JPH0315391A - アベルメクチン生合成のためのストレプトミセス・アベルミチリス由来クローニング遺伝子及びその使用方法 - Google Patents
アベルメクチン生合成のためのストレプトミセス・アベルミチリス由来クローニング遺伝子及びその使用方法Info
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- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
- C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
- C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
- C12P19/623—Avermectin; Milbemycin; Ivermectin; C-076
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ストレプト逅セス（Ｓｔｒｅｐｔｏ■ｙｃｅｓ）は市販
の抗生物質のほとんどを含んでいる種々の二次代謝産物
の生産菌である．このため、ストレプト逅セスに対して
遺伝子クローニング技術を開発するのにかなりの努力が
はらわれてきた．ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）仲
介形質転換によってＤＮＡをストレプトミセスに効率よ
く導入する方法が開発されている．ファージ、高コピー
数プラスミド、低コピー数プラスミド及び大腸菌（Ｂ．
ｃｏｌｔ）一ストレブトミセスシャトルベクターを含
むベクターが作製されている．多くの薬剤耐性遺伝子が
ストレプトξセス種からクローン化されており、これら
の耐性遺伝子のいくつかは選択マーカーとしてベクター
に取込まれている．ストレブト逅セスで使用する現在の
ベクターの総説はハッチンソン（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ
） 、アブライドバイオケ壽ストリーアンドバイオテク
ノロジー第１６巻１６９〜１９０頁（１９８８年）にあ
る．多くの場合、二次代謝産物生産のための遺伝子及び
耐性に対してエンコードしている遺伝子はクラスターに
なっていることがわかっている．従ってクローニング遺
伝子に対してｌ経路での方法としては薬剤耐性遺伝子を
分離し次にその個々の抗生物質の別の遺伝子に対して隣
接したＤＮＡを試験することであった．薬剤耐性遺伝子
の近くでクラスターされている生合威遺伝子の具体例は
アクチノロージン（マルパーチダ（Ｍａｌｐａｒｔｉｄ
ａ）及びホプウッド（ｌｌｏｐｗｏｏｄ）、ネイチュア
第３０９巻．４６２頁（１ ９ ８ ４年〉）、テトラ
セノマイシンＣ（モタメジ（Ｍｏｔａｍｓｄｉ） 及び
ハソチンソン， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ＬＩＳ＾第８４巻．４４４５〜４４４９頁
（１ ９ ８ ７年〉〉、及びビアラホス（ムラカミ等
， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．第２０５巻，４
２〜５０頁（１ ９ ８ ６年）、欧州特許第１７３．
３２７頁〉を含んでいる．欧州特許第２０４．５４９号
は薬剤耐性遺伝子と生合成遺伝子のクラスターを利用し
簡単に分離した薬剤耐性遺伝子を用いて抗生物質遺伝子
を分離する方法の特許を請求している．特許公告ＷＯ８
？／０３９０７はポリケチド合威酵素としてクローン化
した遺伝子を用いてポリケチド抗生物質を単離する方法
を開示している。この出願はアベルメクチンに構造上関
連のある化合物であるミルベマイシン生合成に含まれる
遺伝子のクローニングも開示している．商業上重要な化
合物の生合威のクローニング遺伝子に対する別の方法は
突然変異体の相補性であった。ＤＮＡの生産生物体から
のライブラリーは非生産突然変異体に導入され形質転換
細胞は化合物の生産に対して選抜される。この方法もま
た抗生物質の生産に関係する遺伝子クラスターを同定し
ある場合にはいくつかの抗生物質の生産のための遺伝子
全部がクローン化されている。上の３種の具体例のほか
に抗生物質生合成に関係するクローン化ストレプトミセ
ス遺伝子の具体例としてチロシン（フ４ｙシマン（Ｆｉ
ｓｈｍａｎ）等， Ｐｒｏｃ， Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ． ＵＳＡ．第８４巻．８２４８〜８２５２頁
１９８７年〉、ウンデシルブロジギオシン（フェイテル
ソン（Ｆｅｉ ｔｅｌｓｏｎ）等， Ｊ， Ｇｅｎ．
Ｍｉｃｒｏ．第１３１巻，２４３１〜２４４１頁（１９
Ｂ５年〉、メチレノマイシン（チャター（Ｃｈａｔｅｒ
）及びブルトン（Ｂｒｕｔｏｎ） 、ＥＭＢＯ Ｊ４、
１８９３ 〜１８９７頁（１ ９ ８ ５年）、ノシヘ
プチド（日本特許第８６３６２１６ 号）及びセファマ
イシンＣ（チェン（Ｃｈｅｎ）等、バイオ／テクノロジ
ー第６巻、１２２２〜１２２４真（１ ９ ８ ８年〉
、日本特許第８６６７０４３号）を含んでいる。いくつ
かの場合には新しい抗生物質類似体がクローン化した遺
伝子を別のストレプトミセスに導入して生産されている
（フロス（Ｆｌｏｓｓ＋バイオテクノロジー第５巻、１
１１〜１１５頁（１９８７年）、ホプウッド等、ネイチ
ュア第３１４巻６４２〜６４４頁（１９８５年））．他
の場合には、生合戒遺伝子のエキストラコビーを原生産
生物体に導入して力価が高い抗生物質が生じている．欧
州特許第２３８３２３号は、抗生物質の力価を高めるた
めに律速酵素としての遺伝子を生産生物体に導入する方
法を開示している。
の抗生物質のほとんどを含んでいる種々の二次代謝産物
の生産菌である．このため、ストレプト逅セスに対して
遺伝子クローニング技術を開発するのにかなりの努力が
はらわれてきた．ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）仲
介形質転換によってＤＮＡをストレプトミセスに効率よ
く導入する方法が開発されている．ファージ、高コピー
数プラスミド、低コピー数プラスミド及び大腸菌（Ｂ．
ｃｏｌｔ）一ストレブトミセスシャトルベクターを含
むベクターが作製されている．多くの薬剤耐性遺伝子が
ストレプトξセス種からクローン化されており、これら
の耐性遺伝子のいくつかは選択マーカーとしてベクター
に取込まれている．ストレブト逅セスで使用する現在の
ベクターの総説はハッチンソン（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ
） 、アブライドバイオケ壽ストリーアンドバイオテク
ノロジー第１６巻１６９〜１９０頁（１９８８年）にあ
る．多くの場合、二次代謝産物生産のための遺伝子及び
耐性に対してエンコードしている遺伝子はクラスターに
なっていることがわかっている．従ってクローニング遺
伝子に対してｌ経路での方法としては薬剤耐性遺伝子を
分離し次にその個々の抗生物質の別の遺伝子に対して隣
接したＤＮＡを試験することであった．薬剤耐性遺伝子
の近くでクラスターされている生合威遺伝子の具体例は
アクチノロージン（マルパーチダ（Ｍａｌｐａｒｔｉｄ
ａ）及びホプウッド（ｌｌｏｐｗｏｏｄ）、ネイチュア
第３０９巻．４６２頁（１ ９ ８ ４年〉）、テトラ
セノマイシンＣ（モタメジ（Ｍｏｔａｍｓｄｉ） 及び
ハソチンソン， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ＬＩＳ＾第８４巻．４４４５〜４４４９頁
（１ ９ ８ ７年〉〉、及びビアラホス（ムラカミ等
， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．第２０５巻，４
２〜５０頁（１ ９ ８ ６年）、欧州特許第１７３．
３２７頁〉を含んでいる．欧州特許第２０４．５４９号
は薬剤耐性遺伝子と生合成遺伝子のクラスターを利用し
簡単に分離した薬剤耐性遺伝子を用いて抗生物質遺伝子
を分離する方法の特許を請求している．特許公告ＷＯ８
？／０３９０７はポリケチド合威酵素としてクローン化
した遺伝子を用いてポリケチド抗生物質を単離する方法
を開示している。この出願はアベルメクチンに構造上関
連のある化合物であるミルベマイシン生合成に含まれる
遺伝子のクローニングも開示している．商業上重要な化
合物の生合威のクローニング遺伝子に対する別の方法は
突然変異体の相補性であった。ＤＮＡの生産生物体から
のライブラリーは非生産突然変異体に導入され形質転換
細胞は化合物の生産に対して選抜される。この方法もま
た抗生物質の生産に関係する遺伝子クラスターを同定し
ある場合にはいくつかの抗生物質の生産のための遺伝子
全部がクローン化されている。上の３種の具体例のほか
に抗生物質生合成に関係するクローン化ストレプトミセ
ス遺伝子の具体例としてチロシン（フ４ｙシマン（Ｆｉ
ｓｈｍａｎ）等， Ｐｒｏｃ， Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ． ＵＳＡ．第８４巻．８２４８〜８２５２頁
１９８７年〉、ウンデシルブロジギオシン（フェイテル
ソン（Ｆｅｉ ｔｅｌｓｏｎ）等， Ｊ， Ｇｅｎ．
Ｍｉｃｒｏ．第１３１巻，２４３１〜２４４１頁（１９
Ｂ５年〉、メチレノマイシン（チャター（Ｃｈａｔｅｒ
）及びブルトン（Ｂｒｕｔｏｎ） 、ＥＭＢＯ Ｊ４、
１８９３ 〜１８９７頁（１ ９ ８ ５年）、ノシヘ
プチド（日本特許第８６３６２１６ 号）及びセファマ
イシンＣ（チェン（Ｃｈｅｎ）等、バイオ／テクノロジ
ー第６巻、１２２２〜１２２４真（１ ９ ８ ８年〉
、日本特許第８６６７０４３号）を含んでいる。いくつ
かの場合には新しい抗生物質類似体がクローン化した遺
伝子を別のストレプトミセスに導入して生産されている
（フロス（Ｆｌｏｓｓ＋バイオテクノロジー第５巻、１
１１〜１１５頁（１９８７年）、ホプウッド等、ネイチ
ュア第３１４巻６４２〜６４４頁（１９８５年））．他
の場合には、生合戒遺伝子のエキストラコビーを原生産
生物体に導入して力価が高い抗生物質が生じている．欧
州特許第２３８３２３号は、抗生物質の力価を高めるた
めに律速酵素としての遺伝子を生産生物体に導入する方
法を開示している。
ストレブト壽セスアベノレミチリス（ａｖｅｒｍｉｔｉ
ｌｉｓ）は強力な駆虫作用及び殺虫作用を有する一連の
８種の関連化合物であるアベルメクチンを産生ずる（米
国特許第４．３１０，５１９号及び同第４． ４２９．
０４２号）．アベルメクチンの半合ｒＩｉ．誘導体で
あるイベルメクチンは商業上重要な駆虫剤である．米国
特許第４．３１０．５１９号は天然アベルメクチンのフ
ラン環が無いＳ．アベルミチリスの突然変異体を記載し
ている．シュノレマン（Ｓｃｈｕｌｓａｎ）等、Ｊ．６
ｎｉｉｂｉｏｔ．第３８巻１４９４〜１４９８頁（１９
８５年）はアベルメクチンアグリコンＡｌａ及びＡ２ａ
を生産する突然変異体Ａｇｔｙ−ｔを記載している。ル
ビ− （Ｒｕｂｙ）等、放線菌の生物学に関する第６回
国際シンポジウムの議事録Ｇ．サーボ（Ｓｚａｂｏ）、
Ｓ．ビロ（Ｂｉｒｏ） 、Ｍ．グッドフェロウ（Ｇｏｏ
ｄｆｅｌｌｏｗ）（編集）２７９〜２８０頁（１ ９
８ ５年）及びシエルマン等、Ａｎｔｉｍｉｃｒ． Ａ
ｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，第３１巻，
７４４〜７４７頁（１ ９ ８ ７年）は、１つがＣ−
５のＯ−メチル化に欠損がありもう１つがＣ−３＃とＣ
−３′のＯ−メチル化に欠損がある２種類のＳ．アベル
ξチリス突然変異を記載している。欧州特許第２７６１
０３号は側鎖脂肪酸脱水素酵素に欠損があるＳ．アベル
ミチリスの突然変異体を記載している．欧州特許第２７
６１３１号はＣ−５，Ｃ−３’及びＣ−３’Ｏ−メチル
化に欠損があるＳ．アベルミチリス突然変異体を記載し
ている。イケダ等、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．第１６
９巻、５６１５〜５６２ｌ頁（１９８７年）は２種類の
Ｓ．アベルξチリス突然変異体の分離及び遺伝分析を記
載している。ＡｖｅＡ突然変異体はアベルメクチンアグ
リコン形成に欠損がありＡｖｅＢ突然変異体はオレアン
ドロース部分をアベルメクチンアグリコンに合戒又は付
加することができない。これらは２種類の突然変異が連
鎖される遺伝的証明を得ている。本出願はアベルメクチ
ンの生合戊に必要とされる遺伝子のクローニングを記載
している．アベルメクチン様化合物を生産する他の微生
物はＳ．ヒグロスコピカス（ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕ
ｓ） Ｓ ．シアノグリエセウス（Ｃｙａｎｏｇｒｉｅ
ｓｅｕｓ）及びＳ．サーモアーキノシス（ｔｈｅｒｎ＋
ｏａｒｃｈａｅｎｏｓｉｓ）である。
ｌｉｓ）は強力な駆虫作用及び殺虫作用を有する一連の
８種の関連化合物であるアベルメクチンを産生ずる（米
国特許第４．３１０，５１９号及び同第４． ４２９．
０４２号）．アベルメクチンの半合ｒＩｉ．誘導体で
あるイベルメクチンは商業上重要な駆虫剤である．米国
特許第４．３１０．５１９号は天然アベルメクチンのフ
ラン環が無いＳ．アベルミチリスの突然変異体を記載し
ている．シュノレマン（Ｓｃｈｕｌｓａｎ）等、Ｊ．６
ｎｉｉｂｉｏｔ．第３８巻１４９４〜１４９８頁（１９
８５年）はアベルメクチンアグリコンＡｌａ及びＡ２ａ
を生産する突然変異体Ａｇｔｙ−ｔを記載している。ル
ビ− （Ｒｕｂｙ）等、放線菌の生物学に関する第６回
国際シンポジウムの議事録Ｇ．サーボ（Ｓｚａｂｏ）、
Ｓ．ビロ（Ｂｉｒｏ） 、Ｍ．グッドフェロウ（Ｇｏｏ
ｄｆｅｌｌｏｗ）（編集）２７９〜２８０頁（１ ９
８ ５年）及びシエルマン等、Ａｎｔｉｍｉｃｒ． Ａ
ｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，第３１巻，
７４４〜７４７頁（１ ９ ８ ７年）は、１つがＣ−
５のＯ−メチル化に欠損がありもう１つがＣ−３＃とＣ
−３′のＯ−メチル化に欠損がある２種類のＳ．アベル
ξチリス突然変異を記載している。欧州特許第２７６１
０３号は側鎖脂肪酸脱水素酵素に欠損があるＳ．アベル
ミチリスの突然変異体を記載している．欧州特許第２７
６１３１号はＣ−５，Ｃ−３’及びＣ−３’Ｏ−メチル
化に欠損があるＳ．アベルミチリス突然変異体を記載し
ている。イケダ等、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．第１６
９巻、５６１５〜５６２ｌ頁（１９８７年）は２種類の
Ｓ．アベルξチリス突然変異体の分離及び遺伝分析を記
載している。ＡｖｅＡ突然変異体はアベルメクチンアグ
リコン形成に欠損がありＡｖｅＢ突然変異体はオレアン
ドロース部分をアベルメクチンアグリコンに合戒又は付
加することができない。これらは２種類の突然変異が連
鎖される遺伝的証明を得ている。本出願はアベルメクチ
ンの生合戊に必要とされる遺伝子のクローニングを記載
している．アベルメクチン様化合物を生産する他の微生
物はＳ．ヒグロスコピカス（ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕ
ｓ） Ｓ ．シアノグリエセウス（Ｃｙａｎｏｇｒｉｅ
ｓｅｕｓ）及びＳ．サーモアーキノシス（ｔｈｅｒｎ＋
ｏａｒｃｈａｅｎｏｓｉｓ）である。
このような微生物はＳ．アベルミチリスに対して記載し
たのど同様の方法に委ねることができる。
たのど同様の方法に委ねることができる。
８種の主要なアベルメクチンの類似体を生産するＳ．ア
ベルミチリスの突然変異体、原土壌分離物より異なった
比でアベルメクチンを生産する突然変異体及びアベルメ
クチンを生産することができない突然変異体は突然変異
誘発細胞から分離される．Ｓ．アベルミチリスＤＮＡの
遺伝子ライブラリーは低コピー数ストレプトミセスベク
ターｐｌＪ９２２で作製される．連結反応の後、得られ
た分子はＳ．リビダンス（ｌｉｖｉｄａｎｓ）に形質転
換され形質転換細胞はチオストレプトン耐性（Ｔｈｉｏ
’）として選択される。形質転換細胞をプールし、プラ
スミドＤＮＡが分離される， ｐＩＪ９２２ライブラリ
ーのアリコートはＳ．アベルミチリスの突然変異体に導
入される。アベルメクチンＣ−５０−メチルトランスフ
ェラーゼ（ＯＭＴ）欠失菌株に於て欠損を相補するいく
つかのブラスミドを発見した．最初のブラスミド、ｐＡ
Ｔ１は広範囲に確認される。
ベルミチリスの突然変異体、原土壌分離物より異なった
比でアベルメクチンを生産する突然変異体及びアベルメ
クチンを生産することができない突然変異体は突然変異
誘発細胞から分離される．Ｓ．アベルミチリスＤＮＡの
遺伝子ライブラリーは低コピー数ストレプトミセスベク
ターｐｌＪ９２２で作製される．連結反応の後、得られ
た分子はＳ．リビダンス（ｌｉｖｉｄａｎｓ）に形質転
換され形質転換細胞はチオストレプトン耐性（Ｔｈｉｏ
’）として選択される。形質転換細胞をプールし、プラ
スミドＤＮＡが分離される， ｐＩＪ９２２ライブラリ
ーのアリコートはＳ．アベルミチリスの突然変異体に導
入される。アベルメクチンＣ−５０−メチルトランスフ
ェラーゼ（ＯＭＴ）欠失菌株に於て欠損を相補するいく
つかのブラスミドを発見した．最初のブラスミド、ｐＡ
Ｔ１は広範囲に確認される。
アベルメクチンアグリコン産生突然変異体に於て欠損を
相補する別のブラスミド、ｐＶＥ６５０を発見し、この
突然変異体は合或又はオレアンドロース部分のアベルメ
クチンアグリコンへの付加に欠損がある，ＯＭＴに対し
て遺伝子を示すｐＡＴ１のサブクロニング分析は３．
４ ｋｂ ＢａｍＨ Ｉ断片の位置を決定する。ｐＶ［
！６５０のサブクローニング分析は２つのＢｇｌ ■断
片がいくつかのアベルメクチンアグリコン産生株の欠損
を相補することを示した。
相補する別のブラスミド、ｐＶＥ６５０を発見し、この
突然変異体は合或又はオレアンドロース部分のアベルメ
クチンアグリコンへの付加に欠損がある，ＯＭＴに対し
て遺伝子を示すｐＡＴ１のサブクロニング分析は３．
４ ｋｂ ＢａｍＨ Ｉ断片の位置を決定する。ｐＶ［
！６５０のサブクローニング分析は２つのＢｇｌ ■断
片がいくつかのアベルメクチンアグリコン産生株の欠損
を相補することを示した。
ｐＡＴ１及びｐＶＥ６５０のサザンハイブリッド形或分
析は２つのプラスξドがオーバーラップ配列を含まない
ことを示した。しかしながら、驚くべきことに２つのプ
ラスミドが厳密ではないが関連した相同領域を含むこと
を発見した。２つの異なった関連配列のグループを発見
した。各種類にあるＳ．アベルミチリスのゲノムから異
なるＢａｍＨ Ｉ断片数はＢａ＋ｓＨ Ｔ消化Ｓ．アベ
ルζチリスゲノムＤＮＡのサザン分析によって決定した
。７つの別々のＢａｍＨ Ｉ断片はグループｌからのプ
ローブに対して相同性を示した．これらの７つはｐＡＴ
１でクローン化したＤＮＡに位置した１つの断片、ｐＶ
Ｅ６５０でクローン化したＤＮＡに位置した１つの断片
及び染色体の他の所に位置した５つの他のバンドから或
る。少なくとも１４個のＢａｗｌ Ｉ断片はグループ２
からプローブに対して相同性の領域を含有した。５ ツ
（７）９ＶＥ６５０断片１ツ（ＤｐＡＴ１断片及びＳ．
７ベルミチリスのゲノムの他の所の８つの断片はグル
ープ２１ローブに相同な領域を含んでいた．Ｓ．アベル
ミチリスＤＮＡの第二遺伝子ライブラリーは大腸菌コス
ミドベクターｐＶＩ１３２８で作製される。ｐＶｌｌ！
６５０に相同な配列を含むｐＶＥ３２８コスミドライブ
ラリーからのクローンを分離するためにｐＶＥ６５０か
らの制限断片がプローブとして用いられる．ゲノムＤＮ
Ａの１１０ｋｂで集団的にスピンする一連のコスξドク
ローンが分離される．このＤＮＡはアベルメクチンＣ−
５０−メチルトランスフエラーゼ遺伝子、Ｃ−２２、Ｃ
−２３デビドラーゼ遺伝子を包含し、いくつかの遺伝子
はアベルメクチンアグリコン形戒に関係し、少なくとも
７個の遺伝子はオレアンドロースのアベルメクチンアグ
リコンへの合威又は付加に関係する。
析は２つのプラスξドがオーバーラップ配列を含まない
ことを示した。しかしながら、驚くべきことに２つのプ
ラスミドが厳密ではないが関連した相同領域を含むこと
を発見した。２つの異なった関連配列のグループを発見
した。各種類にあるＳ．アベルミチリスのゲノムから異
なるＢａｍＨ Ｉ断片数はＢａ＋ｓＨ Ｔ消化Ｓ．アベ
ルζチリスゲノムＤＮＡのサザン分析によって決定した
。７つの別々のＢａｍＨ Ｉ断片はグループｌからのプ
ローブに対して相同性を示した．これらの７つはｐＡＴ
１でクローン化したＤＮＡに位置した１つの断片、ｐＶ
Ｅ６５０でクローン化したＤＮＡに位置した１つの断片
及び染色体の他の所に位置した５つの他のバンドから或
る。少なくとも１４個のＢａｗｌ Ｉ断片はグループ２
からプローブに対して相同性の領域を含有した。５ ツ
（７）９ＶＥ６５０断片１ツ（ＤｐＡＴ１断片及びＳ．
７ベルミチリスのゲノムの他の所の８つの断片はグル
ープ２１ローブに相同な領域を含んでいた．Ｓ．アベル
ミチリスＤＮＡの第二遺伝子ライブラリーは大腸菌コス
ミドベクターｐＶＩ１３２８で作製される。ｐＶｌｌ！
６５０に相同な配列を含むｐＶＥ３２８コスミドライブ
ラリーからのクローンを分離するためにｐＶＥ６５０か
らの制限断片がプローブとして用いられる．ゲノムＤＮ
Ａの１１０ｋｂで集団的にスピンする一連のコスξドク
ローンが分離される．このＤＮＡはアベルメクチンＣ−
５０−メチルトランスフエラーゼ遺伝子、Ｃ−２２、Ｃ
−２３デビドラーゼ遺伝子を包含し、いくつかの遺伝子
はアベルメクチンアグリコン形戒に関係し、少なくとも
７個の遺伝子はオレアンドロースのアベルメクチンアグ
リコンへの合威又は付加に関係する。
アベルメクチン遺伝子クラスターの１つの領域は分離さ
れたコスミドから消失している。この領域は、Ｓ．アベ
ルミチリスゲノムから組込みベクターを用いる大腸菌に
直接クローン化される．また１５ｋｂのアベルメクチン
遺伝子クラスターはこの方法でクローン化される。
れたコスミドから消失している。この領域は、Ｓ．アベ
ルミチリスゲノムから組込みベクターを用いる大腸菌に
直接クローン化される．また１５ｋｂのアベルメクチン
遺伝子クラスターはこの方法でクローン化される。
アベルメクチン” の び
アベルメクチン生合戒に欠損のある突然変異体は突然変
異原処理の単一コロニー残存菌の発酵から出るメタノー
ル抽出液の蒲層クロマトグラフィ−（ＴＬＣ）スクリー
ンによって検出される．親株の胞子はホブウッド等、ジ
ェネティック マニブレーシッンズ オブ ストレブト
主セスーＡラボラトリー マニュアル，ジッン イネス
インスチチュート ノースウインチ．１９８５年に記
載されるＵＶ又はＮＴＧを用いて突然変異が誘発される
．胞子の９９〜９９．９％を破壊する処理の残存菌は培
地Ａでウェル胞子形威コロニーを形威させる．単一コロ
ニーからの胞子は増殖培地０．２５一に接種される．４
０時間増殖させた後、発酵培地０． ８ ｄを加え発酵
を１３日間続けた．発酵物は２８℃に於て回転振盪器に
より２２０ｒｐ■で温置される。種々の増殖培地及び発
酵培地を使用することができ、いくつかの培地は米国特
許第４．３１０．５１９号及び同第４．３７８．３５３
号に記載されている．特に有用な増殖培地は培地Ｂであ
り、特に有用な発酵培地は培地Ｃである． 培地Ａ ＫＮ０． １ ｇ
酵母エキス（ジフコ） Ｉｇ麦芽エ
キス １ｇクエン酸ナトリウ
ム ０．５ｇＭｇＳＯ．・７Ｈｚ８
０．２５ｇ微量元素
２． ５ ａｄグルコース
２ｇ蒸留水
１０００ｄＮａＯＨを用いてＰＨ７．０に調
整する．培地Ａの微量元素は蒸留水１ｌ当りｌ｛Ｃ ｆ
ｆｉ （３７．３％） ４ ９．７ａｄ， ＭｇＳＯ
ａ ｍ ７Ｈ＊０ ６ １． １ ｇ， ＣａＣＯｓ２
．Ｏ ｇ， ＰｅＣｆｓ ・６Ｈｚ８ ５．４ ｇ，
ＺｎＳＯ４・７Ｈｔ０１．４ ４ ｇＳＭｎＳＯ４・Ｈ
ｚＯ１． １ １ ｇ， ＣｕＳＯａ ６ ５Ｈｘ００
．２ ５ ｇ， ｝１３ＢＯ３ ０．０ ６ ２ ｇ
及びＮａ．Ｍ．０． ・Ｈ．８０．４９ｇを含む． 培地Ｂ ＭｇＳ０４・７１２０（１２．５％溶液） ２
． ６ ７ ａ１！ＮａＣＩｌ （ １ ２． ５％溶
液） ２． ６ ７ ｄＭｎＳＯｎ
・ＨｚＯ （０．５％溶液） ０． ６
７ ｄＺｎＳＯａ ・７Ｈ１０ （１． ０％溶液）
０．６７，ｄＣａＣｌｘ ・ＨｚＯ （２
．０％溶液） ０． ６ ７ ｄＦｅＳＯ４
・７ＨｚＯ （ ２． ５％溶液’） ０
． ６ ７ ｄＫＮＯ３
１． ３ ３ ｇハイケースｓ．ｐ
． （ハムプコ） １３．３ｇ酵母エキス（ジ
フコ） １３．３ｇグルコース
１ ９． ９ ５ ｇ蒸留水
１０００ｄＩ Ｎ ＮａＯＦｌを
用いてｐＨ７．０に調整する培地Ｃ ペプトン化乳 アルダ逅ンｐＨ グルコース ＭｇＳＯ４・７８！Ｏ ＣＬＩＳＯ４ ・５Ｈ＊Ｏ ＺｎＳＯ４・６ＨｚＯ ＣｏＣＪ＃ − ６Ｈｚ０ ２０ ｇ ４ｇ １０５ ｇ ０．５ｇ ０． ０ ６ ｇ １ ■ ０．１ ■ ＦｅＣｊ！ｘ ・６Ｔｏ０
３ ■蒸留水を加えて容量９００ｄに
する Ｉ Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨ１．２に調整する．最終
容量１００ｊｄの蒸留水中グルコース３５ｇのグルコー
ス溶液を別に調製し、ｐＨ７．２に調整する．オートク
レープにかけた後グルコース溶液を完全培地Ｃに加える
． 発酵ブイヨンは同量のメタノールで抽出され試料をＴＬ
Ｃプレートに注ぎアベルメクチンが分離される．使用し
たＴＬＣ系は竃ラー等、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅ
ｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．第１５巻３６８
〜３７１頁（１９７９年）に記載されるＵＶ蛍光消光
によって検出される４つのバンドにアベルメクチンを分
離する．抽出液をＥ．メルクシリカゲル６０Ｆ−２５４
プレートにスポットし、ジクロロメタン：酢酸エチル：
メタノール９：９：１の溶媒で展開される．この系に於
てアベルメクチンの速い方から遅い方までの順序はアベ
ルメクチンＡＩ，Ａ２，Ｂｌ及びＢ２であり、ａ及びｂ
系は分離されない．組威変化を示すコロニー、変容移動
バンド又はアベルメクチンバンドのいくつかあるいは全
部の欠如は再精製、再発酵される．安定で再生産可能な
発酵物を得る突然変異体はとっておく．突然変異体のい
くつかによって生産されたアベルメクチンは分取用ＴＬ
Ｃ及びＨＰＬＣによって分離され同定が必要なときにＮ
ＭＲ又は質量分析によって確認される．ほとんどの場合
、個々の威分の純粋な試料（例えばＯ−メチルトランス
フェラーゼ活性に欠陥のある突然変異体を同定するため
にはＢ１ａ）、阻害剤の存在下化学修飾又は発酵により
得られる修飾アベルメクチン（例えばアベルメクチンア
グリコン又はデスメチルアベルメクチン）と直接比較す
ることにより同定が決定される〈シュルマン等、Ｊ．
Ａｎｔｉｂｉｏｔ．第３８巻．１４９４〜１４９８頁（
１９８５年））。表１は分離された突然変異体の種類の
要約を示す。
異原処理の単一コロニー残存菌の発酵から出るメタノー
ル抽出液の蒲層クロマトグラフィ−（ＴＬＣ）スクリー
ンによって検出される．親株の胞子はホブウッド等、ジ
ェネティック マニブレーシッンズ オブ ストレブト
主セスーＡラボラトリー マニュアル，ジッン イネス
インスチチュート ノースウインチ．１９８５年に記
載されるＵＶ又はＮＴＧを用いて突然変異が誘発される
．胞子の９９〜９９．９％を破壊する処理の残存菌は培
地Ａでウェル胞子形威コロニーを形威させる．単一コロ
ニーからの胞子は増殖培地０．２５一に接種される．４
０時間増殖させた後、発酵培地０． ８ ｄを加え発酵
を１３日間続けた．発酵物は２８℃に於て回転振盪器に
より２２０ｒｐ■で温置される。種々の増殖培地及び発
酵培地を使用することができ、いくつかの培地は米国特
許第４．３１０．５１９号及び同第４．３７８．３５３
号に記載されている．特に有用な増殖培地は培地Ｂであ
り、特に有用な発酵培地は培地Ｃである． 培地Ａ ＫＮ０． １ ｇ
酵母エキス（ジフコ） Ｉｇ麦芽エ
キス １ｇクエン酸ナトリウ
ム ０．５ｇＭｇＳＯ．・７Ｈｚ８
０．２５ｇ微量元素
２． ５ ａｄグルコース
２ｇ蒸留水
１０００ｄＮａＯＨを用いてＰＨ７．０に調
整する．培地Ａの微量元素は蒸留水１ｌ当りｌ｛Ｃ ｆ
ｆｉ （３７．３％） ４ ９．７ａｄ， ＭｇＳＯ
ａ ｍ ７Ｈ＊０ ６ １． １ ｇ， ＣａＣＯｓ２
．Ｏ ｇ， ＰｅＣｆｓ ・６Ｈｚ８ ５．４ ｇ，
ＺｎＳＯ４・７Ｈｔ０１．４ ４ ｇＳＭｎＳＯ４・Ｈ
ｚＯ１． １ １ ｇ， ＣｕＳＯａ ６ ５Ｈｘ００
．２ ５ ｇ， ｝１３ＢＯ３ ０．０ ６ ２ ｇ
及びＮａ．Ｍ．０． ・Ｈ．８０．４９ｇを含む． 培地Ｂ ＭｇＳ０４・７１２０（１２．５％溶液） ２
． ６ ７ ａ１！ＮａＣＩｌ （ １ ２． ５％溶
液） ２． ６ ７ ｄＭｎＳＯｎ
・ＨｚＯ （０．５％溶液） ０． ６
７ ｄＺｎＳＯａ ・７Ｈ１０ （１． ０％溶液）
０．６７，ｄＣａＣｌｘ ・ＨｚＯ （２
．０％溶液） ０． ６ ７ ｄＦｅＳＯ４
・７ＨｚＯ （ ２． ５％溶液’） ０
． ６ ７ ｄＫＮＯ３
１． ３ ３ ｇハイケースｓ．ｐ
． （ハムプコ） １３．３ｇ酵母エキス（ジ
フコ） １３．３ｇグルコース
１ ９． ９ ５ ｇ蒸留水
１０００ｄＩ Ｎ ＮａＯＦｌを
用いてｐＨ７．０に調整する培地Ｃ ペプトン化乳 アルダ逅ンｐＨ グルコース ＭｇＳＯ４・７８！Ｏ ＣＬＩＳＯ４ ・５Ｈ＊Ｏ ＺｎＳＯ４・６ＨｚＯ ＣｏＣＪ＃ − ６Ｈｚ０ ２０ ｇ ４ｇ １０５ ｇ ０．５ｇ ０． ０ ６ ｇ １ ■ ０．１ ■ ＦｅＣｊ！ｘ ・６Ｔｏ０
３ ■蒸留水を加えて容量９００ｄに
する Ｉ Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨ１．２に調整する．最終
容量１００ｊｄの蒸留水中グルコース３５ｇのグルコー
ス溶液を別に調製し、ｐＨ７．２に調整する．オートク
レープにかけた後グルコース溶液を完全培地Ｃに加える
． 発酵ブイヨンは同量のメタノールで抽出され試料をＴＬ
Ｃプレートに注ぎアベルメクチンが分離される．使用し
たＴＬＣ系は竃ラー等、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅ
ｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．第１５巻３６８
〜３７１頁（１９７９年）に記載されるＵＶ蛍光消光
によって検出される４つのバンドにアベルメクチンを分
離する．抽出液をＥ．メルクシリカゲル６０Ｆ−２５４
プレートにスポットし、ジクロロメタン：酢酸エチル：
メタノール９：９：１の溶媒で展開される．この系に於
てアベルメクチンの速い方から遅い方までの順序はアベ
ルメクチンＡＩ，Ａ２，Ｂｌ及びＢ２であり、ａ及びｂ
系は分離されない．組威変化を示すコロニー、変容移動
バンド又はアベルメクチンバンドのいくつかあるいは全
部の欠如は再精製、再発酵される．安定で再生産可能な
発酵物を得る突然変異体はとっておく．突然変異体のい
くつかによって生産されたアベルメクチンは分取用ＴＬ
Ｃ及びＨＰＬＣによって分離され同定が必要なときにＮ
ＭＲ又は質量分析によって確認される．ほとんどの場合
、個々の威分の純粋な試料（例えばＯ−メチルトランス
フェラーゼ活性に欠陥のある突然変異体を同定するため
にはＢ１ａ）、阻害剤の存在下化学修飾又は発酵により
得られる修飾アベルメクチン（例えばアベルメクチンア
グリコン又はデスメチルアベルメクチン）と直接比較す
ることにより同定が決定される〈シュルマン等、Ｊ．
Ａｎｔｉｂｉｏｔ．第３８巻．１４９４〜１４９８頁（
１９８５年））。表１は分離された突然変異体の種類の
要約を示す。
表１
ストレプトミセスアベルミチリスのアベルメクチン突然
変異体文虚４０Ｉ１４題 産経生處隻 非生産菌 無 ’ＡＧＬ：アグリコン生産菌．ＯｆｆＴ ： ０−メチ
ルトランスフェラーゼ；ＧＭＴ：グリコシル０−メチル
トランスフェラーゼ 分類された突然変異体は分離同定することができる検出
可能な発酵生戒物が蓄積されるために、マクロライド環
構造の形威閉環後に遮断が生じた場合のものである．こ
れらは２種のＯ−メチルトランスフェラーゼ突然変異体
を含む．１番目の種類はＣ−５位のメチル化に欠損があ
り（アベルメクチンＯ−メチルトランスフェラーゼ）、
アベルメクチンＢ威分の蓄積が生じる（ＯＭＴ一表現型
）ルビー等、放線菌の生物学に関する第６回国際シンポ
ジウムの議事録、Ｇ．サーボ、Ｓ．ビロ、Ｍ．グッドフ
エロウ（編集）、２７９〜２８０頁（１９８５年）及び
（シェルマン等， Ａｎｔｉｍｉｃｒ．Ａｇｅｎｔｓ
ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，第３１巻、７４４ 〜７
４７頁（１９８７年））．２番目の種類はオレアンドロ
ース部分のメチル化に欠陥があり（グリコシル〇一メチ
ルトランスフェラーゼ）、デスメチルアベルメクチンの
蓄積を生じる（ＧＭＴ一表現型）ルビー等、放線菌の生
物学に関する第６回国際シンポジウムの議事録、Ｇ．サ
ーボ、Ｓ．ビロ、Ｍ．グッドフェロウ（編集）、２７９
〜２８０頁（１ ９ ８ ５年）及び（シュルマン等＊
Ａｎｔｉ＋ｍｃｒ．ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍ
ｏｔｈｅｒ．第３１巻， ７４４〜７４７頁（１９Ｂ
７年））．生化学の研究はこれらのメチル化反応が少な
くとも２つの異なった酵素によって触媒されることを示
している．大きな種類のアベルメクチン突然変異体はオ
レアンドロース部分をアベルメクチンアグリコンに合戒
又は付加することができない。これらの突然変異体はア
ベルメクチンアグリコンを蓄積し、オレアンドロースジ
ホスホヌクレオチドあるいはオレアンドロースの転移に
欠損がある．他のｌ認された突然変異体はフラン環を閉
環することができないもの、アベルメクチン“２”前駆
体のアベルメクチン“１″前駆体への変換の触媒能力が
減少したものを含む。
変異体文虚４０Ｉ１４題 産経生處隻 非生産菌 無 ’ＡＧＬ：アグリコン生産菌．ＯｆｆＴ ： ０−メチ
ルトランスフェラーゼ；ＧＭＴ：グリコシル０−メチル
トランスフェラーゼ 分類された突然変異体は分離同定することができる検出
可能な発酵生戒物が蓄積されるために、マクロライド環
構造の形威閉環後に遮断が生じた場合のものである．こ
れらは２種のＯ−メチルトランスフェラーゼ突然変異体
を含む．１番目の種類はＣ−５位のメチル化に欠損があ
り（アベルメクチンＯ−メチルトランスフェラーゼ）、
アベルメクチンＢ威分の蓄積が生じる（ＯＭＴ一表現型
）ルビー等、放線菌の生物学に関する第６回国際シンポ
ジウムの議事録、Ｇ．サーボ、Ｓ．ビロ、Ｍ．グッドフ
エロウ（編集）、２７９〜２８０頁（１９８５年）及び
（シェルマン等， Ａｎｔｉｍｉｃｒ．Ａｇｅｎｔｓ
ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，第３１巻、７４４ 〜７
４７頁（１９８７年））．２番目の種類はオレアンドロ
ース部分のメチル化に欠陥があり（グリコシル〇一メチ
ルトランスフェラーゼ）、デスメチルアベルメクチンの
蓄積を生じる（ＧＭＴ一表現型）ルビー等、放線菌の生
物学に関する第６回国際シンポジウムの議事録、Ｇ．サ
ーボ、Ｓ．ビロ、Ｍ．グッドフェロウ（編集）、２７９
〜２８０頁（１ ９ ８ ５年）及び（シュルマン等＊
Ａｎｔｉ＋ｍｃｒ．ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍ
ｏｔｈｅｒ．第３１巻， ７４４〜７４７頁（１９Ｂ
７年））．生化学の研究はこれらのメチル化反応が少な
くとも２つの異なった酵素によって触媒されることを示
している．大きな種類のアベルメクチン突然変異体はオ
レアンドロース部分をアベルメクチンアグリコンに合戒
又は付加することができない。これらの突然変異体はア
ベルメクチンアグリコンを蓄積し、オレアンドロースジ
ホスホヌクレオチドあるいはオレアンドロースの転移に
欠損がある．他のｌ認された突然変異体はフラン環を閉
環することができないもの、アベルメクチン“２”前駆
体のアベルメクチン“１″前駆体への変換の触媒能力が
減少したものを含む。
後者の突然変異体は主としてアベルメクチン″２′″戒
分を蓄積し、“アベルメクチン”デヒドラーゼ作用がな
いと考えられる． アベルメクチン非生産突然変異体の種類はアベルメクチ
ン合威の早い段階で多くの異なった遮断を示すと考えら
れる．これらの突然変異体は生産酵素結合中間体である
ことができるがアベルメクチンに形質転換されることが
できる拡散可能な中間体又はＵ， Ｖ，吸収物質を蓄積
するとは思われない．これらの非生産突然変異体のべア
ワイズ発酵はアベルメクチンを生産することにはならな
い。
分を蓄積し、“アベルメクチン”デヒドラーゼ作用がな
いと考えられる． アベルメクチン非生産突然変異体の種類はアベルメクチ
ン合威の早い段階で多くの異なった遮断を示すと考えら
れる．これらの突然変異体は生産酵素結合中間体である
ことができるがアベルメクチンに形質転換されることが
できる拡散可能な中間体又はＵ， Ｖ，吸収物質を蓄積
するとは思われない．これらの非生産突然変異体のべア
ワイズ発酵はアベルメクチンを生産することにはならな
い。
非生産菌のメタノール抽出液はアベルメクチンに変換す
ることができる前駆体を含有しない．従ってアベルメク
チン非生産菌はまだ種々のグループに分類されていない
． アベルメクチンをＣ−５−ヒドロキシ位でメチル化する
ことができない突然変異体はほとんど独占的にアベルメ
クチンＢｌ （ａ十ｂ）及びＢ２（ａ＋ｂ）を生産する
．これらの突然変異体は低いかあるいは検出できない水
準のアベルメクチンＯＭＴであり、酵素はメチル供与体
としてＳ−アデノシルメチオニンを使用する（シェルマ
ン等，Ａｎｔｉｂｉｏ−ｔ．第３８巻，１４９４ 〜１
４９８真（１９８５年）．いくつかの突然変異体に見ら
れるＡｔｃ分の水準は少量であるが検出可能量の酵素が
存在することも見い出されているために欠損の漏出に関
係している．突然変異体表現型はＯＭＴ酵素の欠如に密
接に相関していると思われる．これらの突然変異体の全
体のアベルメクチン力価は親株から変化しないためにＯ
ＭＴ表現型に関与する突然変異は構造遺伝子の病変であ
ると思われる．分離されたアベルメクチンの中には、Ｏ
ＭＴ種が最もよく確認され理解される．この種類はまず
相補性スクリーンで用いられる． 低コピー数ストレプトミセスベクターｐｌＪ９２２のゲ
ノムライブラリー（ホブウッド等，ジェネティック マ
ニビエレーションズ オブ ストレプトミセス アラボ
ラトリー マニュアル．ジッンイネス インスティテエ
ート．ノルウイッチ，１９８５年）が突然変異体相補性
スクリーンに用いられる．このライブラリーはＳ．アベ
ルξチリスＤＮＡを連結することによって構威され、こ
れはＳａｕ３＾で一部消化されｐｌＪ９２２にサイズ分
画されており、これはＢａ＋ｍＨ Ｉ制限酵素と線状と
なり子ウシ腸管アルカリ性ホスファターゼで処理されて
いる．次に連結されたＤＮＡはＳ．リビダンスあるいは
Ｓ．アベルξチリスに形質転換され、チオストレプトン
耐性コロニーが選択される．胞子形成コロニーは大部分
収集されＹＥＭＥ培地（ホプウッド等，ジェネティック
マニピュレーシッンズオブ ストレプトミセス アラ
ボラトリー マニュアル．ジッンイネス インスティテ
ユート，ノルウインチ．１９８５年）に希釈されプラス
ミド精製のため培養される。これらの培養からの精製プ
ラスミド調製物はｐｌＪ９２２− Ｓ ．アベルミチリ
スゲノムライブラリーを構或する．最初に形質転換され
たコロニー及び精製ライブラリープラス逅ド調製物を用
いて形質転換から誘導されたコロニーの代表的な数は挿
入頻度及びサイズに対してチェックされる．プラスミド
含有挿入断片の頻度は平均サイズ約２０ｋｂで６５％以
上である。頻度あるいは平均挿入断片のいずれも形質転
換細胞の初期のものとライブラリーＤＮＡで得たものと
の間に著しい相違はない． ライブラリーはアベルメクチンＯ−メチルトランスフエ
ラーゼ欠損（ＯＭＴ− ）突然変異体、ＭＡ６２３３を
形質転換することによって最初に選抜され、ライブラリ
ーＤＮＡはＴｈｉｏ’形質転換細胞として選択される。
ることができる前駆体を含有しない．従ってアベルメク
チン非生産菌はまだ種々のグループに分類されていない
． アベルメクチンをＣ−５−ヒドロキシ位でメチル化する
ことができない突然変異体はほとんど独占的にアベルメ
クチンＢｌ （ａ十ｂ）及びＢ２（ａ＋ｂ）を生産する
．これらの突然変異体は低いかあるいは検出できない水
準のアベルメクチンＯＭＴであり、酵素はメチル供与体
としてＳ−アデノシルメチオニンを使用する（シェルマ
ン等，Ａｎｔｉｂｉｏ−ｔ．第３８巻，１４９４ 〜１
４９８真（１９８５年）．いくつかの突然変異体に見ら
れるＡｔｃ分の水準は少量であるが検出可能量の酵素が
存在することも見い出されているために欠損の漏出に関
係している．突然変異体表現型はＯＭＴ酵素の欠如に密
接に相関していると思われる．これらの突然変異体の全
体のアベルメクチン力価は親株から変化しないためにＯ
ＭＴ表現型に関与する突然変異は構造遺伝子の病変であ
ると思われる．分離されたアベルメクチンの中には、Ｏ
ＭＴ種が最もよく確認され理解される．この種類はまず
相補性スクリーンで用いられる． 低コピー数ストレプトミセスベクターｐｌＪ９２２のゲ
ノムライブラリー（ホブウッド等，ジェネティック マ
ニビエレーションズ オブ ストレプトミセス アラボ
ラトリー マニュアル．ジッンイネス インスティテエ
ート．ノルウイッチ，１９８５年）が突然変異体相補性
スクリーンに用いられる．このライブラリーはＳ．アベ
ルξチリスＤＮＡを連結することによって構威され、こ
れはＳａｕ３＾で一部消化されｐｌＪ９２２にサイズ分
画されており、これはＢａ＋ｍＨ Ｉ制限酵素と線状と
なり子ウシ腸管アルカリ性ホスファターゼで処理されて
いる．次に連結されたＤＮＡはＳ．リビダンスあるいは
Ｓ．アベルξチリスに形質転換され、チオストレプトン
耐性コロニーが選択される．胞子形成コロニーは大部分
収集されＹＥＭＥ培地（ホプウッド等，ジェネティック
マニピュレーシッンズオブ ストレプトミセス アラ
ボラトリー マニュアル．ジッンイネス インスティテ
ユート，ノルウインチ．１９８５年）に希釈されプラス
ミド精製のため培養される。これらの培養からの精製プ
ラスミド調製物はｐｌＪ９２２− Ｓ ．アベルミチリ
スゲノムライブラリーを構或する．最初に形質転換され
たコロニー及び精製ライブラリープラス逅ド調製物を用
いて形質転換から誘導されたコロニーの代表的な数は挿
入頻度及びサイズに対してチェックされる．プラスミド
含有挿入断片の頻度は平均サイズ約２０ｋｂで６５％以
上である。頻度あるいは平均挿入断片のいずれも形質転
換細胞の初期のものとライブラリーＤＮＡで得たものと
の間に著しい相違はない． ライブラリーはアベルメクチンＯ−メチルトランスフエ
ラーゼ欠損（ＯＭＴ− ）突然変異体、ＭＡ６２３３を
形質転換することによって最初に選抜され、ライブラリ
ーＤＮＡはＴｈｉｏ’形質転換細胞として選択される。
個々の形質転換コロニーはアベルメクチン生産及び組戒
としてスコアされる．ＯＭＴ突然変異体はこれらの条件
下で２つだけアベルメクチンＴＬＣバンドを生産する（
Ｂｌ及びＢ２）。ＯＭＴ陽性形質転換体はｔｏ，ｏｏｏ
個の形質転換体によりスクリーニングから検出される。
としてスコアされる．ＯＭＴ突然変異体はこれらの条件
下で２つだけアベルメクチンＴＬＣバンドを生産する（
Ｂｌ及びＢ２）。ＯＭＴ陽性形質転換体はｔｏ，ｏｏｏ
個の形質転換体によりスクリーニングから検出される。
この形質転換体は精製され、相補性に対して再試験され
、再精製コロニーの１つからのブラスミドはｐＡＴ１と
呼ばれる。全部で６個のＯＭＴ突然変異体のプラスξド
ｐＡＴ１相補ＯＭＴ表現型を試験した．２０ｋｂのＳ．
アベルミチリスＤＮＡを含むｐＡＴ１の制限地図が決定
される。部位の場所は表３に示され、地図は第１図に示
される．Ｏ−メチルトランスフェラーゼに対する遺伝子
はａｖｒＡと呼ばれる。
、再精製コロニーの１つからのブラスミドはｐＡＴ１と
呼ばれる。全部で６個のＯＭＴ突然変異体のプラスξド
ｐＡＴ１相補ＯＭＴ表現型を試験した．２０ｋｂのＳ．
アベルミチリスＤＮＡを含むｐＡＴ１の制限地図が決定
される。部位の場所は表３に示され、地図は第１図に示
される．Ｏ−メチルトランスフェラーゼに対する遺伝子
はａｖｒＡと呼ばれる。
プラスミドｐＡＴ１はＳ．リビダンスに形質転換され、
得られた菌株はＭＡ６６１９と呼ばれ、ＡＴＣＣ ６７
８２０としてアメリカンタイプカルチュアコレクション
、１２３０１パークラウンＤｒ−＋ ロックビル．
Ｍｄ．２０８５２に寄託されている． ＯＭＴ遺伝子はｐＡＴＩ ＢａｍＨ Ｉ断片をｐｌＪ９
２２にサブクローン化して局在させ次いで形質転換及び
相補性分析が行なわれる。３． ４ ｋｂ ＢａｍＨ
Ｉ断片を含むサブクローンｐＡＴ８３はＭＡ６２３３
（ＯＭＴ− ）を相補することができ遺伝子地図はこの
断片の範囲内であることを示す． オレアンドロースム び は 伝 のクローニ
ング ｐＡＴ１の分離に続いて、他のアベルメクチン突然変異
体を相補するプラスミドを分離するためにスクリーニン
グが行なわれた．ｐＩＪ９２２ライブラリーのアリコー
トがＭＡ６２７８ （ＡＧＬ− 、ＯＭＴ”− ）に形
質転換された．形質転換細胞（ｔｒａｎｓｆｏｒｗａｎ
ｔｓ）はグリコシル化アベルメクチンの生産に対してス
クリーニングされた．この努力はオレアンドロースの合
或あるいはアベルメクチンアグリコンへの転移に欠損の
ある突然変異体株の数を相補する約２４ｋｂのインサー
トを含むブラスξドｐＶＥ６５０を分離することになっ
た。表２はｐＶＩｌ！６５０が２１個のアグリコン生産
突然変異体の欠損を相補することを示すが５個のアグリ
コン生産突然変異体は相補されずこれはいくつかのグリ
コシル化遺伝子がこのクローン化領域の外側にあること
を示している。
得られた菌株はＭＡ６６１９と呼ばれ、ＡＴＣＣ ６７
８２０としてアメリカンタイプカルチュアコレクション
、１２３０１パークラウンＤｒ−＋ ロックビル．
Ｍｄ．２０８５２に寄託されている． ＯＭＴ遺伝子はｐＡＴＩ ＢａｍＨ Ｉ断片をｐｌＪ９
２２にサブクローン化して局在させ次いで形質転換及び
相補性分析が行なわれる。３． ４ ｋｂ ＢａｍＨ
Ｉ断片を含むサブクローンｐＡＴ８３はＭＡ６２３３
（ＯＭＴ− ）を相補することができ遺伝子地図はこの
断片の範囲内であることを示す． オレアンドロースム び は 伝 のクローニ
ング ｐＡＴ１の分離に続いて、他のアベルメクチン突然変異
体を相補するプラスミドを分離するためにスクリーニン
グが行なわれた．ｐＩＪ９２２ライブラリーのアリコー
トがＭＡ６２７８ （ＡＧＬ− 、ＯＭＴ”− ）に形
質転換された．形質転換細胞（ｔｒａｎｓｆｏｒｗａｎ
ｔｓ）はグリコシル化アベルメクチンの生産に対してス
クリーニングされた．この努力はオレアンドロースの合
或あるいはアベルメクチンアグリコンへの転移に欠損の
ある突然変異体株の数を相補する約２４ｋｂのインサー
トを含むブラスξドｐＶＥ６５０を分離することになっ
た。表２はｐＶＩｌ！６５０が２１個のアグリコン生産
突然変異体の欠損を相補することを示すが５個のアグリ
コン生産突然変異体は相補されずこれはいくつかのグリ
コシル化遺伝子がこのクローン化領域の外側にあること
を示している。
ｐＶＥ６５０あるいはｐＡＴ１のいずれもアベルメクチ
ン非生産突然変異体又はＧＭＴ一突然変異体を相補しな
かった。制限地図はｐＶ［！６５０インサートに対して
作られ（第２図）、表４は制限部位の場所を示す．ｐＡ
Ｔ１の地図との比較は、２つのクローン間に共通の断片
を示さない。このプラスミドはＳ．リビダンスに導入さ
れ得られた菌株はＭＡ６６１８と呼ばれる。
ン非生産突然変異体又はＧＭＴ一突然変異体を相補しな
かった。制限地図はｐＶ［！６５０インサートに対して
作られ（第２図）、表４は制限部位の場所を示す．ｐＡ
Ｔ１の地図との比較は、２つのクローン間に共通の断片
を示さない。このプラスミドはＳ．リビダンスに導入さ
れ得られた菌株はＭＡ６６１８と呼ばれる。
この菌株は＾ＴＣＣ ６７８１９として寄託されている
。
。
ＶＥ６５０の ＼
オレアンドロース合戒又は付加に関連する３個のアベル
メクチン遺伝子がｐＶＥ６５０、及び２つのサブクロー
ンを用いて相補性研究により同定されている。ｐＶＥ６
５０はオレアンドロースのアベルメクチンへの合威及び
／又は付加のための遺伝子を含有するＳ．アベルξチリ
スＤＮＡの２４ｋｂインサートを有するプラスミドであ
る。サブクローンｐＶＢ８０６はＢａｗｌ Ｉ部位にク
ローン化した４． ２ ８ ｋｂＢｇｌ ＩＩ断片を有
するｐｌＪ９２２であり、いくつかのアグリコン生産突
然変異体を相補することが見い出されている（表２の分
類Ｉ）。別のサブクローン、ｐＶＥ８０７は、ｐｌＪ９
２２のＢａｍＨ １部位に挿入された２．５ ６ｋｂ
ＢｇｌＩＩ断片からなり他の突然変異体を相補した（分
類■）．分類■はｐＶＥ６５０によって相補される突然
変異体からなるが試験したサブクローンによっては相補
されなかった。各々の種類は１個以上の遺伝子を含むこ
とが極めて可能である。
メクチン遺伝子がｐＶＥ６５０、及び２つのサブクロー
ンを用いて相補性研究により同定されている。ｐＶＥ６
５０はオレアンドロースのアベルメクチンへの合威及び
／又は付加のための遺伝子を含有するＳ．アベルξチリ
スＤＮＡの２４ｋｂインサートを有するプラスミドであ
る。サブクローンｐＶＢ８０６はＢａｗｌ Ｉ部位にク
ローン化した４． ２ ８ ｋｂＢｇｌ ＩＩ断片を有
するｐｌＪ９２２であり、いくつかのアグリコン生産突
然変異体を相補することが見い出されている（表２の分
類Ｉ）。別のサブクローン、ｐＶＥ８０７は、ｐｌＪ９
２２のＢａｍＨ １部位に挿入された２．５ ６ｋｂ
ＢｇｌＩＩ断片からなり他の突然変異体を相補した（分
類■）．分類■はｐＶＥ６５０によって相補される突然
変異体からなるが試験したサブクローンによっては相補
されなかった。各々の種類は１個以上の遺伝子を含むこ
とが極めて可能である。
表 ２
Ｓ．アベルミチリスアベルメクチンアグリコン生産突然
変異体の相補性分類 突然変異体 ｐＶＥ６５０’
ｐＶＥ９０８ ｐＶＥ８０７ ｐＶＥ９４１ ｐ
ＶＥ１０１８ ｐＶＥ１４２０ ｐＶＥｌ１Ｐ６ ＩＶＭＡωｑ，ＭＡ６Ｇ２２， ＋ ｝ ｖＭＡ６５９０ ＋ ÷ ＋ Ｖｌ ａ，ＭＡ６５９４ ＋ ＋ ＋ ＧＭＴ ＭＡ６３１６．ＭＡ６３２３＋ １示されたブラスミドは突然変異体に形質転換さわ、少
なくとも６個の形質転換１ｌｌ胞がアベルメクチン生産
に拭験された，ベクター単逐ψＩＪ９２２は突然変異体
に導入され負の対照として検定された． 分類Ｉの突然変異体は、ｐＶＥ６５０の別のサブクロー
ンによって試験されている．分類Ｉの突然変異体を相補
する１つのサブクローンとしてはｐｌＪ９２２に１方向
（ｏｎｅ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ） （ｐＶＥ８０Ｂ
）でクローン化したとき４． ０ ５ ｋｂ ＥｃｏＲ
Ｉ断片であった。しかしながら他の方向（ｐＶＢ８１
Ｂ）でクローン化したときアベルメクチンのアグリコン
及びグリコシル化形の両方を含む一部相補あるいは混合
ＴＬＣパターンが見られる。これは相補性よりむしろ欠
損を補正する組換えの結果であることができる。他方、
分類Ｉの突然変異体の欠損を相補する遺伝子はｐＶＥ８
１Ｂから十分に表現されず、完全にグリコシル化された
アベルメクチンを生産するために必要なタンパク質の量
が不十分であるかもしれない。
変異体の相補性分類 突然変異体 ｐＶＥ６５０’
ｐＶＥ９０８ ｐＶＥ８０７ ｐＶＥ９４１ ｐ
ＶＥ１０１８ ｐＶＥ１４２０ ｐＶＥｌ１Ｐ６ ＩＶＭＡωｑ，ＭＡ６Ｇ２２， ＋ ｝ ｖＭＡ６５９０ ＋ ÷ ＋ Ｖｌ ａ，ＭＡ６５９４ ＋ ＋ ＋ ＧＭＴ ＭＡ６３１６．ＭＡ６３２３＋ １示されたブラスミドは突然変異体に形質転換さわ、少
なくとも６個の形質転換１ｌｌ胞がアベルメクチン生産
に拭験された，ベクター単逐ψＩＪ９２２は突然変異体
に導入され負の対照として検定された． 分類Ｉの突然変異体は、ｐＶＥ６５０の別のサブクロー
ンによって試験されている．分類Ｉの突然変異体を相補
する１つのサブクローンとしてはｐｌＪ９２２に１方向
（ｏｎｅ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ） （ｐＶＥ８０Ｂ
）でクローン化したとき４． ０ ５ ｋｂ ＥｃｏＲ
Ｉ断片であった。しかしながら他の方向（ｐＶＢ８１
Ｂ）でクローン化したときアベルメクチンのアグリコン
及びグリコシル化形の両方を含む一部相補あるいは混合
ＴＬＣパターンが見られる。これは相補性よりむしろ欠
損を補正する組換えの結果であることができる。他方、
分類Ｉの突然変異体の欠損を相補する遺伝子はｐＶＥ８
１Ｂから十分に表現されず、完全にグリコシル化された
アベルメクチンを生産するために必要なタンパク質の量
が不十分であるかもしれない。
これがそうであるならば、これらの遺伝子のプロモータ
ーはｐＶ［！６５０地図上１ ７．７ ５ｋｂ（７）
ＢｇｌＩ１部位と１９．６７ｋｂのＥｃｏＲ １部位の
間に位置することを示すことができる。２． ３ ６ｋ
ｂ ＥｃｏＲ ｌ − Ｂｇｌ ＩＩ断片がｐｌＪ９０
８を生じるｐｌＪ９２２でクローン化されるとき、分ｉ
ｆの突然変異体も相補され、これらの突然変異体の欠損
を補正するための情報が全てこの断片の範囲内で位置さ
れることを示している。
ーはｐＶ［！６５０地図上１ ７．７ ５ｋｂ（７）
ＢｇｌＩ１部位と１９．６７ｋｂのＥｃｏＲ １部位の
間に位置することを示すことができる。２． ３ ６ｋ
ｂ ＥｃｏＲ ｌ − Ｂｇｌ ＩＩ断片がｐｌＪ９０
８を生じるｐｌＪ９２２でクローン化されるとき、分ｉ
ｆの突然変異体も相補され、これらの突然変異体の欠損
を補正するための情報が全てこの断片の範囲内で位置さ
れることを示している。
分ＩＩで表わされる遺伝子はａｖｒＣと呼ばれる．分１
ｎの突然変異体は２．５ ６ｋｂ ＢｇｌＩＩ断片を有
するｐＴＪ９２２であるｐＶＥ８０７によって補正され
る。分類■の突然変異体によって表わされる遺伝子は藍
迎と呼ばれる。
ｎの突然変異体は２．５ ６ｋｂ ＢｇｌＩＩ断片を有
するｐＴＪ９２２であるｐＶＥ８０７によって補正され
る。分類■の突然変異体によって表わされる遺伝子は藍
迎と呼ばれる。
分類■の突然変異体はｐＶＥ６５０によって相補される
だけである。相補性はｐＶＥ８０８、ｐＶＥ８０６、ｐ
ＶＥ８０７あるいはｐＶＥ８４５を用いても見られない
。ｐＶＥ８４５はＥｃｏＲ １部位で挿入されたｐＶＥ
６５０の１９．６７ｋｂＥｃｏＲ Ｉ断片を有するｐＩ
Ｊ９２２の誘導体（第２図）である。ｐＶＥ８４５、ｐ
ＶＥ８０６、ｐＶＥ８０７及びｐＶ１！８０ＢはｐＶＥ
６５０の配列を全て含有する。これらのクローンはいず
れも分類■の突然変異体を相補しないために分類四の突
然変異体によって表わされる遺伝子又はオペロンはこれ
らのプラスミドによる重なりの領域をスピンするに違い
ない。分１ｍの突然変異体によって表わされる遺伝子は
ａｖｒＢと呼ばれる．５個のアグリコン生産突然変異体
はｐＶＥ６５０によって相補されない。オレアンドロー
ス合或又は付加に対して少なくとも３個の遺伝子のクラ
スターがｐＶＥ６５０に位置し、このクラスターがｐＶ
ｌｌ！６５０のインサートＤＮＡの一方の末端に作られ
るためにオレアンドロース合成又は付加に対して他の遺
伝子はｐＶＥ６５０のインサートに隣接して染色体上に
位置する。後述の通り、この領域を含むコスミドクロー
ンは分離されｐＶＥ６５０地図（７）２２．０ ３ｋｂ
（７） ＢｇｌｌＩ部位で開始し、およそ１４ｋｂ更に
伸びてぃるｐＶＥ６５０の領域を含むＢｇｌｆｆ断片が
同定される。このＢｇｌ Ｉｆ断片はｐＩＪ９２２にサ
ブクローン化されてブラスξドｐＶＥ９４１を生しる。
だけである。相補性はｐＶＥ８０８、ｐＶＥ８０６、ｐ
ＶＥ８０７あるいはｐＶＥ８４５を用いても見られない
。ｐＶＥ８４５はＥｃｏＲ １部位で挿入されたｐＶＥ
６５０の１９．６７ｋｂＥｃｏＲ Ｉ断片を有するｐＩ
Ｊ９２２の誘導体（第２図）である。ｐＶＥ８４５、ｐ
ＶＥ８０６、ｐＶＥ８０７及びｐＶ１！８０ＢはｐＶＥ
６５０の配列を全て含有する。これらのクローンはいず
れも分類■の突然変異体を相補しないために分類四の突
然変異体によって表わされる遺伝子又はオペロンはこれ
らのプラスミドによる重なりの領域をスピンするに違い
ない。分１ｍの突然変異体によって表わされる遺伝子は
ａｖｒＢと呼ばれる．５個のアグリコン生産突然変異体
はｐＶＥ６５０によって相補されない。オレアンドロー
ス合或又は付加に対して少なくとも３個の遺伝子のクラ
スターがｐＶＥ６５０に位置し、このクラスターがｐＶ
ｌｌ！６５０のインサートＤＮＡの一方の末端に作られ
るためにオレアンドロース合成又は付加に対して他の遺
伝子はｐＶＥ６５０のインサートに隣接して染色体上に
位置する。後述の通り、この領域を含むコスミドクロー
ンは分離されｐＶＥ６５０地図（７）２２．０ ３ｋｂ
（７） ＢｇｌｌＩ部位で開始し、およそ１４ｋｂ更に
伸びてぃるｐＶＥ６５０の領域を含むＢｇｌｆｆ断片が
同定される。このＢｇｌ Ｉｆ断片はｐＩＪ９２２にサ
ブクローン化されてブラスξドｐＶＥ９４１を生しる。
このプラスξドはｐＶＥ６５０によって相補されないア
グリコン生産突然変異体を相補することが見い出されて
いる。更にｐＶＩｌ！９４１はＧＭＴ一菌株、ＭＡ ６
３１６を相補し、と社と呼ばれるＴＤＰ−デメチルーオ
レアンドロース３−０一メチルトランスフエラーゼに対
する遺伝子もこの断片上にあることを示している。
グリコン生産突然変異体を相補することが見い出されて
いる。更にｐＶＩｌ！９４１はＧＭＴ一菌株、ＭＡ ６
３１６を相補し、と社と呼ばれるＴＤＰ−デメチルーオ
レアンドロース３−０一メチルトランスフエラーゼに対
する遺伝子もこの断片上にあることを示している。
ｐＶＥ６５０制限フラグメント及びゲノムＤＮＡのサザ
ンハイブリソド形戒分析はｐＶＥ６５０のインサートＤ
ＮＡが染色体と共同線状でありインサート内に反復又は
関連配列の２つのグループがあることを示唆している，
ｐＶＥ６５０の１０個のＢａｓ＋Ｈ １断片の３つか
ら作られるプローブ（２． ２ ２ｋｂ， １． ０
９ｋｂ及び０． ５ ３ ｋｂ ＢａｓＨ Ｉ断片）は
染色体あるいはｐＶＥ６５０の単一断片だけを用いてハ
イブリッド形戒する。グループ１はｐＶＥ６５０の１個
のＢａｍＨ Ｉ断片（２．０ ９ｓｔｂ） 、１個のｐ
ＡＴ１の断片（０．５５ｋｂＢａｍＨ Ｉ ）及び５個
の他の染色体断片からなる．第２グループの関連配列の
Ｂａ＋ｍＨ Ｉから作られるプローブ、グループ２はそ
れ自体並びにｐＶＥ６５０の４個のＢａｇ｝ｌ Ｉ断片
（７． Ｏ ｋｂ， ４． ６ ｋｂ， ３． Ｏ ｋ
ｂ、１．８２ｋｂ及び１． ３ ８ ｋｂ ＢａｓＨ
Ｉ断片〉及びｐＡＴ１の１個のＢａｔａＨ Ｔ断片を含
む９個の他の染色体ＢａｍＨ Ｉ断片（２． １ ｋｂ
Ｂａ＋＊Ｈ Ｉ断片〉を用いてハイブリッド形成する
。ハイブリッド形威バンドの相対強度によって示される
相同性の程度は、各グループ内のクローン化した断片が
これらの関連配列中の不正確な配列相同性を示すプロー
ブであることによって著しく異なっていた． １１０ｋｂアベルメクチン クース − ４゛上述
の通り、５個のアグリコン生産突然変異体はｐＶＥ６５
０によって相補されない。ｐＶＥ６５０の相補領域は、
クローンの一端に位置するために他のアベルメクチン遺
伝子は隣接した染色体ＤＮＡに位置されることが可能で
ある。ｐＶＥ６５０の１．０９ｋｂＢａｍＨ １断片（
表４）はＳ．アベルξチリスＤＮＡのコスミドライブラ
リーをプロープするために用いられる． １．０ ９ｋ
ｂ Ｂａ＊ＨＩ断片を重ねたこれらのクローンの７個か
らのＤＮＡはｐＶＥ６５０の異なるＢａｍＨ Ｉ断片に
関して地図が作られた。コス累ドｐＶｕ８５５はｐｖｇ
ｓｓｏのＤＮＡ全部と両側に隣接したＤＮＡを含む。別
のコスミドｐＶＥ８５９はアグリコン突然変異体を相補
するｐＶＥ６５０の領域を過ぎて少なくとも２６ｋｂ伸
びている（アベルメクチンＯ−メチルトランスフェラー
ゼに対する遺伝子ａｖｒＡがなイ） ． ｐＶＥ６５０
ニ隣接した少なくとも３１ｋｂ（７）ＤＮＡはクローン
化された。
ンハイブリソド形戒分析はｐＶＥ６５０のインサートＤ
ＮＡが染色体と共同線状でありインサート内に反復又は
関連配列の２つのグループがあることを示唆している，
ｐＶＥ６５０の１０個のＢａｓ＋Ｈ １断片の３つか
ら作られるプローブ（２． ２ ２ｋｂ， １． ０
９ｋｂ及び０． ５ ３ ｋｂ ＢａｓＨ Ｉ断片）は
染色体あるいはｐＶＥ６５０の単一断片だけを用いてハ
イブリッド形戒する。グループ１はｐＶＥ６５０の１個
のＢａｍＨ Ｉ断片（２．０ ９ｓｔｂ） 、１個のｐ
ＡＴ１の断片（０．５５ｋｂＢａｍＨ Ｉ ）及び５個
の他の染色体断片からなる．第２グループの関連配列の
Ｂａ＋ｍＨ Ｉから作られるプローブ、グループ２はそ
れ自体並びにｐＶＥ６５０の４個のＢａｇ｝ｌ Ｉ断片
（７． Ｏ ｋｂ， ４． ６ ｋｂ， ３． Ｏ ｋ
ｂ、１．８２ｋｂ及び１． ３ ８ ｋｂ ＢａｓＨ
Ｉ断片〉及びｐＡＴ１の１個のＢａｔａＨ Ｔ断片を含
む９個の他の染色体ＢａｍＨ Ｉ断片（２． １ ｋｂ
Ｂａ＋＊Ｈ Ｉ断片〉を用いてハイブリッド形成する
。ハイブリッド形威バンドの相対強度によって示される
相同性の程度は、各グループ内のクローン化した断片が
これらの関連配列中の不正確な配列相同性を示すプロー
ブであることによって著しく異なっていた． １１０ｋｂアベルメクチン クース − ４゛上述
の通り、５個のアグリコン生産突然変異体はｐＶＥ６５
０によって相補されない。ｐＶＥ６５０の相補領域は、
クローンの一端に位置するために他のアベルメクチン遺
伝子は隣接した染色体ＤＮＡに位置されることが可能で
ある。ｐＶＥ６５０の１．０９ｋｂＢａｍＨ １断片（
表４）はＳ．アベルξチリスＤＮＡのコスミドライブラ
リーをプロープするために用いられる． １．０ ９ｋ
ｂ Ｂａ＊ＨＩ断片を重ねたこれらのクローンの７個か
らのＤＮＡはｐＶＥ６５０の異なるＢａｍＨ Ｉ断片に
関して地図が作られた。コス累ドｐＶｕ８５５はｐｖｇ
ｓｓｏのＤＮＡ全部と両側に隣接したＤＮＡを含む。別
のコスミドｐＶＥ８５９はアグリコン突然変異体を相補
するｐＶＥ６５０の領域を過ぎて少なくとも２６ｋｂ伸
びている（アベルメクチンＯ−メチルトランスフェラー
ゼに対する遺伝子ａｖｒＡがなイ） ． ｐＶＥ６５０
ニ隣接した少なくとも３１ｋｂ（７）ＤＮＡはクローン
化された。
ストレプト逅セスの抗生物質合戒に対する遺伝子はしば
しばクラスターであるために、別のコス【ドクローンは
Ｓ．アベル逅チリスコスミドライブラリーをプローブす
るためにｐＶＥ６５０からの２．０９ｋｂ ＢａＨ Ｉ
断片（表４）を用いて分離された．コスξド、ｐＶｌｓ
９２４は、ａｖｒＡクローン、ｐＡＴ１とｐＶＩｉ６５
０の間で２４ｋｂのＤＮＡに及ぶ。従ってクローン化し
たアベルメクチン遺伝子、ａｖｒＡ及びアグリコン遺伝
子ａｖｒＢ，． ａｖｒＣ及びａｖｒＤは５５ｋｂに及
ぶアベルメクチン遺伝子クラスターを定義する。別のコ
スミドｐＶｌｌ！９２３はアグリコン領域のないａｖｒ
Ａ領域を過ぎて約２０ｋｂ伸びている。集団的には１１
０ｋｂ以上のＤＮＡはアベルメクチン遺伝子クラスター
領域から分離されている．これらのプラスミドはＢａｗ
ｌ Ｉ断片が１個以上のプラスミドに共通して含まれる
ことを求めることによって、プラスξドが関連配列のグ
ループ１とグループ２のＢａｓＨ Ｉ断片を含むことを
決定するサザン分析によって、種々のプラスミドからの
いくつかの断片のプラスξドの存在を試験するサザン分
析により互いに関係する地図が作られた＠ ｐＡＴ１、
ｐＶＥ６５０及びコスξドクローンの相対的な位置は第
３図に示される。
しばクラスターであるために、別のコス【ドクローンは
Ｓ．アベル逅チリスコスミドライブラリーをプローブす
るためにｐＶＥ６５０からの２．０９ｋｂ ＢａＨ Ｉ
断片（表４）を用いて分離された．コスξド、ｐＶｌｓ
９２４は、ａｖｒＡクローン、ｐＡＴ１とｐＶＩｉ６５
０の間で２４ｋｂのＤＮＡに及ぶ。従ってクローン化し
たアベルメクチン遺伝子、ａｖｒＡ及びアグリコン遺伝
子ａｖｒＢ，． ａｖｒＣ及びａｖｒＤは５５ｋｂに及
ぶアベルメクチン遺伝子クラスターを定義する。別のコ
スミドｐＶｌｌ！９２３はアグリコン領域のないａｖｒ
Ａ領域を過ぎて約２０ｋｂ伸びている。集団的には１１
０ｋｂ以上のＤＮＡはアベルメクチン遺伝子クラスター
領域から分離されている．これらのプラスミドはＢａｗ
ｌ Ｉ断片が１個以上のプラスミドに共通して含まれる
ことを求めることによって、プラスξドが関連配列のグ
ループ１とグループ２のＢａｓＨ Ｉ断片を含むことを
決定するサザン分析によって、種々のプラスミドからの
いくつかの断片のプラスξドの存在を試験するサザン分
析により互いに関係する地図が作られた＠ ｐＡＴ１、
ｐＶＥ６５０及びコスξドクローンの相対的な位置は第
３図に示される。
ｐＶＥ８５９は約０． ９ｋｂ， １． ８ｋｂ，
４． ７ｋｂ， ５． ４ｋｂ，１４ｋｂ及び１８ｋｂ
の６個のＢｇｌ ＩＩ断片を含む。
４． ７ｋｂ， ５． ４ｋｂ，１４ｋｂ及び１８ｋｂ
の６個のＢｇｌ ＩＩ断片を含む。
１４ｋｂ断片はｐＶＥ６１６（７） ユニー クなＢｇ
ＩｎにクＯ一ン化されｐＢＲ３２２の４． ２ ｋｂ
Ａｓ＋ｐ’ Ｔｈｉｏ’誘導体はユニークなＢａａ＋ｌ
Ｉ Ｉ、Ｂｇ ＩＩＩ、Ｐｓｔｌ及びＩｆｐａｌクロー
ニング部位を有する。ｐＶＥ６１６はストレプトミセス
で複製することができないが、相同ＤＮＡを含む場合、
Ｔｈｉｏ’誘導体を生じる組換えによってゲノムに組込
むことができる。ＢｇＩ ｎ断片を含む誘導体、ｐＶＥ
９３０はＢｇｌ ＩＩとＥｃｏＲ Ｉ制限酵素の混合物
で消化され、同じ酵素混合物で消化したｐＶＥ６５０
Ｄ Ｎ Ａと比較された．アガロースゲルで分離し、Ｕ
Ｖ照射で可視化した後、ｐＶＥ６５０及びｐＶＥ９３０
が同時移動する１． ５ ５ｋｂ Ｂｇｌ ｎ − Ｅ
ｃｏＲ Ｉ断片を含有することが認められた。これはＳ
．アベルξチリスのゲノムに於てｐＶＥ８５９でクロー
ン化しｋ ｌ ４ｋｂ ＢｇｌＩＩ断片がｐＶＥ６５０
”ｉ？クローン化した０． １ ４ｋｂ Ｂｇｉｎ断片
に隣接することを決定する。
ＩｎにクＯ一ン化されｐＢＲ３２２の４． ２ ｋｂ
Ａｓ＋ｐ’ Ｔｈｉｏ’誘導体はユニークなＢａａ＋ｌ
Ｉ Ｉ、Ｂｇ ＩＩＩ、Ｐｓｔｌ及びＩｆｐａｌクロー
ニング部位を有する。ｐＶＥ６１６はストレプトミセス
で複製することができないが、相同ＤＮＡを含む場合、
Ｔｈｉｏ’誘導体を生じる組換えによってゲノムに組込
むことができる。ＢｇＩ ｎ断片を含む誘導体、ｐＶＥ
９３０はＢｇｌ ＩＩとＥｃｏＲ Ｉ制限酵素の混合物
で消化され、同じ酵素混合物で消化したｐＶＥ６５０
Ｄ Ｎ Ａと比較された．アガロースゲルで分離し、Ｕ
Ｖ照射で可視化した後、ｐＶＥ６５０及びｐＶＥ９３０
が同時移動する１． ５ ５ｋｂ Ｂｇｌ ｎ − Ｅ
ｃｏＲ Ｉ断片を含有することが認められた。これはＳ
．アベルξチリスのゲノムに於てｐＶＥ８５９でクロー
ン化しｋ ｌ ４ｋｂ ＢｇｌＩＩ断片がｐＶＥ６５０
”ｉ？クローン化した０． １ ４ｋｂ Ｂｇｉｎ断片
に隣接することを決定する。
１ ４ｋｂ Ｂｇｌｎ断片は次ニｐＶＥ９４１を得るた
めニｐｌＪ９２２のＢａ＋ｓＨ １部位にサブクローン
された。このプラスミドはｐＶｆ！６５０によって相補
されないアグリコン生産突然変異体に形質転換され相補
性が認められた．またＭＡ６３１６、ＧＭＴ一突然変異
体はｐＶＥ９４１で相補され、ＧＭＴ一菌株で変化した
遺伝子はａｖｒＦと呼ばれる．従って試験されるアグリ
コン突然変異体は全てｐＶｆ！６５０及びｐＶＥ９４１
のＤＮＡによって相補されることができ、約３７ｋｂの
Ｓ．アベルミチリスＤＮＡを集団的に含む。
めニｐｌＪ９２２のＢａ＋ｓＨ １部位にサブクローン
された。このプラスミドはｐＶｆ！６５０によって相補
されないアグリコン生産突然変異体に形質転換され相補
性が認められた．またＭＡ６３１６、ＧＭＴ一突然変異
体はｐＶＥ９４１で相補され、ＧＭＴ一菌株で変化した
遺伝子はａｖｒＦと呼ばれる．従って試験されるアグリ
コン突然変異体は全てｐＶｆ！６５０及びｐＶＥ９４１
のＤＮＡによって相補されることができ、約３７ｋｂの
Ｓ．アベルミチリスＤＮＡを集団的に含む。
ｐＶＥ８５９からノ１ ２ｋｂ Ｐｓｔｌｌｌ片ハ！＝
−クナＰｓｔ１部位でｐＶＥ１０４３にサブクローンさ
れ、ｐＶＢｌ１１６を生或しテイる． ＰＶＩ！１０４
３はｐｌＪ９２２の誘導体でありＩ！ｃｏＲ １からＢ
ａｗｌ Ｉまでの領域は、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｈｐａ Ｉ、
Ｐｓｔｌ、Ｎｈｅ Ｉ ， Ａｓｅ Ｉ ，Ｈｉｎｄ
ｍ、Ｄｒａ Ｉ及びＢａｓ＋Ｈ Ｉに対してユニークな
部位を有するポリリンカーに置き換えられている．１２
ｋｂＰｓｔｌ断片を含むプラスごドｐＶＥ１１１６はア
グリコン生産全種の突然変異体及びＧＭＴ突然変異体に
導入された．表２に示されるように天然アベルメクチン
の生合威は、試験された全突然変異体で認められた。こ
のプラスごドはアベルメクチンのグリコシル化で変化す
る突然変異体全部を相補するために、恐らくアベルメク
ヂンのグリコシル化のための遺伝子全部を含有する。ま
た制限断片はｐＶＥｌ０４３にサブクローンされ、相補
性研究のために突然変異体に導入された。ρＶＥ１０１
８はｐＶＥ９４１からの４． Ｏ ｋｂ ＢａｍＨ Ｉ
断片を含有し、ｐＶＥｌ４２０はｐＶＥ１１１６からの
３． ８ ｋｂ Ｐｓｔ Ｉ − ＥｃｏＲ Ｉ断片を
含有する。結果は表２に示される。突然変異体ＭＡ６０
５７とＭＡ６６２２の欠損は虹埋と呼ばれ、ＭＡ６５９
２とＭＡ６５９４の欠損はａｖｒＧと呼ばれ、ＭＡ６５
９０の欠損はＵ』と呼ばれる。いくつかの相補性種類が
１個以上の遺伝子を含むことを見い出すことは極めて可
能である。第６図はｐＶＥ６５０、ｐＶＥ９４１及びｐ
ＶＥ１１１６の一部の制限地図及びグリコシル化に関係
する７個のアベルメクチン遺伝子の位置を示す。
−クナＰｓｔ１部位でｐＶＥ１０４３にサブクローンさ
れ、ｐＶＢｌ１１６を生或しテイる． ＰＶＩ！１０４
３はｐｌＪ９２２の誘導体でありＩ！ｃｏＲ １からＢ
ａｗｌ Ｉまでの領域は、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｈｐａ Ｉ、
Ｐｓｔｌ、Ｎｈｅ Ｉ ， Ａｓｅ Ｉ ，Ｈｉｎｄ
ｍ、Ｄｒａ Ｉ及びＢａｓ＋Ｈ Ｉに対してユニークな
部位を有するポリリンカーに置き換えられている．１２
ｋｂＰｓｔｌ断片を含むプラスごドｐＶＥ１１１６はア
グリコン生産全種の突然変異体及びＧＭＴ突然変異体に
導入された．表２に示されるように天然アベルメクチン
の生合威は、試験された全突然変異体で認められた。こ
のプラスごドはアベルメクチンのグリコシル化で変化す
る突然変異体全部を相補するために、恐らくアベルメク
ヂンのグリコシル化のための遺伝子全部を含有する。ま
た制限断片はｐＶＥｌ０４３にサブクローンされ、相補
性研究のために突然変異体に導入された。ρＶＥ１０１
８はｐＶＥ９４１からの４． Ｏ ｋｂ ＢａｍＨ Ｉ
断片を含有し、ｐＶＥｌ４２０はｐＶＥ１１１６からの
３． ８ ｋｂ Ｐｓｔ Ｉ − ＥｃｏＲ Ｉ断片を
含有する。結果は表２に示される。突然変異体ＭＡ６０
５７とＭＡ６６２２の欠損は虹埋と呼ばれ、ＭＡ６５９
２とＭＡ６５９４の欠損はａｖｒＧと呼ばれ、ＭＡ６５
９０の欠損はＵ』と呼ばれる。いくつかの相補性種類が
１個以上の遺伝子を含むことを見い出すことは極めて可
能である。第６図はｐＶＥ６５０、ｐＶＥ９４１及びｐ
ＶＥ１１１６の一部の制限地図及びグリコシル化に関係
する７個のアベルメクチン遺伝子の位置を示す。
おもしろいことに２． ０ ９ ｋｂ Ｂａｍｌｌ Ｉ
ブローブで分離されるｐＶＥ９２３は２． ０ ９ ｋ
ｂ ＢａｍＨ Ｉ断片プローブと重なるＤＮＡを含有し
ない。ブラスξドｐＶＥ９２３はグループ１の２種の関
連配列を含むため分離される．４種のプラスミドｐＶＥ
９２３、ｐＶ［！９２４、ｐＶＢ８５５及びｐＶ［！８
５９は標準手法を用いて大腸菌株に挿入されており培養
は有効性を確めるために寄託されている．４種のコス藁
ドクローンを含む４種の大腸菌株はＭＢ５３７３ （ｐ
ＶＥ９２３）と呼ばれ、ＡＴＣＣ６７８９１として寄託
され、ＭＢ５３７４ （ｐＶＥ９２４）はＡＴＣＣ６７
８９２として寄託されＭＢ５３７０ （ｐＶＥ８５５）
はＡＴＣＣ６７８８９として寄託されＭＢ５３７２ （
ｐＶＥ８５９）はＡＴＣＣ６７８９０として寄託されて
いる．これら４種のコスミド並びにｐＡＴ１及びｐＶＥ
６５０のＢａｓＨ Ｉ断片のサイズは求められており表
５に示される．コ スξドＰＶＥ９２４はｐＶＥ６５０からｐＡＴ１マｉ”
（７）領域に及んだ．抗生物質生合戒のための遺伝子は
しばしばクラスターであるために他のアベルメクチン遺
伝子はＯ−メチル化及びグリコシル化のための遺伝子に
連鎖することが可能である．この仮説を試験するために
ｐＶＥ９２４を形威するＢａｍＨ Ｉ断片はｐＶＥ６１
６、ｐＶＥ１０５３ （ｐＶｆ！６１６ノ誘導体）又
はｐＶＥ６２３（ｐｌＪ９２２の誘導体）にサブクロー
ン化された。
ブローブで分離されるｐＶＥ９２３は２． ０ ９ ｋ
ｂ ＢａｍＨ Ｉ断片プローブと重なるＤＮＡを含有し
ない。ブラスξドｐＶＥ９２３はグループ１の２種の関
連配列を含むため分離される．４種のプラスミドｐＶＥ
９２３、ｐＶ［！９２４、ｐＶＢ８５５及びｐＶ［！８
５９は標準手法を用いて大腸菌株に挿入されており培養
は有効性を確めるために寄託されている．４種のコス藁
ドクローンを含む４種の大腸菌株はＭＢ５３７３ （ｐ
ＶＥ９２３）と呼ばれ、ＡＴＣＣ６７８９１として寄託
され、ＭＢ５３７４ （ｐＶＥ９２４）はＡＴＣＣ６７
８９２として寄託されＭＢ５３７０ （ｐＶＥ８５５）
はＡＴＣＣ６７８８９として寄託されＭＢ５３７２ （
ｐＶＥ８５９）はＡＴＣＣ６７８９０として寄託されて
いる．これら４種のコスミド並びにｐＡＴ１及びｐＶＥ
６５０のＢａｓＨ Ｉ断片のサイズは求められており表
５に示される．コ スξドＰＶＥ９２４はｐＶＥ６５０からｐＡＴ１マｉ”
（７）領域に及んだ．抗生物質生合戒のための遺伝子は
しばしばクラスターであるために他のアベルメクチン遺
伝子はＯ−メチル化及びグリコシル化のための遺伝子に
連鎖することが可能である．この仮説を試験するために
ｐＶＥ９２４を形威するＢａｍＨ Ｉ断片はｐＶＥ６１
６、ｐＶＥ１０５３ （ｐＶｆ！６１６ノ誘導体）又
はｐＶＥ６２３（ｐｌＪ９２２の誘導体）にサブクロー
ン化された。
ｐＶＥ９２４はＢａｗｌ Ｉを用いて一部消化され、上
の３つのベクターのユニークなＢａａ＋Ｈ Ｉにクロー
ン化された。１個以上のＢａｗＨ Ｉ断片を含む一紐の
クローンが分離された。１個以上のＢａｎ＋ＩＩ Ｉ断
片をもつクローンからＢａｗｌ Ｉ断片の相対順序の地
図が決定された。第５図はｐＶＩｌ！９２４からのＢａ
Ｉｌｌ Ｉ断片の制限地図を表わす。
の３つのベクターのユニークなＢａａ＋Ｈ Ｉにクロー
ン化された。１個以上のＢａｗＨ Ｉ断片を含む一紐の
クローンが分離された。１個以上のＢａｎ＋ＩＩ Ｉ断
片をもつクローンからＢａｗｌ Ｉ断片の相対順序の地
図が決定された。第５図はｐＶＩｌ！９２４からのＢａ
Ｉｌｌ Ｉ断片の制限地図を表わす。
ｐＶＥ９２４のＤＮＡ並びにプ７ スＱドｐＡＴ１，
ｐＶＥ６５０及びｐＶＢ９４１を集団的に表わすｐＶＥ
９２４の５個のサブクローン〈第５図では＊で示される
）は２４個のアベルメクチン非生産菌（＾ｖｒ）、２種
のＣ−２２、Ｃ−２３デヒドラーゼ（ＤＨ）突然変異体
及びアベルメクチンフラン環（ＦＵＲ）を閉環すること
ができない突然変異体を用いて相補性実験で使用される
。Ｄ Ｈ、ＦＵＲ及び９個のＡｖｒ突然変異体を含む１
２個の突然変異体は相補された。これらの突然変異体は
８種の相補性を与える．ＤＨ突然変異体はａｖｒＩを表
わし、ＦＯＲ突然変異体はａｖｒＪを表わす。６種類の
非生産菌は藍■、藍旦、藍建、ａｖｒＮ、ａｖｒＯ及び
ａｖｒＰを表わす．これらの遺伝子の位置は第３図に示
される． これらの結果は明らかにｐＶＥ９２３、ｐＡＴ１， ｐ
ＶＥ９２４、ｐＶＥ８５５、ｐＶＥ６５０及びｐＶＥ８
５９テクｏ − ン化したＤＮＡが多くのアベルメクチ
ン遺伝子を含むことを示す。このアベルメクチン遺伝子
クラスターからのＤＮＡ全てのサブクローニングはアベ
ルメクチン生合戒のための遺伝子を同定することができ
る。
ｐＶＥ６５０及びｐＶＢ９４１を集団的に表わすｐＶＥ
９２４の５個のサブクローン〈第５図では＊で示される
）は２４個のアベルメクチン非生産菌（＾ｖｒ）、２種
のＣ−２２、Ｃ−２３デヒドラーゼ（ＤＨ）突然変異体
及びアベルメクチンフラン環（ＦＵＲ）を閉環すること
ができない突然変異体を用いて相補性実験で使用される
。Ｄ Ｈ、ＦＵＲ及び９個のＡｖｒ突然変異体を含む１
２個の突然変異体は相補された。これらの突然変異体は
８種の相補性を与える．ＤＨ突然変異体はａｖｒＩを表
わし、ＦＯＲ突然変異体はａｖｒＪを表わす。６種類の
非生産菌は藍■、藍旦、藍建、ａｖｒＮ、ａｖｒＯ及び
ａｖｒＰを表わす．これらの遺伝子の位置は第３図に示
される． これらの結果は明らかにｐＶＥ９２３、ｐＡＴ１， ｐ
ＶＥ９２４、ｐＶＥ８５５、ｐＶＥ６５０及びｐＶＥ８
５９テクｏ − ン化したＤＮＡが多くのアベルメクチ
ン遺伝子を含むことを示す。このアベルメクチン遺伝子
クラスターからのＤＮＡ全てのサブクローニングはアベ
ルメクチン生合戒のための遺伝子を同定することができ
る。
ｐＡＴ１、ｐＶＥ９２３及びｐＶＥ９２４の制限地図を
比較すると０． ５ ５ ｋｂ ＢａｍＨ Ｉ断片に隣
接した領域が３種のクローンで異なることを示す． ｐ
ＡＴ１についてＥｃｏＲ １部位を含むベクター結合断
片まで３．４ｋｂＢａｍＨ Ｔは０． ５ ５ ｋｂ
Ｂａｇ＊Ｈ Ｉ断片に隣接した位置である。ｐＶＥ９２
４についてＥｃｏＲ １部位のない３．２ｋｂＢａｖｌ
ｌ Ｉ断片は０． ５ ５ ｋｂ Ｂａｗｌ Ｉ断片に
隣接した位置にある。コスミドｐＶＥ９２３は０． ５
５ ｋｂ Ｂａｓａｌ Ｉ断片に隣接した位置にある
？． Ｏ ｋｂ ＢａｍＨ Ｉ断片を有する。アベルメ
クチン遺伝子クラスターのこの領域の実際の構造を決定
するためにＳ．アベルξチリス染色体からＤＮＡは直接
大腸菌にクローン化された． この方法は問題の領域に隣接する２つのアベルメクチン
クラスター断片を含む大腸菌ブラスミドが組込まれるＳ
．アベル果チリスの相同組換え系による。コノプラスミ
ド、ｐＶＥ１２９９はｐＡＴ１（７） ３． ４ｋｂ
ＢａｍＨ Ｉ断片を含むｐＶＥ６１６ （Ｔｈｉｏ’
）の誘導体、２．９ｋｂネオマイシン耐性遺伝子（ネオ
）断片種Ｔｎ５及びｐＶＥ９２４からの３．７ ｋｂ
Ｂａｗｌ Ｉ断片である。
比較すると０． ５ ５ ｋｂ ＢａｍＨ Ｉ断片に隣
接した領域が３種のクローンで異なることを示す． ｐ
ＡＴ１についてＥｃｏＲ １部位を含むベクター結合断
片まで３．４ｋｂＢａｍＨ Ｔは０． ５ ５ ｋｂ
Ｂａｇ＊Ｈ Ｉ断片に隣接した位置である。ｐＶＥ９２
４についてＥｃｏＲ １部位のない３．２ｋｂＢａｖｌ
ｌ Ｉ断片は０． ５ ５ ｋｂ Ｂａｗｌ Ｉ断片に
隣接した位置にある。コスミドｐＶＥ９２３は０． ５
５ ｋｂ Ｂａｓａｌ Ｉ断片に隣接した位置にある
？． Ｏ ｋｂ ＢａｍＨ Ｉ断片を有する。アベルメ
クチン遺伝子クラスターのこの領域の実際の構造を決定
するためにＳ．アベルξチリス染色体からＤＮＡは直接
大腸菌にクローン化された． この方法は問題の領域に隣接する２つのアベルメクチン
クラスター断片を含む大腸菌ブラスミドが組込まれるＳ
．アベル果チリスの相同組換え系による。コノプラスミ
ド、ｐＶＥ１２９９はｐＡＴ１（７） ３． ４ｋｂ
ＢａｍＨ Ｉ断片を含むｐＶＥ６１６ （Ｔｈｉｏ’
）の誘導体、２．９ｋｂネオマイシン耐性遺伝子（ネオ
）断片種Ｔｎ５及びｐＶＥ９２４からの３．７ ｋｂ
Ｂａｗｌ Ｉ断片である。
このベクターはＳ．アベルミチリスで複製することがで
きない．Ｓ．アベルミチリスに形質転換するときに染色
体に組込まれるプラスミドを含む形質転換細胞はＴｈｉ
ｏ’ Ｎｅｏ’として分離された。
きない．Ｓ．アベルミチリスに形質転換するときに染色
体に組込まれるプラスミドを含む形質転換細胞はＴｈｉ
ｏ’ Ｎｅｏ’として分離された。
組換えによりＳ．アベルミチリスからこのベクターを除
去した後、得られたブラスミドＤＮＡを分離し大腸菌の
形質転換で用いられた。ブラスミドは回収され、そのｎ
ｅｏ ＤＮＡはｐＶＥ１２９９ではじめにクローン化し
た２つの断片の間に位置するＳ．アベルミチリスＤＮＡ
で置き換えられた．このようなプラスミドの制限地図作
或は０．５５及び３．７ｋｂＢａｍｔｌＩ断片の間に実
際には３つの染色体Ｂａａ＋Ｈ Ｉ断片（７．０ｋｂ、
？．４ｋｂ及び８．Ｏｋｂ）があることを明らかにする
．表６はアベルメクチン遺伝子クラスター領域からの９
５ｋｂ以上のＤＮＡの制限地図を示す。
去した後、得られたブラスミドＤＮＡを分離し大腸菌の
形質転換で用いられた。ブラスミドは回収され、そのｎ
ｅｏ ＤＮＡはｐＶＥ１２９９ではじめにクローン化し
た２つの断片の間に位置するＳ．アベルミチリスＤＮＡ
で置き換えられた．このようなプラスミドの制限地図作
或は０．５５及び３．７ｋｂＢａｍｔｌＩ断片の間に実
際には３つの染色体Ｂａａ＋Ｈ Ｉ断片（７．０ｋｂ、
？．４ｋｂ及び８．Ｏｋｂ）があることを明らかにする
．表６はアベルメクチン遺伝子クラスター領域からの９
５ｋｂ以上のＤＮＡの制限地図を示す。
本出願はアベルメクチン生合威に於で遮断されたＳ．ア
ベルミチリス突然変異体を相補するために低コピー数ベ
クターを用いてアベルメクチン遺伝子の満足すべきクロ
ーニングを記載する。米国特許第４，７０３，００９号
には高コピー数ベクターでのアベルメクチン生合戒とし
てクローン遺伝子に対する方法の具体例が記載されてい
るがこの説明には欠点がある。まずこのように記載され
た高コピー数ベクターは大きな断片を用いてうまく複製
することができない。第二にこのようなＳ．アベルミチ
リスインサートを含む高コピー数ベクターは、ゲノムと
組換えをすることは明らかである。これらのプラスミド
は分離、確認することは困難である。第三に高コピー数
クローンはアベルメークチン遺伝子の制御を変え、相補
するクローンの検出を困難にさせる。
ベルミチリス突然変異体を相補するために低コピー数ベ
クターを用いてアベルメクチン遺伝子の満足すべきクロ
ーニングを記載する。米国特許第４，７０３，００９号
には高コピー数ベクターでのアベルメクチン生合戒とし
てクローン遺伝子に対する方法の具体例が記載されてい
るがこの説明には欠点がある。まずこのように記載され
た高コピー数ベクターは大きな断片を用いてうまく複製
することができない。第二にこのようなＳ．アベルミチ
リスインサートを含む高コピー数ベクターは、ゲノムと
組換えをすることは明らかである。これらのプラスミド
は分離、確認することは困難である。第三に高コピー数
クローンはアベルメークチン遺伝子の制御を変え、相補
するクローンの検出を困難にさせる。
五里牲
Ｓ．アベルξチリスからのアベルメクチン遺伝子クラス
ター領域はいくつかのプラスくドでクローン化されてお
り、アベルメクチンの新規な製造方法を提供するために
使用することができ、新規なアベルメクチンを製造する
ために使用することができハイブリッド抗生物質を提供
するために使用することができる。アベルメクチン生合
成に必要とされる遺伝子のいくつかはサブクローニング
によって局在されている。他のアベルメクチン遺伝子は
クローン化した領域内に及び／又はクローン化した領域
の近くに位置する。クローン化したＳ．アベルミチリス
Ｄ殉Ａに対して多くの用途がある。
ター領域はいくつかのプラスくドでクローン化されてお
り、アベルメクチンの新規な製造方法を提供するために
使用することができ、新規なアベルメクチンを製造する
ために使用することができハイブリッド抗生物質を提供
するために使用することができる。アベルメクチン生合
成に必要とされる遺伝子のいくつかはサブクローニング
によって局在されている。他のアベルメクチン遺伝子は
クローン化した領域内に及び／又はクローン化した領域
の近くに位置する。クローン化したＳ．アベルミチリス
Ｄ殉Ａに対して多くの用途がある。
クローン化したアベルメクチン生合威遺伝子は８種の天
然産物アベルメクチンの標準組成を変えるために使用す
ることができ、新規なプロセスを生じる。アベルメクチ
ン遺伝子クラスター領域からサブクローン化されている
Ｃ−５０−メチルトランスフェラーゼ遺伝子をＳ．アベ
ルミ′チリス株に導入するとＣ−５メトキシ威分の生産
が高められる。同様にアベルメクチンＣ−２２．Ｃ−２
３デヒドラーゼに対する遺伝子は脱水化戒分の生産を高
めるためにＳ．アベルミチリス株に導入することができ
る。
然産物アベルメクチンの標準組成を変えるために使用す
ることができ、新規なプロセスを生じる。アベルメクチ
ン遺伝子クラスター領域からサブクローン化されている
Ｃ−５０−メチルトランスフェラーゼ遺伝子をＳ．アベ
ルミ′チリス株に導入するとＣ−５メトキシ威分の生産
が高められる。同様にアベルメクチンＣ−２２．Ｃ−２
３デヒドラーゼに対する遺伝子は脱水化戒分の生産を高
めるためにＳ．アベルミチリス株に導入することができ
る。
アベルメクチン生合戒の律速段階である酵素をエンコー
ドする遺伝子のクローン化した領域からの同定はアベル
メクチンの改良された生産方法を提供するために使用す
ることができる，これは制限酵素の発現を高めるために
遺伝子をサブクローン化及び操作することにより生じる
。
ドする遺伝子のクローン化した領域からの同定はアベル
メクチンの改良された生産方法を提供するために使用す
ることができる，これは制限酵素の発現を高めるために
遺伝子をサブクローン化及び操作することにより生じる
。
新規なアベルメクチンはクローン化遺伝子の突然変異誘
発によって産生ずることができる．グリコシル化遺伝子
の突然変異誘発は優先的にモノサッカライド含有アベル
メクチンを生産する菌株を生じることができる。アベル
メクチンアグリコンの合威としての遺伝子の突然変異誘
発は新規なアベルメクチンをもたらすことができる。ア
ベルメクチンはケト基又はヒドロキシル、二重結合又は
飽和結合のような異種官能基に還元されるケト基を保持
することができる短鎖カルボン酸の逐次付加により合威
される。クローン化アベルメクチン遺伝子の突然変異誘
発は、天然アベルメクチン又は異なった官能性をもつア
ベルメクチンよりも異なるカルボン酸をもつアベルメク
チンの合威をもたらことができる． アベルメクチン遺伝子クラスター領域からのＤＮＡを相
同配列を同定するためにハイブリッド形威プローブとし
て使用することができる。従ってここでクローン化した
ＤＮＡはここで記載した領域に重なるがＳ．アベルミチ
リスのゲノムで隣接した領域からのクローン化されてい
ないＤＮＡも予め含んでいるＳ．アベルミチリス遺伝子
ライブラリーから別のプラスミドを局在させるために使
用することができる．ここでクローン化した領域からの
ＤＮＡは他の生物体に於て同一ではないが類似の配列を
同定するために使用することができる．アベルメクチン
グリコシル化としての遺伝子は他の抗生物質のグリコシ
ル化に関係する遺伝子を同定分離するために使用するこ
とができる．Ｃ一５アベルメクチンＯ−メチルトランス
フエラーゼとしての遺伝子はＤＮＡプロープとして他の
〇一メチルトランスフェラーゼ遺伝子を同定し、クロー
ニングを促進するために使用することができる。これら
の非相同遺伝子のＳ．アベル旦チリスへの導入は変化し
たメチル化又はグリコシル化による新規なアベルメクチ
ンの合戒によって強力な駆虫剤をもたらすことができる
。同様にアベルメクチンアグリコンの合戒としてのＤＮ
Ａ含有遺伝子はブローブとして同定するために次いで類
似マクロライドの配列にクローン化するために使用する
ことができる。ミルベマイシンのような他の駆虫剤とし
ての遺伝子もこの方法でクローン化することができる。
発によって産生ずることができる．グリコシル化遺伝子
の突然変異誘発は優先的にモノサッカライド含有アベル
メクチンを生産する菌株を生じることができる。アベル
メクチンアグリコンの合威としての遺伝子の突然変異誘
発は新規なアベルメクチンをもたらすことができる。ア
ベルメクチンはケト基又はヒドロキシル、二重結合又は
飽和結合のような異種官能基に還元されるケト基を保持
することができる短鎖カルボン酸の逐次付加により合威
される。クローン化アベルメクチン遺伝子の突然変異誘
発は、天然アベルメクチン又は異なった官能性をもつア
ベルメクチンよりも異なるカルボン酸をもつアベルメク
チンの合威をもたらことができる． アベルメクチン遺伝子クラスター領域からのＤＮＡを相
同配列を同定するためにハイブリッド形威プローブとし
て使用することができる。従ってここでクローン化した
ＤＮＡはここで記載した領域に重なるがＳ．アベルミチ
リスのゲノムで隣接した領域からのクローン化されてい
ないＤＮＡも予め含んでいるＳ．アベルミチリス遺伝子
ライブラリーから別のプラスミドを局在させるために使
用することができる．ここでクローン化した領域からの
ＤＮＡは他の生物体に於て同一ではないが類似の配列を
同定するために使用することができる．アベルメクチン
グリコシル化としての遺伝子は他の抗生物質のグリコシ
ル化に関係する遺伝子を同定分離するために使用するこ
とができる．Ｃ一５アベルメクチンＯ−メチルトランス
フエラーゼとしての遺伝子はＤＮＡプロープとして他の
〇一メチルトランスフェラーゼ遺伝子を同定し、クロー
ニングを促進するために使用することができる。これら
の非相同遺伝子のＳ．アベル旦チリスへの導入は変化し
たメチル化又はグリコシル化による新規なアベルメクチ
ンの合戒によって強力な駆虫剤をもたらすことができる
。同様にアベルメクチンアグリコンの合戒としてのＤＮ
Ａ含有遺伝子はブローブとして同定するために次いで類
似マクロライドの配列にクローン化するために使用する
ことができる。ミルベマイシンのような他の駆虫剤とし
ての遺伝子もこの方法でクローン化することができる。
ξルベマイシン生産菌からの適当な遺伝子による相補性
Ｓ．アベルξチリス突然変異体は強力なハイブリッド駆
虫剤化合物をもたらすことができる． 次の実施例は本発明が更に完全に理解されるように提供
され、発明を制限するものとして解釈されるべきではな
い． プラスξドＤＮＡを分離し他のブラスミドについての研
究で与えられたものとほとんど違わない操作によって処
理した。良好な操作マニュアルはＴ，？ニアチス（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ）． Ｅ， Ｆ ． フリッシュ（Ｐｒ
ｉｔｓｃｈ）及びＪ．サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ
）、モレキュラークローニング：ラボラトリー マニュ
アル コールドスプリングハーバーラボラトリー、コー
ルドスプリングハーバー、ＮＹ（１９８２年）である．
ストレプトくセスに対する良好な操作マニュアルはＤ．
Ａ，ホプウッド・Ｍ． Ｊ．ビブ（Ｂｉｂｂ） 、Ｈ
， Ｆ．チャター（Ｃｈａｔｅｒ） 、Ｔ． キーザ
ー（Ｋｉｅｓｅｒ） 、Ｃ． Ｊ，ブルトン（Ｂｒｕ
ｔｏｎ）、Ｈ．Ｍ．キーザー（Ｋｉｅｓｅｒ） 、Ｄ．
Ｊ． リジェイ｝ （Ｌｙｄｉａｔｅ）、Ｃ．Ｐ
． スミス、Ｊ，Ｍ， ワード？Ｗａｒｄ）及びＨ
．シレンブ（Ｓｃｈｒｅｔ＊ｐｆ） 、ジェネティック
マニピュレーシ甘ン オブ ストレプトξセス，ラボ
ラトリー マニエアル，ジツンイネス ファデーシッン
，ノルウィッチ，υＫ （１９８５年）である．本研究
で使用される特殊な操作は上述したマニュアルに示され
るものと一致しない場合には本明細書に記載される． Ａ、プラスミド分離のためのストレプトξセスの増殖 ストレプトミセス株の単一コロニーをＲ．’ｌＥ． 培
地Ａ又は培地Ｄで分離した．スクロース１０３ｇ，グル
コース１０ｇ，酵母エキス３ｇ１プロリン３ｇ１カサ逅
ノ酸０． １ ｇ， ＫｔＳＯ＊ ０．２ ５ ｇ，
ＭｇＣ５・６Ｈｚ０ １０−１ｇ−Ｒｘ微量元素（
１１当りＦｅＣｌｓ − ６ＨｔＯ Ｏ．２ ｇ．．Ｚ
ｎＣｌｔ Ｏ．０ ４ ｇ，ＭｎＣ１ｇ ・４Ｈｚ０
０．０ １ ｇＳＣｕＣ１ｇ ・２Ｈ！Ｏ ０．０ １
ｇ ， ＮａＢａＯ．ｆ・１０Ｈｘ０ ０． ０ １
ｇ １（ＮＨ＊）Ｊ■ｒｏｇｍ・４Ｈｔ８ ０． １
ｇ ）及び寒天１５ｇを含むＲ！ＹＥを蒸留水で最終容
量９４Ｇ−にした．オートクレープにかけた後次の溶液
、０．５％ＮＨ＃Ｐ０４ １ ０ｍｌ、２．５Ｍ Ｃａ
ＣＩｌｔ ８ｓｄ及び０． ２ ＭＴ Ｅ ＳｐＨ７．
２ （Ｎ一トリスー（ヒドロキシエチル）メチル−２
−アξノエタンスルホン酸）４０−を各量の培地に加え
た。培地Ｄは１１当り酵母エキス４ｇ、麦芽エキスｌＯ
ｇ，グルコース４ｇ，微量元素（１１当り３７．３％Ｉ
ＩＣＩ５０ｄ、ＭｇＳＯ＊ − ７Ｈｔ０ ６ １．
１ ｇ ，ＣａＣＯｓ ２．Ｏ ｇ Ｓ ＦｅＣｉ
ｌｓ ＊ ６１１＊０ ５．４ ｇ Ｓ Ｚｎ
ＳＯｎ７１１ｚ０ １．４ ４ ｇ， ＭｎＳＯａ
＠ ＨｚＯ １．１ １ ｇＳＣｕＳＯ４・５Ｈ！０
０．２ ５ ｇ， ＨｓＢＯｓ Ｏ．０ ６ ２ ｇ及
びＮａ２Ｍ。
Ｓ．アベルξチリス突然変異体は強力なハイブリッド駆
虫剤化合物をもたらすことができる． 次の実施例は本発明が更に完全に理解されるように提供
され、発明を制限するものとして解釈されるべきではな
い． プラスξドＤＮＡを分離し他のブラスミドについての研
究で与えられたものとほとんど違わない操作によって処
理した。良好な操作マニュアルはＴ，？ニアチス（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ）． Ｅ， Ｆ ． フリッシュ（Ｐｒ
ｉｔｓｃｈ）及びＪ．サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ
）、モレキュラークローニング：ラボラトリー マニュ
アル コールドスプリングハーバーラボラトリー、コー
ルドスプリングハーバー、ＮＹ（１９８２年）である．
ストレプトくセスに対する良好な操作マニュアルはＤ．
Ａ，ホプウッド・Ｍ． Ｊ．ビブ（Ｂｉｂｂ） 、Ｈ
， Ｆ．チャター（Ｃｈａｔｅｒ） 、Ｔ． キーザ
ー（Ｋｉｅｓｅｒ） 、Ｃ． Ｊ，ブルトン（Ｂｒｕ
ｔｏｎ）、Ｈ．Ｍ．キーザー（Ｋｉｅｓｅｒ） 、Ｄ．
Ｊ． リジェイ｝ （Ｌｙｄｉａｔｅ）、Ｃ．Ｐ
． スミス、Ｊ，Ｍ， ワード？Ｗａｒｄ）及びＨ
．シレンブ（Ｓｃｈｒｅｔ＊ｐｆ） 、ジェネティック
マニピュレーシ甘ン オブ ストレプトξセス，ラボ
ラトリー マニエアル，ジツンイネス ファデーシッン
，ノルウィッチ，υＫ （１９８５年）である．本研究
で使用される特殊な操作は上述したマニュアルに示され
るものと一致しない場合には本明細書に記載される． Ａ、プラスミド分離のためのストレプトξセスの増殖 ストレプトミセス株の単一コロニーをＲ．’ｌＥ． 培
地Ａ又は培地Ｄで分離した．スクロース１０３ｇ，グル
コース１０ｇ，酵母エキス３ｇ１プロリン３ｇ１カサ逅
ノ酸０． １ ｇ， ＫｔＳＯ＊ ０．２ ５ ｇ，
ＭｇＣ５・６Ｈｚ０ １０−１ｇ−Ｒｘ微量元素（
１１当りＦｅＣｌｓ − ６ＨｔＯ Ｏ．２ ｇ．．Ｚ
ｎＣｌｔ Ｏ．０ ４ ｇ，ＭｎＣ１ｇ ・４Ｈｚ０
０．０ １ ｇＳＣｕＣ１ｇ ・２Ｈ！Ｏ ０．０ １
ｇ ， ＮａＢａＯ．ｆ・１０Ｈｘ０ ０． ０ １
ｇ １（ＮＨ＊）Ｊ■ｒｏｇｍ・４Ｈｔ８ ０． １
ｇ ）及び寒天１５ｇを含むＲ！ＹＥを蒸留水で最終容
量９４Ｇ−にした．オートクレープにかけた後次の溶液
、０．５％ＮＨ＃Ｐ０４ １ ０ｍｌ、２．５Ｍ Ｃａ
ＣＩｌｔ ８ｓｄ及び０． ２ ＭＴ Ｅ ＳｐＨ７．
２ （Ｎ一トリスー（ヒドロキシエチル）メチル−２
−アξノエタンスルホン酸）４０−を各量の培地に加え
た。培地Ｄは１１当り酵母エキス４ｇ、麦芽エキスｌＯ
ｇ，グルコース４ｇ，微量元素（１１当り３７．３％Ｉ
ＩＣＩ５０ｄ、ＭｇＳＯ＊ − ７Ｈｔ０ ６ １．
１ ｇ ，ＣａＣＯｓ ２．Ｏ ｇ Ｓ ＦｅＣｉ
ｌｓ ＊ ６１１＊０ ５．４ ｇ Ｓ Ｚｎ
ＳＯｎ７１１ｚ０ １．４ ４ ｇ， ＭｎＳＯａ
＠ ＨｚＯ １．１ １ ｇＳＣｕＳＯ４・５Ｈ！０
０．２ ５ ｇ， ＨｓＢＯｓ Ｏ．０ ６ ２ ｇ及
びＮａ２Ｍ。
０，−２Ｈ！８ ０． ４ ９ ｇ） ５−を含有した
。培地ＤのＰ｝はオートクレープにかけ前にＮａＯＨを
用いてｐＨ７．０に調節した．ストレプト逅セスに対す
る液状増殖培地は３０％スクロース、５ｄＭｇＣｊ！ｘ
を含むために修飾されプラスξドの維持に選択する抗生
物質を含んだＹＥＭＥ （１ １当り酵母エキス３ｇ１
ペプトン５ｇ，麦芽エキス３ｇ１グルコース１０ｇ）で
ある．チオストレプトン耐性遺伝子（ｔｓｒ）を含むプ
ラス逅ドをもつ菌株はチオストレプトンｌ１ｌＩ１当り
５ｇで増殖した。単一コロニーを１０ｆｌｘ１５０ｍ試
験管内のＹＥＭＥ６ｍｊに接種した。培養液を２８℃で
３日間２２０ｒｐｍで振盪させながら増殖させた。
。培地ＤのＰ｝はオートクレープにかけ前にＮａＯＨを
用いてｐＨ７．０に調節した．ストレプト逅セスに対す
る液状増殖培地は３０％スクロース、５ｄＭｇＣｊ！ｘ
を含むために修飾されプラスξドの維持に選択する抗生
物質を含んだＹＥＭＥ （１ １当り酵母エキス３ｇ１
ペプトン５ｇ，麦芽エキス３ｇ１グルコース１０ｇ）で
ある．チオストレプトン耐性遺伝子（ｔｓｒ）を含むプ
ラス逅ドをもつ菌株はチオストレプトンｌ１ｌＩ１当り
５ｇで増殖した。単一コロニーを１０ｆｌｘ１５０ｍ試
験管内のＹＥＭＥ６ｍｊに接種した。培養液を２８℃で
３日間２２０ｒｐｍで振盪させながら増殖させた。
（１） 小規模プラスミド分離
小規模プラスミド調製試料としてＹＥＭＥ培養液６−か
らの菌糸を１４．０００ｘｇで１２分間遠心分離して収
集した．沈降物を１ ’０％スクロース、１０ｍＭ四酢
酸エチレンジアミン、ｐＨ８．０でｌ回洗浄した。プラ
ス≧ドＤＮＡをマクネイル（ＭａｃＮｅｉｌ） 、Ｄ，
Ｊ， Ｊ， ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｌ ｌ ５〜１２３頁（１ ９ ８ ６年）で
以前に記載されている迅速煮沸操作により菌糸から分離
した。この沈降物をＳＴＥＴ （８％スクロース、５％
トリトンｘ−ｉｏｏ、５０＋ＭＥＤＴＡ及び５０ｍＭ｝
リス、ｐＨ８． ０ ） ０． ５−に再浮遊させ、３
０■／Ｍ１リゾチーム（シグマ， Ｓｔ．ルイスＨａ．
）溶液３０ｐｌを加え、この混合液を３７℃で１５分間
温置し、次に沸騰水浴に２分間入れた．煮沸した溶解物
を１４，０００ｘｇで１２分間回転させ、上清を１．
５ ｌＩｌのエンペンドルフ管に取り除き、次いでＴＥ
（１０＋Ｍトリス．１ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．９）で予
め平衡にしたフェノールで１回抽出した．水相を別の１
．５ＩＩ１のエッペンドルフ管に取り除き、同量のイソ
プロパノールを加えこの溶液を−２０℃で２０分間温置
し、ＤＮＡを７０００ｘｇで６分間ＤＮＡを沈降させた
．７０％エタノールで１回洗浄した後、ＤＮＡをＴＥＩ
ＯＯμｌで再浮遊させた．推定２〜１０μｇのプラスξ
ドＤＮＡが６ＩＩＩ１の培養液から得られた．他方、プ
ラスξドＤＮＡを細胞沈降物６ｍからアルカリ性溶解操
作により分離した．この細胞沈降物を５０ｍＭグルコー
ス、２５ｗＭトリスｐ８８、１０＋ＭＥＤＴＡの１ａ１
に再浮遊させ、５０一Ｈグノレコース、２５一阿トリス
ｐｕｓ、１０ＩＩＩＭＥＤＴＡ中３０■／ｄリゾチーム
溶液’５０ｕｌ．を加えた。
らの菌糸を１４．０００ｘｇで１２分間遠心分離して収
集した．沈降物を１ ’０％スクロース、１０ｍＭ四酢
酸エチレンジアミン、ｐＨ８．０でｌ回洗浄した。プラ
ス≧ドＤＮＡをマクネイル（ＭａｃＮｅｉｌ） 、Ｄ，
Ｊ， Ｊ， ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｌ ｌ ５〜１２３頁（１ ９ ８ ６年）で
以前に記載されている迅速煮沸操作により菌糸から分離
した。この沈降物をＳＴＥＴ （８％スクロース、５％
トリトンｘ−ｉｏｏ、５０＋ＭＥＤＴＡ及び５０ｍＭ｝
リス、ｐＨ８． ０ ） ０． ５−に再浮遊させ、３
０■／Ｍ１リゾチーム（シグマ， Ｓｔ．ルイスＨａ．
）溶液３０ｐｌを加え、この混合液を３７℃で１５分間
温置し、次に沸騰水浴に２分間入れた．煮沸した溶解物
を１４，０００ｘｇで１２分間回転させ、上清を１．
５ ｌＩｌのエンペンドルフ管に取り除き、次いでＴＥ
（１０＋Ｍトリス．１ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．９）で予
め平衡にしたフェノールで１回抽出した．水相を別の１
．５ＩＩ１のエッペンドルフ管に取り除き、同量のイソ
プロパノールを加えこの溶液を−２０℃で２０分間温置
し、ＤＮＡを７０００ｘｇで６分間ＤＮＡを沈降させた
．７０％エタノールで１回洗浄した後、ＤＮＡをＴＥＩ
ＯＯμｌで再浮遊させた．推定２〜１０μｇのプラスξ
ドＤＮＡが６ＩＩＩ１の培養液から得られた．他方、プ
ラスξドＤＮＡを細胞沈降物６ｍからアルカリ性溶解操
作により分離した．この細胞沈降物を５０ｍＭグルコー
ス、２５ｗＭトリスｐ８８、１０＋ＭＥＤＴＡの１ａ１
に再浮遊させ、５０一Ｈグノレコース、２５一阿トリス
ｐｕｓ、１０ＩＩＩＭＥＤＴＡ中３０■／ｄリゾチーム
溶液’５０ｕｌ．を加えた。
３７℃で１５分間温置した後、０． ２Ｎ ＮａＯＨ，
１％ＳＤＳ溶液１．５ｍｌを加え、混合液を５秒間旋
回させ、この混合液を氷上で１５分間温置した．次に氷
冷却ＰＨ４．８酢酸カリウム溶液（酢酸塩について５Ｍ
，カリウムについて３Ｍ）１５０ｔＩｆを加え、この混
合液を１０秒間旋回させ、氷上で１５分間温置した．こ
の混合液を４℃に於て１２．０００ｘｇで１５分間遠心
分離し、得られた上滑を新しい管に移した．−２０℃の
イソブロパノール又は０．０５％ジエチルピロカーボネ
ートを含むイソプロパノール２．５−を加え、混合し、
４℃に於て１２．０００ｘｇで１５分間遠心分離した．
得られたＤＮＡ沈降物からの残りの溶媒をサバンドスピ
ードバク（ＳａｖａｎｔＳｐｅｅｄ Ｖａｃ）に取り除
き、ＤＮＡを０．３Ｍ酢酸アンモニウム０． ５ ｍに
溶解した．この溶液を１．５−のエッペンドルフ管に移
し、ＩＭ｝リスｐＨ７．９で予め平衡にしたフェノール
４００μｌと混合し、水相をξクロフェージで３分間遠
心分離により分離した。この水相を別のエソベンドルフ
管に取り除き、フェノールをクロロホルム４００μｌで
抽出した．得られたＤＮＡ水溶液を２容量のエタノール
を用いて−７０℃で少なくとも２０分間沈殿させた．こ
のＤＮＡをミクロフェージで１５分間遠心分離して収集
し、−２０℃の７０％エタノールで１回洗浄し、サバン
トスピードバクで乾燥させ、ＴＥｗｉ街液１００μｉに
再浮遊させた．（２）大規模プラスミド分離 大規模プラスξド分離に対してＹＥＭＥ培養液６−を使
用してＹＥＭＥ３（ｌｄを含む２５０ｄのバンフル付き
フラスコに接種した。２８℃に於て２２０ｒｐ−で２日
間振盪させた後この培養液を使用してＹＥＭＥ５ ０
０ｉｄを含む２ｌのバンフル付きフラスコを接種した。
１％ＳＤＳ溶液１．５ｍｌを加え、混合液を５秒間旋
回させ、この混合液を氷上で１５分間温置した．次に氷
冷却ＰＨ４．８酢酸カリウム溶液（酢酸塩について５Ｍ
，カリウムについて３Ｍ）１５０ｔＩｆを加え、この混
合液を１０秒間旋回させ、氷上で１５分間温置した．こ
の混合液を４℃に於て１２．０００ｘｇで１５分間遠心
分離し、得られた上滑を新しい管に移した．−２０℃の
イソブロパノール又は０．０５％ジエチルピロカーボネ
ートを含むイソプロパノール２．５−を加え、混合し、
４℃に於て１２．０００ｘｇで１５分間遠心分離した．
得られたＤＮＡ沈降物からの残りの溶媒をサバンドスピ
ードバク（ＳａｖａｎｔＳｐｅｅｄ Ｖａｃ）に取り除
き、ＤＮＡを０．３Ｍ酢酸アンモニウム０． ５ ｍに
溶解した．この溶液を１．５−のエッペンドルフ管に移
し、ＩＭ｝リスｐＨ７．９で予め平衡にしたフェノール
４００μｌと混合し、水相をξクロフェージで３分間遠
心分離により分離した。この水相を別のエソベンドルフ
管に取り除き、フェノールをクロロホルム４００μｌで
抽出した．得られたＤＮＡ水溶液を２容量のエタノール
を用いて−７０℃で少なくとも２０分間沈殿させた．こ
のＤＮＡをミクロフェージで１５分間遠心分離して収集
し、−２０℃の７０％エタノールで１回洗浄し、サバン
トスピードバクで乾燥させ、ＴＥｗｉ街液１００μｉに
再浮遊させた．（２）大規模プラスミド分離 大規模プラスξド分離に対してＹＥＭＥ培養液６−を使
用してＹＥＭＥ３（ｌｄを含む２５０ｄのバンフル付き
フラスコに接種した。２８℃に於て２２０ｒｐ−で２日
間振盪させた後この培養液を使用してＹＥＭＥ５ ０
０ｉｄを含む２ｌのバンフル付きフラスコを接種した。
４， ０００ｘｇで１５分間遠心分離により菌糸を収集
してｌＯ％スクロース、１０ａ＋Ｉ’ｌＥＤＴＡで１回
洗浄した、プラスミドＤＮＡを２方法のいずれかで菌糸
から分離した。第１方法は上記マクネイル、Ｄ．Ｊ．１
９８６年で以前に記載された迅速煮沸操作である。この
細胞沈降物をＳＴＥＴ４ ０１Ｉｄに再浮遊させ、０．
１ Ｍ トリスＰＨ７．９中５０■／ｌＩ１リゾチー
ム溶液０． ５−を加えた．この浮遊液を３７℃で２０
分間温置し、沸騰水浴に３分間入れ、４℃で３０分間９
０．０００ ｘｇにて遠心分離した．上滑を除き、％容
量の−２０℃イソプロパノールを加え、混合し、−２０
℃で２０分間温置した。ＤＮＡを９．０００ｘｇで８分
間遠心分離により収集した。ＣｓＣＩｌ７８ｇを０．
１ Ｍ ｌ−リス６５ｍ、０．０ １Ｍ ＥＤＴＡ，
ｐｌ＋７．９に溶解し、臭化エチジウム（５■／ａｔ）
２ｍｌを加えて調製したＣｓＣ Ｉｔ溶液１３１ｄにこ
のＤＮＡを再浮遊させた．この混合液をベックマン超遠
心機で４３． ＯＯＯｒｐ■により４４時間遠心分離し
た、プラスミドＤＮＡを分離す・る第２方法は上記マニ
アチス等、１９８２年に記載されるアルカリ性溶解操作
の変法である．５００−の細胞沈降物を５０−Ｍグルコ
ース、２５ｓＭ｝リスｐＨ８、１ ０ｍＭＥＤＴＡ３
０ｄｌに再浮遊させ、１５■／ｄリゾチーム溶液２Ｍ１
を加えた．この混合液を３７℃で３０分間温置中にとき
どき回転させた．０．２Ｎ ＮａＯＨＳ１％ＳＤＳ５０
ａｄｌを加えこの混合液が均一になり溶解が明らかにな
るまでＩＷＩ１のピペットでこの混合液を混合した．氷
上で２５分間ときどき回転させながら温置した後、５Ｍ
酢酸カリウムＰＩＩ４．８、４０ｍを加え、沈降物質が
小凝塊に分散するまで混合した．氷上で２５分間温置し
た後、この混合液を４℃で１５分間１５．０００ｘｇに
より遠心分離した．ブラスξド含有上清を混合した−２
０℃イソプロパノール７２ａｄに加え４℃で１５分間１
５，０００ｘｇにより遠心分離した．得られた上清を捨
て、無菌綿棒で余分な液体を除きＤＮＡ沈降物を更に真
空下で５分間乾燥した．ＤＮＡを２０ｓ）ｌ｝リス、０
．５％サノレコシノレ、５ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．９、
９ｊ！ｉ！と１ ０ ｍｇ／ ａｄ ＲＮａｓｅ ２
５ ｕ １に再浮遊させ、容量をｌＯｄ以下にし、Ｃｓ
Ｃｆｌ１ｇを加え、臭化エチジウム５■／ＩＩ１溶液１
ｌＩ１を加えた， ５０００ｘｇで５分間遠心分離した
後、上清をベックマン クイックシール管に加え、閉じ
てベックマン？０．ＩＴｉローターで６５．００Ｏ Ｒ
Ｐ Ｍにより２０℃で１７．５時間回転させた．いず
れかの方法から得られたプラスξドＤＮＡバンドをＵＶ
照射で可視化し、除去し、ＣｓＣＩｌ７ １ ｇを０．
１ Ｍ ｝リス６５−、０．０ １８ ＥＤＴＡ，
ｐＨ７．９に溶解し、臭化エチジウム（５■／ｄ）０．
２−を加えて調製したＣｓＣ １溶液１３ｄで再びバン
ドにした、プラスミドＤＮＡを第２勾配から除去し、臭
化エチジウムを４回のイソペンチルアルコール抽出で除
去した．２容量のＴＥ．０．３容量の３．５Ｍ酢酸ナト
リウム及び６容量の１００％エタノールを加えてブラス
ミドＤＮＡを沈殿させた＊＝２０″Ｃで一晩温置した後
ＤＮＡを１３． ０００ｘｇで１２分間遠心分離して沈
降させ、７０％エタノールで１回洗浄し、ＴＥ１ｍに再
浮遊させた。細胞５００−からＤＮＡの収量は２００〜
１０００μｇであった。
してｌＯ％スクロース、１０ａ＋Ｉ’ｌＥＤＴＡで１回
洗浄した、プラスミドＤＮＡを２方法のいずれかで菌糸
から分離した。第１方法は上記マクネイル、Ｄ．Ｊ．１
９８６年で以前に記載された迅速煮沸操作である。この
細胞沈降物をＳＴＥＴ４ ０１Ｉｄに再浮遊させ、０．
１ Ｍ トリスＰＨ７．９中５０■／ｌＩ１リゾチー
ム溶液０． ５−を加えた．この浮遊液を３７℃で２０
分間温置し、沸騰水浴に３分間入れ、４℃で３０分間９
０．０００ ｘｇにて遠心分離した．上滑を除き、％容
量の−２０℃イソプロパノールを加え、混合し、−２０
℃で２０分間温置した。ＤＮＡを９．０００ｘｇで８分
間遠心分離により収集した。ＣｓＣＩｌ７８ｇを０．
１ Ｍ ｌ−リス６５ｍ、０．０ １Ｍ ＥＤＴＡ，
ｐｌ＋７．９に溶解し、臭化エチジウム（５■／ａｔ）
２ｍｌを加えて調製したＣｓＣ Ｉｔ溶液１３１ｄにこ
のＤＮＡを再浮遊させた．この混合液をベックマン超遠
心機で４３． ＯＯＯｒｐ■により４４時間遠心分離し
た、プラスミドＤＮＡを分離す・る第２方法は上記マニ
アチス等、１９８２年に記載されるアルカリ性溶解操作
の変法である．５００−の細胞沈降物を５０−Ｍグルコ
ース、２５ｓＭ｝リスｐＨ８、１ ０ｍＭＥＤＴＡ３
０ｄｌに再浮遊させ、１５■／ｄリゾチーム溶液２Ｍ１
を加えた．この混合液を３７℃で３０分間温置中にとき
どき回転させた．０．２Ｎ ＮａＯＨＳ１％ＳＤＳ５０
ａｄｌを加えこの混合液が均一になり溶解が明らかにな
るまでＩＷＩ１のピペットでこの混合液を混合した．氷
上で２５分間ときどき回転させながら温置した後、５Ｍ
酢酸カリウムＰＩＩ４．８、４０ｍを加え、沈降物質が
小凝塊に分散するまで混合した．氷上で２５分間温置し
た後、この混合液を４℃で１５分間１５．０００ｘｇに
より遠心分離した．ブラスξド含有上清を混合した−２
０℃イソプロパノール７２ａｄに加え４℃で１５分間１
５，０００ｘｇにより遠心分離した．得られた上清を捨
て、無菌綿棒で余分な液体を除きＤＮＡ沈降物を更に真
空下で５分間乾燥した．ＤＮＡを２０ｓ）ｌ｝リス、０
．５％サノレコシノレ、５ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．９、
９ｊ！ｉ！と１ ０ ｍｇ／ ａｄ ＲＮａｓｅ ２
５ ｕ １に再浮遊させ、容量をｌＯｄ以下にし、Ｃｓ
Ｃｆｌ１ｇを加え、臭化エチジウム５■／ＩＩ１溶液１
ｌＩ１を加えた， ５０００ｘｇで５分間遠心分離した
後、上清をベックマン クイックシール管に加え、閉じ
てベックマン？０．ＩＴｉローターで６５．００Ｏ Ｒ
Ｐ Ｍにより２０℃で１７．５時間回転させた．いず
れかの方法から得られたプラスξドＤＮＡバンドをＵＶ
照射で可視化し、除去し、ＣｓＣＩｌ７ １ ｇを０．
１ Ｍ ｝リス６５−、０．０ １８ ＥＤＴＡ，
ｐＨ７．９に溶解し、臭化エチジウム（５■／ｄ）０．
２−を加えて調製したＣｓＣ １溶液１３ｄで再びバン
ドにした、プラスミドＤＮＡを第２勾配から除去し、臭
化エチジウムを４回のイソペンチルアルコール抽出で除
去した．２容量のＴＥ．０．３容量の３．５Ｍ酢酸ナト
リウム及び６容量の１００％エタノールを加えてブラス
ミドＤＮＡを沈殿させた＊＝２０″Ｃで一晩温置した後
ＤＮＡを１３． ０００ｘｇで１２分間遠心分離して沈
降させ、７０％エタノールで１回洗浄し、ＴＥ１ｍに再
浮遊させた。細胞５００−からＤＮＡの収量は２００〜
１０００μｇであった。
Ｂ、プラスミド分離に対する大腸菌の増殖ｐＶＥ３２Ｂ
由来コスξドクローンを含む大腸菌培養液をＬＢ−Ａｎ
＋ｐ培地〈アンピシリン１００μｇ／ｙｄを含む１１当
りトリプトン１０ｇ１酵母エキス５ｇ， Ｎａ（４ ５
ｇ）で増殖した．これらの培養液を３７℃で２２Ｏｒ
ｐｍにより振盪させながら増殖させ、ＯＯａ。。１．
０〜２．０のとき、５０■／１ｌｉクロラムフエニコー
ル０． ５ ｄを加えた。ストレプト逅セスに対して上
述したアルカリ性溶解操作を変更して５００Ｍｉの培養
液から大量のプラスξドＤＮＡ（２００〜ｔ ． ｓｏ
ｏμｇ）を調製した。６． ０００ｘｇで６分間細胞を
収集し細胞沈降物を５０−Ｍグルコース、２５ＩｌｌＭ
トリスｐｕｓ、１ ０ｍＭＥＤＴＡ １ ８ｓｄに再浮
遊させ１５■／ｄリゾチーム溶液２−を加えた．この混
合液を室温で１５分間温置中にときどき回転した。０．
２Ｎ ＮａＯＬ１％ＳＤＳ４（ｌｄを加え、混合液が
均一になり溶解が明らかになるまでこの混合液を１−ピ
ペットで混合した。氷上で２５分間ときどき回転させな
がら温置した後５Ｍ酢酸カリウムｐＨ４．８、２０−を
加え、沈降物質が小凝集塊に分散するまで混合した。氷
上で２５分間温置した後この混合液を４℃で１５分間１
５，０００ｘＨにより遠心分離した。プラスミド含有上
清を−２０℃イソプロパノール５０１Ｉｌに加え、混合
し、４℃で１５分間１５．０００ｘｇにより遠心分離し
た。得られた上滑を捨て、余分な液体を無菌綿棒で除去
し、次にＤＮＡ沈降物を真空下で５分間乾燥した。この
ＤＮＡを２０＋ｓＭ｝リス、５ｍＭＥＤＴＡｐｌ｛７．
９、９−とｌ Ｑ ＋ｑｇ／ｄ ＲＮａｓｅ ２ ５
ＩＩ ｌに再浮遊させ、容量をｌＱａｄにし、ＣｓＣＩ
２ １ １ ｇを加え、臭化エチジウム５■／一溶液１
−を加えた。５０００ｘｇで５分間遠心分離した後、上
清をベックマンクイックシール管に加え、閉じてベソク
マン７０．１Ｔｉローターで６５．００Ｏ Ｒ Ｐ Ｍ
により２０℃で１７．５時間回転させた。プラスミドＤ
ＮＡバンドをＵＶ照射で可視化し、除去し、ＣｓＣ１
７ １ ｇを０． １ Ｍ トリス６５−、０．０ １
Ｍ ＥＤＴＡＳｐＨ７．９、６５−に溶解し、臭化エチ
ジウム（５ｍ／ｄ）２−を加えて調製したＣｓＣ ｌ溶
液１３−で再びバンドにした。
由来コスξドクローンを含む大腸菌培養液をＬＢ−Ａｎ
＋ｐ培地〈アンピシリン１００μｇ／ｙｄを含む１１当
りトリプトン１０ｇ１酵母エキス５ｇ， Ｎａ（４ ５
ｇ）で増殖した．これらの培養液を３７℃で２２Ｏｒ
ｐｍにより振盪させながら増殖させ、ＯＯａ。。１．
０〜２．０のとき、５０■／１ｌｉクロラムフエニコー
ル０． ５ ｄを加えた。ストレプト逅セスに対して上
述したアルカリ性溶解操作を変更して５００Ｍｉの培養
液から大量のプラスξドＤＮＡ（２００〜ｔ ． ｓｏ
ｏμｇ）を調製した。６． ０００ｘｇで６分間細胞を
収集し細胞沈降物を５０−Ｍグルコース、２５ＩｌｌＭ
トリスｐｕｓ、１ ０ｍＭＥＤＴＡ １ ８ｓｄに再浮
遊させ１５■／ｄリゾチーム溶液２−を加えた．この混
合液を室温で１５分間温置中にときどき回転した。０．
２Ｎ ＮａＯＬ１％ＳＤＳ４（ｌｄを加え、混合液が
均一になり溶解が明らかになるまでこの混合液を１−ピ
ペットで混合した。氷上で２５分間ときどき回転させな
がら温置した後５Ｍ酢酸カリウムｐＨ４．８、２０−を
加え、沈降物質が小凝集塊に分散するまで混合した。氷
上で２５分間温置した後この混合液を４℃で１５分間１
５，０００ｘＨにより遠心分離した。プラスミド含有上
清を−２０℃イソプロパノール５０１Ｉｌに加え、混合
し、４℃で１５分間１５．０００ｘｇにより遠心分離し
た。得られた上滑を捨て、余分な液体を無菌綿棒で除去
し、次にＤＮＡ沈降物を真空下で５分間乾燥した。この
ＤＮＡを２０＋ｓＭ｝リス、５ｍＭＥＤＴＡｐｌ｛７．
９、９−とｌ Ｑ ＋ｑｇ／ｄ ＲＮａｓｅ ２ ５
ＩＩ ｌに再浮遊させ、容量をｌＱａｄにし、ＣｓＣＩ
２ １ １ ｇを加え、臭化エチジウム５■／一溶液１
−を加えた。５０００ｘｇで５分間遠心分離した後、上
清をベックマンクイックシール管に加え、閉じてベソク
マン７０．１Ｔｉローターで６５．００Ｏ Ｒ Ｐ Ｍ
により２０℃で１７．５時間回転させた。プラスミドＤ
ＮＡバンドをＵＶ照射で可視化し、除去し、ＣｓＣ１
７ １ ｇを０． １ Ｍ トリス６５−、０．０ １
Ｍ ＥＤＴＡＳｐＨ７．９、６５−に溶解し、臭化エチ
ジウム（５ｍ／ｄ）２−を加えて調製したＣｓＣ ｌ溶
液１３−で再びバンドにした。
プラスミドＤＮＡを第２勾配から除去し、４回のイソプ
ロビルアルコール抽出で臭化エチジウムを除去した。２
容量のＴＥ，０．３容量の３．５Ｍ酢酸ナトリウム及び
６容量の１００％エタノールを加えてブラスミドＤＮＡ
を沈降させた。−２０℃で一晩温置した後、１３， Ｏ
ＯＯｘｇで１２分間遠心分離してこのＤＮＡを沈降させ
、７０％エタノールで１回洗浄し、ＴＥＬ一に再浮遊さ
せた。
ロビルアルコール抽出で臭化エチジウムを除去した。２
容量のＴＥ，０．３容量の３．５Ｍ酢酸ナトリウム及び
６容量の１００％エタノールを加えてブラスミドＤＮＡ
を沈降させた。−２０℃で一晩温置した後、１３， Ｏ
ＯＯｘｇで１２分間遠心分離してこのＤＮＡを沈降させ
、７０％エタノールで１回洗浄し、ＴＥＬ一に再浮遊さ
せた。
Ｃ．プラスミドＤＮＡの制限分析
ＤＮＡの制限分析及びアガロースゲル電気泳動法並びに
他の組換え体ＤＮＡテクノロジーの標準手法に対する操
作はＴ．マニアチス、Ｅ．Ｆ．フリッシュ及びＪ．サム
ブルック、モレキュラークローニング：ラボラトリー
マニュアル、コールドスプリングハーバー ラボラトリ
ー、コールドスプリングハーバー、ＮＹ（１９８２年）
に詳細に記載されている．大規模及び小規模調製試料か
ら分離したプラスミドＤＮＡを製造業者の指示書により
種々の制限酵素を用いて切断した。酵素はニューイング
ランドバイオラブス（ベバーリー．ＭＡ） 、ベテスダ
リサーチ ラブス（ベテスダ，ＭＤ）及びＩＢＩ（ニ
ュー八ベン，ＣＴ）から人手した。緩衝液として０．
０ ８ Ｍ トリスー酢酸塩一〇．０ ０ ４Ｍ ＥＤ
ＴＡを用いて０． ８％アガロースの電気泳動により消
化を解析した。断片のサイズは既知分子量のλファージ
ＤＮＡ断片と比較して求めた． Ｄ．クローン化ＤＮＡの制限酵素部位のマソピング ｐＡＴ１及びｐＶＩｌ！６５０の制限部位の位置を標準
マッピング手法により決定した．これらはサブクローニ
ング及びサブクローンの分析により更にこの領域から分
離した種々のコス逅ドに含まれる断片の分析により単及
び二重酵素消化の分析を包含する。
他の組換え体ＤＮＡテクノロジーの標準手法に対する操
作はＴ．マニアチス、Ｅ．Ｆ．フリッシュ及びＪ．サム
ブルック、モレキュラークローニング：ラボラトリー
マニュアル、コールドスプリングハーバー ラボラトリ
ー、コールドスプリングハーバー、ＮＹ（１９８２年）
に詳細に記載されている．大規模及び小規模調製試料か
ら分離したプラスミドＤＮＡを製造業者の指示書により
種々の制限酵素を用いて切断した。酵素はニューイング
ランドバイオラブス（ベバーリー．ＭＡ） 、ベテスダ
リサーチ ラブス（ベテスダ，ＭＤ）及びＩＢＩ（ニ
ュー八ベン，ＣＴ）から人手した。緩衝液として０．
０ ８ Ｍ トリスー酢酸塩一〇．０ ０ ４Ｍ ＥＤ
ＴＡを用いて０． ８％アガロースの電気泳動により消
化を解析した。断片のサイズは既知分子量のλファージ
ＤＮＡ断片と比較して求めた． Ｄ．クローン化ＤＮＡの制限酵素部位のマソピング ｐＡＴ１及びｐＶＩｌ！６５０の制限部位の位置を標準
マッピング手法により決定した．これらはサブクローニ
ング及びサブクローンの分析により更にこの領域から分
離した種々のコス逅ドに含まれる断片の分析により単及
び二重酵素消化の分析を包含する。
断片のサイズはＩＩｉｎｄｌｌ［又はＢａＩＩＩＩ Ｉ
とＥｃｏＲ Ｉの組換えを用いて消化したλ断片と比較
して求めた。
とＥｃｏＲ Ｉの組換えを用いて消化したλ断片と比較
して求めた。
Ｅ．プラスミドＤＮＡによるストレプトミセスの形質転
換 （１） 原形質体の生或 形質転換は原形質体によるＰＥＧ仲介ＤＮＡ取込みによ
って達成した。Ｓ．アベルξチリスの原形質体はマクネ
イル，Ｄ．Ｊ．及びクラブコ（Ｋｌａｐｋｏ） ． Ｌ
． Ｍ． １ ９ ８ ７年Ｊ． Ｉｎｄｕｓｔ．Ｈｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ，第２巻．２０９〜２１Ｂ頁に記載され
る通り調製した．３０％スクロース、５ｍＭＭｇＣｊ！
ｚ及び０．５％グリシンを含むＹＥＭＥ培地３（ｌｄに
Ｓ．アベル逅チリスの胞子５Ｘ１０’又は６ＮｉのＹＥ
ＭＥ培養液ｌＩＩｄを接種した。（Ｙ Ｅ Ｍ Ｅ培養
液は単一コロニーを３０％スクロース、５１ＩＭＭｇＣ
ｌ．及び０．５％グリシンを含むＹＥＭＥ５ａｄに接
種して調製した）．３０ｄの培養液を２８℃で２又は３
日間増殖させ、１４．０００ｘｇで１２分間菌糸を沈降
させ、Ｐ培地で１回洗浄した．Ｐ培地は１ｅ当りスクｏ
−スｌ０３ｇ， Ｋｔｓｏｔ Ｏ．２５ｇ、ＭｇＣ
Ｊ ．・Ｈ，０２．０３ｇ及びＲｔ微量元素２１Ｉ＃
１を含む。オートクレープにかけた後次の０．５％Ｘ｝
ｌ．Ｐｏ．１０−、ＣａＣｌｚ ・２Ｈｚ０ ８ｍ、０
．２ＭＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン
酸）４０ｄを加える．この菌糸をＰ培地１５ｍに再浮遊
させ、リゾチーム（Ｐ培地中５０■／ＩＩ＃１）０．２
一を加え、浮遊液を３７℃で１時間ゆっくりと振盪させ
ながら温置した。この混合液を１０一注射器の底の２ｃ
ｌＩのガラスウールにより濾過して原形質体を消化され
ない菌糸から分離した。この原形質体を６．０００ ｘ
ｇで６分間沈降させ、２０％スクロースを含むＰ培地３
ＩＩＩ１に再浮遊させた。Ｓ．リビダンスの原形質体は
ＴＢＳ （ｐＨ７．２）をＭＥＳの代わりに全緩衝液中
で使用した以外はＳ．アベルミチリスに対して上述した
通り調製した。全原形質体をドライアイス／エタノール
浴中で急速凍結し、−７０℃で貯蔵した。
換 （１） 原形質体の生或 形質転換は原形質体によるＰＥＧ仲介ＤＮＡ取込みによ
って達成した。Ｓ．アベルξチリスの原形質体はマクネ
イル，Ｄ．Ｊ．及びクラブコ（Ｋｌａｐｋｏ） ． Ｌ
． Ｍ． １ ９ ８ ７年Ｊ． Ｉｎｄｕｓｔ．Ｈｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ，第２巻．２０９〜２１Ｂ頁に記載され
る通り調製した．３０％スクロース、５ｍＭＭｇＣｊ！
ｚ及び０．５％グリシンを含むＹＥＭＥ培地３（ｌｄに
Ｓ．アベル逅チリスの胞子５Ｘ１０’又は６ＮｉのＹＥ
ＭＥ培養液ｌＩＩｄを接種した。（Ｙ Ｅ Ｍ Ｅ培養
液は単一コロニーを３０％スクロース、５１ＩＭＭｇＣ
ｌ．及び０．５％グリシンを含むＹＥＭＥ５ａｄに接
種して調製した）．３０ｄの培養液を２８℃で２又は３
日間増殖させ、１４．０００ｘｇで１２分間菌糸を沈降
させ、Ｐ培地で１回洗浄した．Ｐ培地は１ｅ当りスクｏ
−スｌ０３ｇ， Ｋｔｓｏｔ Ｏ．２５ｇ、ＭｇＣ
Ｊ ．・Ｈ，０２．０３ｇ及びＲｔ微量元素２１Ｉ＃
１を含む。オートクレープにかけた後次の０．５％Ｘ｝
ｌ．Ｐｏ．１０−、ＣａＣｌｚ ・２Ｈｚ０ ８ｍ、０
．２ＭＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン
酸）４０ｄを加える．この菌糸をＰ培地１５ｍに再浮遊
させ、リゾチーム（Ｐ培地中５０■／ＩＩ＃１）０．２
一を加え、浮遊液を３７℃で１時間ゆっくりと振盪させ
ながら温置した。この混合液を１０一注射器の底の２ｃ
ｌＩのガラスウールにより濾過して原形質体を消化され
ない菌糸から分離した。この原形質体を６．０００ ｘ
ｇで６分間沈降させ、２０％スクロースを含むＰ培地３
ＩＩＩ１に再浮遊させた。Ｓ．リビダンスの原形質体は
ＴＢＳ （ｐＨ７．２）をＭＥＳの代わりに全緩衝液中
で使用した以外はＳ．アベルミチリスに対して上述した
通り調製した。全原形質体をドライアイス／エタノール
浴中で急速凍結し、−７０℃で貯蔵した。
（２）形質転換操作
ストレプトミセス株をＳ．アベルミチリスに記載した方
法（上記マクネイル及びクラプコ． １９８７）の変法
で形質転換した。０．１−の量の原形質体く約１０’／
ｄ）をプラスくドＤＮＡ （２ ５ｎｇ〜１μｇ）５〜
ｌＯμｌで混合し、培地Ｔ Ｏ． ５ ｄを加え、この
混合液を室温で３０秒間温置した．何回か半分の原形質
体、ＤＮＡ及び培地Ｔを一緒に混合した。培地Ｔは異な
った濃度のスクロース（２．５％）、ＣａＣｆｇ （０
． １ Ｍ）を含み、５０ｓＭトリスーマレイン酸（ｐ
Ｈ８）で緩衝され、２５％（重量容量）ＰＥＧＩＯＯＯ
を有するほかは培地Ｐと同じである。この混合液をＳ．
アベルξチリスに対して０．ＯＩＭＭＥＳあるいはＳ．
リビダンスに対して０．ＯＩＭＴＥＳを含むＰ培地で連
続的に希釈した。Ｓ．リビダンスに対しては、形質転換
混合液の希釈液１００μｌをｌ７％スクロースを含むＲ
！ＹＥ培地に拡散させた．Ｓ．アベルξチリスに対して
は形質転換混合液の希釈液１００μｌを５０℃でＲＭＩ
４軟寒天３ＷＩ！ｔに加えＲｌ’ｌｌ４プレートに注い
だ。ＲＭ１４は１１当リスクロース２ ０ ５ ｇ．寒
天２０ｇ．オートミール寒天３ｇを含み、ＴＥＳＯ代わ
りにＯ． ＬＭ ＭＥＳ ＣｐＨ６．５）を含むほかは
Ｒ．Ｙｆ！と同じである， ＲＭ１４軟寒天は１ｊ！当
り寒天６ｇのみを含む． （３）形質転換の検出 形質転換原形質体を含むＲ．ＹＩＥとＲＭｌ４再生培地
を２８℃で２０時間温置した。再生プレートにチオスト
レブトン０． ５ ｅｙｒを含むＲＭ＋ａ軟寒天３Ｗｄ
を置いた。再生プレート上に４〜１５日で形質転換細胞
が現われた。
法（上記マクネイル及びクラプコ． １９８７）の変法
で形質転換した。０．１−の量の原形質体く約１０’／
ｄ）をプラスくドＤＮＡ （２ ５ｎｇ〜１μｇ）５〜
ｌＯμｌで混合し、培地Ｔ Ｏ． ５ ｄを加え、この
混合液を室温で３０秒間温置した．何回か半分の原形質
体、ＤＮＡ及び培地Ｔを一緒に混合した。培地Ｔは異な
った濃度のスクロース（２．５％）、ＣａＣｆｇ （０
． １ Ｍ）を含み、５０ｓＭトリスーマレイン酸（ｐ
Ｈ８）で緩衝され、２５％（重量容量）ＰＥＧＩＯＯＯ
を有するほかは培地Ｐと同じである。この混合液をＳ．
アベルξチリスに対して０．ＯＩＭＭＥＳあるいはＳ．
リビダンスに対して０．ＯＩＭＴＥＳを含むＰ培地で連
続的に希釈した。Ｓ．リビダンスに対しては、形質転換
混合液の希釈液１００μｌをｌ７％スクロースを含むＲ
！ＹＥ培地に拡散させた．Ｓ．アベルξチリスに対して
は形質転換混合液の希釈液１００μｌを５０℃でＲＭＩ
４軟寒天３ＷＩ！ｔに加えＲｌ’ｌｌ４プレートに注い
だ。ＲＭ１４は１１当リスクロース２ ０ ５ ｇ．寒
天２０ｇ．オートミール寒天３ｇを含み、ＴＥＳＯ代わ
りにＯ． ＬＭ ＭＥＳ ＣｐＨ６．５）を含むほかは
Ｒ．Ｙｆ！と同じである， ＲＭ１４軟寒天は１ｊ！当
り寒天６ｇのみを含む． （３）形質転換の検出 形質転換原形質体を含むＲ．ＹＩＥとＲＭｌ４再生培地
を２８℃で２０時間温置した。再生プレートにチオスト
レブトン０． ５ ｅｙｒを含むＲＭ＋ａ軟寒天３Ｗｄ
を置いた。再生プレート上に４〜１５日で形質転換細胞
が現われた。
Ｅ．プラスミドＤＮＡによる大腸菌の形質転換大腸菌の
コンビテント細胞をマンデル（Ｍａｎｄｅｌ） ＋Ｍ．
及びヒガ（Ｉｌｉｇａ） ， Ａ． Ｊ． Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．第５３巻、１５４〜１６２頁（１９７０年）
の方法で調製した。細胞をＬＢ培地でＡ，。。＝ ０．
４ ５まで増殖させ氷上で２０分間温置した。細胞を
沈降させ、原容量の半分まで０． １ Ｍ Ｃａ（Ｊ
ｚに再浮遊させた。
コンビテント細胞をマンデル（Ｍａｎｄｅｌ） ＋Ｍ．
及びヒガ（Ｉｌｉｇａ） ， Ａ． Ｊ． Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．第５３巻、１５４〜１６２頁（１９７０年）
の方法で調製した。細胞をＬＢ培地でＡ，。。＝ ０．
４ ５まで増殖させ氷上で２０分間温置した。細胞を
沈降させ、原容量の半分まで０． １ Ｍ Ｃａ（Ｊ
ｚに再浮遊させた。
氷上で２０分後細胞を再び沈降させ、原容量の０． １
まで０． Ｉ Ｍ ＣａＣ１ ｚに再浮遊させた。これ
らのコンビテント細胞は１５％グリセロールを生成し、
−７０℃で貯蔵した。
まで０． Ｉ Ｍ ＣａＣ１ ｚに再浮遊させた。これ
らのコンビテント細胞は１５％グリセロールを生成し、
−７０℃で貯蔵した。
形質転換のためにコンビテント細胞０． ２−をＤＮＡ
（１ ０〜１ ０ ０ ０ｎｇ／ｄ） １ ０ ｐ
１と混合した．この混合液を氷上で１０分間次に３７
℃で３分間温置した。０．５一量のＬＢ培地を加え、こ
の培養液を３７℃で１時間２２０ＲＰＭにより振盪させ
た。アリコートをアンピシリン１００μｇ／一としＢプ
レートに置きプラスミドを選択した．Ｆ．相補性試験に
対して断片のｐｌＪ９２２へのサブクローニング アベルメクチン生合戒の遺伝子の位置決定を助けるため
ニｐＡＴ１、ｐＶＥ６５０及びｐＶＥ８５９から（７）
ＤＮＡ断片をｐｌＪ９２２にサブクローンした， ｐｌ
Ｊ９２２、２〜１０μｇを適当な制限酵素で消化させて
ｐＩＪ９２２のユニークなＢａｍＨ Ｉ又はＥｃｏＲ
１部位で直線にした。
（１ ０〜１ ０ ０ ０ｎｇ／ｄ） １ ０ ｐ
１と混合した．この混合液を氷上で１０分間次に３７
℃で３分間温置した。０．５一量のＬＢ培地を加え、こ
の培養液を３７℃で１時間２２０ＲＰＭにより振盪させ
た。アリコートをアンピシリン１００μｇ／一としＢプ
レートに置きプラスミドを選択した．Ｆ．相補性試験に
対して断片のｐｌＪ９２２へのサブクローニング アベルメクチン生合戒の遺伝子の位置決定を助けるため
ニｐＡＴ１、ｐＶＥ６５０及びｐＶＥ８５９から（７）
ＤＮＡ断片をｐｌＪ９２２にサブクローンした， ｐｌ
Ｊ９２２、２〜１０μｇを適当な制限酵素で消化させて
ｐＩＪ９２２のユニークなＢａｍＨ Ｉ又はＥｃｏＲ
１部位で直線にした。
直線ＤＮＡを製造業者によって記載される通りかあるい
は別の方法によって子ウシ腸管アルカリ性ホスファター
ゼ（ＣＩＡＰ）（ベーリンガーマンハイム，インディア
ナポリス，ＩＮ）で処理した．簡単な方法は制限酵素消
化が完了した後直ちに直線にしたｐｌＪ９２２を処理す
る方法である。ＣＩＡＰ（ＤＮＡＩμｇ当り０．０２単
位）を制限酵素消化混合液に直接加え、３７℃で３０分
間温置した。
は別の方法によって子ウシ腸管アルカリ性ホスファター
ゼ（ＣＩＡＰ）（ベーリンガーマンハイム，インディア
ナポリス，ＩＮ）で処理した．簡単な方法は制限酵素消
化が完了した後直ちに直線にしたｐｌＪ９２２を処理す
る方法である。ＣＩＡＰ（ＤＮＡＩμｇ当り０．０２単
位）を制限酵素消化混合液に直接加え、３７℃で３０分
間温置した。
ＣＩＡＰの第２アリコートを加え、更に３０分間消化を
続けた．ｌ ０ ０ｓＭＥＤＴＡ、２５％グリセロール
、０．２５％プロムフェノールブルー、０．２％ＳＤＳ
の１／５容量を加えて反応を終結させた。
続けた．ｌ ０ ０ｓＭＥＤＴＡ、２５％グリセロール
、０．２５％プロムフェノールブルー、０．２％ＳＤＳ
の１／５容量を加えて反応を終結させた。
直線ベクターを０．８％アガロースゲルによる電気泳動
にかけ、直線ＤＮＡをそのＤＮＡを含むアガローススラ
イスから電気溶離した．そのＤＮＡをエタノール沈殿さ
せ、ＴＥ５０〜１００μｌに再浮遊させた。サブクロー
ニングとしてｐＡＴ１， ｐＶＥ６５０又はｐＶＥ８５
９、５０〜１０μｇを制限酵素ＢａＩＩＩＩ Ｉ ，
ＢｇＩ ｎ、Ｐｓｔｌ又はＥＣＱＲ Ｉで消化し、０
．８％アガロースゲルの電気泳動にかけ、電気溶離し、
エタノール沈殿させ、ＴＥ５０〜１００μｌに再浮遊さ
せた。Ｂａ＋ｍＨ Ｉ直線ベクターとＢａｓｉＨ Ｉも
しくはＢｇｌ ＩＩ消化断片又はＥｃｏＲ Ｉ直線ベク
ターとＥｃｏＲ Ｉ消化断片又はＰｓｔｌ直線ベクター
とＰｓｔｌ消化断片の種々のアリコートを結合し、Ｓ．
リビダンスに形質転換した。Ｔｈｉｏ’形質転換細胞を
選択し、６−のＹＥＭＥ増殖培養液をミニ溶解物分析で
問題の断片の存在を試験した。
にかけ、直線ＤＮＡをそのＤＮＡを含むアガローススラ
イスから電気溶離した．そのＤＮＡをエタノール沈殿さ
せ、ＴＥ５０〜１００μｌに再浮遊させた。サブクロー
ニングとしてｐＡＴ１， ｐＶＥ６５０又はｐＶＥ８５
９、５０〜１０μｇを制限酵素ＢａＩＩＩＩ Ｉ ，
ＢｇＩ ｎ、Ｐｓｔｌ又はＥＣＱＲ Ｉで消化し、０
．８％アガロースゲルの電気泳動にかけ、電気溶離し、
エタノール沈殿させ、ＴＥ５０〜１００μｌに再浮遊さ
せた。Ｂａ＋ｍＨ Ｉ直線ベクターとＢａｓｉＨ Ｉも
しくはＢｇｌ ＩＩ消化断片又はＥｃｏＲ Ｉ直線ベク
ターとＥｃｏＲ Ｉ消化断片又はＰｓｔｌ直線ベクター
とＰｓｔｌ消化断片の種々のアリコートを結合し、Ｓ．
リビダンスに形質転換した。Ｔｈｉｏ’形質転換細胞を
選択し、６−のＹＥＭＥ増殖培養液をミニ溶解物分析で
問題の断片の存在を試験した。
適当なインサートをもつ誘導体をため、果二溶解物５〜
１０μｌを種々のＳ．アベル稟チリス突然変異体に形質
転換し、得られたチオストレプトン耐性形質転換細胞を
突然変異体欠損の相補性に対して試験した。
１０μｌを種々のＳ．アベル稟チリス突然変異体に形質
転換し、得られたチオストレプトン耐性形質転換細胞を
突然変異体欠損の相補性に対して試験した。
Ａ． Ｓ．アベル逅チリスＤＮＡライブラリーの作製
Ｓ．アベルξチリスＤＮＡのライブラリーはＳａｕ３Ａ
制限酵素で一部消化したゲノムＤＮＡをｐｌＪ９２２の
適合するユニークなＢａｍＨ １部位に結合して作った
， ｐｌＪ９２２はストレプトごセスに於てＴｈｉｏ’
として選択することができる２４ｋｂ、低コピー数スト
レプトξセスベクターである（ホブウッド等、ジエネテ
ィックマニビエレーシッンズオブ ストレプトξセスア
ラボラトリーマニュアル、２７９頁参照）。
制限酵素で一部消化したゲノムＤＮＡをｐｌＪ９２２の
適合するユニークなＢａｍＨ １部位に結合して作った
， ｐｌＪ９２２はストレプトごセスに於てＴｈｉｏ’
として選択することができる２４ｋｂ、低コピー数スト
レプトξセスベクターである（ホブウッド等、ジエネテ
ィックマニビエレーシッンズオブ ストレプトξセスア
ラボラトリーマニュアル、２７９頁参照）。
（１） ゲノムＤＮＡの分離
Ｓ．アベルミチリス胞子株は可視的濁りＹＥＭＥ増殖培
養液０． １ ｍを培地Ｄ寒天プレートに拡散して調製
した．５〜１５日後に胞子を綿棒で除去し、０．８５％
ＮａＣｊ！，５０％グリセロールで湿らし０．８５％Ｎ
ａＣ １、５０％グリセロールの２−に移した．Ｓ．ア
ベルミチリス胞子株（約５Ｘ１０’胞子／ｄ）１００μ
ＥをｙＥＭＥ３１）ｄ＋３０％スクロース＋０．５％グ
リシンを含む２５０−のバッフル付きフラスコに接種し
た．２７℃で回転振盪機による２２０ｒｐｍで４日温置
した後、２５ｍｆのコレックス（（ｏｒｅｘ）遠心機試
験管を用いて４℃でｌＯ分間１２，０００ｘｇにより遠
心分離して細胞を収集した。細胞沈降物を０．０ １Ｍ
ＭＥＳ， ｐｌ｛６．５を含むＰ培地２０ｍに再浮遊
させ、４℃でＩＯ分間１２． ０００ｘｇにより遠心分
離し、沈降物をＰ培地５ｌＲ１に再浮遊させ、リゾチー
ム１０−を加え混合した。浮遊液を３７℃で１時間温置
し、次に０．２５）Ｉ ＥＤＴＡｐＨ８．０、２． ５
ｍを加え氷上で１５分間温置を続けた．この混合物を
穏やかに回転させて２％サルコシル７． ５ ｍを加え
た後細胞溶解が明らかであった。氷上で更に３０分温置
した後前煮沸した５ 噌／ ａｄ ＲＮＡａｓｅタイプ
ＩＡ（シグマ． Ｓｔ，ルイス，ＭＯ）の溶液１５０μ
ｌを加え、３７℃で１時間温置を続けた．次にプロティ
ナーゼＫ（ＩＢＩ，ニューハベン，ＣＴ）０．６ｌＩ１
を加えこの混合液を３７℃で２時間温置し、次に４℃で
一晩温置した．（プロティナーゼＫは２５■／＋＋ｄ溶
液を３７℃で１時間温置して前消化した）．０．２Ｍト
リス，ｐＨ７．９で予め平衡にしたフェノール１５＋＋
ｄをこの溶解物に加え回転ミキサー（ルッジドローター
ター，クラフトデバイシス．ξネオラ，ＮＹ）によりａ
ｒｐ＋ｓで混合した．この混合液を卓上遠心機で回転
させた後、水層を新しい試験管に移し、抽出を２回以上
繰り返した。クロロホルム：イソアミルアルコール２４
：１で５回抽出して試料からフェノールを除去した。得
られた水溶液に０． ５容量の７．５Ｍ酢酸アンモニウ
ムを加え、混合し、２容量の氷冷却エタノールを加えた
．ガラス棒を用いてエタノールを混合し得られた沈降Ｄ
ＮＡを棒に巻きつけた．余分な溶液は棒を試験管の側面
に押しつけてこのＤＮＡから除去し、このＤＮＡをジエ
チルピロカーボネート４μｌを含むＴＥ５−に溶解した
。このＤＮＡを回転ミキサーによるａｒｐ一で回転させ
ながら一晩溶解した．次に上述の通りこの溶液からまた
ＤＮＡを沈殿させ最後にＴ Ｅ ２． ０ １Ｉ１に溶
解してＯＤｔｂ。測定によって定量したＤＮＡ ４ ６
９μｇ／一を得た。
養液０． １ ｍを培地Ｄ寒天プレートに拡散して調製
した．５〜１５日後に胞子を綿棒で除去し、０．８５％
ＮａＣｊ！，５０％グリセロールで湿らし０．８５％Ｎ
ａＣ １、５０％グリセロールの２−に移した．Ｓ．ア
ベルミチリス胞子株（約５Ｘ１０’胞子／ｄ）１００μ
ＥをｙＥＭＥ３１）ｄ＋３０％スクロース＋０．５％グ
リシンを含む２５０−のバッフル付きフラスコに接種し
た．２７℃で回転振盪機による２２０ｒｐｍで４日温置
した後、２５ｍｆのコレックス（（ｏｒｅｘ）遠心機試
験管を用いて４℃でｌＯ分間１２，０００ｘｇにより遠
心分離して細胞を収集した。細胞沈降物を０．０ １Ｍ
ＭＥＳ， ｐｌ｛６．５を含むＰ培地２０ｍに再浮遊
させ、４℃でＩＯ分間１２． ０００ｘｇにより遠心分
離し、沈降物をＰ培地５ｌＲ１に再浮遊させ、リゾチー
ム１０−を加え混合した。浮遊液を３７℃で１時間温置
し、次に０．２５）Ｉ ＥＤＴＡｐＨ８．０、２． ５
ｍを加え氷上で１５分間温置を続けた．この混合物を
穏やかに回転させて２％サルコシル７． ５ ｍを加え
た後細胞溶解が明らかであった。氷上で更に３０分温置
した後前煮沸した５ 噌／ ａｄ ＲＮＡａｓｅタイプ
ＩＡ（シグマ． Ｓｔ，ルイス，ＭＯ）の溶液１５０μ
ｌを加え、３７℃で１時間温置を続けた．次にプロティ
ナーゼＫ（ＩＢＩ，ニューハベン，ＣＴ）０．６ｌＩ１
を加えこの混合液を３７℃で２時間温置し、次に４℃で
一晩温置した．（プロティナーゼＫは２５■／＋＋ｄ溶
液を３７℃で１時間温置して前消化した）．０．２Ｍト
リス，ｐＨ７．９で予め平衡にしたフェノール１５＋＋
ｄをこの溶解物に加え回転ミキサー（ルッジドローター
ター，クラフトデバイシス．ξネオラ，ＮＹ）によりａ
ｒｐ＋ｓで混合した．この混合液を卓上遠心機で回転
させた後、水層を新しい試験管に移し、抽出を２回以上
繰り返した。クロロホルム：イソアミルアルコール２４
：１で５回抽出して試料からフェノールを除去した。得
られた水溶液に０． ５容量の７．５Ｍ酢酸アンモニウ
ムを加え、混合し、２容量の氷冷却エタノールを加えた
．ガラス棒を用いてエタノールを混合し得られた沈降Ｄ
ＮＡを棒に巻きつけた．余分な溶液は棒を試験管の側面
に押しつけてこのＤＮＡから除去し、このＤＮＡをジエ
チルピロカーボネート４μｌを含むＴＥ５−に溶解した
。このＤＮＡを回転ミキサーによるａｒｐ一で回転させ
ながら一晩溶解した．次に上述の通りこの溶液からまた
ＤＮＡを沈殿させ最後にＴ Ｅ ２． ０ １Ｉ１に溶
解してＯＤｔｂ。測定によって定量したＤＮＡ ４ ６
９μｇ／一を得た。
《２》 ゲノムＤＮＡのサイズ分画
２０〜４０ｋｂ範囲の最大断片を得るためにＭｂｏ １
とＳａｕ３Ａを希釈する条件を決定するパイロット実験
の後、Ｓ．アベルミチリスＤＮＡ１００ｎｇの４本のア
リコートを３７℃でＩＯＵ，１６．７Ｕ，２ ３． ３
Ｕ及び３０ＵのＭｂｏ Ｉを用いて消化し、更にＳ．
アベルξチリスＤＮＡＩＯＯμｇの４本のアリコートを
３７℃で３Ｕ、５Ｕ，７Ｕ及び９ＵのＳａｕ３＾を用い
て、１１ｌ１の反応混合液中でｌＯ分間消化した．同じ
緩衝液、ＫＣ１緩衝液を両酵素に対して使用したが、こ
れは２０ｍＭ｝リス、２０ｍＭκＣＩＳ１ ０＋ｓＭ
ＭｇＣｊ！ｚ 、１ｍＭジチオトレイトール、１００μ
ｇ／−ウシ血清アルブミン、ｐｌ１７．９であった。停
止果ツクス（１％ＳＤＳ，５０＋ｗＭＥＤＴＡ）０．２
５−を加えて反応を終結させ次いでフェノール抽出した
．特にことわらない限り、ＤＮＡ溶液をフェノールで処
理して酵素を失活させタンパク質を除去した。標準フェ
ノール抽出はＤＮＡ溶液の有機溶媒による連続抽出から
なり次に遠心分離して相を分離する。抽出は、予め０．
２ Ｍ ｝リスｐＨ７．９で平衡にした同量のフェノ
ール、フェノール：クロロホルム：イソアもルアルコー
ル２５：２４：１、クロロホルム：イソア逅ルアルコー
ル２４：１で行なわれる．ＤＮＡは濃縮及び／又はエタ
ノール沈殿で塩を除去してもよい。ＤＮＡの標準エタノ
ール沈殿は、０．５容量の７．５Ｍ酢酸アンモニウム、
３容量のエタノールヲ加エ、−２０℃で一晩あるいは−
７０℃で１時間温置することからなる，ＤＮＡを１２．
０００ｘｇで１５分間遠心分離で沈降させ、７０％エ
タノールで洗浄し、乾燥してＴＥに再浮遊させる．フェ
ノール抽出及びエタノール沈殿の後にＭｂｏ Ｉ消化物
をプールし、Ｓａｕ３Ａ消化物を別にプールし、３２ｍ
の１０〜４０％スクロース勾配（１１’ｌＮａＣｊ！、
２０一トリス、５ｄＥＤＴＡＳｐＨ８．０）に充填した
。ベックマンＳＷ２ ８ローターで２６．００Ｏ ｒｐ
ｍにより２１時間遠心分離した後底に穴をあけ、勾配を
１４滴画分を集めた。３０画分ごとからのｌＯμｌを０
． ４％アガロースゲルにより行いλ （ラムダ）標準
と比較した。Ｍｂｏ Ｉ消化物の画分１９〜２３をｌＯ
〜３０ｋｂ画分にプールし、両分１６〜１８を＞３０ｋ
ｂ画分にプールした。Ｓａｕ３Ａ消化物画分２３〜２６
をｌＯ〜３０ｋｂ画分にプールし、両分１５〜２２を＞
３０ｋｂ画分にプールした。プールした百分を４℃で４
８時間ＴＥに透析し、２−ブタノールで２１＃１に濃縮
し、酢酸アンモニウムとエタノールを用いて−２０℃で
一晩沈殿させた。このＤＮＡをＴＥ４００μｌに再浮遊
させフェノール抽出し、最後にエチルエーテル抽出し、
エタノール沈殿してＴＥＩＯＯμｌに再浮遊させた。
とＳａｕ３Ａを希釈する条件を決定するパイロット実験
の後、Ｓ．アベルミチリスＤＮＡ１００ｎｇの４本のア
リコートを３７℃でＩＯＵ，１６．７Ｕ，２ ３． ３
Ｕ及び３０ＵのＭｂｏ Ｉを用いて消化し、更にＳ．
アベルξチリスＤＮＡＩＯＯμｇの４本のアリコートを
３７℃で３Ｕ、５Ｕ，７Ｕ及び９ＵのＳａｕ３＾を用い
て、１１ｌ１の反応混合液中でｌＯ分間消化した．同じ
緩衝液、ＫＣ１緩衝液を両酵素に対して使用したが、こ
れは２０ｍＭ｝リス、２０ｍＭκＣＩＳ１ ０＋ｓＭ
ＭｇＣｊ！ｚ 、１ｍＭジチオトレイトール、１００μ
ｇ／−ウシ血清アルブミン、ｐｌ１７．９であった。停
止果ツクス（１％ＳＤＳ，５０＋ｗＭＥＤＴＡ）０．２
５−を加えて反応を終結させ次いでフェノール抽出した
．特にことわらない限り、ＤＮＡ溶液をフェノールで処
理して酵素を失活させタンパク質を除去した。標準フェ
ノール抽出はＤＮＡ溶液の有機溶媒による連続抽出から
なり次に遠心分離して相を分離する。抽出は、予め０．
２ Ｍ ｝リスｐＨ７．９で平衡にした同量のフェノ
ール、フェノール：クロロホルム：イソアもルアルコー
ル２５：２４：１、クロロホルム：イソア逅ルアルコー
ル２４：１で行なわれる．ＤＮＡは濃縮及び／又はエタ
ノール沈殿で塩を除去してもよい。ＤＮＡの標準エタノ
ール沈殿は、０．５容量の７．５Ｍ酢酸アンモニウム、
３容量のエタノールヲ加エ、−２０℃で一晩あるいは−
７０℃で１時間温置することからなる，ＤＮＡを１２．
０００ｘｇで１５分間遠心分離で沈降させ、７０％エ
タノールで洗浄し、乾燥してＴＥに再浮遊させる．フェ
ノール抽出及びエタノール沈殿の後にＭｂｏ Ｉ消化物
をプールし、Ｓａｕ３Ａ消化物を別にプールし、３２ｍ
の１０〜４０％スクロース勾配（１１’ｌＮａＣｊ！、
２０一トリス、５ｄＥＤＴＡＳｐＨ８．０）に充填した
。ベックマンＳＷ２ ８ローターで２６．００Ｏ ｒｐ
ｍにより２１時間遠心分離した後底に穴をあけ、勾配を
１４滴画分を集めた。３０画分ごとからのｌＯμｌを０
． ４％アガロースゲルにより行いλ （ラムダ）標準
と比較した。Ｍｂｏ Ｉ消化物の画分１９〜２３をｌＯ
〜３０ｋｂ画分にプールし、両分１６〜１８を＞３０ｋ
ｂ画分にプールした。Ｓａｕ３Ａ消化物画分２３〜２６
をｌＯ〜３０ｋｂ画分にプールし、両分１５〜２２を＞
３０ｋｂ画分にプールした。プールした百分を４℃で４
８時間ＴＥに透析し、２−ブタノールで２１＃１に濃縮
し、酢酸アンモニウムとエタノールを用いて−２０℃で
一晩沈殿させた。このＤＮＡをＴＥ４００μｌに再浮遊
させフェノール抽出し、最後にエチルエーテル抽出し、
エタノール沈殿してＴＥＩＯＯμｌに再浮遊させた。
（３） ｐｌＪ９２２の調製
ｐｌＪ９２２をそのユニークなＢａｍＨ １部位で切断
し、子ウシ腸管アルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＡＰ、
ベーリンガーマンハイム，インディアナポリス，ＩＮ）
で処理した．細胞４１からｐｌＪ９２２ Ｄ Ｎ Ａを
実施例１で記載した迅速煮沸法によりＳ．リビダンスＴ
Ｋ５４から分離した．ＴＫ５４とｐＩＪ９２２は共にＤ
．ホプウンド．ジョンイネスインスティチュート，ノル
ウインチ英国から得た。ｐＩＪ９２２ Ｄ ＮＡ２３３
μｇを得た． ｐｌＪ９２２はＩＯＸＫＣＪＩ緩衝液（
２００ｍＭ｝リス， ２ ０ ０ｓＭＫＣＩ， ｌ
Ｏ Ｏｄ ＭｇＣＩｔｚ，１■／−ウシ血清アルブミ
ン，ｐＨ７．９）４０μｌ ， ｐＩＪ９２２ （ ２
３． ３μｇ）１００μｌ．ＢａｍＨ １制限酵素（
ＬＯＵ／ｐｉ’＞５ｐｌ及びＨｚ０２５５μｌを含む反
応容量４００μｌ中でＢａｍＨ Ｉにより切断した。３
７℃で４時間消化した後ＤＮＡをフェノールで処理した
エタノール沈殿させた。
し、子ウシ腸管アルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＡＰ、
ベーリンガーマンハイム，インディアナポリス，ＩＮ）
で処理した．細胞４１からｐｌＪ９２２ Ｄ Ｎ Ａを
実施例１で記載した迅速煮沸法によりＳ．リビダンスＴ
Ｋ５４から分離した．ＴＫ５４とｐＩＪ９２２は共にＤ
．ホプウンド．ジョンイネスインスティチュート，ノル
ウインチ英国から得た。ｐＩＪ９２２ Ｄ ＮＡ２３３
μｇを得た． ｐｌＪ９２２はＩＯＸＫＣＪＩ緩衝液（
２００ｍＭ｝リス， ２ ０ ０ｓＭＫＣＩ， ｌ
Ｏ Ｏｄ ＭｇＣＩｔｚ，１■／−ウシ血清アルブミ
ン，ｐＨ７．９）４０μｌ ， ｐＩＪ９２２ （ ２
３． ３μｇ）１００μｌ．ＢａｍＨ １制限酵素（
ＬＯＵ／ｐｉ’＞５ｐｌ及びＨｚ０２５５μｌを含む反
応容量４００μｌ中でＢａｍＨ Ｉにより切断した。３
７℃で４時間消化した後ＤＮＡをフェノールで処理した
エタノール沈殿させた。
ＤＮＡ沈降物をＩＯＸＣＩＰ緩衝液（０．５Ｍ｝リスｐ
ｌ｛９．０． １ ０ｓ＋Ｍ ＭｇＣ１ｇ
、 １ｍＭ ＺｎＣ１ｔ 、 １ ０１スパーミ
ジン）１００μｌ及びＨｇｏ ８ ８ ６μｌからなる
ＣＩＡＰ反応混合液に再浮遊させた。この反応はＣＩＡ
Ｐ，２８Ｕ／μＮ７μｌを加えて開始し、３７℃で３０
分間温置した後別のＣＩＡＰ７μｌを加えた．この反応
は停止ミックス（１０ＸＳＴＥ２００μｊ！［１００ｍ
Ｍ｝リスｐＨ８．０．１Ｍ Ｎａｉｌ，１ ０＋ＭＥＤ
ＴＡ］ 、１ ０％Ｓ？ＳＩＯＯμｌ． ０．５Ｍ
ＥＤＴＡｐｌｌ８．０． ８ ０ｍｌ及びｎｚｏ
６ ２ ０μｌ）１−を加えて終結させ、次いで６５℃
で１０分間加熱した。このＤＮＡをフェノール抽出し、
２−ブタノールで１ｌｄに濃縮し、エタノール沈殿させ
２５０μＡＴＥに再浮遊させ、また再度エタノール沈殿
させ、ＴＥＩＯＯμｌに再浮遊させた。処理したｐＩＪ
９２２のアリコートは０．７％アガロースゲルにより行
ない既知量のλＤＮＡと比較しｐｌＪ９２２をＢａｍＨ
Ｉで切断した。
ｌ｛９．０． １ ０ｓ＋Ｍ ＭｇＣ１ｇ
、 １ｍＭ ＺｎＣ１ｔ 、 １ ０１スパーミ
ジン）１００μｌ及びＨｇｏ ８ ８ ６μｌからなる
ＣＩＡＰ反応混合液に再浮遊させた。この反応はＣＩＡ
Ｐ，２８Ｕ／μＮ７μｌを加えて開始し、３７℃で３０
分間温置した後別のＣＩＡＰ７μｌを加えた．この反応
は停止ミックス（１０ＸＳＴＥ２００μｊ！［１００ｍ
Ｍ｝リスｐＨ８．０．１Ｍ Ｎａｉｌ，１ ０＋ＭＥＤ
ＴＡ］ 、１ ０％Ｓ？ＳＩＯＯμｌ． ０．５Ｍ
ＥＤＴＡｐｌｌ８．０． ８ ０ｍｌ及びｎｚｏ
６ ２ ０μｌ）１−を加えて終結させ、次いで６５℃
で１０分間加熱した。このＤＮＡをフェノール抽出し、
２−ブタノールで１ｌｄに濃縮し、エタノール沈殿させ
２５０μＡＴＥに再浮遊させ、また再度エタノール沈殿
させ、ＴＥＩＯＯμｌに再浮遊させた。処理したｐＩＪ
９２２のアリコートは０．７％アガロースゲルにより行
ない既知量のλＤＮＡと比較しｐｌＪ９２２をＢａｍＨ
Ｉで切断した。
これは上記処理の後１２μｇが回収されたことを示した
。
。
（４） ｐｌＪ９２２のＳ．アベルミチリスゲノム断
片への連結反応 連結反応前に、ＣＩＡＰ処理ｐＩＪ９２２、５μｌ，Ｓ
ａｕ３Ａ断片＞３０ｋｂ，１５＃Ｊ、３Ｍ酢゛酸ナトリ
ウムｌＯμＮ．ＴＥ８０μｌ及びエタノール２７５μｌ
を混合してｐｌＪ９２２とＳ．アベル５チリスＳａｕ３
＾断片＞３０ｋｂを同時沈殿させた。−２０℃で一晩温
置した後、ＤＮＡ沈降物を｝１■Ｏｌ７４μｌ、１０Ｘ
リガーゼ緩衝液（０．５Ｍｌ−リスｐＨ７．４，１ ０
０ｍＭ ＭｇＣｌｇ ． １ ０−スパー逅ジン及
び１■／ｄＢｓＡ）２５μ１０．１Ｍジチオトレイトー
ル２５μｌ及び１０ｍＭＡＴＰ２５μｌの混合液に再浮
遊した。この連結反応はＴ４ＤＮＡリガーゼ（ニューイ
ングランドバイオラブス，ベバーリ−Ｍａ）１μｅを加
えて開始し、１３℃で一晩温置した。３回の実験では、
Ｓ．リビダンス原形質体は実施例ｌで記載した連結ミッ
クス１０μｌで形質転換され、ｔｏ．ｏｏｏ個以上の形
質転換細胞を得た。形質転換細胞の中にはＳ．アベルミ
チリスによって産生した色素メラニンを生じることが４
個見られ、Ｓ．リビダンスにはなかった。形質転換細胞
に胞子形威させ、胞子を集めた。胞子を単一コロニーと
してＲ．ＹＨに塗布し、ブラスミドＤＮＡを調製したと
き、６５％以上のコロニーが平均サイズ約２０ｋｂのイ
ンサートを含むことが観察された。この胞子をＹＥＭＥ
培地に接種するために使用し、プラスミドＤＮＡを迅速
煮沸方法によって調製し、実施例ｌで記載した通り精製
した．このｐｌＪ９２２−Ｓ．アベルξチリスライブラ
リーはＳ．アベルξチリスアベルメクチン突然変異体を
相補したクローンを分離するために使用した。
片への連結反応 連結反応前に、ＣＩＡＰ処理ｐＩＪ９２２、５μｌ，Ｓ
ａｕ３Ａ断片＞３０ｋｂ，１５＃Ｊ、３Ｍ酢゛酸ナトリ
ウムｌＯμＮ．ＴＥ８０μｌ及びエタノール２７５μｌ
を混合してｐｌＪ９２２とＳ．アベル５チリスＳａｕ３
＾断片＞３０ｋｂを同時沈殿させた。−２０℃で一晩温
置した後、ＤＮＡ沈降物を｝１■Ｏｌ７４μｌ、１０Ｘ
リガーゼ緩衝液（０．５Ｍｌ−リスｐＨ７．４，１ ０
０ｍＭ ＭｇＣｌｇ ． １ ０−スパー逅ジン及
び１■／ｄＢｓＡ）２５μ１０．１Ｍジチオトレイトー
ル２５μｌ及び１０ｍＭＡＴＰ２５μｌの混合液に再浮
遊した。この連結反応はＴ４ＤＮＡリガーゼ（ニューイ
ングランドバイオラブス，ベバーリ−Ｍａ）１μｅを加
えて開始し、１３℃で一晩温置した。３回の実験では、
Ｓ．リビダンス原形質体は実施例ｌで記載した連結ミッ
クス１０μｌで形質転換され、ｔｏ．ｏｏｏ個以上の形
質転換細胞を得た。形質転換細胞の中にはＳ．アベルミ
チリスによって産生した色素メラニンを生じることが４
個見られ、Ｓ．リビダンスにはなかった。形質転換細胞
に胞子形威させ、胞子を集めた。胞子を単一コロニーと
してＲ．ＹＨに塗布し、ブラスミドＤＮＡを調製したと
き、６５％以上のコロニーが平均サイズ約２０ｋｂのイ
ンサートを含むことが観察された。この胞子をＹＥＭＥ
培地に接種するために使用し、プラスミドＤＮＡを迅速
煮沸方法によって調製し、実施例ｌで記載した通り精製
した．このｐｌＪ９２２−Ｓ．アベルξチリスライブラ
リーはＳ．アベルξチリスアベルメクチン突然変異体を
相補したクローンを分離するために使用した。
Ｂ．ｐＡＴ１、Ｃ−５アベルメクチンＯ−メチルトラン
スフェラーゼの遺伝子を有するプラスミドの分離 Ｃ−５アベルメクチンＯ−メチルトランスフェラーゼ（
ＯＭＴ−）に欠陥があり、主としてアベルメクチンＢｌ
ａ及びＢ２ａを作る菌株Ｈ＾６２３３の原形質体をｐｌ
Ｊ９２２−Ｓ．アベルミチリスライブラリーで形質転換
した。この形質転換混合液をＲＭＩ４再生培地に塗布し
、２８゜Ｃで温置した．一晩温置した後０． ６％寒天
を有し、チオストレプトン１６５μｇ／ｉｄを含むＲＭ
１４培地の３＃ｌ１！のオーバーレイを加えてＴｈｉｏ
’形質転換細胞を選択した。また２８℃で１２〜１６日
間温置した後、形質転換細胞を個々に無菌のつまようじ
を用いて胞子形或培地Ｄにバッチした．更に２８゜Ｃで
５〜７日間温置した後、胞子形或が明らかであった。次
に０．２５インチのフィルターディスク（シュレイチャ
ー＆シュエル、分析紙＃７４０−Ｅ）を増殖培地Ｅで湿
らし、胞子形戒パッチにこすり、生産培地Ｆに接種する
ために使用した．２８゜Ｃで１２〜１６日間温置した後
菌糸をメタノールで抽出し、抽出液のアリコートをＥ．
メルクシリカゲル６０Ｆ−２５４ＴＬＣプレートに適用
し、アベルメクチンをジクロロメタン：酢酸エチル：メ
タノール９：９：ｌの溶媒混合液を用いて１４分間展開
した。
スフェラーゼの遺伝子を有するプラスミドの分離 Ｃ−５アベルメクチンＯ−メチルトランスフェラーゼ（
ＯＭＴ−）に欠陥があり、主としてアベルメクチンＢｌ
ａ及びＢ２ａを作る菌株Ｈ＾６２３３の原形質体をｐｌ
Ｊ９２２−Ｓ．アベルミチリスライブラリーで形質転換
した。この形質転換混合液をＲＭＩ４再生培地に塗布し
、２８゜Ｃで温置した．一晩温置した後０． ６％寒天
を有し、チオストレプトン１６５μｇ／ｉｄを含むＲＭ
１４培地の３＃ｌ１！のオーバーレイを加えてＴｈｉｏ
’形質転換細胞を選択した。また２８℃で１２〜１６日
間温置した後、形質転換細胞を個々に無菌のつまようじ
を用いて胞子形或培地Ｄにバッチした．更に２８゜Ｃで
５〜７日間温置した後、胞子形或が明らかであった。次
に０．２５インチのフィルターディスク（シュレイチャ
ー＆シュエル、分析紙＃７４０−Ｅ）を増殖培地Ｅで湿
らし、胞子形戒パッチにこすり、生産培地Ｆに接種する
ために使用した．２８゜Ｃで１２〜１６日間温置した後
菌糸をメタノールで抽出し、抽出液のアリコートをＥ．
メルクシリカゲル６０Ｆ−２５４ＴＬＣプレートに適用
し、アベルメクチンをジクロロメタン：酢酸エチル：メ
タノール９：９：ｌの溶媒混合液を用いて１４分間展開
した。
この溶媒系は８種のアベルメクチンを４つのスポットに
分割し、アベルメクチンａ及びｂｌ分は分割されず速い
ものから遅いものまでの順序はアベルメクチンＡｌ，Ａ
２，Ｂｌ，Ｂ２である。これらの条件下でＭＡ６２３３
は２つのスポットを生じこれはアベルメクチンＢ１ａ＋
ｂ及びアベルメクチンＢ２ａ＋ｂを表わす。１０，００
０個以上の形質転換細胞はアベルメクチンＡｌ ａ＋ｂ
及びＡ２ａ＋ｂの生産を選抜した。ｐＡＴ１を含む分離
物はアベルメクチンＡ１ａ＋ｂ１Ａ２ａ＋ｂ，Ｂ１ａ＋
ｂ及びＢ２ａ＋ｂにより同時クロマトグラフイー処理さ
れた４つのスポットを生じることが見い出された。
分割し、アベルメクチンａ及びｂｌ分は分割されず速い
ものから遅いものまでの順序はアベルメクチンＡｌ，Ａ
２，Ｂｌ，Ｂ２である。これらの条件下でＭＡ６２３３
は２つのスポットを生じこれはアベルメクチンＢ１ａ＋
ｂ及びアベルメクチンＢ２ａ＋ｂを表わす。１０，００
０個以上の形質転換細胞はアベルメクチンＡｌ ａ＋ｂ
及びＡ２ａ＋ｂの生産を選抜した。ｐＡＴ１を含む分離
物はアベルメクチンＡ１ａ＋ｂ１Ａ２ａ＋ｂ，Ｂ１ａ＋
ｂ及びＢ２ａ＋ｂにより同時クロマトグラフイー処理さ
れた４つのスポットを生じることが見い出された。
プラスミドＤＮＡはこの分離物から分離されＨ＾６２３
３及び５個のＣ−５０−メチルトランスフェラーゼに欠
陥のある別のＳ．アベルミチリス突然変異体を形質転換
するために使用された。６個全部がアベルメクチンＡ１
ａ＋ｂ及びＡ２ａ＋ｂの生産能を回復した。ｐＡＴ１を
含む突然変異体からのメタノール抽出液のＨＰＬＣ分析
はアベルメクチンＡ１ａ＋ｂとＡ２ａ＋ｂの存在を確認
した。またＣ−５ ０−メチルトランスフェラーゼ活
性はｐＡＴｌをもつＭＡ６２３３で測定し、ｐｌＪ９２
２ベクターを含むＭＡ６２３３とｐｌＪ９２２を含むＯ
ＭＴ″Ｓ．アベルξチリス株と比較した。ＭＡ６２３３
は、ＯＭＴ”株の５％以下のＣ−５ ０−メチルトラ
ンスフェラーゼ活性であったがｐＡＴ１を含ｔ；ＭＡ
６２３３はＯＭＴ”株の８０％以上のＣ−５ ０−メ
チルトランスフエラーゼ活性であった。これはｐＡＴ１
が試験されたＯＭＴ一株の突然変異体を相補するＤＮＡ
を含み、恐ら＜Ｃ−５ ０−メチルトランスフエラー
ゼの遺伝子をエンコードすることを決定的に示している
。
３及び５個のＣ−５０−メチルトランスフェラーゼに欠
陥のある別のＳ．アベルミチリス突然変異体を形質転換
するために使用された。６個全部がアベルメクチンＡ１
ａ＋ｂ及びＡ２ａ＋ｂの生産能を回復した。ｐＡＴ１を
含む突然変異体からのメタノール抽出液のＨＰＬＣ分析
はアベルメクチンＡ１ａ＋ｂとＡ２ａ＋ｂの存在を確認
した。またＣ−５ ０−メチルトランスフェラーゼ活
性はｐＡＴｌをもつＭＡ６２３３で測定し、ｐｌＪ９２
２ベクターを含むＭＡ６２３３とｐｌＪ９２２を含むＯ
ＭＴ″Ｓ．アベルξチリス株と比較した。ＭＡ６２３３
は、ＯＭＴ”株の５％以下のＣ−５ ０−メチルトラ
ンスフェラーゼ活性であったがｐＡＴ１を含ｔ；ＭＡ
６２３３はＯＭＴ”株の８０％以上のＣ−５ ０−メ
チルトランスフエラーゼ活性であった。これはｐＡＴ１
が試験されたＯＭＴ一株の突然変異体を相補するＤＮＡ
を含み、恐ら＜Ｃ−５ ０−メチルトランスフエラー
ゼの遺伝子をエンコードすることを決定的に示している
。
培地Ｅ
ＭｇＳＯａ・７８！Ｏ （１２．５％溶液）ＮａＣ ｌ
（１２． ５％溶液） ＹＩｎＳＯａ ・ｔｌｔｏ （０．５％溶液）ＺｎＳＯ
ａ ’ ７ＨｉＯ（１．０％溶液）ＣａＣ ｌ ！ ・
２８ｚＯ（２．０％溶液）ＦｅＳＯａ ＋ ＩＨｔＯ ＫＮＯ３ ハイケースＳＦ （ハムブコ） 酵母エキス（ジフコ） グルコース トウィーン８０ 蒸留水，最終容量１０００ｄまで加えるＮａＯＨを用い
てｐＨ７．０に調整する培地Ｆ ペプトン化乳 アルダミン グルコース ＭｇＳＯ４・７Ｈ．Ｏ ＣｕＳＯａ ・５Ｈｚ０ ４１Ｉｉ ４ｄ ｌｍ ｌａｄｌ ｌＩｌｌｉ ２５ ■ ２ｇ ２０ ｇ ２０ ｇ ２０ ｇ １００ ■ ２０ ｇ ４ｇ ９０ ｇ ０．５ ｇ ０．０６■ ＺｎＳＯ＊ − ６Ｈｚ０
１ ｍｇＣｏＣｌｇ ・６１１
ｚ０ ０．１
＋＋１ｇＰｅＣｊ！ｚ ・６ｔｈ０
３ ｍｇ寒天
１５ ｇ蒸留水，最終容量１０００−
まで加えるＮａＯＨを用いてＰＨ７．２に調整する。オ
ートクレープにかけた後、フィルター滅菌シクロへキサ
ミド溶液（２．５■／ｍｌ＞ ４ｄとチオストレプト
ン溶液（ジメチルホルムアミド１０■／ｍｆ）ｏ．５ｍ
ｌを加える。
（１２． ５％溶液） ＹＩｎＳＯａ ・ｔｌｔｏ （０．５％溶液）ＺｎＳＯ
ａ ’ ７ＨｉＯ（１．０％溶液）ＣａＣ ｌ ！ ・
２８ｚＯ（２．０％溶液）ＦｅＳＯａ ＋ ＩＨｔＯ ＫＮＯ３ ハイケースＳＦ （ハムブコ） 酵母エキス（ジフコ） グルコース トウィーン８０ 蒸留水，最終容量１０００ｄまで加えるＮａＯＨを用い
てｐＨ７．０に調整する培地Ｆ ペプトン化乳 アルダミン グルコース ＭｇＳＯ４・７Ｈ．Ｏ ＣｕＳＯａ ・５Ｈｚ０ ４１Ｉｉ ４ｄ ｌｍ ｌａｄｌ ｌＩｌｌｉ ２５ ■ ２ｇ ２０ ｇ ２０ ｇ ２０ ｇ １００ ■ ２０ ｇ ４ｇ ９０ ｇ ０．５ ｇ ０．０６■ ＺｎＳＯ＊ − ６Ｈｚ０
１ ｍｇＣｏＣｌｇ ・６１１
ｚ０ ０．１
＋＋１ｇＰｅＣｊ！ｚ ・６ｔｈ０
３ ｍｇ寒天
１５ ｇ蒸留水，最終容量１０００−
まで加えるＮａＯＨを用いてＰＨ７．２に調整する。オ
ートクレープにかけた後、フィルター滅菌シクロへキサ
ミド溶液（２．５■／ｍｌ＞ ４ｄとチオストレプト
ン溶液（ジメチルホルムアミド１０■／ｍｆ）ｏ．５ｍ
ｌを加える。
Ｃ． ｐＡＴ１の確認
ｐＡＴ１は約２０ｋｂのインサートを有し、制限地図は
第１図と表３に示されるｐＡＴＬに対して決定した。
第１図と表３に示されるｐＡＴＬに対して決定した。
ｐＡＴ１は５個の別のＯＭＴ一突然変異体に導入され、
次いで全部がＣ−５にＯ−メトキシをもつ実質量のアベ
ルメクチンを生戒することができた。鮭υ遺伝子の場所
はｐＡＴ１の制限地図の１１．１３ｋｂと１４．５３ｋ
ｂＯ間に位置する３． ４ ｋｂ ＩｌａｍＨ Ｉ断片
に残るように決定された。これは３．４ｋｂ断片をｐＩ
Ｊ９２２のＢａｍＨ １部位にサブクローン化して決定
され ｐＡＴ８３を作製した。ｐＡＴ８３をＭＡ６２３
３に導入されるとき、アベルメクチンＡｌａ＋ｂ，Ａ２
ａ＋ｂ，１３１ａ＋ｂ及びＢ２ａ＋ｂの合戒が許容され
る。
次いで全部がＣ−５にＯ−メトキシをもつ実質量のアベ
ルメクチンを生戒することができた。鮭υ遺伝子の場所
はｐＡＴ１の制限地図の１１．１３ｋｂと１４．５３ｋ
ｂＯ間に位置する３． ４ ｋｂ ＩｌａｍＨ Ｉ断片
に残るように決定された。これは３．４ｋｂ断片をｐＩ
Ｊ９２２のＢａｍＨ １部位にサブクローン化して決定
され ｐＡＴ８３を作製した。ｐＡＴ８３をＭＡ６２３
３に導入されるとき、アベルメクチンＡｌａ＋ｂ，Ａ２
ａ＋ｂ，１３１ａ＋ｂ及びＢ２ａ＋ｂの合戒が許容され
る。
表一」ー
蛙［幻１住
部位
露
部位名
インター６８
（ｂｐ）
コーオーダイネイト
（ｂｐ）
ＢｃｏＲ Ｉ
Ｂａ＊ｌｌ Ｉ
Ｂｇｌ ＩＩ
Ｘｈｏ Ｉ
ＥｃｏＲＶ
ｓｐｈ Ｉ
Ｓｓｔ Ｉ
Ｓｅａ Ｉ
Ｂｇｌ Ｉｆ
Ｂａ＋ｍＨ Ｉ
Ｓｃａ １
Ｂａｗｌ １
κｈｏ １
χｈａ Ｉ
ＢａｍＨ Ｉ
ＢａｍＨ Ｉ
Ｐｓｔ １
ｓｐｈ Ｉ
Ｓｓｔ Ｉ
ＢａｍＨ Ｉ
Ｐｓｔ Ｉ
Ｂａ＋ｗＨ Ｉ
Ｂａｍｌｌ Ｉ
Ｘｈｏ Ｉ
Ｓｓｔ Ｉ
Ｘｈｏ Ｉ
Ｓｓｔ Ｉ
Ｐｓｔ Ｉ
Ｆ！ｃｏＲ Ｉ
１４４Ｂ０
去１０４走
Ｂｇｌ ｎ
Ｘｂａ １
ｓｐｈ Ｉ
Ｓｓｔ Ｉ
Ｎｄｅ Ｉ
ＢｃｏＲＶ
Ｂｇｌ ＩＩ
Ｐｓｔ Ｉ
Ｓｃａ Ｉ
ｓｐｈ Ｉ
ｓｐｈ Ｉ
Ｓｓｔ Ｉ
Ｓｃａ Ｅ
Ｓｐｈ ｒ
Ｓｐｈ ｔ
ｘｈｏ Ｉ
ＥｃｏＲ Ｉ
ｌ０００
２７０？５
プラスミドｐＶＥ６５０をＰＩＪ９２２−ライブラリー
から分離した．原形質体をＳ．アベルミチリス突然変異
体ｌＩＩＡ６２７Ｂ （ＡＧＬ− ， ＯＭＴ一）から
調製した。
から分離した．原形質体をＳ．アベルミチリス突然変異
体ｌＩＩＡ６２７Ｂ （ＡＧＬ− ， ＯＭＴ一）から
調製した。
原形質体２００μｌをライブラリーＤＮＡ約２５ｎｇを
含むＴＥ５μｌで形質転換した．形質転換細胞混合液を
希釈し、ＲＭ１４再生培地に塗布した。
含むＴＥ５μｌで形質転換した．形質転換細胞混合液を
希釈し、ＲＭ１４再生培地に塗布した。
２７℃で２０時間インキヱベートした後、チオストレプ
トン１６５μｇ／一を含むＲＭ１４， ３ ＋ｄをプ
レートにかぶせ温置を１１日間続けた。形質転換プレー
トを４℃に置き次に単一コロニーを胞子形成培地Ｄに無
菌のつまようじで集めた．更に２７〜２８℃で５〜７日
温置した後、胞子形或が明らかであった．次に０．２５
インチのフィルターディスク（シュレイチャー＆シュエ
ル、分析紙＃７４０−Ｅ）を増殖培地Ｅで湿らし、胞子
形成パッチにこすり、生産培地Ｆに接種するために使用
した。
トン１６５μｇ／一を含むＲＭ１４， ３ ＋ｄをプ
レートにかぶせ温置を１１日間続けた。形質転換プレー
トを４℃に置き次に単一コロニーを胞子形成培地Ｄに無
菌のつまようじで集めた．更に２７〜２８℃で５〜７日
温置した後、胞子形或が明らかであった．次に０．２５
インチのフィルターディスク（シュレイチャー＆シュエ
ル、分析紙＃７４０−Ｅ）を増殖培地Ｅで湿らし、胞子
形成パッチにこすり、生産培地Ｆに接種するために使用
した。
２７〜２８℃で１２〜１６日温置した後、菌糸をメタノ
ールで抽出し、抽出液のアリコートをＥ．メルクシリカ
ゲル６０−Ｆ−２５４ＴＬＣプレートに施与し、ジクロ
ロメタン：酢酸エチル：メタノール９：９：１の溶媒混
合液で１４分間アベルメクチンを展開した．これらの条
件下でＭＡ６２７Ｂはアベルメクチンアグリコンを表わ
す４つのスポットを与えた．速いバンドから遅いバンド
までの順序はアベルメクチンアグリコンＡ１ａ＋ｂ，Ａ
２ａ＋ｂ，Ｂ１ａ＋ｂ，Ｂ２ａ＋ｂである， （ＭＡ
６２７８はＯＭＴ−であるが低いＣ−５０−メチルトラ
ンスフエラーゼ活性を保持し、このメチラーゼはグリコ
シル化アベルメクチンより十分にアベルメクチンアグリ
コンＡ１ａ＋ｂとＡ２ａ＋ｂをメチル化することは明ら
かである），３０００個以上の形質転換細胞はグリコシ
ル化アベルメクチンの生産を選抜した． ｐＶＥ６５０
を含む分離物はアベルメクチンＢ１ａ＋ｂとＢ２ａ＋ｂ
により同時クロマトグラブイー処理された２つのスポッ
トを与えることを見い出した．この分離物からプラスξ
ドＤＮＡを分離し、ＭＡ６２７８と２５個の他のオレア
ンドロースをアベルメクチンアグリコンに合威又は付加
するのに欠陥のあるＳ．アベルξチリス突然変異体を形
質転換するために使用した．２１個がオレアンドロース
を含むアベルメクチンの生産能を回復した． ｐＶＢ６５０の制限地図を決定し、表４と第２図に示し
た。オレアンドロースのアベルメクチンアグリコンへの
合或又は付加の遺伝子の位置はｐＶＥ６５０からの断片
をｐｌＪ９２２にサブクローン化し、得られたサブクロ
ーンをアグリコン生産突然変異体に導入して決定した．
少なくとも３種の遺伝子を表わす３種の相補性種類を発
見し、表２に示した。
ールで抽出し、抽出液のアリコートをＥ．メルクシリカ
ゲル６０−Ｆ−２５４ＴＬＣプレートに施与し、ジクロ
ロメタン：酢酸エチル：メタノール９：９：１の溶媒混
合液で１４分間アベルメクチンを展開した．これらの条
件下でＭＡ６２７Ｂはアベルメクチンアグリコンを表わ
す４つのスポットを与えた．速いバンドから遅いバンド
までの順序はアベルメクチンアグリコンＡ１ａ＋ｂ，Ａ
２ａ＋ｂ，Ｂ１ａ＋ｂ，Ｂ２ａ＋ｂである， （ＭＡ
６２７８はＯＭＴ−であるが低いＣ−５０−メチルトラ
ンスフエラーゼ活性を保持し、このメチラーゼはグリコ
シル化アベルメクチンより十分にアベルメクチンアグリ
コンＡ１ａ＋ｂとＡ２ａ＋ｂをメチル化することは明ら
かである），３０００個以上の形質転換細胞はグリコシ
ル化アベルメクチンの生産を選抜した． ｐＶＥ６５０
を含む分離物はアベルメクチンＢ１ａ＋ｂとＢ２ａ＋ｂ
により同時クロマトグラブイー処理された２つのスポッ
トを与えることを見い出した．この分離物からプラスξ
ドＤＮＡを分離し、ＭＡ６２７８と２５個の他のオレア
ンドロースをアベルメクチンアグリコンに合威又は付加
するのに欠陥のあるＳ．アベルξチリス突然変異体を形
質転換するために使用した．２１個がオレアンドロース
を含むアベルメクチンの生産能を回復した． ｐＶＢ６５０の制限地図を決定し、表４と第２図に示し
た。オレアンドロースのアベルメクチンアグリコンへの
合或又は付加の遺伝子の位置はｐＶＥ６５０からの断片
をｐｌＪ９２２にサブクローン化し、得られたサブクロ
ーンをアグリコン生産突然変異体に導入して決定した．
少なくとも３種の遺伝子を表わす３種の相補性種類を発
見し、表２に示した。
糞一エ
ＢｃｏＲ Ｉ
Ｂａ＋＊Ｈ Ｉ
ＢａｍＨ Ｉ
Ｂａｍｌ １
■
部位
薯
部位名
インターバル
（ｂｐ）
ゴー才一ヂイネイト
（ｂｐ）
Ｓｃａ Ｉ
Ｎｒｕ Ｉ
Ｓｔｕ Ｉ
ＢａｍＨ Ｉ
Ｐｓｔ Ｉ
ＢａｔａＨ Ｔ
Ｂｇｌ ＩＩ
Ｐｓｔ Ｉ
Ｂａｓａｌ｛ Ｉ
ＥｃｏＲ Ｉ
ＢａｍＨ Ｉ
Ｂａ＋ｍＨ Ｉ
Ｂａ輪ＩＩ
Ｂｇｌ ＩＩ
Ｂｇｌ ｎ
ＢａｍＨ Ｉ
ＥｃｏＲ Ｉ
Ｂａａ＋Ｈ Ｉ
１２５０
ｉｏｏｏ
ｌ０００
１？７５０
部位
田
部位名
インターバル
（ｂｐ）
コーオーヂイネイト
（ｂｐ）
２３ ８ｇｌ １１ ３９０
２４７３０２４ Ｘｂａ １
４０３０ ２８７６０２５
Ｎｄｅ １ １５６０ ３０
３２０２６ ＨｃｏＲ Ｖ ５０５
３０Ｂ２５２７ ８ｇｌ Ｕ
１３７５ ３２２００２８
Ｐｓｔ Ｉ ９１０ ３
３１１０２９ Ｓｃａ Ｉ ９８
０ ３４０９０３０ Ｓｃａ
Ｉ ３０２０ ３７１１０３１
ＥｃｏＲ Ｉ ６３０
４７８００実見握土 クローン化アベルメクチン遺伝子は発酵生戒物組成：ク
ローン化アベルメクチンＯ−メチルトランスフェラーゼ
遺伝子を変える。
２４７３０２４ Ｘｂａ １
４０３０ ２８７６０２５
Ｎｄｅ １ １５６０ ３０
３２０２６ ＨｃｏＲ Ｖ ５０５
３０Ｂ２５２７ ８ｇｌ Ｕ
１３７５ ３２２００２８
Ｐｓｔ Ｉ ９１０ ３
３１１０２９ Ｓｃａ Ｉ ９８
０ ３４０９０３０ Ｓｃａ
Ｉ ３０２０ ３７１１０３１
ＥｃｏＲ Ｉ ６３０
４７８００実見握土 クローン化アベルメクチン遺伝子は発酵生戒物組成：ク
ローン化アベルメクチンＯ−メチルトランスフェラーゼ
遺伝子を変える。
アベルメクチン生産菌株に於けるプラス逅ドのクローン
化アベルメクチンＯ−メチルトランスフェラーゼ（ＯＭ
Ｔ）の存在は生産したアベルメクチンの組威を変える．
野性型（不変）染色体ＯＭＴ遺伝子を含むＳ．アベルミ
チリス株はＡｔｃ分としてＣ−５にメトキシ基をもつ約
３１％のアベルメクチンとＢ戒分としてＣ−５にヒドロ
キシル基をもつ約６９％のアベルメクチンを生産する．
アベルメクチンＯ−メチルトランスフエラーゼに欠陥の
ある突然変異体株１’ｌＡ６２３３はＡ威分として４％
のアベルメクチンだけをＢ戒分として９６％のアベルメ
クチンを生産する．ＯＭＴ遺伝子を含むプラスミドｐＡ
Ｔ１を突然変異体株ＭＡ６２３３に形質転換するとき、
アベルメクチン，ｍｔｃは、Ａ戒分として２６％のアベ
ルメクチンＢ威分として７４％のアベルメクチンをもつ
野性型菌株レベルにほとんど回復する． ｐＡＴ１を機
能野性型ＯＭＴ遺伝子をもつ菌株に形質転換するとき、
アベルメクチンＡｔｃ分のレベルは６６％に著しく増加
するがアベルメクチンＢ威分の割合は３４％に減少する
．これらの実験は、アベルメクチン生産株のクローン化
遺伝子の存在が発酵生産物組戒を変えることができアベ
ルメクチンＡＩ及びＡ２の効率のよい製造方法をもたら
す具体例を与える． ｐＡＴｌは、二次代謝産物を生産する他のストレプトミ
セス株に形質転換されるとき、最初の実施例と同じ方法
でこれらの発酵を変えることができ、天然発酵生産物の
メチル化誘導体の生産をもたらすことができる．これら
の新規な誘導体はより強力であり、改良された活性スペ
クトルをもつことができる． イケダ等はアベルメクチンアグリコンの合成に対する遺
伝子がオレアンドロース部分のアベルメクチンアグリコ
ンへの合威又は付加の遺伝子に遺伝子的に結合されるこ
とを証明している。従ってアベルメクチン生合威の他の
遺伝子はｐＡＴ１やｐＶＥ６５０クローンのインサー｝
ＤＮＡに隣接したＤＮＡを分離してクローン化すること
ができる。
化アベルメクチンＯ−メチルトランスフェラーゼ（ＯＭ
Ｔ）の存在は生産したアベルメクチンの組威を変える．
野性型（不変）染色体ＯＭＴ遺伝子を含むＳ．アベルミ
チリス株はＡｔｃ分としてＣ−５にメトキシ基をもつ約
３１％のアベルメクチンとＢ戒分としてＣ−５にヒドロ
キシル基をもつ約６９％のアベルメクチンを生産する．
アベルメクチンＯ−メチルトランスフエラーゼに欠陥の
ある突然変異体株１’ｌＡ６２３３はＡ威分として４％
のアベルメクチンだけをＢ戒分として９６％のアベルメ
クチンを生産する．ＯＭＴ遺伝子を含むプラスミドｐＡ
Ｔ１を突然変異体株ＭＡ６２３３に形質転換するとき、
アベルメクチン，ｍｔｃは、Ａ戒分として２６％のアベ
ルメクチンＢ威分として７４％のアベルメクチンをもつ
野性型菌株レベルにほとんど回復する． ｐＡＴ１を機
能野性型ＯＭＴ遺伝子をもつ菌株に形質転換するとき、
アベルメクチンＡｔｃ分のレベルは６６％に著しく増加
するがアベルメクチンＢ威分の割合は３４％に減少する
．これらの実験は、アベルメクチン生産株のクローン化
遺伝子の存在が発酵生産物組戒を変えることができアベ
ルメクチンＡＩ及びＡ２の効率のよい製造方法をもたら
す具体例を与える． ｐＡＴｌは、二次代謝産物を生産する他のストレプトミ
セス株に形質転換されるとき、最初の実施例と同じ方法
でこれらの発酵を変えることができ、天然発酵生産物の
メチル化誘導体の生産をもたらすことができる．これら
の新規な誘導体はより強力であり、改良された活性スペ
クトルをもつことができる． イケダ等はアベルメクチンアグリコンの合成に対する遺
伝子がオレアンドロース部分のアベルメクチンアグリコ
ンへの合威又は付加の遺伝子に遺伝子的に結合されるこ
とを証明している。従ってアベルメクチン生合威の他の
遺伝子はｐＡＴ１やｐＶＥ６５０クローンのインサー｝
ＤＮＡに隣接したＤＮＡを分離してクローン化すること
ができる。
ｐＶＥ６５０のインサートに隣接したＤＮＡはＳ．アベ
ルミチリスＤＮＡのコス旦ドライブラリーから分離した
。使用したコスミドベクターはｐＶＥ３２８であり、コ
スミドベクターはアンピシリン耐性（Ａｍｐ’）を付与
する大腸菌及びＴｈｉｏ’を付与するストレプトミセス
で複製することができる． ｐＶＩｌ！３２８はサイ
ズが７．５ｋｂＬかないので４３ｋｂまでのＤＮＡ断片
をクローン化することができ、ｐＶＥ３２８は２つのＡ
ｃｏｓ部位を含むので試験管内でファージヘッドに効率
よくパッケージすることができる．ｐＶＥ３２８もまた
Ｄｒａ １部位に隣接したユニークなＢｇｌ ＩＩ及び
Ｈｐａ Ｉクローニング部位を含む．ＢｇｌＩ！クロー
ニング部位はＧＡＴＣ末端を有する断片を取込みＢａｎ
＋ＨＴ． ＢｇｌＩＩ， Ｂｅｌｌ， Ｘｈｏ Ｉ
Ｉ及びＭｂｏ Ｉが生じる。Ｈｐａ Ｉ部位はプラント
エンド断片をクローン化するために使用することができ
る．ストレプトミセスＤＮＡが高Ｇ＋Ｃ比、しばしば７
０％以上をもつことから、Ｄｒａ １部位ＴＴＴＡＡＡ
は極めてまれである（３００ｋｂ当り１つ）。従ってＢ
ｇｌ■又はｌｌｐａ１部位にクローン化したほとんどの
断片は後の分析や操作のためにＤｒａ Ｉと共に削除す
ることができる．結局ベクターは広い宿主範囲のストレ
プトミセススアージＴＧ１ｃｏｓ部位を含む．この部位
は生体内でＴＧＩへルパーファージによってｐＶＥ３２
８誘導体をＴＧＩビリオンにパッケージするために使用
することができる。次いでｐＶＥ３２８誘導体で増殖し
たＴＧＩ溶解物はｐＶＥ３２８誘導体をファージ仲介形
質導入によって他のストレブトミセスに導入するために
使用することができる。
ルミチリスＤＮＡのコス旦ドライブラリーから分離した
。使用したコスミドベクターはｐＶＥ３２８であり、コ
スミドベクターはアンピシリン耐性（Ａｍｐ’）を付与
する大腸菌及びＴｈｉｏ’を付与するストレプトミセス
で複製することができる． ｐＶＩｌ！３２８はサイ
ズが７．５ｋｂＬかないので４３ｋｂまでのＤＮＡ断片
をクローン化することができ、ｐＶＥ３２８は２つのＡ
ｃｏｓ部位を含むので試験管内でファージヘッドに効率
よくパッケージすることができる．ｐＶＥ３２８もまた
Ｄｒａ １部位に隣接したユニークなＢｇｌ ＩＩ及び
Ｈｐａ Ｉクローニング部位を含む．ＢｇｌＩ！クロー
ニング部位はＧＡＴＣ末端を有する断片を取込みＢａｎ
＋ＨＴ． ＢｇｌＩＩ， Ｂｅｌｌ， Ｘｈｏ Ｉ
Ｉ及びＭｂｏ Ｉが生じる。Ｈｐａ Ｉ部位はプラント
エンド断片をクローン化するために使用することができ
る．ストレプトミセスＤＮＡが高Ｇ＋Ｃ比、しばしば７
０％以上をもつことから、Ｄｒａ １部位ＴＴＴＡＡＡ
は極めてまれである（３００ｋｂ当り１つ）。従ってＢ
ｇｌ■又はｌｌｐａ１部位にクローン化したほとんどの
断片は後の分析や操作のためにＤｒａ Ｉと共に削除す
ることができる．結局ベクターは広い宿主範囲のストレ
プトミセススアージＴＧ１ｃｏｓ部位を含む．この部位
は生体内でＴＧＩへルパーファージによってｐＶＥ３２
８誘導体をＴＧＩビリオンにパッケージするために使用
することができる。次いでｐＶＥ３２８誘導体で増殖し
たＴＧＩ溶解物はｐＶＥ３２８誘導体をファージ仲介形
質導入によって他のストレブトミセスに導入するために
使用することができる。
この手法は形質転換より技術的に簡単であり、宿主を拡
大し、クローンを導入することができる。
大し、クローンを導入することができる。
ｐＶＥ３２８は上記マニアチス等の操作とほとんど違わ
ない標準組換え体ＤＮＡテクノロジーを用いて作製した
。
ない標準組換え体ＤＮＡテクノロジーを用いて作製した
。
出発プラスごドはリンク マイヤーズ（ＲｉｃｋＭｙｅ
ｒｓ）からＦ１フーア（Ｆｏｏｒ）を経て入手したｐｓ
ＶＯ１０ Ｘ ２である。ｐｓＶＯ１０ Ｘ ２は２つ
の多重クローニング領域といくつかのＳＶ４０ＤＮＡを
含むｐＢＲ３２２の欠失誘導体である。１本の多重クロ
ーニング領域を含み、ＳＶ４０ＤＮＡのなイｐＳＶＯ１
０ Ｘ ２の誘導体を複合連結反応の後に分離した。こ
の連結反応はｐｓＶＯ１０ Ｘ ２の２つの消化（１つ
はＰｓｔｌ、Ｈｉｎｄ ｍ ， Ｐｖｕ Ｉを用いもう
１つはＢａｍｌｌ Ｉ ％旧ｎｄＩ［Ｉ，Ｐｖｕ Ｉを
用いる）とＰＭＣ１４０３ （Ｍ．カサダバン．シカゴ
大学から入手）のＢａｓＨ Ｉ ， Ｐｓｔ Ｉ及び
Ｐｖｕ Ｉｆによる消化を含む．この連結反応の生戒物
中にはｐＶＥ６１と呼ばれる２ｋｂブラス〔ドがあり、
酵素ＥｃｏＲ Ｉ ． Ｓａｇａ Ｉ ＊ Ｂａｍ
Ｈ Ｉ ， Ｐｓｔ Ｉ ＊ ＢｇｌＩＩ， ．Ｘ
ｂａＩ及び旧ｎｄｌｌＩに対して多重クローニング領域
含有部位をもつことが見い出された．このプラスくドは
ｐＶＥ８１からの４ ０ ５ｂｐ Ｈｉｎｃ Ｉｆ ｃ
ｏｓ断片をｐＶＥ６１のユニークなＳｓ＋ａ Ｉ部位に
加えて大腸菌λコスミドに変換してｐＶＥ１０５を得た
。ｐＶＥ８１のｃｏｓ ｊｉｌ域はλからの３． ２
ｋｂ ＥｃｏＲ Ｉ − Ｂｇｌ Ｉｆ断片としてｐＢ
Ｒ３２２のｆ！ｃｏＲ Ｉ − Ｒａｍ＋Ｈ Ｉに予め
クローン化されてイテｐＶＥ８１を得たｅ ＰＶＩ！１
０５（７）ａｓｐ遺伝子のＰｓｔ１部位はｐＶＥ１０５
のＢｇｌ Ｉ −Ａａｔ ＩＩ断片をｐＵｃ８のＢｇｌ
Ｉ 〜Ａａｔ ＩＩ断片（ベセスダリサーチラボラト
リーズ．ゲイセルスブルグ，ＭＤ）に置き換えて取り除
いた．このコスミドはストレプト逅セスブラスミドｐＶ
［！９５をｐＶ［！１６７に連結してシャトルコスミド
にした， ｐＶ［！９５はｐＶＥ２ＢをＳｓｔＩｔ’消
化し次に連結した後分離したｐＶＥ２Ｂの安定なＴｈｉ
ｏ’欠失誘導体である， ｐＶＥ９５をそのユニークな
Ｂｇｌ■部位で直線にし、そのユニークなＢａｍＨ １
部位で直線にしたｐＶｔｉ１６３に結合してｐＶＥ１６
７を得た．ユニークなクローニング部位を合成オリゴヌ
クレオチド配列 ５ ＧＡＴＣＧＴＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＣＡＧＡ
ＴＣＴＴＴＡＡＡＧ ３’３’ ＣＡＡＡＴ
ＴＴＣＡＡＴＴＧＴＣＴＡＧＡＡＡＴＴＴＣＣＴＡＧ
５’の連結によってＢａｌｌ１部位で直線にしたｐ
ＶＥ１６７に導入した．二本鎖オリゴヌクレオチドは各
々１本鎖２９ｍｅｒｌＯ＃ｇをＴＥ５０μｌ中で一緒に
調製し、この混合物を８５℃で５分間加熱し、徐々に室
温に冷やし、４℃で一晩貯蔵した。ｐＶＥ１６７１％μ
ｇを５０倍モル過剰量のアニールしたオリゴヌクレオチ
ドと混合しＴ４ＤＮＡリガーゼと結合した。Ａｎ＋ｐ’
形質転換細胞の中にオリゴヌクレオチドの１本のコピー
を同定しｐＶＥ２３２と呼んだ．ｐＶＥ２３２はＴＧＩ
ｃｏｓ部位を含む２ ７ ０ ｂｐ ＥｃｏＲＶ −
１１ｐａｌ断片を加えてストレプトミセスファージｒｃ
ｔコスｓドに変換した， ｐＶＥ２３２をそ（７）Ｘｂ
ａ１部位で直線にし、この部位をポリメラーゼクレノウ
フラグメント（ベセスダリサーチラボラトリーズ，ゲイ
セルスブルグ，ＭＤ）で処理してプラントにし、Ｈｐａ
ＩとＥｃｏＲ Ｖで切断されたＴＧＩに結合した。
ｒｓ）からＦ１フーア（Ｆｏｏｒ）を経て入手したｐｓ
ＶＯ１０ Ｘ ２である。ｐｓＶＯ１０ Ｘ ２は２つ
の多重クローニング領域といくつかのＳＶ４０ＤＮＡを
含むｐＢＲ３２２の欠失誘導体である。１本の多重クロ
ーニング領域を含み、ＳＶ４０ＤＮＡのなイｐＳＶＯ１
０ Ｘ ２の誘導体を複合連結反応の後に分離した。こ
の連結反応はｐｓＶＯ１０ Ｘ ２の２つの消化（１つ
はＰｓｔｌ、Ｈｉｎｄ ｍ ， Ｐｖｕ Ｉを用いもう
１つはＢａｍｌｌ Ｉ ％旧ｎｄＩ［Ｉ，Ｐｖｕ Ｉを
用いる）とＰＭＣ１４０３ （Ｍ．カサダバン．シカゴ
大学から入手）のＢａｓＨ Ｉ ， Ｐｓｔ Ｉ及び
Ｐｖｕ Ｉｆによる消化を含む．この連結反応の生戒物
中にはｐＶＥ６１と呼ばれる２ｋｂブラス〔ドがあり、
酵素ＥｃｏＲ Ｉ ． Ｓａｇａ Ｉ ＊ Ｂａｍ
Ｈ Ｉ ， Ｐｓｔ Ｉ ＊ ＢｇｌＩＩ， ．Ｘ
ｂａＩ及び旧ｎｄｌｌＩに対して多重クローニング領域
含有部位をもつことが見い出された．このプラスくドは
ｐＶＥ８１からの４ ０ ５ｂｐ Ｈｉｎｃ Ｉｆ ｃ
ｏｓ断片をｐＶＥ６１のユニークなＳｓ＋ａ Ｉ部位に
加えて大腸菌λコスミドに変換してｐＶＥ１０５を得た
。ｐＶＥ８１のｃｏｓ ｊｉｌ域はλからの３． ２
ｋｂ ＥｃｏＲ Ｉ − Ｂｇｌ Ｉｆ断片としてｐＢ
Ｒ３２２のｆ！ｃｏＲ Ｉ − Ｒａｍ＋Ｈ Ｉに予め
クローン化されてイテｐＶＥ８１を得たｅ ＰＶＩ！１
０５（７）ａｓｐ遺伝子のＰｓｔ１部位はｐＶＥ１０５
のＢｇｌ Ｉ −Ａａｔ ＩＩ断片をｐＵｃ８のＢｇｌ
Ｉ 〜Ａａｔ ＩＩ断片（ベセスダリサーチラボラト
リーズ．ゲイセルスブルグ，ＭＤ）に置き換えて取り除
いた．このコスミドはストレプト逅セスブラスミドｐＶ
［！９５をｐＶ［！１６７に連結してシャトルコスミド
にした， ｐＶ［！９５はｐＶＥ２ＢをＳｓｔＩｔ’消
化し次に連結した後分離したｐＶＥ２Ｂの安定なＴｈｉ
ｏ’欠失誘導体である， ｐＶＥ９５をそのユニークな
Ｂｇｌ■部位で直線にし、そのユニークなＢａｍＨ １
部位で直線にしたｐＶｔｉ１６３に結合してｐＶＥ１６
７を得た．ユニークなクローニング部位を合成オリゴヌ
クレオチド配列 ５ ＧＡＴＣＧＴＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＣＡＧＡ
ＴＣＴＴＴＡＡＡＧ ３’３’ ＣＡＡＡＴ
ＴＴＣＡＡＴＴＧＴＣＴＡＧＡＡＡＴＴＴＣＣＴＡＧ
５’の連結によってＢａｌｌ１部位で直線にしたｐ
ＶＥ１６７に導入した．二本鎖オリゴヌクレオチドは各
々１本鎖２９ｍｅｒｌＯ＃ｇをＴＥ５０μｌ中で一緒に
調製し、この混合物を８５℃で５分間加熱し、徐々に室
温に冷やし、４℃で一晩貯蔵した。ｐＶＥ１６７１％μ
ｇを５０倍モル過剰量のアニールしたオリゴヌクレオチ
ドと混合しＴ４ＤＮＡリガーゼと結合した。Ａｎ＋ｐ’
形質転換細胞の中にオリゴヌクレオチドの１本のコピー
を同定しｐＶＥ２３２と呼んだ．ｐＶＥ２３２はＴＧＩ
ｃｏｓ部位を含む２ ７ ０ ｂｐ ＥｃｏＲＶ −
１１ｐａｌ断片を加えてストレプトミセスファージｒｃ
ｔコスｓドに変換した， ｐＶＥ２３２をそ（７）Ｘｂ
ａ１部位で直線にし、この部位をポリメラーゼクレノウ
フラグメント（ベセスダリサーチラボラトリーズ，ゲイ
セルスブルグ，ＭＤ）で処理してプラントにし、Ｈｐａ
ＩとＥｃｏＲ Ｖで切断されたＴＧＩに結合した。
ｐＶＥ２８８を２ ７ ０ｂｐ ｃｏｓ断片を含む誘導
体トシて同定した。Ｈｐａ Ｉ − ＥｃｏＲＶ断片の
Ｘｂａ Ｉ充填部位への挿入が２つのκｈａ１部位を再
生することからＴＧＩ ｃｏｓ断片はｐＶＥ２８８から
Ｘｂａ Ｉで切断することができる．２番目のＡｃｏｓ
部位はＥｃｏＲ Ｉで消化した後ｐＶ［！２８８に挿入
され、ＤＮＡポリメラーゼクレノウ断片で処理される．
得られたｐＶＥ２８８のプラントエンド直線分子は旧ｎ
ａｉｌで消化したｐＶ［！８１に結合し、同じ配向で２
つのＡｃｏｓ部位を有する誘導体を同定し、ｐＶＩｌ！
３２Ｂと呼んだ．一次クローニング部位、Ｂｇｌ ＩＩ
は第４図では＊＊によって示される． Ｓ．アベル逅チリスＤＮＡのライブラリーはコスミドベ
クターｐＶＥ３２Ｂで調製した．一部消化したＳａｕ３
Ａ 処理Ｓ ．アベルミチリス染色体ＤＮＡを１５〜４
０％スクロース勾配で分離した。３５〜４５ｋｂの断片
を含む両分をプールし、スクロースをＴＥｉｌ衝液で透
析して除去し、断片をエタノール沈殿で濃縮した．断片
約３ ｕ ｇ ＠ｐＶＥ３２８、０．５〜０．２μｇと
全容量２０ａｌｌで混合した．ｐＶＥ３２８ＤＮＡは予
め１つのＢｇｌ Ｉ１部位で切断されておりＣＩＡＰで
処理した．Ｔ４ＤＮＡリガーゼと１２℃で１６時間連結
した後、ＤＮＡ混合液４μｌをアンバーシャムλ試験管
内パッケージングキットでファージにパッケージした．
コスξドライブラリーをＡｓｐ″″を選択する大腸菌株
ＲＲＩに導入した，２０１６の形質導入体をアンピシリ
ン７５μｇ／ａｔを有するＬＢ培地０．１５ｍを含むξ
クロ力価皿の細胞に個々に集め、３７℃で一晩増殖し、
ジメチルスルホキシドｌ５μｌを加え、このプレートを
シールーＡ−ミールバッグに閉じ、ドライアイス／エタ
ノール浴で迅速凍結し、−８０℃で貯蔵した。これはＳ
．アベル果チリスのコスミドライブラリーである． コスミドライブラリーからのＤＮＡを含むフィルターは
ＬＢａｍｐ寒天（アンピシリン７５μｇ／ｄ）によりラ
イブラリーのレプリカを増殖して調製した，２０１６の
クローンの培養液を凍結する前に各培養液からの５μｌ
アリコートを８×１２パターンでＬＢａｍｐ寒天（アン
ビシリン７５μｇ／一）に移した．３７℃で一晩温置し
た後、ＩＣＮバイオトランスナイロン膜（１．２μ規格
）をコロニー上に１時間置き、３７℃で温置を続け次に
フィルターをコロニー側を上にしてＬＢ−ａｍｐ寒天に
移し、更に４時間３７℃で温置した。次にフィルターを
ＬＢ−ａｓｐ−ｃａｓ＋寒天（クロラムフェニコール５
０μｇ／一）に移し、３７℃で一晩温置した。
体トシて同定した。Ｈｐａ Ｉ − ＥｃｏＲＶ断片の
Ｘｂａ Ｉ充填部位への挿入が２つのκｈａ１部位を再
生することからＴＧＩ ｃｏｓ断片はｐＶＥ２８８から
Ｘｂａ Ｉで切断することができる．２番目のＡｃｏｓ
部位はＥｃｏＲ Ｉで消化した後ｐＶ［！２８８に挿入
され、ＤＮＡポリメラーゼクレノウ断片で処理される．
得られたｐＶＥ２８８のプラントエンド直線分子は旧ｎ
ａｉｌで消化したｐＶ［！８１に結合し、同じ配向で２
つのＡｃｏｓ部位を有する誘導体を同定し、ｐＶＩｌ！
３２Ｂと呼んだ．一次クローニング部位、Ｂｇｌ ＩＩ
は第４図では＊＊によって示される． Ｓ．アベル逅チリスＤＮＡのライブラリーはコスミドベ
クターｐＶＥ３２Ｂで調製した．一部消化したＳａｕ３
Ａ 処理Ｓ ．アベルミチリス染色体ＤＮＡを１５〜４
０％スクロース勾配で分離した。３５〜４５ｋｂの断片
を含む両分をプールし、スクロースをＴＥｉｌ衝液で透
析して除去し、断片をエタノール沈殿で濃縮した．断片
約３ ｕ ｇ ＠ｐＶＥ３２８、０．５〜０．２μｇと
全容量２０ａｌｌで混合した．ｐＶＥ３２８ＤＮＡは予
め１つのＢｇｌ Ｉ１部位で切断されておりＣＩＡＰで
処理した．Ｔ４ＤＮＡリガーゼと１２℃で１６時間連結
した後、ＤＮＡ混合液４μｌをアンバーシャムλ試験管
内パッケージングキットでファージにパッケージした．
コスξドライブラリーをＡｓｐ″″を選択する大腸菌株
ＲＲＩに導入した，２０１６の形質導入体をアンピシリ
ン７５μｇ／ａｔを有するＬＢ培地０．１５ｍを含むξ
クロ力価皿の細胞に個々に集め、３７℃で一晩増殖し、
ジメチルスルホキシドｌ５μｌを加え、このプレートを
シールーＡ−ミールバッグに閉じ、ドライアイス／エタ
ノール浴で迅速凍結し、−８０℃で貯蔵した。これはＳ
．アベル果チリスのコスミドライブラリーである． コスミドライブラリーからのＤＮＡを含むフィルターは
ＬＢａｍｐ寒天（アンピシリン７５μｇ／ｄ）によりラ
イブラリーのレプリカを増殖して調製した，２０１６の
クローンの培養液を凍結する前に各培養液からの５μｌ
アリコートを８×１２パターンでＬＢａｍｐ寒天（アン
ビシリン７５μｇ／一）に移した．３７℃で一晩温置し
た後、ＩＣＮバイオトランスナイロン膜（１．２μ規格
）をコロニー上に１時間置き、３７℃で温置を続け次に
フィルターをコロニー側を上にしてＬＢ−ａｍｐ寒天に
移し、更に４時間３７℃で温置した。次にフィルターを
ＬＢ−ａｓｐ−ｃａｓ＋寒天（クロラムフェニコール５
０μｇ／一）に移し、３７℃で一晩温置した。
ＤＮＡを細胞から放し、フィルターを種々の溶液で飽和
した一連のホワットマン３ＭＭフィルターに移してフィ
ルターに固定した．各移動の間にフィルターを３ＭＭ乾
燥紙上に置き、余分の溶液を吸い取った．フィルターを
１０％ＳＤＳで飽和した３ＭＭに室温で５分間移し、次
にフィルターを０．５Ｎ ＮａＯＨ， １．５ ＮＮａ
Ｃｌで飽和した３ＭＭに室温で５分間移して細胞を溶解
し、次いで１００℃のスチームキャビネットに５分間入
れた。フィルターを０． ５ Ｍ トリスｐＨ７．９．
１．５ Ｎ Ｍａｃ１で飽和した３ＭＭに移して中
和し、室温で５分間温置した。次いでフィルターを２Ｘ
ＳＳＣ （ＳＳＣは０．１ ５ Ｍ ＭａＣＩｌ．
０．０ １ ５Ｍクエン酸三ナトリウム，ｐｌｌ７．ｏ
）の溶液で２秒間浸し、９５％エタノールにｌＯ秒間浸
し、風乾し、真空オーブン中８０℃で１時間焼いた．残
余の細胞片はフィルターを６５℃に於でｌ％ＳＯＳ，３
ＸＳＳＣで１回ｌ５分ずつ３回洗浄して除去した。洗浄
後フィルターを２ＸＳＳＣに浸し、３ＭＭ紙上で風乾し
、使用するまで４℃でおいた。
した一連のホワットマン３ＭＭフィルターに移してフィ
ルターに固定した．各移動の間にフィルターを３ＭＭ乾
燥紙上に置き、余分の溶液を吸い取った．フィルターを
１０％ＳＤＳで飽和した３ＭＭに室温で５分間移し、次
にフィルターを０．５Ｎ ＮａＯＨ， １．５ ＮＮａ
Ｃｌで飽和した３ＭＭに室温で５分間移して細胞を溶解
し、次いで１００℃のスチームキャビネットに５分間入
れた。フィルターを０． ５ Ｍ トリスｐＨ７．９．
１．５ Ｎ Ｍａｃ１で飽和した３ＭＭに移して中
和し、室温で５分間温置した。次いでフィルターを２Ｘ
ＳＳＣ （ＳＳＣは０．１ ５ Ｍ ＭａＣＩｌ．
０．０ １ ５Ｍクエン酸三ナトリウム，ｐｌｌ７．ｏ
）の溶液で２秒間浸し、９５％エタノールにｌＯ秒間浸
し、風乾し、真空オーブン中８０℃で１時間焼いた．残
余の細胞片はフィルターを６５℃に於でｌ％ＳＯＳ，３
ＸＳＳＣで１回ｌ５分ずつ３回洗浄して除去した。洗浄
後フィルターを２ＸＳＳＣに浸し、３ＭＭ紙上で風乾し
、使用するまで４℃でおいた。
各々９６コスξドクローンからのＤＮＡを含む２１フィ
ルターをプラスミドｐＶＥ６５０端からの１．０９ｋｂ
ＢａｓＨ Ｉ断片を用いてブローブした。このＤＮＡ
をランダムブライミングキット（Ｕ．Ｓ．バイオケミカ
ルス，クリープランド．ＯＨ）を用いて３２−ＰｄＣＴ
Ｐで標識した。ＴＥ５μｌ中の精製１． ０ ９ ｋｂ
Ｂａｓｌｌ Ｉ断片（０．５μｇ）を９５℃で１０分
間加熱し、氷でＩＯ分間冷却して変性した。
ルターをプラスミドｐＶＥ６５０端からの１．０９ｋｂ
ＢａｓＨ Ｉ断片を用いてブローブした。このＤＮＡ
をランダムブライミングキット（Ｕ．Ｓ．バイオケミカ
ルス，クリープランド．ＯＨ）を用いて３２−ＰｄＣＴ
Ｐで標識した。ＴＥ５μｌ中の精製１． ０ ９ ｋｂ
Ｂａｓｌｌ Ｉ断片（０．５μｇ）を９５℃で１０分
間加熱し、氷でＩＯ分間冷却して変性した。
次のｄＡＴＰ ： ｄＴＴＰ ： ｄＧＴＰの
１：１：１の混合液３μｌ、ランダムへキサヌクレオチ
ドを含む１０Ｘ反応混合液２μｌ、１１２０３μｌ、［
”Ｐ ］ｄＣＴＰ （比活性３０００Ｃｉ／ミリモル）
５μｌ及びクレノウ酵素１μｌをＤＮＡに加えた．この
混合液を混合し、１０秒間ミクロフェージし、次いで３
７℃で３０分間温置した． ０． ２ ５Ｍ ＥＤＴＡ
， ｐＨ８．２μｌを加えて反応を終結した．標識１．
０９ｋｂ断片を４℃で３分間１２．００Ｏ ｒｐｍによ
り遠心分離してセントリーセプカラム（プリンストン
セパレーションズ，アデルフィア，ＮＪ）に通過させた
。２１フィルターの各々を別個のプラスチックシールー
Ａ−ミールバソグ＃６００６ （デージー社，インダス
トリアルエアポート．ＫＳ）に入れ、前ハイブリッド形
戒溶液９．５−を加えバッグを加熱密封した．前ハイブ
リッド形成溶液は０．７５ＭＮａＣ ｌ、０．０７５Ｍ
クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０． １％フイコー
ル、０．１％ポリビニルビロリジノン、０．１％ＢＳＡ
，５０％ホルムアミド、０．１％ＳＤＳ及びせん断され
たヘリングスペルム（ｈｅｒｒｉｎｇ ｓｐｅｒｍ）
Ｄ Ｎ Ａを含有し沸騰水浴中で１０分間加熱変性した
。４３℃で３時間温置した後、前ハイブリッド形戒溶液
を除去し、ハイブリッド形威溶液を２１フィルターの各
々を含む同じバッグに加えた。ハイブリソド形或溶液は
、前ハイブリッド溶液を変性しｌＯ％デキストランスル
フエートを含有させた。
１：１：１の混合液３μｌ、ランダムへキサヌクレオチ
ドを含む１０Ｘ反応混合液２μｌ、１１２０３μｌ、［
”Ｐ ］ｄＣＴＰ （比活性３０００Ｃｉ／ミリモル）
５μｌ及びクレノウ酵素１μｌをＤＮＡに加えた．この
混合液を混合し、１０秒間ミクロフェージし、次いで３
７℃で３０分間温置した． ０． ２ ５Ｍ ＥＤＴＡ
， ｐＨ８．２μｌを加えて反応を終結した．標識１．
０９ｋｂ断片を４℃で３分間１２．００Ｏ ｒｐｍによ
り遠心分離してセントリーセプカラム（プリンストン
セパレーションズ，アデルフィア，ＮＪ）に通過させた
。２１フィルターの各々を別個のプラスチックシールー
Ａ−ミールバソグ＃６００６ （デージー社，インダス
トリアルエアポート．ＫＳ）に入れ、前ハイブリッド形
戒溶液９．５−を加えバッグを加熱密封した．前ハイブ
リッド形成溶液は０．７５ＭＮａＣ ｌ、０．０７５Ｍ
クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０． １％フイコー
ル、０．１％ポリビニルビロリジノン、０．１％ＢＳＡ
，５０％ホルムアミド、０．１％ＳＤＳ及びせん断され
たヘリングスペルム（ｈｅｒｒｉｎｇ ｓｐｅｒｍ）
Ｄ Ｎ Ａを含有し沸騰水浴中で１０分間加熱変性した
。４３℃で３時間温置した後、前ハイブリッド形戒溶液
を除去し、ハイブリッド形威溶液を２１フィルターの各
々を含む同じバッグに加えた。ハイブリソド形或溶液は
、前ハイブリッド溶液を変性しｌＯ％デキストランスル
フエートを含有させた。
プローブを９５℃で１０分間加熱し、次いで氷上に置い
た。２Ｘ１０’カウントの全量を各ハイブリッドバッグ
に加え、バッグを加熱密封した。
た。２Ｘ１０’カウントの全量を各ハイブリッドバッグ
に加え、バッグを加熱密封した。
密封後ハイブリッド形成溶液中に一様にプローフを分配
するようにした．ハイブリッド形威は水浴中４３℃で一
晩ゆっくりと攪拌しながら行なった．１８時間後バッグ
からフィルターを取り除き室温に於て０．３Ｍ ＮａＣ
ｌ， ０．０ ３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐｌｌ７．０
、ｌ％ＳＤＳで２回すすいだ。次いでフィルターを０．
３ＭＮａＣｊ！、０． ０ ３ Ｍクエン酸ナトリウム
、ｐｌ＋７．０、０． １％ＳＤＳで２回４３℃で１５
分間洗浄した。次にフィルターを０．０１５ＭＮａＣｌ
， ０．０ ０ １ ５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７
．０，０．１％ＳＤＳで２回４３℃でｌＯ分間、０．
０ ｌ ５ Ｍ ＮａＣｌ、０．００１５Ｍクエン酸ナ
トリウム、ＰＨ１．０、０． １％ＳＤＳで２回６０℃
で１０分間洗浄した。フィルターを全てホヮットマン３
ＭＭｇに吸い取り、ＸｗＡフィルム（コダックＸ−ＯＭ
＾Ｔ ＡＲ−５ ）に１４日間さらした。この最初スク
リーンは推定８１のクローンを与えた。
するようにした．ハイブリッド形威は水浴中４３℃で一
晩ゆっくりと攪拌しながら行なった．１８時間後バッグ
からフィルターを取り除き室温に於て０．３Ｍ ＮａＣ
ｌ， ０．０ ３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐｌｌ７．０
、ｌ％ＳＤＳで２回すすいだ。次いでフィルターを０．
３ＭＮａＣｊ！、０． ０ ３ Ｍクエン酸ナトリウム
、ｐｌ＋７．０、０． １％ＳＤＳで２回４３℃で１５
分間洗浄した。次にフィルターを０．０１５ＭＮａＣｌ
， ０．０ ０ １ ５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７
．０，０．１％ＳＤＳで２回４３℃でｌＯ分間、０．
０ ｌ ５ Ｍ ＮａＣｌ、０．００１５Ｍクエン酸ナ
トリウム、ＰＨ１．０、０． １％ＳＤＳで２回６０℃
で１０分間洗浄した。フィルターを全てホヮットマン３
ＭＭｇに吸い取り、ＸｗＡフィルム（コダックＸ−ＯＭ
＾Ｔ ＡＲ−５ ）に１４日間さらした。この最初スク
リーンは推定８１のクローンを与えた。
１． ０ ９ ｋｂ ＢａｍＨ Ｉ断片に対して正のシ
グナルを生じる個々のコスミド培養液をアンピシリン１
００μｇ／Ｎ４を含むＬＢプレートに３重にスポットし
、３７℃で一晩温置し、４℃で２時間冷却し、８２ｍｌ
ニトロセノレロースフィノレタ−（シュライチ十一アン
ドシュエル、ＢＡ８５，０．４５μ）をプレートに２分
間置き、次に細菌を含むフィルターをタラムフェニコー
ルｌＯμｇ／一を含むＬＢＩ天プレートにコロニー側を
上にして置いた。このプレートを３７℃で１２時間温置
し、次に細菌を溶解し、ＤＮＡをフィルターに固定した
．フィルターを０． ５ Ｍ ＮａＯＨに浸漬したホワ
ットマン３ＭＭ紙のシートにコロニー側を上にして３分
間置いてフィルター上の細菌コロニーを溶解した．次に
フィルターを０． ５ Ｍ ＮａＯＨを含むホヮソトマ
ン３ＭＭ紙の別のシートに移し３分間放置した。次にこ
のフィルターを中和緩衝液（１．０Ｍ｝リスＨＣ Ｉｌ
ｐｌ１ ８／ １． ５ Ｍ ＮａＣｊ！ ）を含むホ
’７７トマン３ＭＭ紙に３分間移した．上の工程を繰り
返した。フィルターを除いてホワットマン３ＭＭ紙上に
置き３０分間風乾した．乾燥フィルターを２枚の３ＭＭ
紙の間にはさみ、真空オープン中８０℃で４５分間ベー
タした．ベータしたフィルターを上述した３２−Ｐ標識
１． ０ ９ ｋｂ ＢａｍＨ Ｉ断片でハイブリッド
形威した．最初の８１推定コロニーのうち９コロニーが
３フィルター全部について正のシグナルを示した。９個
のコスミドクローンを液体培養で増殖させて制限分析に
対して純粋な大量のＤＮＡを分離した。
グナルを生じる個々のコスミド培養液をアンピシリン１
００μｇ／Ｎ４を含むＬＢプレートに３重にスポットし
、３７℃で一晩温置し、４℃で２時間冷却し、８２ｍｌ
ニトロセノレロースフィノレタ−（シュライチ十一アン
ドシュエル、ＢＡ８５，０．４５μ）をプレートに２分
間置き、次に細菌を含むフィルターをタラムフェニコー
ルｌＯμｇ／一を含むＬＢＩ天プレートにコロニー側を
上にして置いた。このプレートを３７℃で１２時間温置
し、次に細菌を溶解し、ＤＮＡをフィルターに固定した
．フィルターを０． ５ Ｍ ＮａＯＨに浸漬したホワ
ットマン３ＭＭ紙のシートにコロニー側を上にして３分
間置いてフィルター上の細菌コロニーを溶解した．次に
フィルターを０． ５ Ｍ ＮａＯＨを含むホヮソトマ
ン３ＭＭ紙の別のシートに移し３分間放置した。次にこ
のフィルターを中和緩衝液（１．０Ｍ｝リスＨＣ Ｉｌ
ｐｌ１ ８／ １． ５ Ｍ ＮａＣｊ！ ）を含むホ
’７７トマン３ＭＭ紙に３分間移した．上の工程を繰り
返した。フィルターを除いてホワットマン３ＭＭ紙上に
置き３０分間風乾した．乾燥フィルターを２枚の３ＭＭ
紙の間にはさみ、真空オープン中８０℃で４５分間ベー
タした．ベータしたフィルターを上述した３２−Ｐ標識
１． ０ ９ ｋｂ ＢａｍＨ Ｉ断片でハイブリッド
形威した．最初の８１推定コロニーのうち９コロニーが
３フィルター全部について正のシグナルを示した。９個
のコスミドクローンを液体培養で増殖させて制限分析に
対して純粋な大量のＤＮＡを分離した。
上述したコスミドライブラリーを含む２ｌフィルターを
ハイブリッドプローブから取り除き、ｐＶ［！６５０の
もう一方の末端からの２． ０ ９ ｋｂ Ｂａｍｌｌ
Ｉ断片でブローブした。乾燥していないフィルターを
９５℃に於て０．０ １ ５Ｍ ＮａＣＩ！， ０．０
０ １ ５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ１．０、０．
５％ＳＤＳで２回２０分間洗浄してプローブから取り除
いた。フィルターをＸ一線フィルムに４８時間さらして
ブローブが除去されたことを確かめた。次いでブロープ
が２． ０ ９ ｋｂ ＢａｍＨ Ｉ断片であるほかは
１．０９ｋｂ断片に対して上述した通り２１フィルター
をプロープした。最初のライブラリースクリーンはｐＶ
Ｉｌｌ６５０からの２． ０ ９ ｋｂ Ｂａ＋ｉ｝Ｉ
Ｉ断片でハイブリッド形威した推定９３コス旦ドを与
えた。再試験の際には１２のコス逅ドが陽性であり、１
２クローンからＤＮＡを精製した。
ハイブリッドプローブから取り除き、ｐＶ［！６５０の
もう一方の末端からの２． ０ ９ ｋｂ Ｂａｍｌｌ
Ｉ断片でブローブした。乾燥していないフィルターを
９５℃に於て０．０ １ ５Ｍ ＮａＣＩ！， ０．０
０ １ ５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ１．０、０．
５％ＳＤＳで２回２０分間洗浄してプローブから取り除
いた。フィルターをＸ一線フィルムに４８時間さらして
ブローブが除去されたことを確かめた。次いでブロープ
が２． ０ ９ ｋｂ ＢａｍＨ Ｉ断片であるほかは
１．０９ｋｂ断片に対して上述した通り２１フィルター
をプロープした。最初のライブラリースクリーンはｐＶ
Ｉｌｌ６５０からの２． ０ ９ ｋｂ Ｂａ＋ｉ｝Ｉ
Ｉ断片でハイブリッド形威した推定９３コス旦ドを与
えた。再試験の際には１２のコス逅ドが陽性であり、１
２クローンからＤＮＡを精製した。
ｐＡＴ１及びｐＶＥ６５０のＢａｍＨ Ｉ断片に関して
制限分析により種々のコスよドクローンの地図を作威し
た。またクローンがグループ１とグループ２の相同性基
を含むことを同定するためにサザン分析を行なった。こ
れは４クローンの同定が認められ、１１０ｋｂ以上のゲ
ノムＤＮＡを集団的に示した．ｐＡＴ１及びｐＶＥ６５
０関する位置は第３図に示される．これらのクローンが
別のアベルメクチン遺伝子のＤＮＡを含む場合を試験す
るためにこのコスミドからｐｌＪ９２２に断片をサブク
ローン化した。ｐＶＥ９４１のサブクローンはｐＶＥ８
５９から（７） １ ４ｋｂ Ｂｇｌｌｌ断片を含有し
た。このＤＮＡはｐＶＥ６５０で相補されないアグリコ
ン生産突然変異体に形質転換された。全部で５個の突然
変異体がグリコシル化アベルメクチン生産能を回復した
。またこのＤＮＡをアベルメクチンの３′及び３＃ヒド
ロキシルをメチル化しないＭＡ６３１６ （ＧＭＴ−
）及びＭＡ６３２３ （ＧＭ−ＯＭＴ− ’）に導入
した。これらの突然変異体も相補性を有した（表２の分
類ＧＭＴ）。
制限分析により種々のコスよドクローンの地図を作威し
た。またクローンがグループ１とグループ２の相同性基
を含むことを同定するためにサザン分析を行なった。こ
れは４クローンの同定が認められ、１１０ｋｂ以上のゲ
ノムＤＮＡを集団的に示した．ｐＡＴ１及びｐＶＥ６５
０関する位置は第３図に示される．これらのクローンが
別のアベルメクチン遺伝子のＤＮＡを含む場合を試験す
るためにこのコスミドからｐｌＪ９２２に断片をサブク
ローン化した。ｐＶＥ９４１のサブクローンはｐＶＥ８
５９から（７） １ ４ｋｂ Ｂｇｌｌｌ断片を含有し
た。このＤＮＡはｐＶＥ６５０で相補されないアグリコ
ン生産突然変異体に形質転換された。全部で５個の突然
変異体がグリコシル化アベルメクチン生産能を回復した
。またこのＤＮＡをアベルメクチンの３′及び３＃ヒド
ロキシルをメチル化しないＭＡ６３１６ （ＧＭＴ−
）及びＭＡ６３２３ （ＧＭ−ＯＭＴ− ’）に導入
した。これらの突然変異体も相補性を有した（表２の分
類ＧＭＴ）。
ｐＶＥ６５０及びｐＶＥ９４１でグリコシル化する遺伝
子は単一ブラスミドにサブクローン化することができる
。ｐＶＥ８５９のＰｓｔｌによる制限消化は８バンドを
生じた．最大のＰｓｔｌ断片をゲル精製し、ｐＶＥ１０
４３ニクｔ１１１−ン化しテｐＶＥ１１１６を作威した
。ｐＶＥ１０４３はｐｌＪ９２２から２工程で誘導され
た．まずｐｌＪ９２２をＰｓｔｌで切断してｐＩＪ９２
２のＰｓｔ［部位を破壊し、その部位に７４ＤＮＡポリ
メラーゼを充填してｐｖｃ１０２３を作威した。（ｐＶ
［ｉｌ０４３はＥｃｏＲ ＩとＢａｍｌｌ １で消化し
たｐＶＥ１０２３に合成オリゴヌクレオチドを挿入して
作製した。オリゴヌクレオチドは次の配列からなる。
子は単一ブラスミドにサブクローン化することができる
。ｐＶＥ８５９のＰｓｔｌによる制限消化は８バンドを
生じた．最大のＰｓｔｌ断片をゲル精製し、ｐＶＥ１０
４３ニクｔ１１１−ン化しテｐＶＥ１１１６を作威した
。ｐＶＥ１０４３はｐｌＪ９２２から２工程で誘導され
た．まずｐｌＪ９２２をＰｓｔｌで切断してｐＩＪ９２
２のＰｓｔ［部位を破壊し、その部位に７４ＤＮＡポリ
メラーゼを充填してｐｖｃ１０２３を作威した。（ｐＶ
［ｉｌ０４３はＥｃｏＲ ＩとＢａｍｌｌ １で消化し
たｐＶＥ１０２３に合成オリゴヌクレオチドを挿入して
作製した。オリゴヌクレオチドは次の配列からなる。
５ ’ ＡＡＴＴＣＧＴＴＡＡＣＴＧＣＡＧＣＴＡＧ
ＣＡＴＴＡＡＴＡＡＧＣＴＴＴＡＡＡＧ ３ ’３ ’
ＧＣＡＡＴＴＧＡＣＧＴＣＧＡＴＣＧＴＡＡＴＴＡＴ
ＴＣＧＡＡＡＴＴＴＣＣＴＡＧ ５ ’これはＥｃｏＲ
Ｉ −， Ｉｌｐａ Ｉ、Ｐｓｔｌ、Ｎｈｅ Ｉ、
Ａｓｅ Ｉ ， ＩＩｉｎｄｌｌ［、Ｄｒａ Ｉ及びＲ
ａｍ ｍとしてユニークな部位を有するポリクローニン
グ部位の作威をもたらした。） ｐＶＢ１１１６は分類
■、分１１１Ｖ、分類■、分類■及びＧＭＴ突然変異体
全てに相補性を有した。また分Ｈｘ及び分類■からの代
表的な突然変異体を相補することが確認された．従って
ｐＶＥ１１１６はアベルメクチンをグリコシル化する遺
伝子を全て含むと考えられる．このブラスミドはアベル
メクチンアグリコンのアベルメクチンへの生物形質転換
が認められる．このプラスミドを適当な遊離ヒドロキシ
ルを含む別の抗生物質を生産する菌株に導入するとき、
このブラスξドはオレアンドロースを抗生物質に付加し
て新規な抗生物質を生或する。これらの新規な抗生物質
は高い活性を有することができる． ｐＡＴ１， ｐＶＥ９２３及びｐＶＥ９２４（７）制限
地図の比較は０． ５ ５ ｋｂ ＢａｍＨ Ｉ断片に
隣接した領域が３種のクローンで異なることを示した。
ＣＡＴＴＡＡＴＡＡＧＣＴＴＴＡＡＡＧ ３ ’３ ’
ＧＣＡＡＴＴＧＡＣＧＴＣＧＡＴＣＧＴＡＡＴＴＡＴ
ＴＣＧＡＡＡＴＴＴＣＣＴＡＧ ５ ’これはＥｃｏＲ
Ｉ −， Ｉｌｐａ Ｉ、Ｐｓｔｌ、Ｎｈｅ Ｉ、
Ａｓｅ Ｉ ， ＩＩｉｎｄｌｌ［、Ｄｒａ Ｉ及びＲ
ａｍ ｍとしてユニークな部位を有するポリクローニン
グ部位の作威をもたらした。） ｐＶＢ１１１６は分類
■、分１１１Ｖ、分類■、分類■及びＧＭＴ突然変異体
全てに相補性を有した。また分Ｈｘ及び分類■からの代
表的な突然変異体を相補することが確認された．従って
ｐＶＥ１１１６はアベルメクチンをグリコシル化する遺
伝子を全て含むと考えられる．このブラスミドはアベル
メクチンアグリコンのアベルメクチンへの生物形質転換
が認められる．このプラスミドを適当な遊離ヒドロキシ
ルを含む別の抗生物質を生産する菌株に導入するとき、
このブラスξドはオレアンドロースを抗生物質に付加し
て新規な抗生物質を生或する。これらの新規な抗生物質
は高い活性を有することができる． ｐＡＴ１， ｐＶＥ９２３及びｐＶＥ９２４（７）制限
地図の比較は０． ５ ５ ｋｂ ＢａｍＨ Ｉ断片に
隣接した領域が３種のクローンで異なることを示した。
ｐＡＴ１についてベクター結合断片までの３． ４ ｋ
ｂ Ｂａｗｌ ＩはＥｃｏＲ １部位を含み、０． ５
５ ｋｂ ｌｌａｍ ＩＩＩ断片に隣接した位置にあ
る。ｐＶＥ９２４についてＨｃｏＲ １部位のない３．
２ｋｂＢａｍｔｌ Ｉ断は０． ５ ５ ｋｂ Ｂａ＋
＊Ｉ Ｉ断片に隣接した位置にある。コスミドｐＶ［！
９２３は０． ５ ５ ｋｂ Ｂａａ＋ＩＩ Ｔ断片に
隣接した位置にある７． Ｏ ｋｂ Ｉｌａｎ＋Ｈ断片
を有する。
ｂ Ｂａｗｌ ＩはＥｃｏＲ １部位を含み、０． ５
５ ｋｂ ｌｌａｍ ＩＩＩ断片に隣接した位置にあ
る。ｐＶＥ９２４についてＨｃｏＲ １部位のない３．
２ｋｂＢａｍｔｌ Ｉ断は０． ５ ５ ｋｂ Ｂａ＋
＊Ｉ Ｉ断片に隣接した位置にある。コスミドｐＶ［！
９２３は０． ５ ５ ｋｂ Ｂａａ＋ＩＩ Ｔ断片に
隣接した位置にある７． Ｏ ｋｂ Ｉｌａｎ＋Ｈ断片
を有する。
アベルメクチン遺伝子クラスターのこの領域の実際の構
造を決定するためにＳ．アベルメクチン染色体からのＤ
ＮＡを大腸菌に直接クローン化した。
造を決定するためにＳ．アベルメクチン染色体からのＤ
ＮＡを大腸菌に直接クローン化した。
Ｓ．アベルミチリスからのＤＮＡを大腸菌に直接クロー
ン化するために選択される方法は、大腸菌プラスミドを
組込ませるＳ．アベルミチリスの相同組換え系に依存す
る。大腸菌プラスミドは問題の領域に隣接するアベルメ
クチンクラスタ一の２つの断片を含有する。このような
プラスミドはゲノムと相同断片の１つとの間に組換えに
よって組込む。得られた組込み体は２つのクローン化断
片によって示される各領域の複製を有する。複製された
領域間の組換えはベクターの除去をもたらす。この組換
えが組込みをもたらす組換えと異なった領域間で生じる
場合は得られた除去プラスξドは２つのクローン化した
断片とその間のＤＮＡ全てを含有する。
ン化するために選択される方法は、大腸菌プラスミドを
組込ませるＳ．アベルミチリスの相同組換え系に依存す
る。大腸菌プラスミドは問題の領域に隣接するアベルメ
クチンクラスタ一の２つの断片を含有する。このような
プラスミドはゲノムと相同断片の１つとの間に組換えに
よって組込む。得られた組込み体は２つのクローン化断
片によって示される各領域の複製を有する。複製された
領域間の組換えはベクターの除去をもたらす。この組換
えが組込みをもたらす組換えと異なった領域間で生じる
場合は得られた除去プラスξドは２つのクローン化した
断片とその間のＤＮＡ全てを含有する。
ストレプトミセスで複製しない大腸菌ベクターは、次の
特徴、大腸菌で選択する遺伝子、ストレプトミセスで選
択する遺伝子及び２つの断片をクローニングするユニー
クな部位を有する場合に使用することができる．これら
の実験に対してｐＶＢ６１６の誘導体を作威した。ｐＶ
Ｅ６１６は既に大腸菌で選択する遺伝子（ａｍｐ）及び
ストレプトミセスで選択する遺伝子（ｔｈｉｏ）を含ん
でいる。次の配列を有する有用なクローニング部位を与
えるために合威オリゴヌクレオチドを作威した． ５’ ＧＡＴＣＣＧＡＣＴＧＴＴ＾＾ＣＡＧＡＴＣＴ
ＧＡＧＣＴＣＴＧＣＡ ３’３’ ＧＣＴＧＡ
ＣＡＡＴＴＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧ ５’オ
リゴヌクレオチドをｐｖＥｓｉｅのＢａｓＨ Ｉ ”
Ｐｓｔ １部位にクローン化してＢａｓＨ ［、ｌｌｐ
ａｌ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｓｓｔｌ及びＰｓｔＴに対するポ
リクローニング部位を有するｐＶＥ１０１１を作った．
第７図はｐＶＥ１０１１ （７）制限地図を示す， ｐ
ＶＥ１０１１にクローン化するために選択される２つの
断片は０． ５ ５ ｋｂ ＢａｇｉＨ Ｉ断片に隣接
する， ｐＡＴ１の３． ４ ｋｂ ＢａａＨ ［断片
とｐＶＢ９２４からの３． ７ ｋｂ ＢａｓＨ Ｉ断
片を選択した（表６参照）。
特徴、大腸菌で選択する遺伝子、ストレプトミセスで選
択する遺伝子及び２つの断片をクローニングするユニー
クな部位を有する場合に使用することができる．これら
の実験に対してｐＶＢ６１６の誘導体を作威した。ｐＶ
Ｅ６１６は既に大腸菌で選択する遺伝子（ａｍｐ）及び
ストレプトミセスで選択する遺伝子（ｔｈｉｏ）を含ん
でいる。次の配列を有する有用なクローニング部位を与
えるために合威オリゴヌクレオチドを作威した． ５’ ＧＡＴＣＣＧＡＣＴＧＴＴ＾＾ＣＡＧＡＴＣＴ
ＧＡＧＣＴＣＴＧＣＡ ３’３’ ＧＣＴＧＡ
ＣＡＡＴＴＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧ ５’オ
リゴヌクレオチドをｐｖＥｓｉｅのＢａｓＨ Ｉ ”
Ｐｓｔ １部位にクローン化してＢａｓＨ ［、ｌｌｐ
ａｌ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｓｓｔｌ及びＰｓｔＴに対するポ
リクローニング部位を有するｐＶＥ１０１１を作った．
第７図はｐＶＥ１０１１ （７）制限地図を示す， ｐ
ＶＥ１０１１にクローン化するために選択される２つの
断片は０． ５ ５ ｋｂ ＢａｇｉＨ Ｉ断片に隣接
する， ｐＡＴ１の３． ４ ｋｂ ＢａａＨ ［断片
とｐＶＢ９２４からの３． ７ ｋｂ ＢａｓＨ Ｉ断
片を選択した（表６参照）。
ｐＡＴ１の３． ４ ｋｂ ＢａｍＨ Ｉ断片をアガロ
ースゲルで精製し、消化したＢｇＩ ｎ ニ結合し、ｐ
ＶＲ１０１１をＣＩＡＰ処理した．大腸菌を形質転換し
た後Ａ＋ｓｐ’形質転換細胞をインサートとしてスクリ
ーンした．１つの形質転換細胞は３．４ｋｂインサート
を有するプラスξドを含みこのプラス逅ドはｐＶＥ１０
３８を消化した， ｐＶＥ１０３ＢをＬＢａｓｐ （ア
ンピシリン１００＃ｇ／ｌＩ１を含むＬＢ）増殖培養液
５００ａｌｔから分離しＣｓＣ ｊ！パンディングによ
り精製した．次にｐＶＥ１０３８をＢａｇｅＨ Ｉとｌ
ｌｐａｌで消化し、Ｔｎ５のゲル精製２． ９ ｋｂ
Ｂａｗｌ Ｉ − Ｈｐａ Ｉ断片に結合した．得られ
たＮｅｏゝＡｍｐ’形質転換細胞は２．９ｋｂ断片を有
するプラスミドＰＶＥ１０５１を含む， ｐＶＥ１０５
１をＬＢａｍｐ増殖培養液５００ｄから分離し、ＣｓＣ
ｊ！パンディングによって精製した．次にｐＶＢ１０
５１をＢａｍＨ Ｉで消化し、ＣＩＡＰで処理しｐＶＢ
９２４のゲル精製３． ７ ｋｂ Ｂａ麟Ｈ Ｉ断片に
結合させた．形質転換細胞は３．７ｋｂインサートと一
致し、３．４ｋｂと３．７ｋｂＢａｗｌ Ｉ断片の配向
は染色体と同じであった。ｐＶｌｌｉ１２９９と呼ばれ
るブラスミドのＤＮＡをＤＮＡメチル化欠陥菌株、ＭＢ
５３８６に形質転換した．Ｓ．アベルミチリスはメチル
特異的制限系を有する（Ｊ．Ｂａｃｔ．第１７０巻，５
６０７ 〜５６１２頁（１９８８年））。従ってＤＮＡ
を大腸菌からのＳ．アベルミチリスに導入する前にｃｌ
ａ■及びｄｃ−メチル化に欠陥のある菌株から分離しな
ければならない。ＭＢ５３８６から分離したｐＶ［！１
２９９（７） ＣｓＣｆｆｉ精製ＤＮＡ５μｌをＳ．ア
ベルミチリス原形質体１００，ｃ／！に導入した．形質
転換細胞をＮｅｏ’ Ｔｈｉ’として選択し、ＧＧ１７
７６と呼ばれるものをとっておく。小規模調製試料をチ
オストレブトン５μｇ／一とネオマイシン５μｇ／一を
有するＹＥＭＥで増殖したＧＧ１７７６ 、６ｍから調
製した．得られたＤＮＡ調製試料ｌＯμ℃は大腸菌を形
質転換するために使用し、Ａｍｐ’Ｎｅｏ”形質転換細
胞を試験した．予期した通り、これらの形質転換細胞は
３．４ｋｂ、２． ｌ ｋｂ， ０． ５ ５ ｋｂ
Ｂａｗｌ｛ ｌ断片並びにｐＶＥ９２３の７． ０ ｋ
ｂ Ｂａｍｌｌ ！バンドを含有した。驚くべきことに
形質転換細胞はまた２つの新しい８．Ｏｋｂと７．４ｋ
ｂのＢａｍ＋Ｈ Ｉ断片を含有した． ７．Ｏｋｂ，
８．Ｏｋｂ及び７．４ｋｂ断片はｐＶＥ９２４と Ｉ）
ＡＴＩ ニ存在しない。従ってｐＶＥ９２４は３． ２
ｋｂ ＢａｍＨ Ｉ断片をもたらす０．５５ｋｂと
３． ７ ｋｂ Ｂａｍｆｌ Ｉバンドの間でＤＮＡの
欠失を含む。ｐＶＥ１４４６と呼ばれるプラス逅ドをも
つ形質転換細胞ＥＴ１４１６７をとっておく。次いで制
限地図作成はｐＶｒｉｌＡ４６について断片の順序を決
定した（表６参照）．７．４ｋｂ及び８． ０ ｋｂ
ＢａｍＨ Ｉ断片によって示されるＤＮＡはアベルメク
チン遺伝子がこの領域の両側に位置していたことからア
ベルメクチン遺伝子を含むと思われる。ｐＶＥ１４４６
を含む大腸菌株はＭＢ５４７２と呼ばれＡＴＣＣ ６８
２５０として寄託されている。
ースゲルで精製し、消化したＢｇＩ ｎ ニ結合し、ｐ
ＶＲ１０１１をＣＩＡＰ処理した．大腸菌を形質転換し
た後Ａ＋ｓｐ’形質転換細胞をインサートとしてスクリ
ーンした．１つの形質転換細胞は３．４ｋｂインサート
を有するプラスξドを含みこのプラス逅ドはｐＶＥ１０
３８を消化した， ｐＶＥ１０３ＢをＬＢａｓｐ （ア
ンピシリン１００＃ｇ／ｌＩ１を含むＬＢ）増殖培養液
５００ａｌｔから分離しＣｓＣ ｊ！パンディングによ
り精製した．次にｐＶＥ１０３８をＢａｇｅＨ Ｉとｌ
ｌｐａｌで消化し、Ｔｎ５のゲル精製２． ９ ｋｂ
Ｂａｗｌ Ｉ − Ｈｐａ Ｉ断片に結合した．得られ
たＮｅｏゝＡｍｐ’形質転換細胞は２．９ｋｂ断片を有
するプラスミドＰＶＥ１０５１を含む， ｐＶＥ１０５
１をＬＢａｍｐ増殖培養液５００ｄから分離し、ＣｓＣ
ｊ！パンディングによって精製した．次にｐＶＢ１０
５１をＢａｍＨ Ｉで消化し、ＣＩＡＰで処理しｐＶＢ
９２４のゲル精製３． ７ ｋｂ Ｂａ麟Ｈ Ｉ断片に
結合させた．形質転換細胞は３．７ｋｂインサートと一
致し、３．４ｋｂと３．７ｋｂＢａｗｌ Ｉ断片の配向
は染色体と同じであった。ｐＶｌｌｉ１２９９と呼ばれ
るブラスミドのＤＮＡをＤＮＡメチル化欠陥菌株、ＭＢ
５３８６に形質転換した．Ｓ．アベルミチリスはメチル
特異的制限系を有する（Ｊ．Ｂａｃｔ．第１７０巻，５
６０７ 〜５６１２頁（１９８８年））。従ってＤＮＡ
を大腸菌からのＳ．アベルミチリスに導入する前にｃｌ
ａ■及びｄｃ−メチル化に欠陥のある菌株から分離しな
ければならない。ＭＢ５３８６から分離したｐＶ［！１
２９９（７） ＣｓＣｆｆｉ精製ＤＮＡ５μｌをＳ．ア
ベルミチリス原形質体１００，ｃ／！に導入した．形質
転換細胞をＮｅｏ’ Ｔｈｉ’として選択し、ＧＧ１７
７６と呼ばれるものをとっておく。小規模調製試料をチ
オストレブトン５μｇ／一とネオマイシン５μｇ／一を
有するＹＥＭＥで増殖したＧＧ１７７６ 、６ｍから調
製した．得られたＤＮＡ調製試料ｌＯμ℃は大腸菌を形
質転換するために使用し、Ａｍｐ’Ｎｅｏ”形質転換細
胞を試験した．予期した通り、これらの形質転換細胞は
３．４ｋｂ、２． ｌ ｋｂ， ０． ５ ５ ｋｂ
Ｂａｗｌ｛ ｌ断片並びにｐＶＥ９２３の７． ０ ｋ
ｂ Ｂａｍｌｌ ！バンドを含有した。驚くべきことに
形質転換細胞はまた２つの新しい８．Ｏｋｂと７．４ｋ
ｂのＢａｍ＋Ｈ Ｉ断片を含有した． ７．Ｏｋｂ，
８．Ｏｋｂ及び７．４ｋｂ断片はｐＶＥ９２４と Ｉ）
ＡＴＩ ニ存在しない。従ってｐＶＥ９２４は３． ２
ｋｂ ＢａｍＨ Ｉ断片をもたらす０．５５ｋｂと
３． ７ ｋｂ Ｂａｍｆｌ Ｉバンドの間でＤＮＡの
欠失を含む。ｐＶＥ１４４６と呼ばれるプラス逅ドをも
つ形質転換細胞ＥＴ１４１６７をとっておく。次いで制
限地図作成はｐＶｒｉｌＡ４６について断片の順序を決
定した（表６参照）．７．４ｋｂ及び８． ０ ｋｂ
ＢａｍＨ Ｉ断片によって示されるＤＮＡはアベルメク
チン遺伝子がこの領域の両側に位置していたことからア
ベルメクチン遺伝子を含むと思われる。ｐＶＥ１４４６
を含む大腸菌株はＭＢ５４７２と呼ばれＡＴＣＣ ６８
２５０として寄託されている。
皇一−ｉ
１二一更
アベルメクチン
クース ーの
１７．５０
７．４０
７．００
３．６０
２． １０
１．７５
ｌ．５０
０．８５
０．５８
０．５５
２７．４５
４．９０
３．４０
２．５０
２．４４
２，１０
０．７０
０．５５
８，００
７．６０
７．４０
７．００
３．７０
２．１０
０．５５
９．１０
５．５ｏ
４．９０
３．７０
３．４０
３．１５
２．６０
２．４４
２．３０
２．ｌ０
１．９０
１．３ｏ
１．２０
０．９５
０．７５
０．５５
１０．００
７．４０
５．６ｏ
４．７０
３．３０
３．００
２．６０
２．５０
２．３５
１．８５
１．６０
１．４０
０．９５
０，７５
０．５３
０．０２
２４．０５
７．４０
４．７０
３．００
２．３５
２．ｏ９
１．８５
１．４０
１．ｏ９
０．５３
０．０２
１３．６０
５．７０
５．５ｏ
４．７０
４．００
３．２０
３，００
２．３５
１．６５
１．４０
０．５３
０．０２
Ｂａｍｌｌ
［１ａｓｌｌ
ＰｓＬ
Ｂａｍｌｌ
Ｐｓｔ
Ｂ ａ ｔｓ Ｈ
Ｂａｎ＋Ｈ
ＥｃｏＲ Ｉ
ＢａｍＨ Ｉ
Ｓｔｕ Ｉ
Ｂａｍｆｌｌ
Ｓｔｕ Ｉ
Ｂａｍｌｌ Ｉ
Ｂａｍｌｌ Ｉ
ＢａｍＨ Ｉ
１３００
ｌ７４０
ｌ６６０
ｌ００
７ｌ００
ＢａｍＨ Ｉ
ＢａｓＨ Ｉ
ＢａｓＨ Ｉ
ＢａｍＨ Ｉ
Ｂａ＋ｓＨ Ｉ
ＢａｍＨ Ｉ
ＢａｍＨ Ｉ
Ｓｅａ Ｉ
Ｓｔｕ Ｉ
Ｓｅａ Ｉ
Ｂａ餉ＨＩ
Ｐｓｔ Ｉ
ＢａｍＨ Ｉ
Ｂｇｌ ＩＩ
ＰｓＬ Ｉ
１３ａｍＨ Ｉ
ＥｃｏＲ Ｉ
ＢａｍＨ Ｉ
１２００
ｌ９００
部位
口
部位名１
インターバル
（ｂｐ）
コー才−ヂイネイト
（ｂｐ）
Ｂａｓ＋ＩＩ Ｉ
Ｂａ＋ｓＨ Ｉ
Ｂｇｌ ＩＩ
Ｂｇｌ ＩＩ
Ｓｔｕ Ｉ
ＢａｍＨ Ｉ
ＥｃｏＲ Ｉ
Ｂａｍ＋ｔｌ Ｉ
ＢａｍＨ Ｉ
ＢｃｏＲ Ｉ
Ｂａｗ＋Ｈ Ｉ
Ｐｓｔ Ｉ
ＢａａＨ Ｉ
Ｂｇｌ ＩＩ
Ｂａ＋ｍＨ Ｉ
Ｂａｍｌｌ Ｉ
２７ｌ０
２４ｌ０
Ｂ７３３０
ｌ． この９５ｋｂｆｉｌ域に於けるＢａｓ１ １部位
の地図は作威されている， Ｂｇｌ ＩＩ ， ｔ
！ｃｏＲ Ｉ ．Ｐｓｔ Ｉ ， Ｓｔｕ Ｉ及びＳｃ
ａ １部位の地図のいくつかは作成されている．
の地図は作威されている， Ｂｇｌ ＩＩ ， ｔ
！ｃｏＲ Ｉ ．Ｐｓｔ Ｉ ， Ｓｔｕ Ｉ及びＳｃ
ａ １部位の地図のいくつかは作成されている．
第１図はｐＡＴｌの制限地図である。ベクター及びイン
サー｝ＤＮＡの両方で作威した部位が示される。 第２図はｐＶＥ６５０の制限地図である。ベクター及び
インサートＤＮＡの両方で作威した部位が示され。 第３図はアベルメクチン遺伝子クラスタ一の地図である
。ｐＶ［！９２３， ｐＡＴ１． ｐＶＥｌ４４６、ｐ
ＶＥ９２４． ｐｖＨ８５５． ｐＶＥ６５０，ｐＶＥ
１１１６及びｐＶＥ８５９ニ含まれるＤＮＡの範囲が示
される． ｐＶＢ９２４の欠失した領域は中空線で示さ
れる．アベルメクチン突然変異体を相補する領域が示さ
れる．ａｖｒＡはアベルメクチンＣ−５ ０−メチル
トランスフェラーゼとしての遺伝子である。虹４，旦．
Ｄ．Ｅ．旦及び旦は分類■，分類■．分類■．分類■、
分類■及び分類■、アグリコン生産突然変異体に欠損の
ある遺伝子を示す， ａｖｒＦはアベルメクチングリコ
シルＯ−メチルトランスフェラーゼとしての遺伝子であ
る．アベルメクチンＣ−２２．Ｃ−２３デヒドラーゼは
ａｖｒｌと呼ばれ、アベルメクチンのフラン環を作るた
めに関係ある遺伝子はａｖｒＪと呼ばれ、巨環状ラクト
ン環を作るために関係する６種の遺伝子はａｖｒＬと桟
，Ｕ本，と杜，藍捜及びと辻と呼ばれる．グループｌ及
びグループ２の関連配列の領域のおよその位置が示され
る． 第４図はｐＶＥ３２Ｂの制限地図である。 第５図はコスミドｐＶＥ９２４及びＢａｓｌｌ １部分
サブクローンに於けるインサートの制限地図である．垂
直線はＢａｍＨ Ｉ部位を示す．２〜１５の数字は、表
５で挙げたｐＶＥ９２４の２番目に大きい断片から最も
小さいＢａｍＨ Ｉ断片を示す。＊で示されるプラス逅
ドは相補性試験で使用した． 第６図はグリコシル化領域の制限地図である。 点線で示されるＢａｓＨ １部位はｐＶＥ６５０のイン
サ−ト／ベクター結合に存在し染色体にはない。Ｏｋｂ
の原点はｐＶＥ６５０のインサートの開始を表わす。 ｐＶＥ６５０， ｐＶＢ１１１６． ｐＶＥ９４１，
ｐＶＥ９０８， ｐＶＥ８０６．ｐＶＥ８０？． ｐ
ＶＥ８０８． ｐＶＢ１０１８及びｐｖＥｌ４２０ニツ
イてＤＮＡの範囲が示される．アベルメクチンのグリコ
シル化に欠損のある突然変異体を相補する領域の位置が
示される。 第７図はｐＶＥｌ０１１の制限地図である。＊＊はｐＶ
Ｅ１２９９を作るために使用したクローニング部位を示
す。 ＦＩＧ．２ 領域 ■Ｔｈｉｏ ＥＨＸＬＡＭＣＯＳ ａｌｌ Ａ＠ＦＩＧ
．４ 領域 一一■ＴｈｉｏＢａｍ ：＝＝Ｅｃｙ？Ｅｐ Ｅｍ： Ａｓｐ ＦＩＧ．７ 手続補正書 （方式） 別紙の通り、 明細書１通を提出致します． 別紙の通り， 正式図面１通を提出致します． ｌ．″１ｔ件の表示 平成２年特許願第８４７５１号 ２．発明の名称 アベルメクチン生合成のためのストレプトミセスアベル
ジチリス由来クローニング遺伝子及びその使用方法 ３．補正をする者 事件との関係
サー｝ＤＮＡの両方で作威した部位が示される。 第２図はｐＶＥ６５０の制限地図である。ベクター及び
インサートＤＮＡの両方で作威した部位が示され。 第３図はアベルメクチン遺伝子クラスタ一の地図である
。ｐＶ［！９２３， ｐＡＴ１． ｐＶＥｌ４４６、ｐ
ＶＥ９２４． ｐｖＨ８５５． ｐＶＥ６５０，ｐＶＥ
１１１６及びｐＶＥ８５９ニ含まれるＤＮＡの範囲が示
される． ｐＶＢ９２４の欠失した領域は中空線で示さ
れる．アベルメクチン突然変異体を相補する領域が示さ
れる．ａｖｒＡはアベルメクチンＣ−５ ０−メチル
トランスフェラーゼとしての遺伝子である。虹４，旦．
Ｄ．Ｅ．旦及び旦は分類■，分類■．分類■．分類■、
分類■及び分類■、アグリコン生産突然変異体に欠損の
ある遺伝子を示す， ａｖｒＦはアベルメクチングリコ
シルＯ−メチルトランスフェラーゼとしての遺伝子であ
る．アベルメクチンＣ−２２．Ｃ−２３デヒドラーゼは
ａｖｒｌと呼ばれ、アベルメクチンのフラン環を作るた
めに関係ある遺伝子はａｖｒＪと呼ばれ、巨環状ラクト
ン環を作るために関係する６種の遺伝子はａｖｒＬと桟
，Ｕ本，と杜，藍捜及びと辻と呼ばれる．グループｌ及
びグループ２の関連配列の領域のおよその位置が示され
る． 第４図はｐＶＥ３２Ｂの制限地図である。 第５図はコスミドｐＶＥ９２４及びＢａｓｌｌ １部分
サブクローンに於けるインサートの制限地図である．垂
直線はＢａｍＨ Ｉ部位を示す．２〜１５の数字は、表
５で挙げたｐＶＥ９２４の２番目に大きい断片から最も
小さいＢａｍＨ Ｉ断片を示す。＊で示されるプラス逅
ドは相補性試験で使用した． 第６図はグリコシル化領域の制限地図である。 点線で示されるＢａｓＨ １部位はｐＶＥ６５０のイン
サ−ト／ベクター結合に存在し染色体にはない。Ｏｋｂ
の原点はｐＶＥ６５０のインサートの開始を表わす。 ｐＶＥ６５０， ｐＶＢ１１１６． ｐＶＥ９４１，
ｐＶＥ９０８， ｐＶＥ８０６．ｐＶＥ８０？． ｐ
ＶＥ８０８． ｐＶＢ１０１８及びｐｖＥｌ４２０ニツ
イてＤＮＡの範囲が示される．アベルメクチンのグリコ
シル化に欠損のある突然変異体を相補する領域の位置が
示される。 第７図はｐＶＥｌ０１１の制限地図である。＊＊はｐＶ
Ｅ１２９９を作るために使用したクローニング部位を示
す。 ＦＩＧ．２ 領域 ■Ｔｈｉｏ ＥＨＸＬＡＭＣＯＳ ａｌｌ Ａ＠ＦＩＧ
．４ 領域 一一■ＴｈｉｏＢａｍ ：＝＝Ｅｃｙ？Ｅｐ Ｅｍ： Ａｓｐ ＦＩＧ．７ 手続補正書 （方式） 別紙の通り、 明細書１通を提出致します． 別紙の通り， 正式図面１通を提出致します． ｌ．″１ｔ件の表示 平成２年特許願第８４７５１号 ２．発明の名称 アベルメクチン生合成のためのストレプトミセスアベル
ジチリス由来クローニング遺伝子及びその使用方法 ３．補正をする者 事件との関係
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、プラスミドｐＡＴ１、ｐＶＥ６５０、ｐＶＥ９２３
、ｐＶＥ９２４、ｐＶＥ８５５、ｐＶＥ８５９及びｐＶ
Ｅ１４４６。 ２、ｐＡＴ１である請求項１記載のプラスミド。 ３、ｐＶＥ６５０である請求項１記載のプラスミド。 ４、ｐＶＥ９２３、ｐＶＥ９２４、ｐＶＥ８５５又はｐ
ＶＥ８５９である請求項１記載のプラスミド。 ５、プラスミドｐＶＥ１４４６。 ６、プラスミドｐＶＥ９０８、ｐＶＥ８０７、ｐＶＥ８
０６、ｐＶＥ９３０、ｐＶＥ８０８、ｐＶＥ９４１、ｐ
ＶＥ８１８、ｐＶＥ１１１６、ｐＶＥ１０１８、ｐＶＥ
１４２０及びｐＡＴ８３。 ７、プラスミドｐＡＴ１、ｐＶＥ６５０、ｐＶＥ９２３
、ｐＶＥ９２４、ｐＶＥ８５５、ｐＶＥ８５９又はｐＶ
Ｅ１４４６に含まれるアベルメクチン生合成のための遺
伝子。 ８、プラスミドｐＡＴ１に含まれる請求項７記載の遺伝
子。 ９、プラスミドｐＶＥ６５０に含まれる請求項７記載の
遺伝子。 １０、プラスミドｐＶＥ９２３、ｐＶＥ９２４、ｐＶＥ
８５５又はｐＶＥ８５９に含まれる請求項７記載の遺伝
子。 １１、ｐＶＥ１４４６に含まれる請求項７記載の遺伝子
。 １２、プラスミドｐＡＴ１、ｐＶＥ６５０、ｐＶＥ９２
３、ｐＶＥ９２４、ｐＶＥ８５５、ｐＶＥ８５９、ｐＶ
Ｅ１４４６又は該プラスミドのＤＮＡ断片の１種以上を
微生物に取込ませることを特徴とするアベルメクチン又
はアベルメクチン様化合物の発酵ブイヨンからの収率を
改良する方法。 １３、微生物がストレプトミセスである請求項１２記載
の方法。 １４、微生物がストレプトミセスアベルミチリスである
請求項１３記載の方法。 １５、微生物がストレプトミセスヒグロスコピカスであ
る請求項１３記載の方法。 １６、微生物がストレプトミセスシアノグリセウスであ
る請求項１３記載の方法。 １７、微生物がストレプトミセスサーモアーキノシスで
ある請求項１３記載の方法。 １８、プラスミドがｐＡＴ１である請求項１２記載の方
法。 １９、プラスミドがｐＶＥ６５０である請求項１２記載
の方法。 ２０、プラスミドがｐＶＥ９２３、ｐＶＥ９２４、ｐＶ
Ｅ８５５又はｐＶＥ８５９である請求項１２記載の方法
。 ２１、プラスミドがｐＶＥ１４４６である請求項１２記
載の方法。 ２２、プラスミドｐＡＴ１、ｐＶＥ６５０、ｐＶＥ９２
３、ｐＶＥ９２４、ｐＶＥ８５５、ｐＶＥ８５９又はｐ
ＶＥ１４４６のプラスミド又はＤＮＡ断片の１種以上が
取込まれているストレプトミセスアベルミチリスを用い
て調製したアベルメクチン化合物。 ２３、ハイブリッド形成プローブとしてアベルメクチン
遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いることを特徴とする遺伝
子を微生物から分離する方法。 ２４、微生物がストレプトミセスである請求項２３記載
の方法。 ２５、ＤＮＡ断片がプラスミドｐＡＴ１、ｐＶＥ６５０
、ｐＶＥ９２３、ｐＶＥ９２４、ｐＶＥ８５５、ｐＶＥ
８５９又はｐＶＥ１４４６から調製される請求項２３記
載の方法。２６、ＤＮＡ断片がプラスミドｐＡＴ１から
調製される請求項２３記載の方法。 ２７、ＤＮＡ断片がプラスミドｐＶＥ６５０から調製さ
れる請求項２３記載の方法。 ２８、ＤＮＡ断片がプラスミドｐＶＥ９２３、ｐＶＥ９
２４、ｐＶＥ８５５又はｐＶＥ８５９から調製される請
求項２３記載の方法。 ２９、ＤＮＡ断片がプラスミドｐＶＥ１４４６から調製
される請求項２３記載の方法。 ３０、ストレプトミセスアベルミチリス突然変異体とク
ローン化したストレプトミセスアベルミチリスＤＮＡと
の相補性を利用するストレプトミセスアベルミチリスか
らアベルメクチン遺伝子を分離する方法。 ３１、クローン化したストレプトミセスアベルミチリス
ＤＮＡがプラスミドｐＶＥ６５０、ｐＡＴ１、ｐＶＥ９
２３、ｐＶＥ９２４、ｐＶＥ８５５、ｐＶＥ８５９又は
ｐＶＥ１４４６に由来する請求項３０記載の方法。 ３２、プラスミドがｐＡＴ１である請求項３１記載の方
法。 ３３、プラスミドがｐＶＥ６５０である請求項３１記載
の方法。 ３４、ＤＮＡがプラスミドｐＶＥ９２３、ｐＶＥ９２４
、ｐＶＥ８５５又はｐＶＥ８５９に由来する請求項３１
記載の方法。 ３５、ＤＮＡがプラスミドｐＶＥ１４４６に由来する請
求項３１記載の方法。 ３６、プラスミドｐＡＴ１を含む微生物学的菌株である
ストレプトミセスリビダンス。 ３７、ＭＡ６６１９（ＡＴＣＣ６７８２０）及びその突
然変異体である請求項３６記載の微生物学的菌株。 ３８、プラスミドｐＶＥ６５０を含む微生物学的菌株で
あるストレプトミセスリビダンス。 ３９、ＭＡ６６１８（ＡＴＣＣ６７８１９）及びその突
然変異体である請求項３８記載の微生物学的菌株。 ４０、プラスミドｐＶＥ９２３を含む微生物学的菌株で
ある大腸菌。 ４１、ＭＢ５３７３（ＡＴＣＣ６７８９１）及びその突
然変異体である請求項４０記載の微生物学的菌株。 ４２、プラスミドｐＶＥ９２４を含む微生物学的菌株で
ある大腸菌。 ４３、ＭＢ５３７４（ＡＴＣＣ６７８９２）及びその突
然変異体である請求項４２記載の微生物学的菌株。 ４４、プラスミドｐＶＥ８５５を含む微生物学的菌株で
ある大腸菌。 ４５、ＭＢ５３７０（ＡＴＣＣ６７８８９）及びその突
然変異体である請求項４４記載の微生物学的菌株。 ４６、プラスミドｐＶＥ８５９を含む微生物学的菌株で
ある大腸菌。 ４７、ＭＢ５３７２（ＡＴＣＣ６７８９０）及びその突
然変異体である請求項４６記載の微生物学的菌株。 ４８、プラスミドｐＶＥ１４４６を含む微生物学的菌株
である大腸菌。 ４９、ＭＢ５４７２（ＡＴＣＣ６８２５０）及びその突
然変異体である請求項４８記載の微生物学的菌株。
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-
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