JPH0315483B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、濾過操作が最小の時間で実施される
のを可能にする濾過装置に関する。この急速濾過
装置は、生物学的な分野、特に、生物化学および
生物エネルギ論に広く使用される２つの型式の研
究、即ち酵素の機構と、細胞膜を通るイオン流量
の測定との研究に特に適用可能である。

イオン流量を制御する酵素の反応および機構の
詳細な研究は、調査される過程の遷移事象を解明
するのを可能にする特別な構造の改良された装置
を必要とする。通常、酵素による触媒の反応は、
非常に早い速度で生じ、ほゞ数ミリ秒の時間分解
能を可能にする方法を必要とする。従来、酵素反
応の機構に関する進歩は、一般に、使用される方
法の改良、特に、得られる時間分解能の改良を伴
つた。

従つて、酵素サイクルの持続時間が一般に１秒
よりも遥かに短いことは、公知である。通常、１
つのサイクル中で比較的多数の中間状態を同定す
ることは、可能である。急速混合ないし多重混合
の方法は、これ等の遷移状態を調査することに鑑
み過去において開発された。実際上、これ等の方
法は、比較的簡単であり、酵素Ｅは、分子ないし
基質Ｓに非常に急速に（数ミリ秒）混合され、次
に、反応は、その過程をたどり、生成物Ｐの解放
の際に完了する。即ち、 (1) Ｅ＋Ｓ→E.S→E.Q＋Ｓ→E.＋Ｐ→Ｅ＋Ｐ 中間段階（この場合には、状態E.⁺S）の解析
は、E⁺Sを安定化する反応物質Ｑとの第２急速混
合（最初の混合後、数ミリ秒から数秒）を実施す
ることで行われる。次に、E⁺Sは、通常の屡々遅
い生物化学的方法で分析される。酵素は、その改
質物を生じる以前に化合を要する分子ないし基質
に非常に急速に混合される。この目的は、反応(1)
を調査することである。

酵素は、調査すべき分子（ないし基質Ｓ）との
接触にもたらされる。第２段階では、酵素と分子
ないし基質とは、化合した後、酵素による分子の
改質が生じる。該反応は、反応物質Ｑの扶助によ
りこの段階で阻止される。従つて、上述の急速混
合の様な通常の生物化学的方法により、阻止され
たE⁺Sを分析することは、可能である。

適当な反応物質があれば、総ての段階（E⁺S、
E⁺P、Ｅ＋Ｐ）で反応を阻止することは、可能で
ある。他の方法は、時間の関数として反応(1)の進
行をたどるのを可能にする化学的な類似体（同様
な化学的特性を有するが、視覚的に追縦可能の特
別な物理特性、例えば、螢光発光および吸収率を
有する分子）で天然基質Ｓに置換えることから成
る。急速混合方法および光学的方法の時間分解能
は、約10ミリ秒である。

イオン流量測定（分子に入つて出る分子、イオ
ン等の流量の測定）は、濾過方法、例えば、ミリ
ポアフイルタを使用することで、過去において殆
んど排他的に実施された。要約すると、これ等の
測定の原理は、次の通りである。膜状小胞ないし
細胞の懸濁液は、細胞内に移行されるイオン流量
を調査するのが所望の基質ないし分子を含有する
媒体で希釈される。通常、基質は、放射性アイソ
トープで置換して識別される。種々な長さの保持
時間の後、懸濁液は、濾過される。膜ないし細胞
は、フイルタで支持され、移行は、シンチレーシ
ヨン計数器の扶助でフイルタの反応率を測定する
ことで評価される。この方法は、比較的遅い（最
短で２秒）が、現在利用可能な唯一の方法であ
る。従つて、該方法は、流量測定が分子薬理学と
同様に、細胞の生理学およびエネルギ論での研究
に非常に重要なため、広く使用される。

本発明の装置は、非常に急速な濾過を可能に
し、これは、生物学的液体内の反応、特に、生物
化学および生物エネルギ論における反応の異なる
段階をたどるのを可能にする。

この目的のため、本発明は、 −その底が多孔質ペレツトで密封され、その上部
が適当な機械的装置によりその中を並進して変
位可能なピストンで密封され、濾過すべき液相
を収容するタンクを有する注入装置と、 −実際の濾過材料のサポートとして作用する多孔
質ペレツトでその上部を密封され、その中に真
空を生じるのを可能にするポンプ装置にその基
部で結合されるチヤンバを有するフイルタ支持
装置と、 −前記注入装置と、該フイルタ支持装置との急速
で一時的な接触を保証する装置と、 −該接触用装置と、ピストンの機械的な並進装置
とに同時に作用した後、注入の中止と、該注入
装置と該フイルタ支持装置との分離とを所望の
際にもたらすことにより、各濾過操作を制御す
る電子式制御組立体と を備え濾過装置を提供する。

本発明の第１実施例によると、多孔質ペレツト
は、フリツトガラスのものである。

本発明の第２実施例によると、並進してピスト
ンを変位する機械的装置は、ステツピングモータ
で構成される。

最後に、本発明の最後の実施例によると、注入
装置と、フイルタ支持装置との急速で一時的な接
触用装置は、電子式制御組立体で電気的に付勢さ
れフイルタサポートを注入装置に向いまたは離れ
る様に移動することでフイルタ支持装置の垂直方
向の並進を発生可能なレバーを作動するソレノイ
ドを備えている。

本発明は、その実施例に関し添付図面を参照し
て下記に詳細に説明される。

第１図は、底を多孔質ペレツト５で密封され締
付けねじ３でサポートに維持される円筒形タンク
４を備える注入装置１を示す。円筒形タンク４の
上部は、円筒形タンク４内を垂直方向に並進して
変位可能なピストン６で密封され、該ピストンの
変位は、ピストン６のヘツド８に直接に作用する
ステツピングモータ７で制御される。

本発明の急速濾過装置は、円筒形チヤンバ１０
をその中心に有しその上部が他の多孔質ペレツト
１１で密封されるフイルタ支持装置９を備えてい
る。多孔質ペレツト１１は、実際の濾過材料１２
のサポートとして作用し、それ自体公知の態様で
フイルタ、ゲル、ガラスの微小球体または任意の
その他の合成物質のサポートによつて形成され
る。ポンプ１３は、適当なときに、円筒形チヤン
バ１０に真空を生じるのを可能にする。それ自体
公知の並進案内装置１４は、フイルタ支持装置９
を急速な一時的接触用装置１５の作用の下で注入
装置１の軸線における軸方向の並進で可能にする
のを可能にする。装置１５は、例えば、電磁作用
でレバー１６に遠隔して作用可能であり、レバー
１６は、水平な軸１７のまわりに移動可能であ
り、その端部１８は、ボール継手１９を介してフ
イルタ支持装置９のその軸線に沿う並進運動を制
御する。電子式制御組立体２０は、線路２１およ
び線路２２，２３によりステツピングモータ７お
よび急速接触用装置１５での同時作用を可能にす
る。

第１図の実施例では、急速な一時的接触用装置
１５は、電子式制御組立体２０で電気的に付勢さ
れるソレノイドを有し、該ソレノイドは、強磁性
接極子２４の吸引と、矢印FF′で示す如くレバー
１６のその軸１７のまわりの旋回とを生じさせる
のに充分な強さの磁場を発生可能である。

急速濾過装置の作用は、次の通りである。

濾過を所望の液相は、注入装置１の円筒形タン
ク４へ予め導入される。濾過材料、例えば、ミリ
ポアフイルタは、多孔質ペレツト１１の表面に置
かれ、濾過装置は、いつでも運転できる。電子式
制御装置２０の作用の下で、注入装置１と、フイ
ルタ支持装置９との急速な一時的接触用装置１５
は、レバー１６に作用し、レバー１６は、その軸
１７のまわりに旋回し、注入装置１へ向いフイル
タ支持装置９の急速な運動を生じさせ、注入装置
１は、並進案内装置１４の扶助で固定されたまゝ
である。濾過装置の上述の２部分間に接触が設定
されると、図示されない検出器は、制御装置２０
へ接触情報を直ちに伝達し、制御装置２０は、所
定の量だけタンク４にピストン６を導入して、タ
ンク４に収容される液相の一部の非常に急速な濾
過が２つの多孔質ペレツト５，１１と、濾過材料
１２とを介して行われる如く線路２１によつてス
テツピングモータ７に直ちに作用する。これと同
時に、ポンプ装置１３は、電子式制御組立体２０
によつて運転状態になり、円筒形チヤンバ１０に
真空を発生することで濾過の増速と共に、フイル
タを通過した液相の排出に役立つ。

所定の時間の終りに、または液相の所望の量が
急速濾過装置で濾過されると直ちに、制御組立体
２０は、注入装置１と、フイルタ支持装置９とで
構成される濾過装置の２つの半分を再度分離する
如く一時的接触用装置１５に逆方向に作用する。
この進行の態様は、特に、濾過すべき製品が放射
性であるとき、フイルタの汚染時間を厳密な最小
に制限することを可能にする。

一列として、本発明の急速濾過装置の適用を下
記に説明する。蛋白質または膜状小胞（神経線維
または筋肉膜の断片）は、過剰な水の除去の後、
これ等を支持するのに適用な特性を有するミリポ
アフイルタに載せられる。次に、生物学的物質
（膜または蛋白質）を有するフイルタは、放射性
基質、即ち、フイルタに支持される蛋白質または
膜に結合すべき分子を含有する溶液で急速に洗滌
される。該分子ないし基質との反応と、濾過媒体
との交換とは、濾過時間の全体にわたつて継続す
る。濾過は、所望の時間に中止され、フイルタ
は、反応する物質から分離され、フイルタに含ま
れる放射能は、測定され、濾過の中止の際におけ
る反応状態の情報を得るのを可能にする。開発さ
れた装置は、濾過量と共に、液体の通過時間を非
常に正確に調節するのを可能にする。数十ミリ秒
の様な短い濾過時間、即ち、通常の濾過方法で得
られるもの（少くとも２秒から５秒）に比し２桁
以下の時間分解能を得るのが可能である。

この特徴は、細胞膜を通るイオンの移行の測定
に対して本装置を大きな関心事にする。また、こ
れは、完全に新寄な酵素の動的測定を意図するの
を可能にし、特に、本装置は、基質、酵素の錯体
または非共有原子価分子の研究を可能にする。該
測定は、膜状蛋白質に対するCa⁺⁺イオンの結合
（筋小胞体ATPアーゼーCa⁺⁺）の反応速度の測
定に関して下記に詳細に説明される。

この測定は、下記の態様で行われる。

−ミリポアフイルタ（HAWP0.45μm）は、フイ
ルタ支持装置に載せられ、 −蛋白質を含有する膜状小胞は、フイルタに載せ
られ（フイルタに対し200μgから300μgの蛋白
質）、 −フイルタ支持装置は、⁴⁵Caを含有する溶液を充
填された注入装置の下方に置かれ、 −反応は、所定の時間（20ミリ秒から数秒までの
間）にわたりフイルタと、注入装置とを接触さ
せる電子式制御装置で開始され、該時間中、注
入装置は、作動され、⁴⁵Caを含有する溶液は、
フイルタを介して注入される（0.2mlから１
ml）。

また、濾過される液体の量は、予め定められ
る。反応および濾過は、フイルタと、注入装置と
の物理的な分離によつて中止される。フイルタの
放射能は、シンチレーシヨン計数器の扶助で測定
される。このシーケンスは、各々の所望の濾過時
間に対して反復され、得られる結果は、⁴⁵Ca²⁺の
溶液と、膜状小胞との接触時間の関数として膜状
小胞で固定されるCa²⁺の量を表示する第２図に
示される結合の反応速度である。各点０は、調査
すべき蛋白質を有する新しいフイルタの異なる測
定、従つて、各時間に対応する。点は、蛋白質を
含有しないフイルタで実施された測定に対応し、
従つて、フイルタ湿潤水で捕捉される放射能の測
定に対応する。

この一連の実験で得られるCa²⁺イオン結合の
反応速度は、次に解析され、これは、この蛋白質
の特定の作用の詳細を点検することを可能にす
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の装置の立面図、第２図は
Ca⁺⁺イオンと膜状蛋白質との化合の反応速度の
測定値の線図を示す。 １…注入装置、４…円筒形タンク、５，１１…
多孔質ペレツト、６…ピストン、７…ステツピン
グモータ、９…フイルタ支持装置、１０…円筒形
チヤンバ、１２…濾過材料、１３…ポンプ、１５
…接触用装置、１６…レバー、２０…電子式制御
組立体。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ その底が多孔質ペレツトで密封され、その上
   部が適当な機械的装置によりその中を並進して変
   位可能なピストンで密封され、濾過すべき液相を
   収容するタンクを有する注入装置と、実際の濾過
   材料のサポートとして作用する多孔質ペレツトで
   その上部を密封され、その中に真空を生じるのを
   可能にするポンプ装置にその基部で結合されるチ
   ヤンバを有するフイルタ支持装置と、前記注入装
   置と、該フイルタ支持装置との急速で一時的な接
   触を保証する装置と、該接触用装置と、前記ピス
   トンの機械的な並進装置とに同時に作用した後、
   注入の中止と、該注入装置と該フイルタ支持装置
   との分離とを所望の際にもたらすことにより、各
   濾過操作を制御する電子式制御組立体とを備える
   特に、生物学的液体の急速濾過装置。 ２ 前記多孔質ペレツトが、フリツトガラスで作
   られる特許請求の範囲第１項記載の濾過装置。 ３ 前記ピストンを並進して変位する機械的装置
   が、ステツピングモータを備える特許請求の範囲
   第１項記載の濾過装置。 ４ 前記注入装置と、フイルタ支持装置との間に
   急速で一時的な接触をもたらす前記装置が、前記
   電子式制御組立体で電気的に付勢されると共に、
   該注入装置に向いまたは離れる様に移動すること
   で該フイルタ支持装置の垂直方向の並進を発生可
   能なレバーを作動するソレノイドを備える特許請
   求の範囲第１項記載の濾過装置。