JPH03151977A - 生組織等価物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 魚１Ｆとた對 本発明は、（ｉ）収縮集結因子（物質）によって収縮集
結された水和コラーゲン格子と（ｉｉ）透過性部材に接
触しているコラーゲンゲルとを包含している組織等価物
を製造及び使用する方法に係わる。

更に本発明は、かかる組織等価物が組み込まれた試験系
にも係わる。

組織等価物を形成するために腺維芽細胞または血小板の
ような収縮集結因子によって収縮集結された水和コラー
ゲン格子を含む組織等価物は、米国特許第４，４８５，
０９６号、第４，４８５，０９７号、第４，５３９゜７
１６号、第４，５４６，５００号、第４，６０４，３４
６号及び第４，８３７．３７９号、並びに１９８８年９
月３０日出願の同時係属米国特許出願第０７／２５２，
２４９号（及びその対応米国外出願）に記載されており
、上記全ての特許明細書は参照により本明細書の一部を
構成するものとする（本明細書中では以降これらをまと
めて「関連特許」と表記する）。本明細書において使用
される組織とは、−緒になって１つ以上の所定の機能を
果たす任意の細胞群または細胞層からなる。このような
組織等価物としては、次のものに限定されることはない
が、上皮組織、結合組織、軟骨、骨、臓器、腺及び血管
の等価物を挙げることができ、これらは生細胞及び細胞
外基質分子、主としてコラーゲンを含んでおり、必要に
よっては、典型的には正規の組織に見られない成分を含
むことができる。

一般にこのような生組織等価物は、生組織中に収縮集結
される水和コラーゲン格子を形成することにより製造さ
れる。収縮集結因子の例としては、腺維芽細胞、平滑筋
細胞及び血小板を挙げることができる。皮膚等価物は、
生結合組織等価物基質上にケラチン細胞を平板培養し、
増殖することにより、生結合組織等価物基質から製造す
ることができる。

上記組織等価物には、長期間生存することができる細胞
であって且つ生産された単位が実質的に均一であるとい
う保証がある量だけ生産され得る細胞が集団形成される
。このような組織等価物における細胞は正規組織の細胞
に、構造的構成、生合成産出量及び透過性において類似
である。これらの組織等価物はヒトのものである必要は
なく、所望の任意の動物のものとし得ることを理解され
たい。

本発明の教示による組織等価物は、研究及び開発や、組
織及び臓器の置換並びに試験における利用を含む広範囲
にわたる用途を有する。

ヒト皮膚組織等価物は、十分に分化する正規のヒト表皮
細胞の成長を可能にする。これは、今までの常習的な培
養方法では得られなかった。かかる皮膚組織等価物は、
動物実験における永久置換皮膚として幅広く使用されて
いる。かかる皮膚組織等価物の形態的様相は正常であり
、構成細胞は、遺伝標識によって示されるように移植後
にも存続し、機能的性能も立証されている。例えば５ｃ
ｉｅｎｃｅ。

２１１：１０５２〜１０５４（１９８１）；Ｊ、Ｉｎｖ
ｅｓｔ、ＤｅｒＩｌｌａｔｏｌ、８１：２ｓ〜１０ｓ（
１９８３）を参照されたい。

前述の関連特許に記載の方法によってｉｎ　ｖｉｔｒ。

製造された皮膚組織等価物は天然皮膚と極めて類似して
いる。かかる等価物は、よく成長した基底細胞が真皮層
に結合している多層表皮からなる。

真皮層は、真皮腺維芽細胞が分布しているコラーゲンマ
トリックスからなる。３次元コラーゲンマトリックス中
の細胞は、ｉｎ　ｖｉｖｏで現れるのと多くの点で類似
の分化状態に達する。例えば、常在性（ｒｅｓｉｄｅｎ
ｔ）腺維芽細胞は合成的に活性であり、コラーゲン及び
多数の他の分子種を含むｉｎ　ｖｉｔｒ。

マトリックスを豊富にし、またｉｎ　ｖｉｖｏＭ胞に典
型的な透過性を示す。例えばＣｏ１１ａｌ（ｅｎ　Ｒｅ
１．Ｒｅｓ、４：３５１〜３６４（Ｒｅ８４）を参照さ
れたい。更に皮膚組織等価物は、色素をケラチン細胞に
与えるメラニン細胞を包含させることにより色素沈着す
ることができ、このプロセスは、紫外線照射によりｉｎ
　ｖｉｔｒ。

で加速されることが示された（Ｊ、１ｎｖｅｓｔ、Ｄｅ
ｒｍａｔｏｌ。

８７：６４２〜６４７．１９８６）。

米国特許第４，８３５，１０２号は、天然組織の多くの
物理的及び生物学的特性をｉｎ　ｖｉｔｒｏで再生し、
しかも例えば組繊細胞生物学、生理学及び病理学の研究
に有効な組織等価物が組み込まれた系を開示している。

かかる系は、少なくとも１種の組織等価物を使用するこ
とにより組織と少なくとも１種の作用因子との相互作用
を測定するための装置及びキットを包含している６作用
因子としては、次のものに限定されることはないが、化
学物質、化粧品、医薬品といった種々の物質、刺激（例
えば光または物理的創傷）及び組織保護剤を挙げること
ができる。

組織等価物は任意の所望の形状に流延する（ｃａｓｔ）
ことができる、皮膚移植及び試験系に使用するための皮
膚組織等価物は一般に平坦なシートに流延され、血管等
価物は一般に中空チューブまたは中空チューブ網状に製
造される。しかしながら、組織等価物の生来の形状また
は構成は所望であれば変えることができる０例えば、皮
膚等価物はシート状ではなくて円筒形に流延することが
できる。

組織等価物の製造における収縮集結因子として腺維芽細
胞または平滑筋細胞を使用する場合、典型的にはコラー
ゲン格子を何の拘束もなしに全ての方向に収縮集結させ
る。調整可能な形状及び／または寸法を有する組織等価
物や生組織を形成する上で助けとなる種々の方法は、例
えば米国特許第４．４８５，０９６号に開示されている
。例えばコラーゲン格子はステンレススチールフレーム
上に流延し、その縁を固定して把持し、そうして実質的
に厚さ方向にのみ収縮集結させることができる。組織等
価物の構成を調整するのに使用され得る他の部材として
は、ＶＥＬＣＲＯ（登録商標）、型押しくｔｅｘｔｕｒ
ｅｄ）プラスッチ及び型押しＴＥＦＬＯＮ（登録商標）
を挙げるごとができる、これらの拘束手段は有効である
が、コスト及び単純性の両面における多くの点で、流延
チャンバと一体的でない拘束手段を使用することが好ま
しい。

組織等価物の多くの用途を鑑み、優れた組織等価物及び
かかる組織等価物を製造する方法を追究しな。

ル匪座贋１ 本発明は、（ｉ）収縮集結因子によって収縮集結された
水相コラーゲン格子、及び（ｉｉ）コラーゲンゲルを包
含する組織等価物を提供する。更に本発明は、収縮集結
の程度において、また皮膚組織等価物の場合には表皮の
分化の程度において、試料毎の再現性が高いという特性
等の、優れた特性を有する組織等価物を提供する。

本発明の幾つかの実施態様においては、かかる組織等価
物は、線維性バッド及びゲル（例えばアガロース）を含
む１つ以上の吸収部材に隣接している。

更に本発明は、かかる優れた組織等価物を製造及び使用
する方法も提供する。本明＃ＩＩｌ書において教示する
方法は、前述の関連特許に開示された方法よりも製造が
容易で且つ製造コストが低い点で有利である。

組織等価物を形成する本発明の方法の１つは、（ａ）　
　コラーゲンと少なくとも１種の収縮集結因子を含む混
合物を形成し、 （ｂ）　　ステップ（ａ）で得られた混合物をコラーゲ
ンゲルに付着させ、前記混合物及びゲルを組織等価物が
形成し得る条件下に維持する ことからなる。

更に本発明は、組織と少なくとも１種の作用因子との相
互作用を測定するための、ががる組織等価物が組み込ま
れた装置を提供する。

本発明の１つの好ましい実施態様においては、かかる装
置は、その中に、組織等価物が上に置がれているコラー
ゲンゲルを備えた透過性手段によって規定される（アウ
トライン、境界が定められている）第１及び第２の領域
を包含しており、それによって前記組織等価物が前記第
１の領域を規定し且つ前記透過性部材が前記第２の領域
を規定する。

本発明の他の好ましい実施態様においては、かかる装置
は、少なくとも１種の組織等価物と該組織等価物のため
の少なくとも１つの容器とを備えており、前記容器が、 （ｉ）組織等価物がその上に置かれているコラーゲンゲ
ルを備えた透過性手段を含む内側ウェルであって、それ
によって透過性手段が該内側ウェルの底部を規定する内
側ウェル、及び にｉｉ）前記内側ウェルがその中に置かれる外側ウェル を備えている。

魚３しと１１ 本発明の組織等価物は、製造及び使用の方法が前述の関
連特許に開示された水和コラーゲン格子を包含するもの
に類似であるが、更にコラーゲン層も包含する。

予期せずして、透過性部材と接触しているコラーゲンゲ
ル上に流延させたコラーゲン格子は、厚さ方向に収縮集
結する際に半径方向または横方向には実質的に収縮集結
せず、このことによって、半径方向または横方向の収縮
集結を調節するためにコラーゲン格子を例えばステンレ
ススチール上に固定する必要性が排除されることが判っ
た０例えば、前述の関連特許に教示のごとく流延させた
直径２４ｍｍのコラーゲン格子は、固定手段なしでは半
径方向には直径５輸−以下にまで収縮集結するであろう
、これに反して、透過性部材に接触しているコラーゲン
ゲル上に流延させた直径２４輪輪のコラーゲン格子は典
型的には半径方向には直径約１５ｍｍまでしか収縮集結
しない、横方向／半径方向収縮集結を調節するための固
定手段の排除は、組織等価物製造のコスト削減及び容易
さの点で長所をもたらす。かかる固定手段は、所望であ
れば透過性部材に接触させたコラーゲンゲルと一緒に使
用し得ることを理解されたい。

本発明の組織等価物を得る１つの方法は、（ａ）　　コ
ラーゲンと少なくとも１種の収縮集結因子を含む混合物
を形成し、 （ｂ）　　ステップ（ａ）で得られた混合物を透過性部
材に接触しているコラーゲンゲルに付着させ、前記混合
物及びゲルを組織等価物が形成し得る条件下に維持する ことからなる。

本発明の幾つかの実施態様においては、次のものに限定
されることはないが、線維性パッド〈例えば綿パッド）
やゲル（例えばアガロースゲル）等の１つ以上の吸収部
材を前記コラーゲンゲルと一緒に使用する。このような
吸収部材は、終始水平な物理的支持体を提供し、しかも
組織等価物と細胞培地の間の均一な接触を促進すること
が判った。

典型的には、吸収部材は水和コラーゲン格子とは反対側
のコラーゲンゲル表面に当接させる。吸収部材自体がゲ
ル、例えばアガロースである場合には、このゲルは、組
織等価物に養分を与えるための滋養培地と一緒に設ける
ことができる。

皮膚組織等価物の種々の発生段階において、コラーゲン
ゲル及び／または吸収部材を用いたり、用いずに維持し
た組織等価物について以下の実験的決定点をモニターし
た。

１、グルコース利用の程度； ２、表皮層形成及び角質化の広がり及び質；３、培地の
ｐＨ。

吸収部材を用いて維持した組織等価物から得られた培地
に認められたｐｎは、かかる部材の不在下に維持した組
織等価物より一定してより高く、生理学的ｐＨにより近
かった。更に、グルコース利用の程度は、吸収部材を用
いて維持した組織等価物において一般により低いことが
認められた。

驚くべきことには、吸収部材を使用することにより製造
した皮膚組織等価物は、かかる部材を使用せずに製造し
た対照皮膚等価物と比較し、角質熟成化が促進されるこ
とが判った。上記吸収部材が表皮の角質化に及ぼし得る
メカニズムは未知であるが、かかる部材が拡散の障壁、
例えば透過性の障壁として作用し得、媒質を濾過したり
及び／または分泌細胞産物を組織等価物に極めて近いと
ころに保持したりすることが推定される。

本発明の生皮膚等価物は、本発明では水和コラーゲン格
子をコラーゲンゲル上に流延させることを除き、前述の
関連特許に記載のごとく製造される。

本発明の皮膚組織等価物を製造する１つの方法は、 （ａ）　　コラーゲンと少なくとも１種の収縮集結因子
とを含む混合物を形成し、 （ｂ）　　ステップ（ａ）で得られた混合物を透過性部
材に接触しているコラーゲンゲルに付着させ、前記混合
物及びゲルを組織等価物が形成し得る条件下に維持し、 （ｃ）　　ステップ（ｂ）で得られた組織等価物にケラ
チン細胞を播種する ことからなる。

従来技術によれば、本発明の組織等価物を流延させる１
つの都合の良い方法は、ｐＨ約３〜４を有する酸性コラ
ーゲン溶液を滋養培地と一緒に素早く混合し、得られた
溶液のｐＨを必要であればｐＨ約６．６〜７．８に調整
し、腺維芽細胞を加え、得られた混合物（「流延用混合
物（ｃａｓｔｉｎｇ　ｍ１ｘｔｕｒｅ）」）を適当な型
またはコラーゲンゲルが入れられた流延装置内に移し、
好ましくは約３５〜３８℃の温度でインキュベートする
ことを含む、同時にｐｌ＋を調整し且つ流延用混合物の
成分を配合することが最も都合が良い、しかしながら、
流延用混合物が適正に硬化するための型に移され得るよ
うにステップが完了するという条件で、上記ステップは
任意の所望の順序で実施することができる。コラーゲン
フィブリルは、溶液を暖め且つｐＨを上昇させた結果と
して流延用混合物から沈澱し、収縮集結因子によって収
縮集結されコラーゲンゲル上に置かれる水和コラーゲン
ゲルを形成する。

本発明によって提供される生組織を製造する方法は一般
の組織等価物の製造に適用可能であるが、これらの方法
を、皮膚移植のための及び皮膚等価物が組み込まれた試
験系に使用するための皮膚等価物製造と関連して説明す
る。

皮膚組織等価物を含む組織等価物を使用することにより
、組織と１種以上の作用因子との相互作用を測定するた
めの装置、方法及びキットは米国特許第４，８３５，１
０２号に記載されている０本発明においては、かかる用
途に供する組織等価物は有利なことに更に透過性部材に
接触しているコラーゲンゲルを包含する。

図面を参照すると、第１図〜第３図は、本発明の皮膚組
織等価物を使用することにより皮膚と１種以上の試薬と
の相互作用を測定するための装置の１つの実施態様を示
す、これらの図では本発明の組織等価物がその中に置か
れている多重容器１０゜２０がベースまたはホルダに備
えられている。第１図〜第３図に示した装置には更にカ
バー手段２が備わっている。幾つかの実施態様において
はカバーは各容器１０．２０に備えられる（図示なし）
、カバーは、シールを容器上に保持する任意の生態適合
性材料から選択される。使用可能なカバー材料としては
、接着剤または熱によって装置に封止され得るフォイル
及び遮断フィルムを挙げることができる。ヒートシール
可能なポリエステルフィルムは本発明の実用化において
特に有効である。

組織等価物用の容器は外側容器１０及び内側容器２０を
備えている。内側容器２０には、外側容器１０内に内側
容器２０を位置決めし、それによって外側領域１４及び
内側領域２２を規定する手段となるリム５０が備わって
いる。内側容器２０には、コラーゲンゲル２５上に置か
れた皮膚Ｍ織等価物２８．２８が備えられている。尚、
そのコラーゲンゲル２５は透過性部材２４に当接・載置
されている。透過性部材は、内側容器２０の底面を形成
するために内側容器２０に封止代に取り付けられている
。皮膚組織等価物は２つの層２６及び２８を含んでおり
、層２８は表皮層からなり、層２６は真皮層からなる。

ｍつかの実施態様においては、封止部材３０は内側容器
２０の内壁と皮膚等価物２６．２８との間を封止し、ま
た組織等価物２６．２８の外側縁がコラーゲンゲル２５
の内側に位置している場合にはコラーゲンゲル２５の周
囲を覆う。

図に示した実施態様においては、容器２０に外側領域１
４に通じる開口２１が備えられている。

第３図に示した装置には更に吸収部材３２が備えられて
いる。更に他の実施態様においては、外側チャンバ１４
はその中にゲルを置くことができる（図示なし）。

第４図〜第６図は、本発明の組織等価物を使用すること
により組織と１種以上の作用因子との相互作用を測定す
る装置の他の実施態様を示す、前述の実施態様のものと
同様のエレメントは同じ参照番号で示しである。この実
施態様においては外側ウェル１０は方形であり１、底部
には、内側容器２０を載置することができる隆起部（ｅ
ｌｅｖａｔｅｄ　５ｅｃｔｉｏｎ）６０を備えている。

外側ウェル１０は装置の底部から上向きに突出している
というよりは、装置の頂部からポケット状に形成されて
いる。

外側ウェル１０には組織等価物のための滋養培地が備え
られている。このような培地は当業者には公知である。

好ましい無血清滋養培地は同時係属米国特許出願第３６
１，０４１号に開示されている。培地の容積は、培地を
透過性部材２４、コラーゲンゲル２５及び組織等価物２
６．２８を通して内側容器２０内に押し込むであろう靜
圧頭が生じないように外側容器１４を適当なレベルまで
充填するように選択せねばならない。

本発明の幾つかの実施態様においては外側容器１０に吸
収部材３２が備えられており、吸収部材３２は外側容器
ｌＯ内に透過性部材２４の外側表面と接触するように置
かれている。吸収部材３２は生組織等価物と適合性であ
らねばならない、吸収部材に好ましい材料としては綿、
ポリエステル及びレーヨンを挙げることができる。特に
好ましい材料は吸収綿である。一般に吸収部材は、洗剤
のような添加剤を含有していないことが好ましい。

本発明の他の実施態様においては、外側ウェル１０には
アガロースのようなゲル（図示なし）が備えられ、これ
が媒質を捕捉する役割を果たす、アガロースゲルは開口
２４のレベルのちょうど下まで加えることができるので
、より多くの滋養培地を組織等価物のために使用するこ
とができ、組織等価物２６．２８への養分供給は迅速に
使い果たされることはない。このようなゲルの使用は、
本発明の装置を保管及び出荷する上で培地の漏出を最小
化し、結果として組織等価物の汚染の可能性を最小化す
る点で有益である。

外側容器１０及び内側容器２０は、組織等価物を含むア
ッセイの成分に反応せずまたそれらに望ましくない影響
を及ぼさない任意の所望の材料で製造することができる
１例えば、生組織等価物用の流延用混合物は、収縮集結
の際に内側容器の壁に付着して組織等価物の形成に干渉
するようなことがあるべきではない。

内側容器２０を殺菌するのに使用される方法は組織組成
物の接着性に強く影響し得ることが判った。

例えば、酸化エチレンではなくて電子ビームによって殺
菌する場合には、形成しつつある組織は内側容器の１つ
の好ましい材料であるポリスチレンに付着する。これに
反して、ポリスチレン及びブタジェンのポリマーアロイ
であって内側容器の特に好ましい材料であるに樹脂は、
形成しつつある組織等価物を付着させることなく電子ビ
ームによって殺菌することができる（Ｋ樹脂はＰｈｉｌ
ｌｉｐｓＰｅｔｒｏｌｅｕｍの商標である）、幾つかの
実施例においては容器は、組織等価物が容器を通して、
例えば容器の壁または容器にある窓を通して見えるよう
に製造することが望ましい。容器１０に好ましい材料と
してはポリスチレン及びＰＥＴＧを挙げることができる
。

内側容器２０は、所望の大きさ及び形状の組織等価物を
収容する任意の形状及び容積とすることができる。容器
の寸法もまた所望の組織等価物及び所望のアッセイ容積
の大きさ及び形状に依存する。

例えば、外径が約２５ｍｍで溶液的５ｍｌを含む容器が
本発明を実施する上で有効である。第１図〜第３図に示
した実施態様においては、ベースまたはホルダー内に多
重容器が備えられている。

透過性部材２４は、コラーゲンゲル２５及び組織等価物
２６．２８を支持するのに十分な強度を有さねばならな
い０本発明の実施においては多孔質膜が有効である。こ
のような膜の孔径は、コラーゲンゲル２５に対する付着
性を与えるように選択する。好ましい膜は親水性であり
、厚さ約１〜１０ｆｉＩＩ及び孔径約１〜約１０μを有
するものである。透過性部材２４に好ましい材料として
はポリカーボネートを挙げることができる。特に好まし
い透過性部材は、好ましくは湿潤剤を含まず、Ｎｕｃｌ
ｅｐｏｒｅがら市販されており、且つ孔径的３〜１０μ
を有するポリカーボネート膜である。

封止手段３０は、使用するアッセイ条件及び組織等価物
に対して不活性であり、しかも内側容器２０と組織等価
物との間に優れた封止を提供する任意の材料で製造する
ことができる。好ましい材料としてはポリエチレン、Ｔ
ＥＦＬＯＮ（登録商標）、ポリカーボネート及びナイロ
ンを挙げることができる。

封止手段は、外側溶液の内容物を表皮２５に与えた任意
の溶液または物質から分離して維持することが所望の場
合、例えば組織等価物を通しての物質の拡散または透過
を測定する場合に特に有効である。

本発明の組織等価物及びコラーゲンゲルは両方とも、ラ
ット尾鮪、仔ウシ皮膚コラーゲン及び仔つシ伸筋健等の
皮膚及び鍵由来のコラーゲンを使用して製造することが
できる。他のコラーゲン源も適当であろうが、仔ウシ共
通（総）指（ｃａｌｆ　ｃｏｍｎ＋ｏｎｄｉｇｉｔａｌ
）伸筋翳由来の特に好ましいコラーゲン組成物及びこの
ようなコラーゲン組成物を誘導する方法は、本出願と同
日出願（対応米国特許出願第０７／４０７４６５号）の
明細書に開示されており、この開示内容は参照により本
明細書の一部を構成するものとする。

本発明の１つの方法においてはコラーゲンゲル２５は、
約０．５〜２　、Ｏｍｙ／＋１、好ましくは約０．９〜
１．１ｍｇｋｌのコラーゲンと滋養培地とを含むコラー
ゲン組成物から製造される。このコラーゲン組成物を内
側容器２０に入れ、コラーゲン組成物が硬化し、典型的
には厚さ約１〜５１、好ましくは厚さ約２〜約３１の適
当な寸法のコラーゲンゲルを形成し得る条件下に維持す
る。コラーゲンゲル２５は、細胞が組織等価物からコラ
ーゲンゲル中に移動するときに一部は細胞を含まないま
まに維持されるのに十分なほど厚く、且つ組織等価物が
、外側容器１０内に提供された養分源から不本意に離れ
ないように十分薄いことが望ましい。

次に真皮等価物をコラーゲンゲル上に、前述の関連特許
及び以下に記載の手順を使用して流延させる。即ち、コ
ラーゲン及び腺維芽細胞を含有する流延混合物を内側容
器２０内のコラーゲンゲル２５上に加え、組織等価物が
形成され得る条件下に維持する０組織等価物がコラーゲ
ンゲル２５上に形成されると、それは半径方向に収縮集
結する。しかしながら、コラーゲンゲル２５は、型押し
金属及びプラスチックまたはＶＥＬＯＣＲＯ（登録商標
）のような機械的把持手段の必要性なしに組織等価物の
過剰な半径方向収縮集結を防止する。

典型的には組織等価物２６の側部は、第３図及び第６図
に参照番号５２で示したような卓状部を形成するために
、コラーゲンゲル２５の外側周囲に向かって傾斜してい
る。そうして、組織等価物２６に上皮細胞を播種して表
皮層２８を形成する。表皮細胞を培地中に濃度的０．３
Ｘ　１０’〜３０Ｘ１０’細胞／ｍｌで播種する。播種
する表皮細胞の容積は卓状部の大きさに依存する。

コラーゲンの濃度、細胞の数及び流延用混合物の容積を
調整して生組織等価物の直径及び厚さを最適化すること
ができる。流延用混合物は、滋養培地中に濃度的１．２
５〜５ｘｉｏ’細胞／ｍｌの細胞と約０．５〜２．０Ｂ
／ｍｆのコラーゲンとを含有している。

好ましい細胞濃度は約２．５Ｘ　１０’細胞７ａ１であ
る。

コラーゲンゲルのための流延用混合物の容積に対する組
織等価物のための流延用混合物の容積の比は細胞の生存
可能性及び分化に影響を及ぼすことが判った６組織等価
物用・流延用混合物とコラーゲンゲル用・流延用混合物
との有効な容積比は約３：ｌ〜１：３である。コラーゲ
ン格子中の細胞濃度が約２．５ｘ　１０’ｉ胞／Ｉｌｌ
である場合の好ましい比は３：１である。

本発明は以下の実施例を参照することにより更に理解さ
れるであろう、但し、これらの実施例は単に例示を目的
としており、本発明の範囲を制限するものではない。

以下の実施例に使用した材料は実施例中に記載の源から
取得したか、または記載の文献に従って製造した。全実
施例を通して無菌手順を使用した。

組織等価物はインキュベーター内で１０％ＣＯ７下に維
持し、初めから終わりまで無菌手順を使用した。

！ＪＬＬＬ：　　　　　　　　　　　　・　　　二の　
　゛告＾、以下に記載の実験を実施するに当たり第４図
に示したものに類似の装置を使用した。操作を実施する
ためにカバーを取り外したが、そうでないときは無菌状
態を維持するために元に戻しておいた。装置に関する詳
細を以下に列挙する。

外側容器１０：　　直径３８ｗｎ　　容量３５ｍｊ！、
内側容器２０：　　直径２４ｍｍ　　容量４ｍｌ、透過
性部材２４：　Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ製のポリカーボネー
ト膜、孔径３μ、厚さ５μ Ｂ、透過性部材２４上にコラーゲンゲルを以下のように
形成した。

（１）プレミックス： １０Ｘ　ＭＥＮ　　　　　　　　　　　　　１６．２ｍ
ｉ’Ｌ−グルタミン（２００＋＋Ｍ）　　　　　　　１
．６論！ゲンタマイシン（５０ｎ＋ｇ／ａｔ’）　　　
　　０．２ｍＮウシ胎児血清　　　　　　　　　１８．
０ｍｉ’重炭酸ナトリウム（７１，２ｔａｌｍｊり　　
　５．０ｍｌ上記順序で配合した原料溶液（ｓｔｏｃｋ
　５ｏｌｕｔｉｏｎｓ）を３７℃で混合し、５０ｍ１試
験管中に４℃で約３０分間保管したく通気なし）。

（２）　　０．０５％ｖ／ｖ酢酸中のく仔ウシ共通〈総
）指伸筋鍵から酸によって抽出した）ＩＢ／ｍ１コラー
ゲン溶液２７．８．を５０ｍ１試験管中に計り収り、４
℃で３０分間保管した。

（３）　　（１０％ＦＢＳ、４ｍＭ　Ｌ−グルタミン、
５０ｐｇ／ｉｌゲンタマイシンを含有する）前記プレミ
ックス８．２ｍＺ及びＤＭＥＭ純粋液４ｍｌを内側容器
２０内に加え、更に１ｍｌアリコートをピペットで滴下
し、フード内でゲル化させた。

Ｃ９以下に記載のように、組織等個物をヒト真皮ａｍ芽
細胞と一緒に流延させ、ヒト表皮（上皮）細胞を播種し
た。操作手順及び試薬の一般的説明は前述の関連特許及
び１９８９年６月５日出願の同時係属米国特許出願第０
７７３６１．０４１号（及びその対応米国外出願）に見
ることができる。

（１）流延用混合物： 上記ステップ＾（２）に記載のごとく前記プレミックス
８．２ｍｌを０，０５％ｖ／ｖ酢酸中のｌｅｍｇ／ｍｆ
コラーゲン溶液２７．８．に加え、ヒト真皮腺維芽細胞
（２，５ｘ　１０５細胞／５ｌ）４ｔａｌを配合した。

容器２０内の上記ステップＢ（２）で形成されたコラー
ゲンゲル上に３ｍｌアリコートをピペットで滴下し、ゲ
ル化させた。ＤＭＥＭ純粋液４．５＋ｍ１を外側溶液Ｉ
Ｏに加え、次いで３６℃７１０％ＣＯ□で典型的には４
〜８日間インキュベートした。

以下の培地を使用した。

人士　　　　　　　　　　　　　ｍ５１３Ｍヒドロコル
チゾン　　　　　　　１．１μＭインシュリン　　　　
　　　　　５　ｕｇ／ｍｌトランスフェリン　　　　　
　　５ＩＪ１９／ｌ１ｌｌトリヨードチロニン　　　　
　　２０　ｐＨエタノールアミン　　　　　　　１ｘｌ
ｏ−’ＭＯ−ホスホリルエタノールアミン　ｌＸｌ０−
’Ｍアデニン　　　　　　　　　　　０．１８　ｍＭプ
ロゲステロン　　　　　　　　２Ｘ１０−＠Ｍセレン５
．２６Ｘ　１０−’Ｍ ウシ血清　　　　　　　　　　　０．３％表皮成長因子
　　　　　　　　　１０ｎｆＩ／ｌ１１１力ルシウム非
含有ＤＭＥＳ　　　　　　７５％１１ａｎ　ｓ　Ｆ−１
２２５％ 使用した他の２つの培地は以下の点を除きｍｓＢＭと同
一であった。

鐸閃　　　　五」狙 プロゲステロン　　　　　ＯＯ ウシ血清　　　　　　　　２．０％　　１％表皮成長囚
子　　　　　　ＩＢ／＋＊１１ｎｇ／ｍｆカルシウム非
含有ＤＭＥＭ　　　５０％　　　５０％１１ａｍ　ｓ　
Ｆ−１２５０％　　　５０％場合によっては培地に塩化
カルシウムを１．８ｍＭ加えた。これを、培地士カルシ
ウム、例えばｍｓＢＭ＋カルシウムと表記する。

Ｄ１組織等価物を流延させてから６日後に表皮形成（ｅ
ｐｉｄｅｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）が開始した。

（１）夫文旦り 上記ステップＣの培地を内側容器２０及び外側容器１０
から取り出した。ヒト表皮細胞（３，３３Ｘ　１０’細
胞／＋ｓｌ）の懸濁液５０．ｉｔを、上記ステップＣで
形成した組織等価物上に置いた。次いで容器を３６°Ｃ
及び１０％ＣＯ２で４時間インキュベートした。輸５Ｂ
１４１２．０糟ｌを外側チャンバに加え、４１ＩＮをウ
ェルに加えた。

次いで装置を同じインキュベーターに戻した。

（２）水孔 表皮形成２日後に培地を取り出し、ｍｓＢＭ＋カルシウ
ムで置き換えた。

（３）エア１フー　ン　ａｉｒｌｉｆｔｉｎ表皮形成５
日後に表皮形成５奢後施した。

培地を内側及び外側チャンバから取り出した。内側容器
２０を取り出し、２容積のｃｓＢＭ＋カルシウムをしみ
込ませた綿パッドを外側チャンバ１０の底部に置き、　
ｃｓＢＭ＋カルシウム９．０＋ｓｊ！を加えた０次いで
内側容器２０を置き換え、装置を３５゜５℃及び１０％
ＣＬでインキュベートした。

（４）４符 ４日ごとに培地を取り出し、新しい主ＳＯＮ＋カルシウ
ムで置き換えた。

火１■１：　　ロースが　み　　　ｔ−０２％アガロー
ス水溶液をオートクレーブ処理により滅菌し、４０℃に
冷却し、等容積の２倍濃度の主ＳＢＭと混合した。吸収
綿パッドを取り出し、混合物１３−１を外側領域１４内
に注入し、３６°Ｃ（ｔＯ％Ｃ０２）で硬化させ、出荷
前の保管のためにインキュベーターに戻した。

本明細書に記載の実施例及び実施態様は例示を目的とし
たものであり、当業者には想起されるであろう本発明の
種々の変形及び変更は、本発明の要旨及び範囲並びに特
許請求の範囲に包含され得ることを理解されたい。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の１つの装置のアイソメトリックな一部
切欠斜視図、第２図は第１図の装置の分解図、第３図は
第１図の装置の３−３を通る断面図、第４図は本発明の
他の装置の一部切欠斜視図、第５図は第４図の装置の分
解平面図、第６図は第４図の装置の６−６を通る分解断
面図である。 ２・・・カバー手段、１０・・・外側容器、２０・・・
内側容器、２１・・・開口、２４・・・透過性部材、２
５・・・コラーゲンゲル、２８．２８・・・組織等価物
、３２・・・吸収部材。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）（ａ）収縮集結因子によって収縮集結された水和
   コラーゲン格子、及び （ｂ）透過性部材と接触しているコラーゲンゲルを含有
   している組織等価物。 （２）（ａ）コラーゲンと少なくとも１種の収縮集結因
   子とを含む混合物を形成し、 （ｂ）ステップ（ａ）で得られた混合物を透過性部材に
   接触しているコラーゲンゲルに付着させ、前記混合物及
   びゲルを組織等価物が形成し得る条件下に維持する ことからなる組織等価物を製造する方法。 （３）前記収縮集結因子が腺維芽細胞からなる請求項２
   に記載の方法。 （４）前記ステップ（ａ）の混合物が濃度約１．２５〜
   ５×１０＾４細胞／ｍｌの腺維芽細胞と約０．５〜２．
   ０ｍｇ／ｍｌのコラーゲンとを含有する請求項２に記載
   の方法。 （５）前記コラーゲンゲルを、コラーゲンを濃度約０．
   ５〜２．０ｍｇ／ｍｌで含有するコラーゲン溶液を流延
   することにより製造する請求項２に記載の方法。 （６）前記ステップ（ａ）の混合物及びステップ（ｂ）
   の溶液を容積比約３：１〜１：３で使用する請求項５に
   記載の方法。 （７）前記透過性部材に隣接させて吸収部材を置く請求
   項２に記載の方法。 （８）前記吸収部材が線維性パッドまたはゲルからなる
   請求項７に記載の方法。 （９）前記線維性パッドが綿である請求項８に記載の方
   法。 （１０）前記透過性部材に隣接させてアガロースからな
   るゲルを置く請求項２に記載の方法、。 （１１）少なくとも１種の組織等価物を使用することに
   より組織と少なくとも１種の作用因子との相互作用を測
   定する装置であって、その中に、該組織等価物が上に置
   かれるコラーゲンゲルを備えた透過性手段によって規定
   される第１及び第２の領域を包含しており、その場合、
   前記組織等価物が第１の領域を規定し且つ前記透過性部
   材が前記第２の領域を規定している装置。 （１２）少なくとも１種の組織等価物を使用することに
   より組織と少なくとも１種の作用因子との相互作用を測
   定する装置であって、組織等価物と該組織等価物用の少
   なくとも１つの容器を備えており、前記容器が、 （ｉ）組織等価物がその上に置かれるコラーゲンゲルを
   備えた透過性手段を含む内側ウェルであって、それによ
   って透過性手段が該内側ウェルの底部を規定している内
   側ウェル、及び （ｉｉ）前記内側ウェルがその中に置かれる外側ウェル を備えている装置。 （１３）更に、前記容器を閉鎖する手段を備えており、
   該閉鎖手段が該容器を着脱可能に封止し得る請求項１２
   に記載の装置。 （１４）前記内側ウェルに少なくとも１つの開口が備え
   られており、該開口が外側ウェルと連通している請求項
   １２に記載の装置。 （１５）前記内側ウェルがに樹脂からなる請求項１２に
   記載の装置。 （１６）前記透過性手段に隣接して吸収性部材が置かれ
   ている請求項１２に記載の装置。（１７）前記吸収性部
   材が線維性パッドまたはゲルからなる請求項１６に記載
   の装置。 （１８）前記線維性パッドが綿である請求項１６に記載
   の装置。 （１９）前記外側容器内にアガロースゲルが置かれてい
   る請求項１２に記載の装置。