JPH03155778A - 胎児の栄養膜細胞層細胞の単離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、比較的非侵入性の手段を使用する妊娠初期の
出生前診断による遺伝疾患の検出に関する。

（従来の技術） 様々な遺伝疾患が、胎児が子宮に存在する間に検出され
得る。これらの疾患の中には胎児を極端に衰弱させるも
のがあり、その場合両親に妊娠を中止するよう決心させ
ることが望ましい。しかし。

最も頻繁に使用される出生前の診断技術、すなわち羊水
穿刺および絨毛膜絨毛サンプリング（ＣＶＳ）には２重
大な欠点がある。これらの技術では。

必然的に胎児または胎盤膜の妨害が生じる。さらに、羊
水穿刺には合併症を併発する危険はほとんどないが、第
２トリメスターの中期まで行うことができない。中止が
示される場合、このタイミングが遺伝分析に必要とされ
る時間と組合わせると母体が妊娠第２トリメスター後期
に直面することになるので、母体の健康が危険にさらさ
れることになる。ＣＶＳは妊娠６カ月後に行われ得るが
。

高い中絶率を有しており、記録によると１２％である。

さらに、核型分析に適切な絨毛膜絨毛を得るのが困難で
あるというような他の関連したリスクは、この技術を幅
広（使用する妨げとなっている。

母体血液から得られた胎児細胞を使用する出生前の診断
方法は、上記の診断技術に特有の問題を減少させるであ
ろう。しかし、この目的を達成するにあたって１例えば
母体血液中に胎児細胞が出現することが通常比較的まれ
であるという主要な障害のために、その発展が阻まれて
いる。事実。

それらの検出には１通常蛍光活性細胞分離のような特殊
な方法が必要である。

胎児細胞を、蛍光活性細胞分離により母体血液から単離
する試みがなされている。［Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇら（
１９７９）　］。これらの分離は、母体血液においてＨ
ＬＡ　　Ａ２陰性細胞と結合するであろう標識された抗
体プローブの検出に基づいていた。この方法で分離され
た男子胎児細胞は、Ｙクロマチンのキナクリン染色によ
ってさらに同定された。単離された細胞は、起源がリン
パ球のようであった。

しかし、胎児の雄性細胞と母体の雌性細胞との間のキナ
クリン染色における相違は小さいので、このアッセイの
決定には疑問がある。さらに、単離された胎児細胞は通
常刺激されて有糸分裂することができない。有糸分裂は
核型分析および結合分析（ｂａｎｄｉｎｇ　ａｎａｌｙ
ｓｉｓ）に重要である。

他の方法もまた。母体血液における胎児Ｙクロマチン陽
性細胞を検出するために蛍光活性細胞ソーターを使用し
ている。これらの細胞の起源は不明であるが、これらの
形態はリンパ球の形態と類似している。フィトヘムアグ
ルチニンに対する非応答性［Ｚｉｌｌａｃｕｓら（１９
７５）　］は、それらがリンパ球または赤血球前駆体で
あり得ることを示唆している［　ＰａｒｋｓおよびＨｅ
ｒｚｅｎｂａｒｇ　（１９８２）　］　ｏ　　このよう
な細胞が観察される頻度は、０．２％未満［Ｚｉｌｌａ
ｃｕｓら（１９７５）　１　から４％Ｃ５ｉｅｂｅｒｓ
ら（１９７５）　］　であった。

また、胎児の栄養膜を血球流量計によって母体血液、か
ら回収するための試みもなされた。　［Ｃｏｖ。

ｎｅら（１９８４）　］。これらの研究に使用されたモ
ノクローナル抗体である）１３１５は、満期胎盤の合胞
体栄養膜細胞層の刷子縁から単離された微小絨毛を使用
して生成された。それはヒト合胞体栄養膜細胞層および
他の栄養腫細胞集団の表面において発現され、末梢血液
細胞には欠損している糖タンパクを同定すると報告され
ている。フィコール−トリオシル（ｆｉｃｏｌｌ−ｔｒ
ｉｏｓｉｌ）勾配を使用して分画された細胞の副次集団
は９分離実験に使用された。記述された細胞または細胞
物質は、１）８０％の母体細胞中、　　１−４７１００
０の頻度で発見された多核の合胞体細胞；２）５０％の
サンプル中、８／１０００の頻度で発見された二倍体細
胞；および３３％のサンプル中、　　＜３７１０００頻
度で発見され、恐らくこれらも合胞体由来である単核細
胞断片であった。

胎児細胞の形態は示されなかった。また、抗体陽性細胞
の特徴をさらに決定づける試みもなかった。

さらに、使用された抗体は、妊娠していない女性由来の
凝集細胞または多核細胞をも認識した。

ヒト胎盤の懸濁液からの胎盤細胞集団を単離する方法は
、　　Ｋａｖａｔａら（１９８４）によって記述されて
いる。この方法は相関２色（ｃｏ−ｏｒｄｉｎａｔｅ　
ｔｗｏ　ｃ。

１ｏｒ）および光散乱蛍光活性細胞ソーター（ＦＡＣ８
）分析法および分離法を使用する。５つの異なる細胞集
団は、　　ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ単形性決定子に対するモ
ノクローナル抗体（ＭＢ４０．５）およびヒト栄養膜に
対するモノクローナル抗体（抗Ｔｒｏｐ　１．および抗
Ｔｒｏｐ　２）により検出された細胞表面抗原の相関発
現（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）に
おける大きさおよび量の差に基づいて単離された。抗Ｔ
ｒｏｐ　１および抗Ｔｒｏｐ　２が両方とも、大きさが
中／大であり胎児細胞の特徴をいくつかもっているがＨ
ＬＡ−Ａ、　Ｂ、　Ｃ抗原を示さない種類の細胞と結合
したことが報告されている。

ＬｏｋｅおよびＢｕｔｔｅｒｖｏｒｔｈ　（１９８５）
は、２つのモノクローナル抗体、　　１８Ｂ／Ａ５およ
び１８Ａ／Ｃ４を記述しており、それらは第１トリメス
ター栄養膜細胞層と反応する。しかし、これらのモノク
ローナル抗体は、池の胎児上皮組織とも反応する。さら
に、１８Ｂ／Ａ　５は１合胞体栄養膜細胞層とも反応す
る。

（発明の要旨） 母体血液から胎児細胞を得ることは、出生前の遺伝子分
析のために胎児組織を得るために一般に使用されている
技術特宵の問題を減少させるであろう。しかし、この目
的のためには、主として２つの障害によってその発展が
阻まれている。第１に、母体血液中に胎児細胞が現れる
ことは２通常比較的まれであり、検出のための蛍光活性
細胞分離のような特殊な方法が必要とされる。箪２に。

胎盤および胎児血液由来のものを包含する幅広いスペク
トルの細胞タイプが、母体循環に侵入し得る。本発明は
、妊娠第１トリメスター中の母体血液から胎児栄養膜細
胞層を単離するのに有用な方法および組成物を提供する
ことによってこれらの問題を解決するので、胎児サンプ
ルを得るための比較的非侵入性の技術を使用して妊娠初
期の出生前の遺伝子分析を可能にする。

従って１本発明の１つの目的は第１トリメスター栄養膜
細胞層細胞に対して特異的なモノクローナル抗体を提供
するハイブリドーマを調製する方法であって、以下の工
程を包含する： ａ、第１トリメスター栄養膜細胞層細胞の精製された調
製物を提供する工程； ｂ、工程ａの調製物で個体を免疫する工程；Ｃ９工程す
で免疫された個体の抗体産生細胞を永久増殖化する工程
；および ｄ、精製された栄養膜細胞層細胞と反応し、末梢血液中
の他の細胞とは反応しない抗体を産生ずる抗体産生永久
増殖化細胞のクローンを単離する工程。

本発明の他の目的は、第１トリメスター栄養膜細胞層細
胞に対して特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイ
ブリドーマまたはその子孫である。

本発明のもう１つの目的は、第１トリメスター栄養膜細
胞層細胞に対して特異的なモノクローナル抗体である。

本発明のさらにもう１つの目的は、母体血液から胎児栄
養膜細胞層細胞を単離する方法であって。

以下の工程を包含する： ａ、母体血液のサンプルを提供する工程；ｂ、母体血液
サンプルを、免疫学的に特異に反応させる条件下で、第
１　）　ＩＪメスター栄養膜細胞層細胞に対して特異的
なモノクローナル抗体と接触させる工程；および ｃ、母体血液成分の残物から抗体−栄養膜細胞層複合体
を単離する工程。

本発明のさらにもう１つの目的は、以下の工程を包含す
る。母体血液中の胎児栄養膜細胞層を検出する方法であ
って、以下の工程を包含する：ａ、母体血液のサンプル
を提供する工程；ｂ、母体血液サンプルを、免疫学的に
特異に反応させる条件下で、第１トリメスター栄養膜細
胞層細胞に対して特異的なモノクローナル抗体と接触さ
せる工程；および ｃ、抗体−細胞複合体の形成を検出する工程。

本発明のさらにもう１つの目的は、ハイブリドーマ、そ
の子孫ならびにそれらの等価物であるハイブリドーマが
ＡＴＣＣＮｏ、　　１００９６である。

本発明のさらにもう１つの目的は、ハイブリドーマ、そ
の子孫ならびにそれらの等価物であるハイブリドーマが
ＡＴＣＣＮｏ、　１００９７である。

（発明の構成） 本発明は、出生前の診断に適切な胎児細胞を母体血液か
ら単離するのに有用な方法および組成物に特徴を有して
いる。母体循環に侵入することができ、かつそのため検
出用に用いられ得る胎児胎盤細胞の可能性のある起源を
評価することによって１本発明の様々な実施態様および
母体血液中での単離または検出のための標的細胞として
の胎児栄養膜細胞層の重要性を理解することが容易にな
る。

母体−胎児界面の構造は、第１図に示されている。界面
において、２つのタイプの胎児細胞が母体血液に接触し
ている。すなわち９合胞体栄養膜細胞層細胞および栄養
膜細胞層細胞である。絨毛膜絨毛は合胞体栄養膜細胞層
細胞によって覆われており、これらの合胞体細胞または
多核細胞は。

恐らく母体−胎児界面上に存在する最も多数の胎児細胞
タイプであり、第１図においてｒａＪで示されている。

これらの細胞を覆う微絨毛刷子縁は。

クラス！およびクラスＩＩの組織適合性抗原を欠いてい
る。完全な合胞体栄養膜細胞層細胞またはそれらに覆わ
れる絨毛膜絨毛が、母体血液中で長時間にわたって循環
する可能性はほとんどない。

これらの多核細胞は、それらの合胞体特性のために極端
に大きい（＞１００ｔクロン）。従って、′−Ｖ−れら
は循環中に１例えば肺および肝臓のような母体の毛細血
管床において捕られれるであろう。組織構造検査の結果
、多核合胞体栄養膜細胞層細胞が妊娠中の女性の肺に存
在し、　　［ＡｔｖｏｏｄおよびＰａｒｋ（１９６１）
　］　、　　そして、出産後間もなく子宮を廃液（ｄｒ
ａｉｎ）する脈管から流れ出た血液中に存在することが
示された［　Ｄｏｕｇｌａｓら（１９５９）　］　。　
　母体−胎児界面において見られるもう１つの細胞タイ
プは、立方体様の栄養膜細胞層細胞であり、それはｌ細
胞当りｌ核を有し、約２０ミクロンの大きさである。こ
れらの細胞の相対的な位置は第１図および第２図に示さ
れている。栄養膜細胞層細胞のタイプは、形態学の基準
およびそれらの異なる機能によって裏付けされるように
、２つの異なる集団に分類可能である［Ｅｎｄｅｒｓ　
（１９６８）　］　ｏ栄養膜細胞層の２つの集団の相対
的な位置は第２図に示されている。栄養膜細胞層細胞の
１つの集団は合胞体の下に存在する。これらの細胞は１
合胞体栄養膜細胞層細胞に対する前駆体であり、栄養膜
細胞層の融合に起因する（第２図ａ）。前駆体の部分集
団は絨毛膜絨毛内に埋め込まれ、恐らく母体血液にはさ
らされることはほとんどないであろう。

これらの前駆体細胞は第１トリメスターにおいて最も多
（存在し、第２トリメスターにおいてその数は急速に減
少し、満期にはほとんど存在しない。

栄養膜細胞層のこの前駆体部分集団を有する絨毛膜絨毛
は、子宮に付着しておらず、むしろ母体血液中に浮遊し
ているので、　「自由絨毛」と呼ばれる。第１トリメス
ターにおける減圧吸引によって得られた胎盤および満期
胎盤は主として自由絨毛を含有する。

栄養膜細胞層細胞の第２集団は「侵入性」の栄養膜細胞
層である。これらの細胞の塊は、　「細胞カラム」と呼
ばれ、絨毛膜絨毛を覆う栄養膜細胞層細胞を通る穴を堀
り、子宮に侵入する。最終的には、細胞カラムは子宮管
を侵食し、栄養膜細胞層細胞は母体内皮内層に取って代
わる［Ｐｉｊｎｅｎｂ。

ｒｇ　（１９８１）］。　（第１図パネルｂおよび第２
図パネルｂ参照）。細胞カラムは、絨毛膜絨毛において
見られる栄養膜細胞層幹細胞と連続しているので。

この工程によって形成された付着絨毛膜絨毛は胎盤を子
宮に付着させる。これらの侵入性栄養膜細胞層細胞は母
体血管に付着し、このようにして母体血液と接触する。

（第２図パネルｂ参照）。さらに、それらは比較的サイ
ズの小さい単一細胞なので、循環中に母体毛細血管床で
取り除かれないであろう。

インビボでの胎盤形成の初期段階において発生する特定
の事項がイソヒドロにおいて繰り返され得るという仮定
と首尾一貫する結果が得られている。初期の実験では、
胎盤絨毛から移動する第１トリメスター栄養膜細胞層細
胞が、ウシ角膜内皮細胞（ＢＣＥ−ＥＣＭ）およびＰＦ
−ＨＲ９奇形癌細胞系によって生成された細胞外マトリ
ックスに侵入したことが示された［Ｆｉｓｈｅｒら（１
９１１５）］。続いて栄養膜細胞層細胞の精製調製物も
また。このマトリックスに侵入したことが確かめられた
［Ｆｉｓｈｅｒら（１９８９ａａｎｄｂ）］。どちらの
場合も、絨毛における細胞集団の副次集団または精製細
胞のみが、その上でそれらが培養されるマトリックスを
分解した。

このことは、主として自由絨毛に見られる幹細胞からな
る。第１トリメスターヒト胎盤から単離された栄養膜細
胞眉細胞が、侵入性となり得るものと融合して合胞体を
形成するものとの混合物であることを示唆している。さ
らに、結果は、イソヒドロで培養された栄養膜細胞層細
胞が、妊娠後１２週間で侵入が頂点に達するインビボに
おいて表される侵入挙動のタイムテーブルを保持するこ
とを示した。第２トリメスター絨毛および栄養膜細胞層
細胞はマトリックスに付着するが、侵入はしない。

最近行われた実験（調製におけるマニニスクリプト）で
は、栄養膜侵入を調査するために腫瘍細胞の侵入を研究
するために考案されたもう１つの実験システムＣ（Ａｌ
ｂｉｎｉら（１９８７）　；　ＥｒｋｅｌｌおよびＳｃ
ｈｉｒｒｍａｃｈｅｒ　（１９８８）コを使用している
。３゜５、および８μｍの細孔を有するポリカーボネー
トフィルターを市販の膜状の基部材料であるＭａｔｒｉ
ｇｅｌで均一にコーティングした。第１トリメスターお
よび満期栄養膜細胞層細胞をこれらのマトリックスでコ
ーティングしたフィルター上で培ｉした。これらの実験
からいくつかの興味深い発見がなされた。特に注目すべ
きなのは、栄養膜細胞層細胞は、異なるタイプの細胞外
マトリックスにプレートされると、非常に異なる行動を
示すことである。単一細胞としてＰＦ　ＨＲ９マトリッ
クス上にプレートされた第１トリメスター栄養膜細胞層
が単−届を形成する［Ｆｉｓｈｅｒら（１９８５，１９
８９＞１のに対して、　　ＭａＬｒｉｇｅｌ上にプレー
トされた同様の数の第１トリメスター栄養膜細胞層細胞
は塊を形成する。

さらに、これらの構築物の多くは、隣接する塊と接触す
る伸長工程で連結されるようである。これらの塊の構築
物は、栄養膜細胞層細胞の単一層よりも絨毛に類似して
いる。これに対して、　　ＭａＬｒｉｇｅｌにプレート
された同一の数の満期細胞は凝集しない。

胎盤細胞の侵入特性を調べるためにこのシステムを使用
した。１８時間後、第１および第３トリメスター栄養膜
細胞層の培養物から断片を切断した。第１トリメスター
構築物の底部に位置する細胞は、構築物全体がマトリッ
クス内へ沈むようなネット効果で、下にあるＥＣＭへ侵
入しているようであった。そのような侵入が発生したこ
とは。

下にあるＭａｔｒｉｇｅｌの多数の断片が、くり抜かれ
たチャネル内に存在する栄養膜細胞層を埋め込んだこと
が観察されたことによって確認された。これに対して、
満期栄養膜細胞層細胞は、侵入した形跡がなく見かけ上
Ｍａｔｒｉｇｅｌに付着した単一細胞として残存してい
た。

栄養膜細胞石によるＭａｔｒｉｇｅ！侵入を研究するた
めに走査電子顕微鏡も使用した。すでに観察されたよう
に、　　ＰＦ　ＨＲ９マトリックス内の穴の端に沿って
見られた栄養膜細胞居は、非常に複雑な表面を有してい
た。走査電子顕微鏡により、マトリックスと相互作用す
る細胞が、細胞表面から光を放射するという複雑な工程
により複雑な表面を有していることが示された。栄養膜
工程は、マトリックス分解の部位と関連しているようで
ある。これらの細胞が成長したＭａｔｒｉｇｅｌでコー
ティングされたフィルターの下部も調べた。第１トリメ
スター栄養膜細胞層細胞は、３μｍの細孔を有するフィ
ルターを通過することができなかったが、５μｍおよび
８μｍの細孔の場合と同様にこれらを通じて多数の複雑
な工程を伝えた。膜の最先端には、しばしばしわが見ら
れ、再び多数の複雑な工程が見られた。一般に、これら
の細胞突起物が最初に現れ２次いで完全な細胞が細孔を
通して現れた。第１トリメスターがＭａｔｒｉｇｅｌで
コーティングされた８μｍの細孔を有するフィルター上
にプレートされた際に、完全な細胞が通過し得た。フィ
ルターの低部のパワーの低いＳＥＭによって、培養後わ
ずか１８時間で多数の細胞が上部表面からＭａｔｒｉｇ
ｅｌを通って移動したことが示された。第１トリメスタ
ーヒト胎盤から単離された繊維芽細胞もまた。

Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングされたフィルター上に
プレートされた。これらの細胞は塊よりもむしろ単−層
を形成した。フィルターの下部を調べると。

フィルターを通過した細胞がないことが分かった。

このように、第１トリメスターヒト栄養膜細胞層はイソ
ヒドロにおいてＥＣＭを分解［（Ｆｉｓｈｅｒら（１９
８５，１９８９ａ、　ｂ）］　Ｌ、　　Ｅ　ＣＭを通し
て移動する。

これに対して、妊娠後期の栄養膜細胞層細胞は分解も移
動もしない。これらの結果から、栄養膜細胞層細胞は、
インビボにおいて示した発展的に制御された侵入性挙動
をイソヒドロにおいても維持することが分かる。さらに
、フィルターの下部において出現する栄養膜細胞層細胞
の侵入性副次集団はＭａｔｒｉｇｅｌを通過しない非侵
入性細胞から分離され得る。

また、出生前の遺伝子分析に対して重要なことは、第１
トリメスターヒト栄養膜細胞層細胞が培養物中に維持さ
れ得ることである。胎児循環から生じる細胞は、この特
性を有していないようである。

上記に基づいて１本発明の方法および組成物は。

第１トリメスター栄養膜細胞層の特性を示す胎児細胞の
母体血液中における同定および母体血液からの単離に関
連する。なぜなら、これらの細胞が母体循環に最も到達
しやすく７．そしてその後毛細血管床において取り除か
れないからである。

本発明において、第１トリメスターヒト栄養膜細胞層に
より発現され抗原に対して特異的なモノクローナル抗体
のパネルを生成する。妊娠中、胎盤は大きな形態変性を
受け、このことは多数の生化学的および機能的特性にお
ける変化を反映している。これらの形態学的および機能
的変性は、妊娠初期において栄養膜細胞層細胞上に存在
する抗原が、満期胎盤由来の栄養膜細胞層細胞上におい
て失われるかまたは変性され得ることを示唆している。

例えば、特定のプロテアーゼおよびインテグリン（ｉｎ
ｔｅｇｒｉｎｓ、細胞粘着分子）は、第１トリメスター
細胞に対して特異である［Ｆｉｓｈｅｒら（１９８９ｂ
）］。従って９本発明において栄養膜細胞層抗原に対し
て特異なモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ
は、第１トリメスター栄養膜細胞層細胞の精製調製物を
イムノゲンとして使用することによって作製される。こ
の調製物は、侵入性細胞および融合されて合胞体を形成
する細胞により構成されている。第１トリメスター栄養
膜細胞層は、これらの細胞により発現された抗原を特異
的に検出するモノクローナル抗体を生成する可能性を高
めるためにイムノゲンとして使用される。

ハイブリドーマによるモノクローナル抗体を作製する一
般的方法は公知である。永久増殖化された抗体産生細胞
系は、細胞融合、および、腫瘍形成ｌ５ＮＡでＢリンパ
球を直接形質転換したり、またはＥｐｓｔｅｉ　ｎ−Ｂ
ａｒｒウィルスでトランスフェクションするような他の
技術により作製され得る。Ｍ、　５ｃｈｒｅｉｅｒら　
（１９８０）：　Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら（１９８１）
；　Ｋｅｎｎｅｔｔら（１９８Ｇ）：を参照。さらに、
米国特許筒４．３４１．７６１号；第４．３９９．１２
１号；第４．４２７．７８３号；第４．４４４．８８７
号；第４．４６６、９１７号；第４．４７２．５００号
；第４．４９１゜６３２号；および第４．４９３，８９
０号を参照。単離された栄養膜細胞層細胞をイムノゲン
として使用してモノクローナル抗体を生成する方法につ
いては後述する。前述および後述される特許、特許出願
ならびに引例はすべて９本願に参考文献として取り入れ
られている。

モノクローナル抗体は次いでスクリーニングされ、゛合
胞体栄養膜細胞層に対する前駆体であるものおよび侵入
性であるものを含む第１トリメスター栄養膜細胞層細胞
の大半を検出するのに有用なものを同定する。スクリー
ニングは、特異性の緊縮性の程度を変える通常特異性の
緊縮性を高める多数の工程から構成される。スクリーニ
ング工程は以下の工程を包含する。

１、第１トリメスターヒト胎盤絨毛膜絨毛の断片におけ
る栄養膜細胞層と特異的に反応する抗体を単離する工程
。

２、栄養膜細胞層細胞と反応し、末梢血液成分とは反応
しない抗体を単離する工程。

３、前駆体および侵入性タイプの分解された栄養膜細胞
層細胞の精製Ｆｉｌ物と反応する抗体を単離する工程。

４、工程１−３を満たす抗体がまた。イソヒドロにおい
て細胞外マトリックスに活発に侵入する第１トリメスタ
ーヒト栄養膜細胞層細胞と反応するかどうかを決定する
工程。

スクリーニング工程は、第１トリメスター栄養膜細胞層
細胞に対して産生されたモノクローナル抗体により同定
された抗原の発現の特異性を、正確にテストするために
設計されている。その方法は２つの重要な考察を反映し
ている。第１に、第１トリメスター胎盤および末梢血液
のスミアの断片を使用する最初の工程は迅速に比較的簡
単に行われる。従って、これらの工程は多数の抗体のス
クリーニングを可能にする。第２に、最終の２つの工程
（工程３および４）は実施がより困難なので、多数の抗
体の一般的スクリーニングとしては使用されない。スク
リーニング方法において、これらの工程によりスリーニ
ングされる抗体の数は。

最初の２つの′スクリーニング工程のために、すでにか
なり減少している。

断片の初期スクリーニングによって、第１トリメスター
絨毛膜絨毛を覆う合胞体栄養膜細胞層の下に位置する栄
養膜細胞層と反応する抗体が同定される。これらの栄養
膜細胞層は前駆体細胞であり、融合されて合胞体を形成
するかまたは侵入特性を得る。従って、これらの細胞は
大多数の栄養膜細胞層細胞に共通する抗原を発現すると
予想される。

初期スクリーニング工程において使用され得る池の材料
は胎盤床の断片である。子宮組織、特に血管は侵入性栄
養膜細胞層細胞を含有する。

スクリーニング工程における第２工程は、母体血液と反
応する抗体を減少させることである。本発明のモノクロ
ーナル抗体が胎児細胞と母体血液細胞とをうまく区別す
るのに使用されるなら、この工程またはそれと同等のも
のが特に重要である。

重要なことは、リンパ球および栄養膜細胞が共通の抗原
を共有していることである。ネズミ栄養膜および末梢血
液リンパ球の間の抗血清の交差反応はＢｅｅｒら（１９
７２）によって報告されている。同様のクラスのヒト抗
原は、　　ＭｃｌｎｔｙｒｅおよびＦａｕｌｋ（１９７
９）によりＴＬＸ　（栄養膜リンパ球交差反応抗原）と
呼ばれ、　　Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇおよびその協力者に
よって使用された抗体は、この特定クラスにおける抗原
を同定し得た［　Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇら（１９７９）
コ。

第２工程におけるスクリーニングは、抗体の末梢血液細
胞への結合または結合の欠失をモニターする技術を使用
して成し遂げられ得る。これらの技術は、当業者に既知
である。しかし、上記に引用した理由によりスクリーニ
ングは末梢血液のスミアを使用して実施される。対照血
液スミア（妊娠していない個体由来）において成分細胞
と反応しない抗体は、高速細胞ソーターを使用してざら
にスクリーニングされて抗体が血液細胞との免疫活性を
欠いていることを確認され得る。

スクリーニング工程における箪３工程は、絨毛膜絨毛に
おいて栄養膜細胞層細胞を特異的に同定するが、末梢血
液成分とは反応しないモノクローナル抗体が精製された
栄養膜細胞層細胞の調製物において多数の細胞を染色す
るかどうかを決定する。多数の細胞との陽性の反応は、
抗体が、融合されて合胞体を形成する前駆体細胞および
侵入性細胞の両方を同定することを示している。

最終スクリーニング工程は、先行する基準を満足する抗
体がまた。イソヒドロにおいて細胞外マトリックスを積
極的に分解する栄養膜細胞層細胞と反応するかどうかを
決定することである。母体組織の侵入は母体循環へ接近
するように進行し。

侵入性表現型の発生がスクリーニング工程の他の工程に
おいて検出されるいくつかの抗原の破壊と同時に起こる
可能性がある。従って、この工程は。

選択された抗体が前駆体および侵入性栄養膜細胞店の両
方に共通の抗原を認識することを確認する。

このスクリーニングに適切なイソヒドロシステムはＦｉ
ｓｈｅｒら（１９８５，１９８９ａ、　ｂ）において記
述されており、詳細は後述されている。

上記スクリーニング工程により単離されたモノクローナ
ル抗体を、母体血液のサンプルにおける栄養膜細胞層の
検出および／または単離のために使用する。この工程に
おいて、抗体を母体血液と混合し、抗体細胞複合体を血
液細胞の残物から同定および／または分離する。同定は
抗体を適切な標識で標識することにより行われ得る。適
切な標識およびそれらを抗体に付着させる方法は当業者
に既知であり、蛍光性、化学ルミネセンス、放射性、お
よび染色分子を包含する。標識された抗体からシグナル
を増幅する技術もまた既知であり。

例えば、ビオチンおよびアビジンを使用する検出システ
ム、および酵素で標識および仲介された免疫アッセイで
ある。検出および分離の好ましいシステムは、フルオレ
セインを使用して抗体を標識し１次いで高速蛍光活性細
胞ソータを使用して分離する。

栄養膜細胞層の単離および／または検出を成し遂げるた
めに抗栄養膜細胞層モノクローナル抗体を固体層に付着
させることが望ましい。モノクローナル抗体を固体層に
付着させる方法は当該技術において既知であり、モノク
ローナル抗体の固体層への疎水性、イオン性、および化
学的結合の方法を包含する。有用な固体層は当該技術に
おいて既知であり２例えば、磁性または非磁性ビーズ。

プレート、および重合材料の小片を包含し得る。

モノクローナル抗体が磁気ビーズに付着する際に。

磁気細胞分離装置を使用して抗体細胞複合体を単離する
ことは可能である。

さらに、抗栄養膜細胞層モノクローナル抗体との特異的
反応の以前に母体血液サンプル中の栄養膜細胞層の濃度
を高めておくことが望ましい。これは陽性または陰性選
択技術により成し遂げられ得る。例えば、陽性選択技術
によると、スクリーニング前の混合物は栄養膜細胞層特
異的なモノクローナル抗体、および／または、栄養膜細
胞層および他の細胞タイプに存在し、血液細胞に存在し
ないエピトープに結合するモノクローナル抗体を含有し
得る。後者の例としては、抗サイトケラチンがある。我
々の研究によると、第１トリメスター栄養膜細胞層がサ
イトケラチンを含有し、抗サイトケラチンは母体血液由
来の栄養膜細胞層をスクリーニングするために使用され
た。［１［ｈｏｎｇら（１９８６）１　　さらに、サイ
トケラチンは通常血液細胞の構成要素ではないことが予
想される。

他の濃縮方法は、陰性選択技術に依存し得る。

例えば、栄養膜細胞層を結合せず、血液中の他の細胞を
結合する抗体は、初期にこれらの細胞タイプをサンプル
から取り除くために使用され得る。

これらの抗体は、上記のように、固体層に付着し分離を
援助し得る。血液中の様々なタイプの細胞に結合する抗
体は、当該技術において既知であり。

例えば、単核細胞に対して特異的なＨＬＥ−１がある。

他の細胞タイプが取り除かれ、栄養膜細胞層を含有する
調製物は９次いで抗栄養膜細胞層モノクローナル抗体で
処理され栄養膜細胞層を単離および／または検出し得る
。

抗体−細胞複合体の単離および／または検出は像分析を
行う装置を使用して成し遂げられ得る。

これらの装置は、当業者に既知であり２例えば光顕微鏡
、光学装置、蛍光走査等を包含し、これらの装置はフン
ピ二−タ使用して走査され得る。　さらに、装置は抗体
−細胞複合体を含有すると思われる懸濁液の流れをモニ
ターし得る。

本願で記載される工程により単離された抗栄養膜細胞層
モノクローナル抗体は、出生前の診断において使用され
る様々な技術に有用である。例えば、この工程により同
定された細胞は、核型形成のための既知の工程を使用し
て、培養物および核型において成長し得る。細胞はまた
１例えば、サラセミア、鎌状赤血球細胞貧血、青少年イ
ンシュリン依存糖尿病およびＨｕｎｔｉｎｇｔｏｎ病の
様々な遺伝子疾患に関連すると知られる制限長多形現象
の同定にも使用され得る。遺伝子疾患に関連する個体Ｄ
ＮＡ配列もまた。ポリメラーゼ鎖反応技術のようなりＮ
Ａ増幅技術を使用する技術によって検出され得る。

さらに、循環栄養膜細胞の増加が牛癩前症のようなある
種の病的状態と関連し得ることが示されている。　［Ｊ
ａａｍｅｒｉら（１９６５）コこの増加しつつある胎児
合併症は１通常第２トリメスター中に現れ。

母体の高血圧、タンパク尿、および胎児子宮内成長妨害
によって特徴づけられる。明白な兆候が現れる以前に、
抗栄養膜細胞層モノクローナル抗体を使用して増加した
循環栄養膜細胞層によってこの状態が進行しているかど
うかを決定するために。

第１トリメスターの後期段階における母体血液サンプル
をモニターし得る。

以下１本発明の実施例について記述するが１例証的な目
的のためであってその範囲を制限するものではない。本
明細書を考慮して、特許請求の範囲内における多数の実
施例が当該技術において明かであろう、特定のハイブリ
ドーマが実施例において示されているが、これらのハイ
ブリドーマの等偽物は当業者により容易に認識される。

等価ハイプリドーマは、指定のハイブリドーマによって
生成された抗体と免疫学的に反応するエピトープと免疫
学的に反応する抗体を生成するものを含む。

但し、結合親和力は異なり得る。抗体が免疫学的に同様
のエピトープと反応するかどうかを決定する技術は当該
技術において既知であり９例えば。

競合性結合の研究を包含する。

（実施例） １トリメスター　　　　　　　　の 栄養膜細胞層細胞を第１トリメスターヒト胎盤から単離
する。真空吸引後、素早く胎盤を取り出し、残存する母
体血液をできるだけ多く取り除くために１０’Ｃのリン
酸緩衝塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で洗浄する。固形血液を取り
除くことができなかった胎盤の断片はすべて捨てる。胎
児組織を粘着脱落膜から切開し、白絨毛膜絨毛が緩′衝
液中で浮遊するまでい（らかのＰＢＳ中ですすぐ。大き
な絨毛断片を胎盤から取り除き、１０％の胎児子ウシ血
清（Ｆ　ＣＳ）および５０ミクログラム／ｍｌのゲンタ
マイシンを含有するＤＭＥ　　１（−２１に移す。

遠心分離（１８０ｘｇ、５ｍ１ｎ）後、培地を吸引し２
組織の湿潤重量を決定する。絨毛を、さらに２回異なっ
た培地で洗浄する。

栄養膜細胞層細胞を単離するために、洗浄した絨毛ベレ
ットを分離溶液ｌ　［コラゲナーゼ（シグマ、タイプＩ
Ｖ）５００Ｕ／ｍｌ、　　ヒアルロニダーゼ（シグマ、
タイプ１−３）２００Ｕ／ｍｌ。

ＤＮａｓｅ（シグマ、タイプＩＶ）０．２ｍｇ／ｍｌお
よびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１ｍｇ／ｍｌを含有
するＰＢＳコ中で再懸濁（５：ｌ、ｖ／　ｗ　／　ｗ　
）する。懸濁液を３７’Ｃ水浴で静かに振る。絨毛膜絨
毛を覆う栄養膜細胞層細胞の層を取り除くのに必要なイ
ンキュベージ３ン時間をコラゲナーゼのロフト、および
年齢の異なる胎盤毎に組織学的・に決定する。一般に、
第１トリメスター組織を２０分間インキュベートする。

合胞体（ｓｙｎｃｙｔｉｕｍ）を含有する第１分離溶液
を取り除き、絨毛を分離溶液１１［）リブシン（シグマ
、タイプＸＩ　Ｉ　Ｉ）０．２５％、ＥＤＴＡ２ｍＭお
よび　ＤＮａｓｅＯ，２ｍｇ／ｍｌを含有するＰＢＳｌ
中で再懸濁する。３７’Ｃの振とう水浴中で１０分間イ
ンキュベートした後、絨毛コア（ｃｏｒｅ）および分離
細胞の混合物を１０％のＦＣＳを含有する同量の培地で
希釈する。大きな組織断片を取り除くため、絨毛および
培地をガーゼで濾し、上澄を上記のように遠心分離する
。栄養膜細胞層を取り除くために必要なインキュベーシ
ョン時間を組織学的に決定する。一般に、シングルサイ
クルで、栄養膜細胞層細胞は絨毛膜絨毛から取り除かれ
る。

生じた細胞ペレットを１０％のＦＣＳを含有する４ｍｌ
の培地で再懸濁し、に１　ｉｍａｎら＜１９８６）の方
法によりＨａｎｋの平衡塩溶液中に形成したＰｅｔｃａ
ｌｌ勾配の上に積層した。勾配は、９０％Ｐｅｒｃｏｌ
ｌ　（Ｐｅｒｃｏｌ　１９部：ｌＯＸ　Ｈａｎｋ平衡塩
溶液１部）をカルシウムおよびマグネシウムを含まない
（ＣＭＦ）Ｈａｎｋ平衡塩溶液で希釈し、５０ｍ１の円
錐形ポリスチレン遠心分離管中に積層することによって
、３ｍｌ毎の５％ステップで７０％から１５％のＰｅｔ
ｃａｌｌ　（Ｖ／Ｖ　）に形成する。上記勾配を室温で
２５分間遠心分離（１０００ｘｇ）Ｌ、　　その後栄養
膜細胞層細胞を含有する管の中央の広いバンドを取り除
き。

１０容量倍の培地で希釈する。細胞を遠心分離により単
離し、さらに２回洗浄し、２０％の透析ＦＣ３，１％の
グルタミンおよび５０ミクログラム／ｍｌのゲンタマイ
シンを含有するＭＥＭ　Ｄ−バリン培地［Ｇ１１ｂｅｒ
ｔおよびＭｉｇｅｏｎ（１９７５）］で再懸濁する。栄
養膜細胞届細胞を血球計で測定し、最終濃度５ｘｌＯ’
／ｍｌに調整する。栄養膜細胞層細胞の収率は、第１ト
リメスター胎盤毎に約１０’から１０８である。

栄養膜細胞層の単離されたＴＡ製物は、く１％の繊維芽
細胞を含む。１週間より長期にわたって維持されるであ
ろう培養調製物における繊維芽細胞の成長を防止するた
めに、培地を含有するＤ−バリンを使用する。

モノクローナル　　の生 モノクローナル抗体を、栄養膜細胞層プラズマ膜、また
は栄養膜細胞層の洗剤抽出物、あるいはサイトケラチン
、Ｆｃレセプター突起（ｐｒｏｃｅｓｓ）および細胞粘
着分子のような単離分子をイムノゲン無傷栄養膜細胞層
、として使用して、生じさせる。

栄養膜細胞層プラズマ膜をＢｒｕｎｅｔｔｅおよびＴｉ
１ｌ（１９７１）に従って単離する。洗剤抽出物を調製
する［Ｋｎｕｄｓｅｎ　（１９８５）］。後者の工程に
おいて、細胞を冷却下でＴｒｉＬｏｎ　Ｘ−１１４で抽
出し、３０°Ｃの「曇り点（ｃｌｏｕｄ　ｐｏｉｎｔ）
　Ｊに調整する。抽出物を遠心分離した後２分離層を収
集する。

以下のように、上記イムノゲンでマウスを免疫する。３
週間置きに、イムノゲンを、完全（注入１）または不完
全（注入２および３）フロインドアジユバントとともに
ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に注入する。最終の一連の
注入においては、アジュバントを有さないイムノゲン注
射を尾静脈に３日間毎日行う。

ラットもまた。抗体を生成するための免疫化には適切で
ある。細胞または成分を完全フロイントアジ−パントと
ともに腹腔内に注射する。次いで。

アジュバントを有さない注射を２回腹腔内に注入する。

免疫してから３日後、肺臓を、免疫したマウスまたはラ
ットから取り除き、実質的にＩ（ｅｎｎｅｔｔ（１９８
０）の工程に従って、肺臓をＳ　Ｐ　２１０マウス骨髄
腫細胞と融合する。融合細胞を、５０ミクロリツトルＫ
ｅｎｎｅｔｔＨ−Ｙ培地中でミクロタイターウェル当り
１個の融合生成物が成功裏に得られる予想濃度でプレー
ト（ｐｌａｔｅ）する。２４時間後、非融合５Ｐ２１０
細胞を選択的に殺すために、各ウェルの細胞に５０ミク
ロリツトル）Ｉ−Ｙに加えて倍量のアミノプテリンを補
給する。

所望の抗体を生成するハイブリドーマのスタ、リーニン
グを行うために、特定の融合に使用されるイムノゲンを
、　　Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ａ
ｌｅｘａｎｄｒｉａ、　Ｖａ、のＶｏｌｌｅｒらによっ
て記述されるようにｐＨ９，０！ｉ街液中で９６ウエル
ミクロＥＬＩＳＡプレートに固定する。関心のある抗原
（例えば、胎盤繊維芽細胞または末檎血液細胞）を発現
することが予想されない細胞または組織の抽出物を陰性
対照として使用する。ハイブリドーマ上澄液を４°Ｃで
２時間加える。洗浄後、結合した抗体の量を、βガラク
トシターゼ結合うビット抗マウスＩｇＧを２時間加え９
次いでｐ−ニトロフェニールβ−ｄ−ガラクトピラミド
（ＢＲＬ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍｄ、）を加える
ことによって決定する。陽性ウェルは鮮やかな黄色を示
す。陽性ハイブリドーマ（例えば、固定されたイムノゲ
ンと反応するが、陰性対照とは反応しない抗体を生成す
るハイブリドーマ）を制限希釈培養法によりクローン化
し、再クリーニングする。陽性クローンを下記のように
、第１トリメスター絨毛膜絨毛の、冷凍され、プラスチ
ックに包埋された断片を使用して、ざらにスクリーニン
グする。この選択の結果生じた／１イプリドーマはＪＩ
Ｄ８．ＮＩＣ６，Ｊ２Ｆ６．ＰＩＢ５，５８Ｇ４．ＪＩ
Ｂ５．１０Ｄ３．Ｄ９．１０１０ｇ、Ｃ９、Ｊ２Ｆ６．
　　およびＪ２Ｅ８である。

モノクローナル抗体の効果的な生成は、ブリスタンでプ
ライムされたＢａ１ｂ／Ｃマウスの腹腔内に。

選択されたハイブリドーマの約１０７細胞を注入するこ
とによって成し遂げられる。腹水液を取り出し、液体中
の細胞をペレットし１次いで連続して他のマウスに注入
するために使用する。

抗体を精製するために、腹水液または抗体生成細胞によ
り条件を調節された培養培地中に存在する抗体をタンパ
クＡ親和性クロマトグラフィーにより精製する。抗体が
異なったイソタイプで、タンパクＡに結合しない場合は
、それらを、固定された抗マウスイムノグロブリンを使
用して親和性クロマトグラフィーにより精製する。ある
いは。

マウスＩｇのすべてのイソタイプは、ヒドロキシアパタ
イトカラム（旧ｏＲａｄ）上でＨＰＬＣを使用して精製
され得る。

グ 上記の工程により選択されたハイブリドーマが栄養膜細
胞層細胞と特異的に反応する抗体を生成するかどうかを
決定するために、抗体を第１トリメスターヒト胎盤由来
の絨毛膜絨毛の断片を使用してスクリーニングする。抗
体位置を決定するための迅速な工程として、冷凍組織断
片を使用する。

真空吸引後素早く得た第１トリメスターヒト絨毛膜絨毛
から冷凍断片を調製する。組織をｃｐＢＳ中で、ｐＨ７
，２において３％のパラホルムアルデヒドで３０分間固
定する。サンプルを５％のスクロースを含有するＣＭＦ
　　ＰＢＳ中ですすぎ、未反応のアルデヒド基をクエン
チするために０．１％のグリシンを含有するＣＭＦ中で
洗浄する。

５、ｔｏ、　　および１５％のスクロースを含有するＣ
ＭＦ　　ＰＢＳ中ですすいだ後１組織をＯＣＴ　（Ｍｉ
ｌｅｓ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、　Ｎａｐｅｒｖｉｌｌ
ｅ、　　ＩＬ）に包埋し。

液体窒素において冷凍する。断片（５ミクロン）をｂ、
ｅｅＨＲ低温槽を使用して切断し、２２ｍｍ２のカバー
グラス上に集める。

これの代わりにまたはこれに加えて、抗体を。

グリコメチルアクリレート（ＧＭＡ、３８−４１）また
はＮｅｙｍａｎｎら（１９，８３）によるＬＲホワイト
に包埋された手薄断片（ｓｅｎｔ−ｔｈｉｎ　５ｅｃｔ
ｉｏｎ）を染色することによってスクリーニングする。

染色前に。

抗体による非特異的結合をブロックするためにカバーグ
ラスを０．２％のＢＳＡを含有するＰＢＳに１０分間さ
らす。

Ｇ　Ｍ　Ａ包埋方法は下記の通りである。組織を。

新たに調製された３％のバラホルムアルデヒドを含有す
る０、１Ｍリン酸緩衝液を用いて、ｐＨ７゜４で、２時
間固定する。以下のように２段階的にアセトン中で脱水
した後１反応させることにより組織をＪ　Ｂ−４（Ｐｏ
ｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｉｎｃ、により市販されるＧ
ＭＡ）に包埋する：　１）５０％のア七トンで２同各１
０分間；２）９５％のア七トンで２同各ｌＯ分間；３）
１００％のア七トンで２同各１０分間；４）５０％のア
七トン：５０％のＪＢ−４単量体（溶液Ａ）で１回１０
分間；５）ＪＢ−４単量体テｌ　Ｘ　１０分間；および
６）ＪＢ−４単量体で一昼夜。次いで１組織をＪ　Ｂ−
４溶液Ａ（２ｏｍｔ）ペンゾール過酸化物（０，０９ｇ
）およびＪＢ−４溶液Ｂ　（０、５ｍ　ｌ、　　Ｐｏ１
ｙｓｃｉｅｎｃｅｓ。

Ｉｎｃ、　）包埋を含有するモールドに移す。重合を。

４０Ｃで１２時間、真空下（１５−２０ｍｍＨｇ）で行
う。室温まで暖めた後、厚さ２ミクロンの断片を５ｏｒ
ｖａｌｏｌ　ＪＢ−４ミクロトームを使用してガラスナ
イフで切断する。断片を、水を介してカバーグラスに移
し、室温で空気乾燥する。染色する前に。

断片を有するカバーグラスをＰＢＳ中で洗浄し。

加湿室において室温で３０分間ＰＰＢＳ中３％正常ヤギ
血清（ＮＧＳ）にさらす。

モノクローナル抗体の免疫学的反応性をモニターする。

テストされる抗体の調製物をＰＢＳ中でＮＧＳを使用し
て希釈し１組織断片と共にで３０から６０分間インキコ
ベートする。スライドをＰＢＳ−ＮＧＳで洗浄し、モノ
クローナル抗体の種およびイムノグロブリンクラスに対
して特異性を有する蛍光性またはローダミン結合第２抗
体に３０分間さらす。スライドを蛍光性Ｚｅｉｓｓ顕微
鏡を使用して検査する。非免疫血清にさらすこと、第１
抗体が存在しないこと、および不適切な第２抗体を使用
することは、対照として役立つ。

第２抗体はペルオキシダーゼ結合し得る。そのような場
合、内因性のベルオキシダーゼ活性は。

断片をメタノール中の０，３％の過酸化水素に３０分間
さらし、ＰＢＳで洗浄することによってブロックされる
。断片を、ペルオキシダーゼ結合第２抗体（１：　２０
−１：　１００）で４’Ｃで２４時間インキュベートし
５次いでＰＢＳで洗浄する。反応はジアミノベンジジン
（５ミクロリットル３０％過酸化水素を含有するＩＱＯ
ｍｌＰＢＳ中の１２．５ｍｇのＤＡＢ）で１０分間行わ
れる。

末　　　　　との力差反応性の欠如についてのスクリー
ニング 最初に、抗栄養膜細胞層モノクローナル抗体を全血液か
ら分画された細胞上でスクリーニングする。全白色細胞
をＷｉｎｔ　ｒｏｂｅ管において分画遠心分ｉ４法によ
り末稍血液から単離する。白色細胞を含有する１滴の重
責褐色塗布物をスライド上に塗り付け、抗体にさらす前
に水冷却メタノールアセトン（３：ｌ　　ｖ／ｖ）を使
用して軽く固定する。

抗体を上記のようにさらす。

スライド上で白色細胞と反応しない抗体の調製物を、高
速細胞ンーターを使用して末梢血液成分と反応させるた
めにざらにスクリーニングする。

この場合、抗体を蛍光標識する。

上のスクリーニング 上記の工程を使用して、栄養膜細胞層細胞を第１トリメ
スタニヒト胎盤から単離する。細胞ペレットを液体窒素
冷却インペンタン中で冷凍し、上記のように切断して冷
凍断面（ｃｒｏｓｓ−ｓｅｃｔｉｏｎ）を形成する。冷
凍断面はモノクローナル抗体と反応し、免疫学的反応性
が上記のように決定される。

次いで、冷凍部と積極的に反応する抗体を、ＧＭ　Ａに
包埋された単離栄養膜細胞層との反応性についてスクリ
ーニングする。包埋および反応性モニターは、単離栄養
膜細胞層を有する細胞ペレ・ノドをヒト絨毛膜絨毛に置
き換えること以外は、上記のように行う。

このスクリーニングに使用される侵入性栄養膜細胞層細
胞を単離された細胞外マトリ・ノクス（ＥＣＭ）上で成
長させる。侵入性細胞の存在は、マトリックスを浄化（
ｃｌｅａｎｉｎｇ）することによって証明される。異な
る特性を有する３つの異なるマトリックスが使用され得
る。ＰＦ　　）（Ｒ９奇形癌マトリックスの構成は、天
然基底膜の構成と類似しており、主要な構成物はコラー
ゲンタイプＩＶ。

ラミニン（両方とも基底膜の特徴を示すと見なされる）
、エンタフチン、および硫酸へパリチンプロテオグリカ
ンを包含する。　［Ｋｒａｍｅｒら（１９８４）］。

しかし、天然基底膜と比較して９分子の架橋の程度は最
小である。ウシ角膜内皮（ＢＣＥ）細胞はバイブリドマ
トリックスを分泌する。このマトリックスは基底膜およ
び間質性のマトリ・ノクス成分の両方を有し、また架橋
される。［ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＧｏｓｐｏｄａｒｏ
ｗｉｃｚ　（１９８３）］　ｏ　　コラーゲンおよびエ
ラスチンの架橋は、結果として物理的に安定で非侵入性
の層を形成することになる。従って、ＨＲ９マトリック
ス分解に必要でない酵素は、　　ＢＣＥマトリックス侵
入に必要であり得る。

ＰＦ−ＨＲ９細胞系をＬａ　Ｊｏｌｌａ　Ｃａｎｃｅｒ
　Ｒｅ５ｅａｒａｈ　ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎにおいてＤ
ｒ、　Ｅｒｋｋｉ　Ｒｕｏｓｌａｈｔｉｃより得た。細
胞を通常のようにＤＭＥ（，４５％グルコース、ＤＭＥ
Ｍ−Ｈ）において培養し、１０％のＦ　Ｂ　Ｓ　（ＦＢ
Ｓ、　５ｔｅｒｉｌｅ　Ｓｙｓｔｅｍ、　Ｌｏｇａｎ、
　ＵＴ）および１０−５０ミクログラム／ｍｌのゲンタ
マイシンを補給した。すべての細胞をトリプシンのみま
たはトリプシンＥＤＴＡを使用して、規則正しい間隔を
置いて通過させる。

ＰＦ−ＨＲ９−ＥＣＭを、細胞をプラスチックカバーグ
ラスまたは１ウェル当り５ｘｌＯ’細胞でプラスチック
ウェルに接種することによって生成する。基底をウシプ
ラズマフィブロネクチン（ＰＢＳ中５０ミクログラム／
ｍｌ、２５’Ｃで３０分間）でプレコーティングし、　
　Ｋｒａｍｅｒら　（１９８２）およびＫｒａｍｅｒら
（１９８３）に記述されるように単離する。

培養培地を１日置きに、１０％ｐ’ｓｓ、ｓｏミクログ
ラム／　ｍ　ｌのアスコルビン酸および１０ミクログラ
ム／　ｍ　ｌのゲンタマイシンを含有するＤＭＥＭ−Ｈ
で置換する。

約１０日後、　　ＰＦ−ＨＲ９−ＥＣＭを、　　Ｋｒａ
ｍｅｒ（１９８４）によってすでに記述されている工程
の改変を利用して単離する。カバーガラスまたはウェル
を低張緩衝液（ｈｙｐｏｔｏｎｉｃ　ｂｕｆｆｅｒ）　
　（１０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣＩ、　０．５　ｌｌ１ｇ／
ｍｌ　ＢＳＡ、　０．１　ｍＭ　ＣａＣｌ２．　ｐＨ７
，５）を使用して３７６Ｃで２回洗浄し１次いで同様の
緩衝液により３７’Ｃで１０分間インキュベートすると
。

その間に細胞は膨張する。細胞溶解は、低張緩衝液で希
釈した０、５％のＮＰ−４０非イオン洗浄剤を使用した
簡単な抽出（３７’Ｃで２分間）により行う。カバーグ
ラスまたはプレートを蒸留水で４回洗浄し、０．１Ｍ水
酸化アンモニウムとともに室温で１５分間インキュベー
トし、１０％のＦＢＳを含有するＰＢＳで３回すすぎ９
次いで残存する洗浄剤を抽出するためにＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍ
　−Ｈプラス１０篤ＦＢＳ中で１時間インキニベートす
る。いずれの場合もＰＦ−ＨＲ９−ＥＣＭを単離直後に
使用する。

ＢＣＥ細胞の培養物は、　　Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃ
ｚら（１９８３）に従って、去勢ウシの目から確立され
る。保存種をゼラチンでコーティングした組織培養皿上
で維持し、１５％のＦＢＳ、２ｍＭのグルタミンおよび
５０マイクログラム／　ｍ　ｌゲンタマイシンを補給し
たダルベツコ変性イーグル培地（０，１％のグルコース
、　　Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　−Ｌ　’）中で成長させる。Ｇ
Ｏｓｐｏｄａｒｏｖｉｃｚら（１９８４）に従って単離
された繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）を、培養物が集密
化（ｃ。

ｎＮｕｅｎｃｅ）するまで、最終濃度が１　ｎ　ｇ　／
　ｍ　１になるように１日置きに加える。保存種をに６
４の分割比で１週間毎に通過させる。ＢＣＥ−ＥＣＭで
コーティングした表面を、３％のデクストラン（４０，
０００ＭＷ）を補給した上記培養物中に細胞を接種する
ことによって生成する。集密化してから１週間後、培養
物を２０ｍＭの水酸化アンモニウムに５分間さらすこと
によって、　　ＢＣＥ−ＥＣＭから細胞を除去する。こ
のＢＣＥ−ＥＣＭはＤ−ＰＢＳプラス抗体中で４０Ｃに
て貯蔵される前にダルベツコＰＢＳ　（Ｄ−ＰＢＳ）で
洗浄される。

上記の項で記述したように調製された単離栄養膜細胞層
細胞をＥＣＭ上でプレートする。マトリックスの分解は
、細胞が集密化した直後に開始するようである。はとん
ど架橋しないＰＦ−ＨＲ９−Ｅ　ＣＭの場合、可視穴は
通常４８から７２時間以内に形成されるが、ＢＣＥ−Ｅ
ＣＭにおける同様の浄化（ｃｌｅａｎｉｎｇ）には２倍
の時間がかかる。

Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングしたフィルターの侵入
は１８時間で起こる。侵入性栄養膜細胞届と免疫学的に
反応する抗栄養膜細胞層モノクローナル抗体についての
スクリーニングは、カバーグラス上またはＭａｔｒｉｇ
ｅｌでコーティングされたフィルターを通して侵入した
細胞を使用してモニターされる。

カバーグラスおよびフィルター上への材料の固定ならび
に固定材料の免疫学的反応は、上記の通り絨毛膜絨毛の
薄い断片のためである。

スクリーニングは９通常ＰＦ−ＨＲ９−ＥＣＭまたはＭ
ａｔｒｉｇｅｌに侵入する栄養膜細胞層上でまず行われ
る。さらにスクリーニングが所望されるなら、ＢＣＥ−
ＥＣＭに侵入する細胞をテストして。

侵入がさらに進んだ後も栄養膜細胞層特異性抗原が検出
され得るかどうかを確認する。所望の特異性を有するモ
ノクローナル抗体を産生ずると考えられるハイブリドー
マのクローンは、ＪＩＤ８（また。

ＢＤ６６とも呼ばれる）、　　１ＯＤ３．Ｄ９．　１０
Ｄ８．Ｃ９および旧Ｃ６である。

上記の方法を使用し、栄養膜細胞層と免疫学的に反応す
るモノクローナル抗体を、ＪＡＲ絨毛癌細胞をイムノゲ
ンとして使用することによって生成する。この方法にお
いて、ラットを免疫し、免疫された肺臓細胞を５Ｐ２１
０細胞と融合する。

生じたハイブリドーマを上記の方法でスクリーニングす
る。栄養膜細胞層とのみ免疫学的に反応する２つのクロ
ーンを単離する。これらのクローンの内の１つを８４　
Ｆ２と名付ける。

ＪＡＲヒト絨毛癌系をＰａｔｉｌｌｏおよびＧｅｙ（１
９６８）の方法を使用して生成し、１０％のＦｅ２，１
％のグルタミンおよび５０マイクログラム／ｍｌのゲン
タマイシンを含有するＤＭＥ　　Ｈ２Ｓ中で成長させる
。

上記のように単離された栄養膜細胞層細胞を。

これらの細胞が抗栄養膜細胞層モノクローナル抗体によ
って同定され得るかどうかを決定するために末梢血液の
サンプルに加える。栄養膜細胞層を男子胎児の堕胎児か
ら精製し、ｌ／１０から１／１０．０００の範囲の濃度
で末梢血液のサンプルに加える。モノクローナル抗体を
、免疫学的反応をさせる条件下で血液サンプルとインキ
ュベートする。次いで、サンプルを含む抗体を高速細胞
分離装置にかける。結果として生じた分離抗体−細胞度
合体をグラススライド上に置き、固定し、Ｙ特異的プロ
ーブを用いる蛍光性ハイブリダイゼーションを使用して
染色し、それらが胎児起源であることを確認する。

あるいは、　Ｍａｔｒｉｇｅｌ培養物システムが母体血
液中の胎児細胞を増殖させるために使用され得る。

マクロファージを除去した血液を、　　Ｍａｔｒｉｇｅ
ｌでコーティングしたフィルターおよびフィルターの反
対側に集められた侵入性栄養膜細胞層細胞上にプレート
する。また、　　Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングされ
たカバーグラスを母体血液から単離された栄養膜細胞を
成長させるために使用する。

以下に掲載する材料はＡｍｅｒｉｃａｎｎ　Ｔｙｐｅ　
Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｔｏｎ　（ＡＴＣＣ）、
　１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒ、、　Ｒｏｃｋ
ｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２とのブダ
ペスト条約の条約項の下で寄託されており、以下のよう
な受託番号が与えられている。

ＡＴＣＣＮｏ、　　　　寄ｌＬ匹 うブドハイフ゛リド−７、ＪＩＤ８（６６）　　　ｌＢ
１００９６　　１９８９年４月４日ラフト八イアハイド
−ｖ、　　ＰＩＢＳ（６７）　　　）ｌＢ１００９７　
　１９８９年４月４日米国特許としての本出願の許可お
よび発行に際して、これらの寄託物の入手制限はすべて
取り除かれる。そして、　　３７　ＣＦＲ１，１４およ
び３５　ＵＳｃ、，２２の下で権限を与えられる長官に
より決定された者には、上記各の出願係属中に指定の寄
託物の入手が認められるであろう。さらに、指定の寄託
物は寄託の日から３０年間、寄託の最終要求から５年間
。

または米国特許の実施できる期間のどちらか長い方の期
間維持される。本出願で記載される寄託材料は便宜上示
されるだけで本発明の記述を実施するために必要される
ものではなく、さらにこれらの材料は参照としてここに
組み込まれている。

本発明の様々な実施例は、様々な商業的有用性をもって
いる。本出願において記述されるスクリーニング工程に
従って単離されたハイブリドーマによって生成されたモ
ノクローナル抗体は、その特異性のために、母体血液に
おける循環栄養腫細胞層の検出および単離に有用である
。また、これは、比較的非侵入性であり、妊娠第１トリ
メスターまたは妊娠第２トリメスター初期に行われ得る
出生前の分析の方法を提供する。さらに、モノクローナ
ル抗体は、母体血液中の栄養腫細胞層の濃度が増加する
のに基づく、明白な兆候の発生前に子側前症を検出する
方法に有用である。本出願に記載のハイブリドーマをス
クリーニングする方法は、栄養膜細胞庖に対して特異的
で、また上記有用性を有するモノクローナル抗体を生成
するハイブリドーマを単離するのに有用である。

（本出願の引用文献） Ａｌｂｉｎｉら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　
４７巻：　３２３９−３２４５頁。

ＡｔｔｖｏｏａおよびＰａｒｋ（１９６０）、　Ｊ、　
０ｂｓｔｅｔ、　Ｇｙｎｅｃ。

Ｂｒ１ｔ、　　Ｃｏ＋ｍａ＋、　　６８巻：　６１１頁
。

Ｂｅｅｒら（１９７２）、　　Ｊ、　　Ｅｘｐ、　　Ｍ
ｅｄ、　　１３５巻：　１１７？頁。

ＢｒｕｎｅｔｔｅおよびＴｉ１ｌ（１９７１）、　　　
Ｊ、Ｍｅｍｂ、Ｂｉｏｌ。

１５巻＝２１５頁。

ＢｕｔｔｅｒｖｏｒｔｈおよびＬｏｋｅ（１９８５）、
　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｓｃｉ。

７６巻：１８９頁。

Ｃｏｖｏｎｅら（１’９８４）、　　Ｌａｎｃｅｔ、　
　１０月１３日、　　８４１−８４２頁。

Ｄｏｕｇｌａｓら（１９５９）、　　Ａ１１．　　Ｊ、
　　０ｂｓｔｅｔ、　　Ｇｙｎｅｃ、　　７８巻：９６
０頁。

Ｅｎｄｅｒｓ（１９６８）、　　Ａｍ、　　Ｊ、　　Ａ
ｎａｔ、　　１２２巻：４１９頁。

ＥｒｋｅｌｌおよびＳｃｈｉｒｒｍａｃｈｅｒ（１９８
８）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ。

４８巻：　　６９３３−６９３７頁。

Ｆｉｓｈｅｒら（１９８５）、　　Ｊ、　　Ｃｅ１１．
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　２７巻：３１頁０ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｓ、Ｊ、、　　Ｃｕｔ、　　Ｔ、−Ｙ、
、　　Ｚｈａｎｇ、　　Ｌ、、　　Ｈａｒｔ＋ｍａｎ、
　　Ｌ、　、　　Ｇｒａｈｌ、　　に、、　　Ｇｕｏ−
Ｙａｎｇ、　　Ｚ、、　　Ｔａｒｐｅｙ、　　Ｊ、　　
ａｎｄ　Ｄａｍｉｋｙ、　Ｃ，（出版中）　Ａｄｈｅｓ
ｉｖｅ　ａｎｄ　Ｄｅｇｒａｄａｔｉｖｅ　Ｐｒｏｐｅ
ｒｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｈｕ＋ｍａｎ　Ｐｌａｃｅｎｔａｌ
　Ｃｙｔｏｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ　Ｃａ１ｌｓ　Ｉｎ
　Ｖｉｔｒｏ、　　Ｊ、　　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ
。

Ｆｉｓｈｅｒ、　　Ｓ、Ｊ、、　　５ｕｔｈｅｒｌａｎ
ｄ、　　Ａ、、　　Ｍｏ５ｓ、　　Ｌ、、　　Ｈａｒｔ
ｎ＋ａｎ、　　Ｌ、、　　Ｃｒｏｖｌｅｙ、　　Ｅ、、
　　Ｂｅｒｎｆｉｅｌｄ、　　Ｍ、、　　Ｃａ１ａｒｃ
ｏ、　Ｐ、　ａｎｄ　Ｄａｍｓｋｙ、　Ｃ，（出版中）
　Ａｄｈｅｓｉｖｅ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ
　Ｍｕｒｉｎｅ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｒｏｐｈｏｂ
ｌａｓｔ　Ｃｅｌｌ５．　　Ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。

Ｇ１１ｂｅｒｔおよびＭｉｇｅｏｎ（１９７５）、　Ｃ
ｅ１ｌ　５巻＝１１頁Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｖｃｚら（１
９ｇ３）、　　Ｊ、　　Ｃｅ１１．　　ＰｈＦｓｉｏｌ
、　　１１４巻：　１９１頁。

Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｖｉｃｚら（１９１１４）、　　Ｐ
ｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　
　８１巻：６９６３頁。

Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇら（１９７９）、　　Ｐｒｏｃ、
　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ。

７６巻：１４５３頁。

Ｋａｖａｔａら（１９８４）、　　Ｊ、　　Ｅｘｐ、　
　Ｍｅｄ、　　１６０巻＝６３３頁。

Ｋｈｏｎｇら（１９８６）、　　Ｃｅ１ｌ　Ｔｉ５ｓｕ
ｅ　Ｒｅｓ、　　２４６巻：１８９頁。

Ｋｅｎｎｅｔｔら（１９８０）　ｉｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏ
ｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ。

３６５−３６７頁（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　　Ｎ
、Ｙ、）。

Ｋｌｉ＋＊ａｎら（１９８６）、　　Ｅｎｄｏｃｒｉｎ
ｏｌｏｇｙ　１１８巻：１５６７頁。

Ｋｎｕｄｓａｎ　（１９８５）、　　Ａｎａｌ、　　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、　　１４７巻：２８５頁。

Ｋｒａｍｅｒら（１９８２）、　　Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、
　　Ｃｈｅｔ　　２５７巻：２０７８頁。

Ｋｒａｍｅｒら（１９８３）、　　Ｉｎｔ、　　Ｊ、　
　Ｃａｎｃｅｒ　２６巻：６３９頁。

Ｋｒａｍｅｒら（１９８４）、　　Ｊ、　　Ｎａｔｌ、
　　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、　　７２巻二８８９頁。

Ｍｃ＋ｎｔｙｒｅおよびＦａｕｌｋ（１９７９）、　Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　７
６巻：４０２９頁。

Ｎｅｖｍａｎら（１９８３）、　）ｌｉｓｔｏｃｈｅｍ
、　　Ｊ、　　１５巻：５４３頁。

ＰａｒｋｓおよびＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇ（１９８２＞　
ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎＣｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ
、　ｖｏｌ、　１０．　２７７−２９５頁（Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ、　　Ｎ、Ｙ、）。

ＰａｔｉｌｌｏおよびＧｅｙ（１９６８）、　Ｃａｎｃ
ｅｒ　Ｒｅｓ、　２８巻：１２３１頁。

Ｐｉｊｎｅｎｂｏｒｇら（１９８１）、　　Ｐｌａｃｅ
ｎｔａ　２巻ニア１頁。

Ｓ　１ｅｂｅｒｓら（１９７５）、　　）Ｉｕｍａｎｇ
ｅｎｅｔｉｋ　２ａ巻＝２７３頁。

Ｚｉｌｌａｃｕｓら（１９７５）、　　５ｃａｎ、　　
Ｊ、　　Ｈａｅｍａｔｏｌ、　　１５巻：３３３頁。

（発明の要約） 妊娠初期における出生前の分析を行う比較的非侵入性の
工程は、抗栄養膜細胞層モノクローナル抗体を使用する
。この工程では、これらの細胞を母体血液サンプルから
検出し、単離する。スクリーニング工程は、栄養膜細胞
層と反応するが、池の末梢血液成分とは反応しないとい
う特異性を有するモノクローナル抗体を産生ずるバイブ
リド−て合胞体となる幹細胞を示す。パネルｂは子宮お
よび母体管に侵入し、最終的に内皮内層に取って代わる
栄養膜細胞層細胞の副次集団を示す。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、第１トリメスター栄養膜細胞層細胞に対して特異的
   なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを調製
   する方法であって、該方法は、以下の工程を包含する： ａ、第１トリメスター栄養膜細胞層細胞の精製調製物を
   提供する工程； ｂ、個体を工程ａの調製物で免疫する工程；ｃ、工程ｂ
   において免疫された個体の抗体産生細胞を永久増殖化す
   る工程；および ｄ、精製された栄養膜細胞層細胞と反応し、末梢血液中
   の他の細胞とは反応しない抗体を産生する抗体産生永久
   増殖化細胞のクローンを単離する工程。 ２、イソヒドロにおいて細胞外マトリックスに活発に侵
   入する第１トリメスターヒト栄養膜細胞層細胞と反応す
   る抗体産生永久増殖化細胞のクローンを単離する工程を
   さらに包含する、請求項１に記載の方法。 ３、前記第１トリメスター栄養膜細胞層細胞に対して特
   異的なモノクローナル抗体を分泌する、ハイブリドーマ
   またはその子孫。 ４、分泌された抗体が侵入性ヒト栄養膜細胞層細胞と反
   応する、請求項３に記載のハイブリドーマ。 ５、前記第１トリメスター栄養膜細胞層細胞に対して特
   異的なモノクローナル抗体。 ６、前記侵入性ヒト栄養膜細胞層細胞と反応する、請求
   項５に記載のモノクローナル抗体。 ７、胎児栄養膜細胞層細胞を母体血液から単離する方法
   であって、該方法は、以下の工程を包含する： ａ、母体血液のサンプルを提供する工程； ｂ、免疫学的に特異に反応させる条件下で、母体血液サ
   ンプルを第１トリメスター栄養膜細胞層細胞に対して特
   異的なモノクローナル抗体と相接触させる工程；および ｃ、抗体−栄養膜細胞層複合体を母体血液成分の残物か
   ら単離する工程。 ８、前記母体血液のサンプルを、栄養膜細胞層上のエピ
   トープおよび他の細胞と結合するが血液細胞とは結合し
   ないモノクローナル抗体と接触させて、栄養膜細胞層に
   対して該サンプルを強化し、そして抗体−細胞複合体を
   単離する工程をさらに包含し、該強化工程が請求項７に
   記載の工程ｂに先行する、請求項７に記載の方法。 ９、前記モノクローナル抗体が抗サイトケラチンである
   、請求項８に記載の方法。 １０、前記母体血液のサンプルを、栄養膜細胞層でない
   末梢血液中の細胞と結合する抗体と接触させ、栄養膜細
   胞層に対する該母体血液サンプルを強化し、そして抗体
   −細胞複合体を取り除く工程を包含し、該強化工程が請
   求項７に記載の工程ｂに先行する請求項７に記載の方法
   。 １１、前記抗体が単核細胞に結合する、請求項１０に記
   載の方法。 １２、前記接触工程が侵入性栄養膜細胞層細胞に反応性
   があるモノクローナル抗体を用いる、請求項７に記載の
   方法。 １３、細胞ソーターにおいて前記複合体の単離工程が行
   われる、請求項７に記載の方法。 １４、前記抗体が固体相に結合する、請求項７に記載の
   方法。 １５、前記抗体が磁気ビーズに結合し、前記単離工程が
   磁気分離装置によって実施される、請求項７に記載の方
   法。 １６、前記抗体が固体相に結合する、請求項１に記載の
   方法。 １７、前記抗体が磁気ビーズに結合し、前記単工程が磁
   気分離装置によって実施される、請求項１６に記載の方
   法。 １８、母体血液中の胎児栄養膜細胞層の検出方であって
   、該方法は、以下の工程を包含する：ａ、母体血液のサ
   ンプルを提供する工程； ｂ、免疫学的に特異に反応させる条件下で、該母体血液
   サンプルを、第１トリメスター栄養膜細胞層細胞に対し
   て特異的なモノクローナル抗体と接触させる工程；およ
   び ｃ、抗体−細胞複合体の形成を検出する工程。 １９、前記検出工程が画像解析が可能な装置によって行
   われる、請求項１８に記載の方法。 ２０、前記検出工程が抗体−細胞複合体を含有している
   であろうと予想される懸濁液の流れをモニターする装置
   によって行われる、請求項１９に記載の方法。 ２１、前記ハイブリドーマがＡＴＣＣ−Ｎｏ．１００９
   ６である、ハイブリドーマ、その子孫およびそれらの等
   価物。 ２２、前記ハイブリドーマがＡＴＣＣ−Ｎｏ．１００９
   ７である、ハイブリドーマ、およびその子孫およびそれ
   らの等価物。