塩基配列またはその相補鎖のうち、少なく
とも連続した１２個の好ましくは２０個以上の塩基配列
を含むことを特徴とする標識オリゴヌクレオチドプロー
ブ。 【遺伝子配列があります】 - （２）下記の塩基配列またはその相補鎖を有することを
特徴とする請求項１の標識オリゴヌクレオチドプローブ
。 【遺伝子配列があります】 （式中、Ｎは、Ａ、ＧまたはＣ、Ｘは、ＡまたはＧ、Ｙ
は、ＣまたはＧ、Ｚは、ＡまたはＣである） - （３）下記の塩基配列を有することを特徴とする請求項
２の標識オリゴヌクレオチドプローブ。 【遺伝子配列があります】 - （４）酵素、ラジオアイソトープ、および化学ルミネッ
センス発光体により標識されたことを特徴とする請求項
１〜３のいずれかの項に記載の標識オリゴヌクレオチド
プローブ。 - （５）請求項１〜４のいずれかの項に記載の標識オリゴ
ヌクレオチドプローブを含む遺伝子診断キット。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1284909A JPH03147799A (ja) | 1989-11-02 | 1989-11-02 | 新規なオリゴヌクレオチドプローブ |
| PCT/JP1990/001404 WO1991006675A1 (fr) | 1989-11-02 | 1990-10-31 | Nouvelle sonde a base d'oligonucleotides |
| AU66310/90A AU6631090A (en) | 1989-11-02 | 1990-10-31 | New oligonucleotide probe |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1284909A JPH03147799A (ja) | 1989-11-02 | 1989-11-02 | 新規なオリゴヌクレオチドプローブ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03147799A true JPH03147799A (ja) | 1991-06-24 |
Family
ID=17684620
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1284909A Pending JPH03147799A (ja) | 1989-11-02 | 1989-11-02 | 新規なオリゴヌクレオチドプローブ |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03147799A (ja) |
| AU (1) | AU6631090A (ja) |
| WO (1) | WO1991006675A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001057277A3 (en) * | 2000-02-04 | 2003-02-13 | Aeomica Inc | Human genome-derived single exon nucleic acid probes useful for analysis of gene expression in human fetal liver |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20220067489A1 (en) | 2020-08-28 | 2022-03-03 | Illumina, Inc. | Detecting and Filtering Clusters Based on Artificial Intelligence-Predicted Base Calls |
| AU2022248999A1 (en) | 2021-03-31 | 2023-02-02 | Illumina, Inc. | Artificial intelligence-based base caller with contextual awareness |
-
1989
- 1989-11-02 JP JP1284909A patent/JPH03147799A/ja active Pending
-
1990
- 1990-10-31 AU AU66310/90A patent/AU6631090A/en not_active Abandoned
- 1990-10-31 WO PCT/JP1990/001404 patent/WO1991006675A1/ja not_active Ceased
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001057277A3 (en) * | 2000-02-04 | 2003-02-13 | Aeomica Inc | Human genome-derived single exon nucleic acid probes useful for analysis of gene expression in human fetal liver |
| WO2001057273A3 (en) * | 2000-02-04 | 2003-06-26 | Aeomica Inc | Human genome-derived single exon nucleic acid probes useful for analysis of gene expression in human adult liver |
| GB2375111B (en) * | 2000-02-04 | 2004-12-01 | Aeomica Inc | Human genome-derived single exon nucleic acid probes useful for analysis of gene expression in human fetal liver |
| GB2375539B (en) * | 2000-02-04 | 2004-12-08 | Aeomica Inc | Human genome-derived single exon nucleic acid probes useful for analysis of gene expression in human adult liver |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1991006675A1 (fr) | 1991-05-16 |
| AU6631090A (en) | 1991-05-31 |
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