JPH03147800A - 核酸固相化アンカー及びその調整方法 - Google Patents
核酸固相化アンカー及びその調整方法Info
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- JPH03147800A JPH03147800A JP28504289A JP28504289A JPH03147800A JP H03147800 A JPH03147800 A JP H03147800A JP 28504289 A JP28504289 A JP 28504289A JP 28504289 A JP28504289 A JP 28504289A JP H03147800 A JPH03147800 A JP H03147800A
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は例えばＤＮＡ結合タンパク貿の分離、精製や遺
伝子クローニング等で必要なりＮＡを酵素的に固相化ま
たは脱固相化することのできる核酸固相化アンカー及び
その調整方法に関するものである。
伝子クローニング等で必要なりＮＡを酵素的に固相化ま
たは脱固相化することのできる核酸固相化アンカー及び
その調整方法に関するものである。
［従来の技術］
核酸をセルロース等の固相担体に結合させる試みは古く
、既に１９６２年から行われており、核酸に存在するア
ミノ基や水酸基と固相担体とを架橋結合する所謂化学法
が主流であった。
、既に１９６２年から行われており、核酸に存在するア
ミノ基や水酸基と固相担体とを架橋結合する所謂化学法
が主流であった。
しかし、多くは水溶液中で行われるため、固相担体との
架橋効率が低く、結合可能な対象は専ら一本鎖のＤＮＡ
やＲＮＡであり、二本鎖のＤＮＡに至ってはほとんど不
可能に近い状態であった。
架橋効率が低く、結合可能な対象は専ら一本鎖のＤＮＡ
やＲＮＡであり、二本鎖のＤＮＡに至ってはほとんど不
可能に近い状態であった。
最近、ＤＮＡシンセサイザーが開発され、有機溶媒中で
ＤＮＡの末端に反応性の高いアミノ基の導入が可能とな
り、合成した一本鎖Ｄ Ｎ Ａを効率良く固相担体に結
合することができるようになった。しかし、生体より抽
出した種々の二本ｆｔ１ＤＮＡを効率よく固相担体に結
合させる方法は未だ行われていない。
ＤＮＡの末端に反応性の高いアミノ基の導入が可能とな
り、合成した一本鎖Ｄ Ｎ Ａを効率良く固相担体に結
合することができるようになった。しかし、生体より抽
出した種々の二本ｆｔ１ＤＮＡを効率よく固相担体に結
合させる方法は未だ行われていない。
また、近年さかんに行われているｃＤＮＡクロニング法
においては、まずｍＲＮＡを抽出、精製することが必要
となる。最近ではこの目的のために一本鎖のオリゴｄＴ
を固相に結合したものが利用できるが、これに続＜ｃＤ
ＮＡの合成過程の前にｍＲＮＡを一旦解離精製しなけれ
ばならない。この解離精製はある程度のｍＲＮＡの分解
を伴なうとともに回収率を低下させる原因となり、従来
のプレートスリクーニングの域を脱していなかった。
においては、まずｍＲＮＡを抽出、精製することが必要
となる。最近ではこの目的のために一本鎖のオリゴｄＴ
を固相に結合したものが利用できるが、これに続＜ｃＤ
ＮＡの合成過程の前にｍＲＮＡを一旦解離精製しなけれ
ばならない。この解離精製はある程度のｍＲＮＡの分解
を伴なうとともに回収率を低下させる原因となり、従来
のプレートスリクーニングの域を脱していなかった。
［発明が解決しようとする課題］
特定の塩基配列を持つ二本ｆｉＤＮＡに結合するタンパ
ク質を単離する場合や、核酸プローブにより目的ＤＮＡ
を検出単離する場合に、効率よく、しかも簡単に二本鎖
Ｄ Ｎ Ａを固相担体に結合させることは大変有用な技
術であるにもかかわらず、未だこのような技術方法はな
い。
ク質を単離する場合や、核酸プローブにより目的ＤＮＡ
を検出単離する場合に、効率よく、しかも簡単に二本鎖
Ｄ Ｎ Ａを固相担体に結合させることは大変有用な技
術であるにもかかわらず、未だこのような技術方法はな
い。
また、固相担体に結合したオリゴｄＴ（固相化オリゴｄ
Ｔ）を用いてｍＲＮＡを単離し、これを基にし”Ｃ，Ｃ
ＤＮＡを合成することは最近さかんに行われているが、
この場合、−旦ｍＲＮＡを固相化オリゴｄＴより解離し
て精製した後、ｃＤＮＡを合成する。もし、これを固相
化状態で行えば、効率及び収率が格段に上昇するわけで
あるが、従来の固相化オリゴｄＴでは、最終産物である
二本鎖ｃ Ｄ Ｎ Ａを簡単に固相担体より単離できな
いという問題があった。
Ｔ）を用いてｍＲＮＡを単離し、これを基にし”Ｃ，Ｃ
ＤＮＡを合成することは最近さかんに行われているが、
この場合、−旦ｍＲＮＡを固相化オリゴｄＴより解離し
て精製した後、ｃＤＮＡを合成する。もし、これを固相
化状態で行えば、効率及び収率が格段に上昇するわけで
あるが、従来の固相化オリゴｄＴでは、最終産物である
二本鎖ｃ Ｄ Ｎ Ａを簡単に固相担体より単離できな
いという問題があった。
本発明は、固相担体と核酸とを酵素的につなぐことので
きる核酸固相化アンカー及びその調整方法を得ることを
目的とする。
きる核酸固相化アンカー及びその調整方法を得ることを
目的とする。
［課題を解決するための手段］
本発明に係る核酸固相化アンカーでは、核酸断片の一端
に所望の固相担体に結合する官能基を備え、前記核酸に
所望の核酸プローブを結合させるものである。
に所望の固相担体に結合する官能基を備え、前記核酸に
所望の核酸プローブを結合させるものである。
また、核酸断片に所望の制限酵素切断部位が備わったも
の、更に、核酸断片の他端にポリｄＴ配列を備わったも
のをも開示するものである。
の、更に、核酸断片の他端にポリｄＴ配列を備わったも
のをも開示するものである。
核酸断片の一端に備わった官能基は、具体的にはスルフ
ヒドリル基、脂肪族の一級アミノ基等の固相担体との結
合が容易で、固相担体及び核酸との結合時に核酸の変性
を生じないものであればよい。
ヒドリル基、脂肪族の一級アミノ基等の固相担体との結
合が容易で、固相担体及び核酸との結合時に核酸の変性
を生じないものであればよい。
別の発明に係る核酸固相化アンカーの調整方法では、核
酸断片の一端に官能基を配し、固相担体を活性化して前
記官能基と反応性をもたせ、前記官能基を固相担体に結
合させる方法である。
酸断片の一端に官能基を配し、固相担体を活性化して前
記官能基と反応性をもたせ、前記官能基を固相担体に結
合させる方法である。
前記官能基の具体的な例は、スルフヒドリル基、脂肪族
の一級アくノ基等であり、前記官能基と反応性をもたせ
るための具体的な例は、固相担体をマレイミド基、スク
シニミジル基等で活性化させる方法がある。即ち、前記
官能基を容易に結合させ、固相担体及び核酸との結合時
に核酸の変性を生じないものであればよい。
の一級アくノ基等であり、前記官能基と反応性をもたせ
るための具体的な例は、固相担体をマレイミド基、スク
シニミジル基等で活性化させる方法がある。即ち、前記
官能基を容易に結合させ、固相担体及び核酸との結合時
に核酸の変性を生じないものであればよい。
［作用］
本発明における核酸固相化アンカーでは、核酸断片の一
端に所望の固相担体に結合する官能基を備え、前記核酸
に所望の核酸プローブを結合させるものであるため、例
えば、アニーリングして前記核酸に相補的な核酸と、ハ
イブリッド形成することができる。ハイブリッドされた
核酸は固相化されているため、固相化されなかった物質
と分離が容易であり、使用目的に応じた高収率、高効率
が達成できる。
端に所望の固相担体に結合する官能基を備え、前記核酸
に所望の核酸プローブを結合させるものであるため、例
えば、アニーリングして前記核酸に相補的な核酸と、ハ
イブリッド形成することができる。ハイブリッドされた
核酸は固相化されているため、固相化されなかった物質
と分離が容易であり、使用目的に応じた高収率、高効率
が達成できる。
また、核酸断片に所望の制限酵素切断部位が備わらてい
れば、例えば、特定の制限酵素による切断後、生成する
末端構造と対向する末端をもつ二本鎖、−本願の核酸を
、リガーゼ等の酵素をもってつなぐことができる。固相
化された核酸は、固相化されなかった物質と分離が容易
であり、使用目的に応じた高収率、高効率が達成できる
。
れば、例えば、特定の制限酵素による切断後、生成する
末端構造と対向する末端をもつ二本鎖、−本願の核酸を
、リガーゼ等の酵素をもってつなぐことができる。固相
化された核酸は、固相化されなかった物質と分離が容易
であり、使用目的に応じた高収率、高効率が達成できる
。
更に、核酸断片の他端にポリｄＴ配列を備わっていれば
、ｍＲＮＡのポリＡＭと容易に結合することから、逆転
写酵素等の酵素により、直接ｃＤＮＡライブラリーを製
作することが容易となる。
、ｍＲＮＡのポリＡＭと容易に結合することから、逆転
写酵素等の酵素により、直接ｃＤＮＡライブラリーを製
作することが容易となる。
作成されたｃＤＮＡライブラリーは、固相化されなかっ
た物質と分離が容易であり、しかも作成されたｃＤＮＡ
は単離・回収が容易であるため、容易にベクター等に挿
入を行なうことができる。
た物質と分離が容易であり、しかも作成されたｃＤＮＡ
は単離・回収が容易であるため、容易にベクター等に挿
入を行なうことができる。
また、核酸の一端に備わった官能基には、具体的には、
脂肪族の一級アミノ基やスルフヒドリル基等の固相担体
との結合が容易で、固相担体及び核酸との結合時に核酸
の変性を生じないものであればよい。即ち、本発明によ
る核酸固相化アンカーは、アンカー内の核酸断片や制限
酵素の種類を適当に選べば、如何なる二本９５９ Ｄ
Ｎ Ａ 、−本１１ ＤＮＡ、ＲＮＡプローブも容易に
固相化できる。
脂肪族の一級アミノ基やスルフヒドリル基等の固相担体
との結合が容易で、固相担体及び核酸との結合時に核酸
の変性を生じないものであればよい。即ち、本発明によ
る核酸固相化アンカーは、アンカー内の核酸断片や制限
酵素の種類を適当に選べば、如何なる二本９５９ Ｄ
Ｎ Ａ 、−本１１ ＤＮＡ、ＲＮＡプローブも容易に
固相化できる。
また、調整方法の発明においては、核酸断片の一端に官
能基を配し、固相担体を活性化して前記官能基と反応性
をもたせ、前記官能基を固相担体に結合させる方法であ
るため、所望の核酸断片であれば、如何なるものでも核
酸固相化アンカーとして使用できる。即ち、ＤＮＡ合戒
合成で作成した二本鎖ＤＮＡ、−末鎖ＤＮＡやＲＮＡ、
市販の制限酵素切断部位が判明しているＤＮＡ断片、プ
ラスミドを任意の制限酵素で切断したＤＮＡ断片等の使
用目的に沿った如何’ｅる核酸も使用できる。
能基を配し、固相担体を活性化して前記官能基と反応性
をもたせ、前記官能基を固相担体に結合させる方法であ
るため、所望の核酸断片であれば、如何なるものでも核
酸固相化アンカーとして使用できる。即ち、ＤＮＡ合戒
合成で作成した二本鎖ＤＮＡ、−末鎖ＤＮＡやＲＮＡ、
市販の制限酵素切断部位が判明しているＤＮＡ断片、プ
ラスミドを任意の制限酵素で切断したＤＮＡ断片等の使
用目的に沿った如何’ｅる核酸も使用できる。
この使用目的に合致した核酸を、スルフヒドリル基、脂
肪族の一級アミノ基等の官能基とつなぎ、この官能基と
反応性をもたせるため、固相担体をマレイミド基、スク
シニよジル基等で活性化させて、前記官能基とを結合さ
せる。
肪族の一級アミノ基等の官能基とつなぎ、この官能基と
反応性をもたせるため、固相担体をマレイミド基、スク
シニよジル基等で活性化させて、前記官能基とを結合さ
せる。
この他にも官能基をジアゾ結合によって固相担体に結合
する方法、カルボジイミド（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ
）を介してカップリングする方法、ビスオキシラン（ｂ
ｉｓｏｘｉｒａｎｅ）と直接カップリングする方法等が
ある。即ち、前記官能基を容易に結合させ、固相担体及
び核酸との結合時に核酸の変性を生じないものであれば
よい。
する方法、カルボジイミド（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ
）を介してカップリングする方法、ビスオキシラン（ｂ
ｉｓｏｘｉｒａｎｅ）と直接カップリングする方法等が
ある。即ち、前記官能基を容易に結合させ、固相担体及
び核酸との結合時に核酸の変性を生じないものであれば
よい。
［実施例コ
第１Ａ、Ｂ図は各々核酸固相化アンカの一実施例の遺伝
子配列を示す説明図である。第１Ａ図は主に固相化クロ
ーニングやＤＮＡ結合蛋白質分離用に使用される核酸固
相化アンカー、第１Ｂ図はｍＲＮＡのポリＡ鎖部位に結
合するためのポリｄＴ配列を含み、主に固相化ｃＤＮＡ
１合戒用に使用言れる核酸固相化アンカーである。
子配列を示す説明図である。第１Ａ図は主に固相化クロ
ーニングやＤＮＡ結合蛋白質分離用に使用される核酸固
相化アンカー、第１Ｂ図はｍＲＮＡのポリＡ鎖部位に結
合するためのポリｄＴ配列を含み、主に固相化ｃＤＮＡ
１合戒用に使用言れる核酸固相化アンカーである。
図に示す通り、幾つかの制限酵素切断部位を備えたＤＮ
Ａフラグメントの一端に所望の固相担体に結合する官能
基りを備えた構造となっている。
Ａフラグメントの一端に所望の固相担体に結合する官能
基りを備えた構造となっている。
一端に備わった官能基りは、予め反応性の高い物質や操
作で表面を活性化処理された樹脂担体などに固相化され
る。その具体的な例として例えば、マレイミド基やスク
シニよジル基等の反応性の高い作用基で活性化された樹
脂担体などに固相化される。
作で表面を活性化処理された樹脂担体などに固相化され
る。その具体的な例として例えば、マレイミド基やスク
シニよジル基等の反応性の高い作用基で活性化された樹
脂担体などに固相化される。
このＤＮＡフラグメントの他端又は制限酵素切断部位に
、固相化する所望のプローブＤＮＡ又はＲＮＡ断片をＤ
ＮＡリガーゼや制限酵素等の酵素によって結合させる。
、固相化する所望のプローブＤＮＡ又はＲＮＡ断片をＤ
ＮＡリガーゼや制限酵素等の酵素によって結合させる。
具体的には、第１Ａ図に示される核酸固相化アンカーは
、例えば、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断されたプローブＤ
ＮＡを固相化する場合には、固相化するプローブＤＮＡ
の末端に符合させるため、同じ制限酵素ＥｃｏＲＩによ
って核酸固相化アンカーのＤＮＡフラグメントを切断し
、これに固相化するプローブＤＮＡを加え、ＤＮＡリガ
ーゼによって結合させる。
、例えば、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断されたプローブＤ
ＮＡを固相化する場合には、固相化するプローブＤＮＡ
の末端に符合させるため、同じ制限酵素ＥｃｏＲＩによ
って核酸固相化アンカーのＤＮＡフラグメントを切断し
、これに固相化するプローブＤＮＡを加え、ＤＮＡリガ
ーゼによって結合させる。
核酸固相化アンカーのＤＮＡフラグメントや制限酵素の
種類を適当に選べば、如何なるプローブＤＮＡも容易に
固相化できる。また例えば、ＡｖａＩや５ｆｉ１等の切
断末端を利用することにより固相化されるプローブＤＮ
Ａの配向を規定したり、ＤｒＩＪＡフラグメントや固相
化されたプローブＤＮＡを再切断、再結合することも可
能である。固相化されるプローブＤＮＡは、核酸結合蛋
白質をアフィニティー分離する目的には二本鎖のまま使
用し、固相化クローニングの目的には一本鎖にしてから
用いるとよい。
種類を適当に選べば、如何なるプローブＤＮＡも容易に
固相化できる。また例えば、ＡｖａＩや５ｆｉ１等の切
断末端を利用することにより固相化されるプローブＤＮ
Ａの配向を規定したり、ＤｒＩＪＡフラグメントや固相
化されたプローブＤＮＡを再切断、再結合することも可
能である。固相化されるプローブＤＮＡは、核酸結合蛋
白質をアフィニティー分離する目的には二本鎖のまま使
用し、固相化クローニングの目的には一本鎖にしてから
用いるとよい。
同様に、第１Ｂ図に示される核酸固相化アンカーのＤＮ
Ａフラグメントの他端に備わったポリｄＴ配列は、ｍＲ
ＮＡのポリＡ ６１部位に結合するため、直接ｃＤＮＡ
ライブラリーを製作し、必要に応じて制限酵素で切り出
し、ベクターに組み込むことができる。
Ａフラグメントの他端に備わったポリｄＴ配列は、ｍＲ
ＮＡのポリＡ ６１部位に結合するため、直接ｃＤＮＡ
ライブラリーを製作し、必要に応じて制限酵素で切り出
し、ベクターに組み込むことができる。
尚、核酸固相化アンカー中のＤＮＡフラグメントは、所
望のＤＮＡフラグメントであれば、如何なるものでも使
用できる。即ち、ＤＮＡ合戒合成で作成した二末娘ＤＮ
Ａ、−本１１ Ｄ Ｎ ＡやＲＮＡ、市販の制限酵素切
断部位が判明しているＤＮＡ断片、プラスミドを任意の
制限酵素で切断したＤＮＡ断片等の使用目的に沿った如
何なる核酸も使用できる。
望のＤＮＡフラグメントであれば、如何なるものでも使
用できる。即ち、ＤＮＡ合戒合成で作成した二末娘ＤＮ
Ａ、−本１１ Ｄ Ｎ ＡやＲＮＡ、市販の制限酵素切
断部位が判明しているＤＮＡ断片、プラスミドを任意の
制限酵素で切断したＤＮＡ断片等の使用目的に沿った如
何なる核酸も使用できる。
以下に具体的な核酸固相化アンカーの調整方法及び使用
方法を説明する。
方法を説明する。
実施例１（核酸固相化アンカーの調整方法）固相担体と
の結合反応には種々の化学反応を利用することが可能で
ある。
の結合反応には種々の化学反応を利用することが可能で
ある。
以下に、−例として種々の制限酵素により切断可能なマ
ルチクローニング部位を有するｐＧＥＭ７プラスミドＤ
ＮＡ （プロメガ社製）を５ａｃＩとＮａｅ Ｉとで切
断したＤＮＡフラグメント（４００ｂｐ）を固相化した
場合の方法と結果を述べる。
ルチクローニング部位を有するｐＧＥＭ７プラスミドＤ
ＮＡ （プロメガ社製）を５ａｃＩとＮａｅ Ｉとで切
断したＤＮＡフラグメント（４００ｂｐ）を固相化した
場合の方法と結果を述べる。
固相化反応に用いたＤＮＡフラグメントは、ρＧＥＭ７
ブラスミドＤＮＡ（プロメガ社製）を ５ａｃＩと Ｎ
ａｅＩとで切断したものを使用した。第２図の反応式に
示す通り、予めｐＨ９，０で２−イミノチオラン（２−
１ｍ１ｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）処理し、 Ｓａｃ Ｉ切
断末端側の塩基由来の−ＮＨ２基に −５Ｈ基を導入し
、 −５Ｈ基と親和性の高いＳＨ−アフィニティーカラ
ムにより分離・精製した。
ブラスミドＤＮＡ（プロメガ社製）を ５ａｃＩと Ｎ
ａｅＩとで切断したものを使用した。第２図の反応式に
示す通り、予めｐＨ９，０で２−イミノチオラン（２−
１ｍ１ｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）処理し、 Ｓａｃ Ｉ切
断末端側の塩基由来の−ＮＨ２基に −５Ｈ基を導入し
、 −５Ｈ基と親和性の高いＳＨ−アフィニティーカラ
ムにより分離・精製した。
固相担体には、非多孔買製のビーズ状の樹脂担体（東ソ
ー製ＮＰＲ１粒径２．５μｍ）を使用し、第３図に記載
の反応式に示す通り、樹脂表面上の水酸基（−ＯＨ基）
とビスオキシラン（ｂｉｓｏｘｔｒａｎｅ）とを反応さ
せた後、適当な長さを持つアミノ・リンカ−としてエチ
レンジアミン（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｆａｍｉｎｅ）をつ
なぎ、更に末端には、二官能性試薬のスルフォサクシン
イミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレイト
を用いてマレイミド基を導入した。
ー製ＮＰＲ１粒径２．５μｍ）を使用し、第３図に記載
の反応式に示す通り、樹脂表面上の水酸基（−ＯＨ基）
とビスオキシラン（ｂｉｓｏｘｔｒａｎｅ）とを反応さ
せた後、適当な長さを持つアミノ・リンカ−としてエチ
レンジアミン（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｆａｍｉｎｅ）をつ
なぎ、更に末端には、二官能性試薬のスルフォサクシン
イミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレイト
を用いてマレイミド基を導入した。
固相化反応は０．１Ｍの燐酸Ｎ、衝新液ｐ）Ｉ ７．０
）中室温で行い、第３図の反応式で得られたマレイくド
化樹脂の懸濁溶液に、Ｎ２図の反応式で得られたＳＨ化
ＤＮＡを加え、２秒おきに上下が逆になるよう回転する
振盪器によってゆっくり攪拌しながら第４図に記載され
た反応式に示す通りの反応を行った。
）中室温で行い、第３図の反応式で得られたマレイくド
化樹脂の懸濁溶液に、Ｎ２図の反応式で得られたＳＨ化
ＤＮＡを加え、２秒おきに上下が逆になるよう回転する
振盪器によってゆっくり攪拌しながら第４図に記載され
た反応式に示す通りの反応を行った。
第５図は核酸固相化アンカーの固相担体への結合を経時
的に追ったグラフであり、懸濁溶液の遠心上清に残留す
る未反応のＤＮＡ量を、ＨＰＬＣでのピークの高さとし
て測定し、この値をもとに算出した結合ＤＮＡの百分率
を経時的に示したものである。図に示す通り、約２時間
の反応で核酸固相化アンカーＤＮＡ中の９０％以上が固
相化されていることがわかった。
的に追ったグラフであり、懸濁溶液の遠心上清に残留す
る未反応のＤＮＡ量を、ＨＰＬＣでのピークの高さとし
て測定し、この値をもとに算出した結合ＤＮＡの百分率
を経時的に示したものである。図に示す通り、約２時間
の反応で核酸固相化アンカーＤＮＡ中の９０％以上が固
相化されていることがわかった。
尚、その他にも脂肪族の一級アミノ基等の官能基を予め
導入し、固相担体表面の作用基と反応する基を導入して
も良い。また、固相担体の表面をマレイミド基の作用基
で活性化させたが、マレイミド基の他にもスクシニよジ
ル基等の反応性の高い作用基で活性化させてもよい。
導入し、固相担体表面の作用基と反応する基を導入して
も良い。また、固相担体の表面をマレイミド基の作用基
で活性化させたが、マレイミド基の他にもスクシニよジ
ル基等の反応性の高い作用基で活性化させてもよい。
第６図、第７図は別の実施例の脂肪族一級アくノ基とス
クシニミジル基との架橋反応を使用した反応を示す説明
図である。第６図において、前記反応と同様に、非多孔
貿製の樹脂担体の表面上の水酸基（−〇Ｈ基）とビスオ
キシラン（ｂｆｓｏｘｉｒａｎｅ）とを反応させた後、
両端に一５Ｈ基を有し適当な長さをもつＳＨ・リンカ−
としてジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔ
ｏｌ）をつなぎ、更に末端には、二官能性試薬のスルフ
ォサクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−
ブチレイトを用いてスクシニよジル基を導入した。
クシニミジル基との架橋反応を使用した反応を示す説明
図である。第６図において、前記反応と同様に、非多孔
貿製の樹脂担体の表面上の水酸基（−〇Ｈ基）とビスオ
キシラン（ｂｆｓｏｘｉｒａｎｅ）とを反応させた後、
両端に一５Ｈ基を有し適当な長さをもつＳＨ・リンカ−
としてジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔ
ｏｌ）をつなぎ、更に末端には、二官能性試薬のスルフ
ォサクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−
ブチレイトを用いてスクシニよジル基を導入した。
固相化するＤＮＡ断片には、予めＤＮＡ合成装置で、５
′ＯＨ末端にアミノリンク等の脂肪族一級アミン基を導
入している（アプライド社製マニュアル）。第７図に示
す通り、この脂肪族一級アミノ基と第６図で得られた末
端のスクシニミジル基との架橋反応によりＤＮＡを固相
化させる。
′ＯＨ末端にアミノリンク等の脂肪族一級アミン基を導
入している（アプライド社製マニュアル）。第７図に示
す通り、この脂肪族一級アミノ基と第６図で得られた末
端のスクシニミジル基との架橋反応によりＤＮＡを固相
化させる。
実施例２（固相化アンカーの利用）
目的とする核酸の熱力学的解析や、固相化プローブを用
いて遺伝子やｃＤＮＡをクローニングする場合、ＤＮＡ
の融解反応の測定が重要な意義を持つ。
いて遺伝子やｃＤＮＡをクローニングする場合、ＤＮＡ
の融解反応の測定が重要な意義を持つ。
第８図は核酸固相化アンカーを使用したＤＮＡの熱融解
曲線図である。即ち、核酸固相化アンカーを介して固相
担体に結合した一本鎖のプローブＤＮＡ （以下、ｐＤ
ＮＡとする）に、これと相補的な塩基配列を持つＤＮＡ
（以下、車にｃＤＮＡとする）の熱融解曲線が示され
ている。
曲線図である。即ち、核酸固相化アンカーを介して固相
担体に結合した一本鎖のプローブＤＮＡ （以下、ｐＤ
ＮＡとする）に、これと相補的な塩基配列を持つＤＮＡ
（以下、車にｃＤＮＡとする）の熱融解曲線が示され
ている。
熱融解の実験に先立ち、ｐＤＮＡを固相化したビーズ状
のＮＰＲ樹脂固相担体０．２５ｍ１を１．５ｍｌのエツ
ベンドルフチューブに取り、これにｌＸ５ＳＣ溶液（０
，１５Ｍ ＮａＣ１、０，０１５Ｍクエン酸ナトリウ
ム）に溶解したｃＤＮＡを加え、９゛５℃、５分間、熱
処理し、６８℃、３０分間の保温後、３７℃まで徐々に
降温することにより、ｃＤＮＡを固相化ｐＤＮＡにハイ
ブリダイズした。
のＮＰＲ樹脂固相担体０．２５ｍ１を１．５ｍｌのエツ
ベンドルフチューブに取り、これにｌＸ５ＳＣ溶液（０
，１５Ｍ ＮａＣ１、０，０１５Ｍクエン酸ナトリウ
ム）に溶解したｃＤＮＡを加え、９゛５℃、５分間、熱
処理し、６８℃、３０分間の保温後、３７℃まで徐々に
降温することにより、ｃＤＮＡを固相化ｐＤＮＡにハイ
ブリダイズした。
樹脂を洗浄後、徐々に昇温していき、固相担体から遊離
してくるｃＤＮＡをＨＰＬＣで定量し、完全に遊離した
ときの値の百分率でプロットした。第８図からＴｍ値は
５５℃と推定された。
してくるｃＤＮＡをＨＰＬＣで定量し、完全に遊離した
ときの値の百分率でプロットした。第８図からＴｍ値は
５５℃と推定された。
以上のように固相法では、従来の方法では不可能であっ
た特定のＤＮＡやＲＮＡに着目した熱力学的解析が可能
であることが判明した。
た特定のＤＮＡやＲＮＡに着目した熱力学的解析が可能
であることが判明した。
実施例３（固相クローニング法の評価）固相クローニン
グ法は、固相化プローブと相補的な塩基配列をもつｃＤ
ＮＡの精製効率や回収率をもって評価できる。
グ法は、固相化プローブと相補的な塩基配列をもつｃＤ
ＮＡの精製効率や回収率をもって評価できる。
固相クローニングのモデル実験系として以下の実験を行
った。
った。
ｐＤＮＡ固相化ＮＰＲ（ｐＤＮＡを核酸固相化アンカー
を介してＮＰＲに固相化したもの）の０ 、’ Ｉ Ｉ
Ｉ （約２０ｕｇのｐＤＮＡが結合している）をエッペ
ンドルフチューブにとり、これにＰＤＮＡと相補的な塩
基配列をもっｃＤＮＡ１μｇとアフリカッメガエルのゲ
ノム（Ｈｉｎｄｌｌｌ、５ａｕ３ Ａ１、 ）Ｉｈａ
ｌで切断しである）５００μｇの混合試料０．５ｍｌを
加え、実施例２と同じ条件下で、ハイブリダイズさせた
。
を介してＮＰＲに固相化したもの）の０ 、’ Ｉ Ｉ
Ｉ （約２０ｕｇのｐＤＮＡが結合している）をエッペ
ンドルフチューブにとり、これにＰＤＮＡと相補的な塩
基配列をもっｃＤＮＡ１μｇとアフリカッメガエルのゲ
ノム（Ｈｉｎｄｌｌｌ、５ａｕ３ Ａ１、 ）Ｉｈａ
ｌで切断しである）５００μｇの混合試料０．５ｍｌを
加え、実施例２と同じ条件下で、ハイブリダイズさせた
。
反応後、遠心分離により、上清に回収される未反応のＤ
ＮＡ部分を、非結合ＤＮＡ画分として保存し、樹脂担体
を洗浄後、９５℃、５分間の熱処理によって遊離してく
るＤＮＡを、結合ＤＮＡ画分として回収した。
ＮＡ部分を、非結合ＤＮＡ画分として保存し、樹脂担体
を洗浄後、９５℃、５分間の熱処理によって遊離してく
るＤＮＡを、結合ＤＮＡ画分として回収した。
第９図は３％のアガロースゲルを用いたゲル電気泳動法
によって各画分を測定した泳動パターン図である。尚、
参考写真はこの電気泳動写真である。図において、レー
ン（ａ）はコントロールとして０．５μｇのｃＤＮＡを
単独で電気泳動したもの。レーン（ｂ）はカエルゲノム
ＤＮＡ （Ｈｉ ｎ ｄ ＩＩＩ、５ａｕ３Ａ Ｉ 、
ＨｈａＩで切断しである）とＣＤＮＡを混合した試
料２０μ℃を泳動したもので、ｃＤＮＡとして０．０４
μｇを含んだもの。レーン（Ｃ）は本核酸固相化プロー
ブとパイプリダイズしなかった非結合ＤＮＡ分画を２０
μ℃泳動したもの。レーン（ｄ）は本核酸固相化プロー
ブとパイプリダイズしたＤＮＡを回収した試料を泳動し
たものである。
によって各画分を測定した泳動パターン図である。尚、
参考写真はこの電気泳動写真である。図において、レー
ン（ａ）はコントロールとして０．５μｇのｃＤＮＡを
単独で電気泳動したもの。レーン（ｂ）はカエルゲノム
ＤＮＡ （Ｈｉ ｎ ｄ ＩＩＩ、５ａｕ３Ａ Ｉ 、
ＨｈａＩで切断しである）とＣＤＮＡを混合した試
料２０μ℃を泳動したもので、ｃＤＮＡとして０．０４
μｇを含んだもの。レーン（Ｃ）は本核酸固相化プロー
ブとパイプリダイズしなかった非結合ＤＮＡ分画を２０
μ℃泳動したもの。レーン（ｄ）は本核酸固相化プロー
ブとパイプリダイズしたＤＮＡを回収した試料を泳動し
たものである。
図に示した通り、レーン（ｄ）にはコントロール（ａ）
と同一位置にパターンが検出され、本核酸固相化プロー
ブによって、ｃＤＮＡを高収率かつ特異的に分離できる
ことが確認された。
と同一位置にパターンが検出され、本核酸固相化プロー
ブによって、ｃＤＮＡを高収率かつ特異的に分離できる
ことが確認された。
以上のように本発明によって、如何なる核酸でも容易に
固相化でき、核酸結合蛋白質の単離はもとより、微量の
ｍＲＮＡやＤＮＡからの固相ライブラリーの作製や、効
率のよいクローニングが可能となり、遺伝子工学的手法
を、これまで以上に強力に推し進めることができる等、
得られる効果は計りしれないものがある。
固相化でき、核酸結合蛋白質の単離はもとより、微量の
ｍＲＮＡやＤＮＡからの固相ライブラリーの作製や、効
率のよいクローニングが可能となり、遺伝子工学的手法
を、これまで以上に強力に推し進めることができる等、
得られる効果は計りしれないものがある。
［発明の効果］
本発明は以上説明した通り、核酸断片の一端に所望の固
相担体に結合する官能基を備え、前記核酸に所望の核酸
プローブを結合させるものであるため、例えば、アニー
リングして前記核酸に相補的な核酸と、ハイブリッド形
成することができる。ハイブリッドされた核酸は固相化
されているため、固相化されなかった物質と分離が容易
であり、使用目的に応じた高収率、高効率が達成できる
。
相担体に結合する官能基を備え、前記核酸に所望の核酸
プローブを結合させるものであるため、例えば、アニー
リングして前記核酸に相補的な核酸と、ハイブリッド形
成することができる。ハイブリッドされた核酸は固相化
されているため、固相化されなかった物質と分離が容易
であり、使用目的に応じた高収率、高効率が達成できる
。
また、核酸断片に所望の制限酵素切断部位が備わってい
れば、例えば、特定の制限酵素による切断後、生成する
末端構造と対向する末端をもつ二本鎖、−末鎖の核酸を
、リガーゼ等の酵素をもってつなぐことができる。固相
化された核酸は、固相化されなかった物質と分離が容易
であり、使用目的に応じた高収率、高効率が達成できる
。
れば、例えば、特定の制限酵素による切断後、生成する
末端構造と対向する末端をもつ二本鎖、−末鎖の核酸を
、リガーゼ等の酵素をもってつなぐことができる。固相
化された核酸は、固相化されなかった物質と分離が容易
であり、使用目的に応じた高収率、高効率が達成できる
。
更に、核酸断片の他端にポリｄＴ配列を備わりていれば
、ｍＲＮＡのポリＡ鎖と容易に結合することから、逆転
写酵素等の酵素により、直接ｃＤＮＡライブラリーを製
作することが容易となる。
、ｍＲＮＡのポリＡ鎖と容易に結合することから、逆転
写酵素等の酵素により、直接ｃＤＮＡライブラリーを製
作することが容易となる。
作成されたｃＤＮＡライブラリーは、固相化されなかっ
た物質と分離が容易であり、しかも作成されたｃＤＮＡ
は単離・回収が容易であるため、容易にベクター等に挿
入を行なうことができる。
た物質と分離が容易であり、しかも作成されたｃＤＮＡ
は単離・回収が容易であるため、容易にベクター等に挿
入を行なうことができる。
また、核酸の一端に備わった官能基には、具体的には、
脂肪族の一級アミノ基やスルフヒドリル基等の固相担体
との結合が容易で、固相担体及び核酸との結合時に核酸
の変性を生じないものであればよい。即ち、本発明によ
る核酸固相化アンカーは、アンカー内の核酸断片や制限
酵素の種類を適当に選べば、如何なる二本鎖Ｄ Ｎ Ａ
、−末鎖ＤＮＡ、ＲＮＡプローブも容易に固相化でき
る。
脂肪族の一級アミノ基やスルフヒドリル基等の固相担体
との結合が容易で、固相担体及び核酸との結合時に核酸
の変性を生じないものであればよい。即ち、本発明によ
る核酸固相化アンカーは、アンカー内の核酸断片や制限
酵素の種類を適当に選べば、如何なる二本鎖Ｄ Ｎ Ａ
、−末鎖ＤＮＡ、ＲＮＡプローブも容易に固相化でき
る。
また、調整方法の発明においては、核酸断片の一端に官
能基を配し、固相担体を活性化して前記官能基と反応性
をもたせ、前記官能基を固相担体に結合させる方法であ
るため、所望の核酸断片であれば、如何なるものでも核
酸固相化アンカーとして使用できる。即ち、ＤＮＡ合成
装置で作成した二本鎖ＤＮＡ、−末鎖ＤＮＡやＲＮＡ、
市販の制限酵素切断部位が判明しているＤＮＡ断片、プ
ラスミドを任意の制限酵素で切断したＤＮＡ断片等の使
用目的に沿った如何なる核酸も使用できる。
能基を配し、固相担体を活性化して前記官能基と反応性
をもたせ、前記官能基を固相担体に結合させる方法であ
るため、所望の核酸断片であれば、如何なるものでも核
酸固相化アンカーとして使用できる。即ち、ＤＮＡ合成
装置で作成した二本鎖ＤＮＡ、−末鎖ＤＮＡやＲＮＡ、
市販の制限酵素切断部位が判明しているＤＮＡ断片、プ
ラスミドを任意の制限酵素で切断したＤＮＡ断片等の使
用目的に沿った如何なる核酸も使用できる。
この使用目的に合致した核酸を、例えば、スルフヒドリ
ル基、脂肪族の一級アくノ基等の官能基とつなぎ、この
官能基と反応性をもたせるため、固相担体をマレイ稟ド
基、スクシニミジル基等で活性化させて、前記官能基と
を結合させる。
ル基、脂肪族の一級アくノ基等の官能基とつなぎ、この
官能基と反応性をもたせるため、固相担体をマレイ稟ド
基、スクシニミジル基等で活性化させて、前記官能基と
を結合させる。
このため、如何なる核酸でも容易に固相化でき、核酸結
合蛋白質の単離はもとより、微量のｍＲＮＡやＤＮＡか
らの固相ライブラリーの作製や、効率のよいクローニン
グが可能となり、遺伝子工学的手法を、これまで以上に
強力に推し進めることができる等の効果がある。
合蛋白質の単離はもとより、微量のｍＲＮＡやＤＮＡか
らの固相ライブラリーの作製や、効率のよいクローニン
グが可能となり、遺伝子工学的手法を、これまで以上に
強力に推し進めることができる等の効果がある。
第１Ａ、Ｂ図は各々核酸固相化アンカの−実施例の遺伝
子配列を示す説明図、第２図は核酸固相化アンカのＤＮ
Ａと官能基の反応を示す説明図、第３図は固相担体の活
性化反応を示す説明図、第４図は活性化された固相担体
と核酸固相化アンカーの反応を示す説明図、第５図は核
酸固相化アンカーの固相担体への結合を経時的に追った
グラフ、第６図、第７図は別の実施例の反応を示す説明
図、第８図は核酸固相化アンカーを使用したＤＮＡの熱
融解曲線図、第９図はゲル電気泳動法の泳動パターン図
である。
子配列を示す説明図、第２図は核酸固相化アンカのＤＮ
Ａと官能基の反応を示す説明図、第３図は固相担体の活
性化反応を示す説明図、第４図は活性化された固相担体
と核酸固相化アンカーの反応を示す説明図、第５図は核
酸固相化アンカーの固相担体への結合を経時的に追った
グラフ、第６図、第７図は別の実施例の反応を示す説明
図、第８図は核酸固相化アンカーを使用したＤＮＡの熱
融解曲線図、第９図はゲル電気泳動法の泳動パターン図
である。
Claims (8)
- （１）核酸断片の一端に所望の固相担体に結合する官能
基を備え、 前記核酸に所望の核酸プローブを結合させることを特徴
とする核酸固相化アンカー。 - （２）前記請求項１に記載の核酸固相化アンカーにおい
て、 前記核酸断片内に所望の制限酵素切断部位を備え、 前記核酸の他端又は制限酵素切断部位に所望の核酸プロ
ーブを結合させることを特徴とする核酸固相化アンカー
。 - （３）前記請求項１又は２に記載の核酸固相化アンカー
において、 前記核酸断片の他端にポリｄＴ配列を備え、前記ポリｄ
ＴにポリＡ鎖を結合させることを特徴とする核酸固相化
アンカー。 - （４）前記請求項１〜３の何れかに記載の核酸固相化ア
ンカーにおいて、 前記官能基が脂肪族の一級アミノ基であることを特徴と
する核酸固相化アンカー。 - （５）前記請求項１〜３の何れかに記載の核酸固相化ア
ンカーにおいて、 前記官能基がスルフヒドリル基であることを特徴とする
核酸固相化アンカー。 - （６）核酸断片の一端に官能基を配し、 固相担体を活性化して前記官能基と反応性をもたせ、 前記官能基を固相担体に結合させることを特徴とする核
酸固相化アンカーの調整方法。 - （７）前記請求項６に記載の核酸固相化アンカーの調整
方法において、 前記官能基が脂肪族の一級アミノ基であり、前記官能基
と反応性をもたせるため、前記固相担体をスクシニミジ
ル基で活性化し、 該スクシニミジル基と前記脂肪族の一級アミノ基との反
応により前記核酸を固相担体に結合させることを特徴と
する核酸固相化アンカーの調整方法。 - （８）前記請求項６に記載の核酸固相化アンカーの調整
方法において、 前記官能基がスルフヒドリル基であり、 前記官能基と反応性をもたせるため、前記固相担体をマ
レイミド基で活性化し、 該マレイミド基と前記スルフヒドリル基との反応により
前記核酸を固相担体に結合させることを特徴とする核酸
固相化アンカーの調整方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28504289A JPH03147800A (ja) | 1989-11-02 | 1989-11-02 | 核酸固相化アンカー及びその調整方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28504289A JPH03147800A (ja) | 1989-11-02 | 1989-11-02 | 核酸固相化アンカー及びその調整方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03147800A true JPH03147800A (ja) | 1991-06-24 |
Family
ID=17686414
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28504289A Pending JPH03147800A (ja) | 1989-11-02 | 1989-11-02 | 核酸固相化アンカー及びその調整方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03147800A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994021819A1 (fr) * | 1992-03-19 | 1994-09-29 | Kabushiki Kaisha Nippon Gene | Ancre en phase solide supportant des acides nucleiques et son procede d'ajustement |
| US5656462A (en) * | 1992-01-29 | 1997-08-12 | Hitachi Chemical Co., Ltd. | Method for synthesizing cDNA using a polynucleotide immobilized support |
| JPH10239300A (ja) * | 1997-02-28 | 1998-09-11 | Kagaku Gijutsu Shinko Jigyodan | 全自動遺伝子解析システム |
-
1989
- 1989-11-02 JP JP28504289A patent/JPH03147800A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5656462A (en) * | 1992-01-29 | 1997-08-12 | Hitachi Chemical Co., Ltd. | Method for synthesizing cDNA using a polynucleotide immobilized support |
| WO1994021819A1 (fr) * | 1992-03-19 | 1994-09-29 | Kabushiki Kaisha Nippon Gene | Ancre en phase solide supportant des acides nucleiques et son procede d'ajustement |
| JPH10239300A (ja) * | 1997-02-28 | 1998-09-11 | Kagaku Gijutsu Shinko Jigyodan | 全自動遺伝子解析システム |
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