JPH03163347A - 酵素固定化膜 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は化学・食品工業，医療計測，環境計測などの分
野で利用されるバイオセンサ，特に酵素固定化膜を有す
る酵素センサに関する。

［従来技術及び課題］ 近年，酵素センサが注目されており．例えば水溶性の酵
素を多孔質無槻担体や高分子担体に固定化してなる酵素
固定化膜を用い，その酵素反応によって生ずる化学物質
等の変化をトランスデューサによって電気信号に変換し
て特定基質濃度を計測するようにした酵素センサが開発
されている。

しかし，酵素固定化膜では，試料液中の特定基質に対す
る酵素反応が起こる一方，トランスデューサへの反応関
連物質の拡散もなされる。そのため．低濃度の試料液に
対しても正確な測定を行なうために酵素固定化膜を厚く
して酵素の固定化はを増やすと，拡散に支障をきたし，
応答性の遅れを生ずる。特に．使用酵素が低活性である
場合に，酵素固定化量を増やす必要性が高く，こうした
問題を生じ易い。

それ故，センサ応答性を向上させるためにはできる限り
酵素固定化膜を薄くして反応関連物質の拡散を容易にす
る必要がある。

しかし，酵素固定化膜を薄くすると，酵素固定化量が減
り，出力信号が小さくなるため，感度が低下し，センサ
小型化に支障をきたす。又，酵素固定化膜の強度低下に
もつながる。特に，ガラスや磁器などの脆い担体を用い
たものの場合，非常に破損し易く，センサ製造上（膜自
体の製作，センサ素子の組立て等）．更にはセンサ使川
上障害となる。

［課題の解決手段］ そこで，本発明はかかる課題を下記手段によって解決し
た。

酵素固定化膜の片面が少なくともその作動部位において
繰返し凹凸構造となっていることをＩｒ：１徴とするバ
イオセンサ。

上記構成によれば，酵素固定化膜の凹凸構造によって凸
部（厚膜部）３ａと凹部（薄膜部）３ｂとが存在するこ
とになる（第１図）。そして．凸部３ａで全体的な機械
強度を確保する一方，凹部３ｂで試料液の拡散を容易な
らしめ．しかも全体として高感度を維持できる。

酔素固定化膜を構或する多孔質担体としては，通常使用
されるものでよく，無機質担体としては，アルミナ，マ
グネシア，チタニア，ジルコニア等の酸化物セラミック
ス；リン酸塩（水酸アパタイト等）等の複酸化物セラミ
ックス；及びシリカガラスなど，又高分子担体としては
例えばポリエチレン，ポリスチレン，ポリウレタンなど
が挙げられる。気孔率は２５％以上，平均気孔径０．３
１Ｕにするとよい。多孔質担体は，通常の方法によって
所定の酵素を固定して酵素固定化膜とされる。

多孔質担体（従って酵素が固定化された酵素固定化膜）
の少なくとも片面が繰返し凹凸構造となっている。トラ
ンスデューサ等に取付けられる面は通常のように平面と
し，反応関連物質の拡散距離が極力増大しないように，
又トランスデューサ等との結合に支障をきたさないよう
にすることが好ましい。酵素固定化膜の少なくとも作動
部位において繰返し凹凸構遣となっていればよい。

「作動部位」とは酵素固定化膜がその使用時において有
効に酵素反応に寄与し得る部分を指し，残りの部位例え
ば基板への接合部位などは必ずしも該構造であることを
要しない。凹凸構造は繰返して存在すればよく，凹部（
薄膜部）と凸部（厚膜部）との存在比率を例えば３７７
〜７／３程度の範囲から選択するとよい。但し，酵素固
定化膜の強度を保つため凸部が少なくとも連続して存在
し．各凹部を取り囲むようにすることが望ましい（第２
．５〜８図参照）。ここで，「四部」とは標準厚より薄
い部分（薄膜部〉，「凸部」とは標準厚より厚い部分（
厚膜部〉を意味するものとする。又．「標準厚」とは酵
素固定化膜ないしはその多孔質担体について一般的に用
いられている厚みをいう。その標準厚は．酵素固定化膜
用多孔質担体の場合，通常Ｏ．ＯＳ〜０．５ｍｍ，特に
０．１〜０　．　７　ａｍの範囲とされる。尚，酵素が
固定化された後の状態である酵素固定化膜についても，
若干厚くなる（１０μ１以下）が略同一範囲内の厚みと
なっている。

凹部の最小厚は標準厚に対して好ましくは０．５倍以下
，より好ましくは０．３倍以下にするとよい。一方．凸
部の最大厚は漂準厚に対して好ましくは３倍以上，より
好ましくは４倍以上にするとよい。例えば，凹部の最小
厚は０．Ｏｌ〜０．１５ｍｍ，　−方凸部の最大厚は０
．２〜２　ｍ＋ａにする。隣接する凸部同士の間隔（一
の凸部の中心点から隣接する他の凸部の中心点までの距
ｉｌｌｆ）は，平均して好ましくは０．４〜１．３ｍ＋
ｓ，　　より好ましくは０．５〜ｌ　ｍｒ＠にするとよ
い。又，一の凸部の幅ないし径は好まし＜　ハ（１．３
〜０．８ｍｍ，より好ましくは０．５〜０．７ｍｍにす
るとよい。

トランスデューサとしては，酵素固定化膜における酵素
反応の物質変化を電気信号に変換する電極（いわゆる電
極型酵素センサ）が好ましく，反応関連物質濃度との相
関がとり易い。酵素固定化膜と電極とは密着しているこ
とが好ましい。但し０．１ｍｍ程度の隙ＩＵｆがあって
も差支えない。

酵素固定化膜の一側ないしは両側には，　ｆｉＩＩ定誤
差をもたらす有害物質（例えば血液中のグルコース測定
におけるアルコルビン酸や尿酸）が電極などに付着する
のを防止するために，選択透過膜を存在させることが好
ましい。その選択透過膜は酢酸セルロース，アルミナゲ
ル，シリカゲル等からなり，厚さ　０．１〜３μ覆，気
孔率４０〜８０％程度にするとよい。

［実施例］ 以下，グルコール（糖〉センサを例にとって説明する。

（１〉固定化用多孔質担体の成形 ・アルミナ　　　　　　　１００　ｇ （粒径０．５μ１，純度９９．９％市販品）・メチルセ
ルロース　　　　ｌｏｇ　（市販品）・ポリエチレング
リコール　５ｇ（市販品）・水　　　　　　　　　８３
ｇ 以ＪＺを１０’ｍｓのアルミナ球石３（ｌ［ｌ　ｇと共
に容積５　０　０　ｍｌのポリエチレン容俄に入れ，　
　１２０ｒｐｍで２４時間，溶解混合する。こうして得
られたスラリーを真空脱泡した後，あらかじめ用意した
門凸模様のあるポリエチレンシ一ト（市販品）上に薄く
拡げる。その後，　１５時間自然乾燥し，次いでポリエ
チレンシ一トをはがし，片面に凹凸模様の付いたアルミ
ナ生シートを得た。これをサイズ５．４×５．４關にナ
イフで切り出し，　１２５０℃で０．５時間焼威し，酵
素固定化用多孔質担体を得た（５Ｘ５Ｘ０．５ｔ　ｍｍ
）　　。

次に，この多孔質担体の平面側に，あらかじめ：Ａ製し
ておいたアルミナゾルを薄く塗布し８００℃で１時間焼
付け選択透過膜を形成した。

これら多孔質担体及び選択透過膜の特性を第１表及び第
２図に示す。

第　　１　　表 １）担体の厚み二０．５關は最大厚， 最小厚 ０．１關は （２）酵素の固定化 この多孔質担体（選択透過膜を形威したもの）に，次の
手順で固定化処理を施す。

（イ）　・γ−アミノプロビル トリエトキシシラン　１０ｍｆｆ トルエン　　　　　　　　９０ｍｌ 上記溶液中へ１５時間浸す。

◎　・トルエン　１　０　０　ｍｅ中で１０分洗浄・エ
タノール１　０　０　ｍｌ中で１０分洗浄・純水１　０
　０　ｍｌｌ中で３０分洗浄（ハ）　これを１時間自然
乾燥した後，・グルタルアルデヒド　　２．５一 ・リン酸塩緩衝液　　　　９７．５ｍＮ上記溶液中へ２
時間浸す。

（ニ）　・酵素（グルコースオキシダーゼ）　　　０．
５ｇ・リン酸塩緩衝液　　　　　　　　　９９．５ｇ上
記溶液中へ１時間浸す。

（ホ）　リン酸塩緩衝液１　０　０　ｍ（！中に２時間
浸して洗浄し，酵素固定化処理を完了させる。

（３）センサ素子の組立て 第３図に示すように，あらかじめ白金電極２を蒸着した
アルミナ基板（　ＩＯＸ　ＩＯＸ　　Ｏ．８ｔｍｍ）　
　１を用意し．その白金電極２の上へ前記酵素固定化膜
３を，凹凸面を外側にしてかぶせる。その周囲をエポキ
シ接着剤でシールする。

（４），ｉＪＩＩＪ定 リン酸塩緩衝液に．所定量のグルコースを溶解し，種々
の濃度の試験液を調製する。測定は，電極２の端子にエ
レクトロメータを接続し０．６Ｖの電圧を印加した状態
で０．０３ｍｆｆの試験液を滴下し，電流値を測定した
。又，　ＪＩＳ　Ｒ１６０１に準じて（三点曲げ，　Ｌ
　：　２０ｍｍ，　ｗ　：　１０ｍｍ）曲げ強さを測定
した。

比較のため，酵素固定化膜の厚みについて，細心の注意
を払って作製した厚さ　０．１ｍｍのもの（比較例１）
と，　０。５關のもの（比較例２）を同様な測定に供し
た。

それらの試験結果を第２表及び第４図に示す。

（以下余白） 第 ２ 表 ｌ）酵素固定化膜の厚み（担体の厚み）２）試験液のグ
ルコース濃度 ３）試験液を滴下してから，エレクトロメータで計測さ
れる電流値が定常状態になるまでの時間 第２表及び第４図から明らかなように，凸部（最大厚０
．５ｍｍ）と凹部（最小厚０．Ｉ＋＋ｕｓ）とヲ併存さ
せることにより，応答性及び感度について優れたセンサ
素子となることが判明した。

即ち，実施例のグルコースセンサは．比較例１（膜厚０
．ｌｍｍ）のものに比して，応答時間を略同レベルに維
持しつつ，計７ｆＪＪ電流値を大幅に高め，従って低濃
度試料に対しても高感度測定が可能である。しかも，セ
ンサ素子製作にあたり，この比較例１のように細心の注
意を払う必要が無い。他方，比較例２（膜厚０，５ｍｍ
）のものに比して，応答時間を大幅に短縮しながら．計
測電流値を略同レベルに維持できた。しかも試料液のグ
ルコース濃度３００■／ｄｆｆ以上では，比較例２のも
のに比しても計測電流値が高くなる。加えて．グルコー
ス濃度と計測電流との関係について，汰範νＨの濃度に
おいて優れた直線性を示し，何ら捕正をすることなく正
確なグルコース濃度の測定が可能である。又，本実施例
のように酵素固定化膜（本体）と計測用電極との間に選
択透過膜を介（〔させた場合であっても，充分な応答性
を維持できることも併せて確認できた。

本実施例のセンサ素子は，試料液中に挿入して測定を行
なうバッチシステム．又通液型のセル中に装着して試料
液を注入することにより測定を行なうフローシステム．
更には試料液滴−ドシステムのいずれにも適用可能であ
る。

本発明は上記実施例に限定されるものではない。例えば
酸素固定化用多孔質担体の断面形状については，凹凸断
面となっている限り，挿々のもの（第５図〜第８図）を
採用できる。尚，第７．８図のように凹部が貫通孔とな
ったものであっても差支えない。

更に，多孔質担体への酵素の固定化法として，共有結合
法，架橋化法，包括法等種々のものを使用できることも
勿論である。又，グルコールセンサに限らず，他の糖セ
ンサ，更にはアルコールセンサ（エタノール等の測定）
，脂質センサ（コレステロール等の測定）にも本発明の
バイオセンサは適用される。又，酵素固定化膜における
酵素反応によって生じる変化に応じて，電極以外のトラ
ンスデューサ．例えば熱計測デバイスとしてのサーミス
タ等を使用するバイオセンサにも本発明を適用できるこ
とは自明であろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の作用を説明するための一例図， 第２図は本発明に係るバイオセンサ索子の多孔質担体（
酵素固定化膜）の一実施例を示す図であって，第２図（
イ）は斜視図，第２図０は断面における各寸法を示した
断面図， 第３図は上記実施例のセンサ索子を示す図であって，第
３図（イ）は酵素固定化膜（及び選択透過膜）の取付前
の状態を示した平面図，第３図０は酵素固定化膜の取付
後の状態を示した平面図，及び第３図（ハ）は同じく断
面図， 第４図は実施例及び比較例のセンサ素子を用いた比較試
験の結果を示すグラフであって，グルコース濃度と計測
電流との関係を示したもの．第５〜８図は本発明に係る
多孔質担体（酵索固走化膜）の他の実施例を示す図であ
って，第５図（イ）及び第６図（イ）は斜視図をもって
示したもの（第５図０及び第６図０はその対応断面図）
，他は断面図をもって示したもの， を夫々表わす。 Ａ・・・バイオセンサ素子 ３・・・酵素固定化膜　　３ａ・・・凸部３ｂ・・・凹
部

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）酵素固定化膜の片面が少なくともその作動部位に
   おいて繰返し凹凸構造となっていることを特徴とするバ
   イオセンサ。
2. （２）繰返し凹凸構造について、凹部の最小厚が標準厚
   に対して０．５倍以下、凸部の最大厚が標準厚に対して
   ２倍以上である請求項１記載のバイオセンサ。
3. （３）隣接する凸部同士の間隔が０．３〜３ｍｍである
   請求項１、２の一記載のバイオセンサ。