JPH03164143A - キサンタンガムのアセチル化及びピルビル化の遺伝子調節 - Google Patents
キサンタンガムのアセチル化及びピルビル化の遺伝子調節Info
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- JPH03164143A JPH03164143A JP2195073A JP19507390A JPH03164143A JP H03164143 A JPH03164143 A JP H03164143A JP 2195073 A JP2195073 A JP 2195073A JP 19507390 A JP19507390 A JP 19507390A JP H03164143 A JPH03164143 A JP H03164143A
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- acetylated
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- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
- C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
- C08B37/0033—Xanthan, i.e. D-glucose, D-mannose and D-glucuronic acid units, saubstituted with acetate and pyruvate, with a main chain of (beta-1,4)-D-glucose units; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
- C12P19/06—Xanthan, i.e. Xanthomonas-type heteropolysaccharides
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は多塘ポリマーに関する。特に、本発明は、キサ
ンタンガムと構造的に等しく、キサンタン生合成経路の
成分により形成されるポリマーと規定されるキサンタン
ベース多糖ポリマーに関し、外部マンノースが特にアセ
チル化されているがピルビル化されていない、ピルビル
化されているがアセチル化されていないよう改良されて
いるか、又は改良されていないが内部マンノースが独立
にアセチル化されているかもしくは改良されていないキ
サンタンベースポリマーを含む。
ンタンガムと構造的に等しく、キサンタン生合成経路の
成分により形成されるポリマーと規定されるキサンタン
ベース多糖ポリマーに関し、外部マンノースが特にアセ
チル化されているがピルビル化されていない、ピルビル
化されているがアセチル化されていないよう改良されて
いるか、又は改良されていないが内部マンノースが独立
にアセチル化されているかもしくは改良されていないキ
サンタンベースポリマーを含む。
キサンタンガムはキサントモナス（Ｘａｎ ｔｈｏｍｏ
ｎａｓ）属の細菌、特にＸ．カンペストリス（Ｘ．ｃａ
ｎ＋ ｅｓｔｒｉｓ）種の微生物により製造される。キ
サンタンガムは、その特有の物理特性、すなわち高比粘
度及び疑凝塑性のため広く用いられている製品である。
ｎａｓ）属の細菌、特にＸ．カンペストリス（Ｘ．ｃａ
ｎ＋ ｅｓｔｒｉｓ）種の微生物により製造される。キ
サンタンガムは、その特有の物理特性、すなわち高比粘
度及び疑凝塑性のため広く用いられている製品である。
それは通常増粘剤として食品に並びに流動性調節及び特
性改良剤として二次もしくは三次油回収に、さらに石油
掘削液に用いられる。
性改良剤として二次もしくは三次油回収に、さらに石油
掘削液に用いられる。
化学的に、キサンタンガムはアニオンヘテロ多糖である
。ポリマーの繰り返し単位は５個の糖成分、特に２個の
グルコース、１個のグルクロン酸及び２個のマンノース
成分からなる五量体である。
。ポリマーの繰り返し単位は５個の糖成分、特に２個の
グルコース、１個のグルクロン酸及び２個のマンノース
成分からなる五量体である。
これらの糖残基はグルコース成分がポリマー鎖の主ｔｍ
ヲ形成し、マンノースーグルクロン酸−マンノース残基
の側鎖がグルコース威分より交互に伸びているよう配列
される。通常、この基本構造は、例えばＪａｎｓｏｎ．
Ｐ．Ｅ． ＋ Ｋｅｎｎｅ， Ｌ．、及びＬｉｎｄｂ
ｅｒｇ，Ｂ．らのＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ，４５：２７５〜２Ｂ２（１９７５）並びにＭ
ｅｌｔｏｎ，Ｌ．Ｄ．，旧ｎｏｔ， Ｌ．， ｝ｌｅｅ
ｓ， Ｄ．Ａ．、及びＳａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ｒ．ら
のＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＋４６
：２４５〜２５７ （１９７６）に記載されているよう
にアセチル化及びピルビル化される。アセチル化及びピ
ルビル化の程度は様々であることが公知である。キサン
タンガムの構造を下式Ｉに示す。
ヲ形成し、マンノースーグルクロン酸−マンノース残基
の側鎖がグルコース威分より交互に伸びているよう配列
される。通常、この基本構造は、例えばＪａｎｓｏｎ．
Ｐ．Ｅ． ＋ Ｋｅｎｎｅ， Ｌ．、及びＬｉｎｄｂ
ｅｒｇ，Ｂ．らのＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ，４５：２７５〜２Ｂ２（１９７５）並びにＭ
ｅｌｔｏｎ，Ｌ．Ｄ．，旧ｎｏｔ， Ｌ．， ｝ｌｅｅ
ｓ， Ｄ．Ａ．、及びＳａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ｒ．ら
のＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＋４６
：２４５〜２５７ （１９７６）に記載されているよう
にアセチル化及びピルビル化される。アセチル化及びピ
ルビル化の程度は様々であることが公知である。キサン
タンガムの構造を下式Ｉに示す。
自然発生キサンタンガムの広範な有効性にもかかわらず
、その物理特性が制限される状況がある．特に、二次も
しくは三次油回収において、油溜中の温度及び溜中の塩
濃度がキサンタン溶液の最適より高い場合一般的ではな
い．この状況が生じた場合、キサンタンは沈殿し、′＆
ｋ集し及び／又はその粘度を失う。従って、油回収の間
遭遇する種々の条件、例えば高温及び高塩濃度において
うまく作用する新規増帖物質が望ましい。
、その物理特性が制限される状況がある．特に、二次も
しくは三次油回収において、油溜中の温度及び溜中の塩
濃度がキサンタン溶液の最適より高い場合一般的ではな
い．この状況が生じた場合、キサンタンは沈殿し、′＆
ｋ集し及び／又はその粘度を失う。従って、油回収の間
遭遇する種々の条件、例えば高温及び高塩濃度において
うまく作用する新規増帖物質が望ましい。
本発明は、自然発生キサンタンガムとくらべ改良された
特性を有するキサンタンベース多糖ポリマー族を開示す
る。キサンタンガムの改良はすでに記載された。例えば
、Ｂｒａｄｓｈａｗらは（Ｃａｒｂｏｈｙｄ−ｒａｔｅ
Ｐｏ１ｙｍｅｒｓ．３：２３〜３８（１９８３〕）
、脱アセチル化又は脱ピルビル化した化学的に改良した
キサンタンガムの製造方法を記載している。χａｎ ｔ
ｈｏｍｏｎａｓ■肚竺江ｎにより製造されたキサンタン
ガムを化学的に脱アセチル化する方法も米国特許第３，
０００，７９０号及び３，０５４．６８９号に記載され
ている。
特性を有するキサンタンベース多糖ポリマー族を開示す
る。キサンタンガムの改良はすでに記載された。例えば
、Ｂｒａｄｓｈａｗらは（Ｃａｒｂｏｈｙｄ−ｒａｔｅ
Ｐｏ１ｙｍｅｒｓ．３：２３〜３８（１９８３〕）
、脱アセチル化又は脱ピルビル化した化学的に改良した
キサンタンガムの製造方法を記載している。χａｎ ｔ
ｈｏｍｏｎａｓ■肚竺江ｎにより製造されたキサンタン
ガムを化学的に脱アセチル化する方法も米国特許第３，
０００，７９０号及び３，０５４．６８９号に記載され
ている。
現在まで、この脱アセチル化法に用いられている主な方
法はアセチル化されたキサンタンガムからのアセテート
成分の化学的除去であった。キサンタンガムの化学的脱
アセチル化法により多くの望ましくない副作用がおこり
、グリコシド主鎖の加水分解をおこし、分子の配座に不
可逆的変化をおこし、分子量を低下させる。
法はアセチル化されたキサンタンガムからのアセテート
成分の化学的除去であった。キサンタンガムの化学的脱
アセチル化法により多くの望ましくない副作用がおこり
、グリコシド主鎖の加水分解をおこし、分子の配座に不
可逆的変化をおこし、分子量を低下させる。
キサンタンガムは、Ｈｏｌｚｗａｒｔｈ及びＯｇｌｅｔ
ｒｅｅらのＣａｒｂｏ．Ｒｅｓ．． ７６：２７７〜２
８０（１９７９）に記載のようにして化学的に脱ピルビ
ル化される．この化学的脱ピルビル化法もキサンタンポ
リマーユニットを変え及び／又はグリコシド主鎖を加水
分解する。
ｒｅｅらのＣａｒｂｏ．Ｒｅｓ．． ７６：２７７〜２
８０（１９７９）に記載のようにして化学的に脱ピルビ
ル化される．この化学的脱ピルビル化法もキサンタンポ
リマーユニットを変え及び／又はグリコシド主鎖を加水
分解する。
ｋ■肚聾紅ｎの株は米国特許第４．２９６．２０３号に
記載されており、非ピルビル化キサンタンガムを製造す
るが、この非ピルビル化ガムは化学的手段を用いて完全
にアセチル化又は脱アセチル化された。
記載されており、非ピルビル化キサンタンガムを製造す
るが、この非ピルビル化ガムは化学的手段を用いて完全
にアセチル化又は脱アセチル化された。
本発明の目的は、内部マンノースがアセチル化されてい
るかもしくは未改良であり、一方外部マンノースがアセ
チル化もしくはピルビル化されているか又は未改良であ
る多糖キサンタンポリマーの族を提供することである． また、この生底物を試験管内で得る方法及び生体内で多
塘ポリマーの族を形成する能力を有する微生物を与える
ことも本発明の目的である．本発明の他の目的は、種々
の多塘ポリマーを形成する能力を有する微生物を好気性
発酵することによる多Ｉ！類の製造方法を提供すること
である。
るかもしくは未改良であり、一方外部マンノースがアセ
チル化もしくはピルビル化されているか又は未改良であ
る多糖キサンタンポリマーの族を提供することである． また、この生底物を試験管内で得る方法及び生体内で多
塘ポリマーの族を形成する能力を有する微生物を与える
ことも本発明の目的である．本発明の他の目的は、種々
の多塘ポリマーを形成する能力を有する微生物を好気性
発酵することによる多Ｉ！類の製造方法を提供すること
である。
本発明の他の目的及び利点を以下の記載に一部示し、一
部はその記載より明らかであろう。
部はその記載より明らかであろう。
この目的を達戒するため及び本発明により、約２：ｌｌ
の比のＤ−グルコース：Ｄ−マンノース：Ｄ−グルクロ
ン酸を有する多塘ポリマーを含む組威物が提供され、こ
こでＤ−グルコース成分はベーター〔１．４〕形状で結
合し、内部Ｄ−マンノース成分は通常交互のグルコース
成分にアルファー〔１ ． ３〕形状で結合し、Ｄ−グ
ルクロネート成分は内部マンノース成分にベーター〔１
．２〕形状で結合し、外部マンノース成分はベーター〔
１ ． ４〕形状でＤ−グルクロネート成分に結合して
いる。
の比のＤ−グルコース：Ｄ−マンノース：Ｄ−グルクロ
ン酸を有する多塘ポリマーを含む組威物が提供され、こ
こでＤ−グルコース成分はベーター〔１．４〕形状で結
合し、内部Ｄ−マンノース成分は通常交互のグルコース
成分にアルファー〔１ ． ３〕形状で結合し、Ｄ−グ
ルクロネート成分は内部マンノース成分にベーター〔１
．２〕形状で結合し、外部マンノース成分はベーター〔
１ ． ４〕形状でＤ−グルクロネート成分に結合して
いる。
本発明の目的を達戒するため、内部マンノース成分が６
一〇位でアセチル化されているキサンタンガムを含む組
成物が提供される。他の構造は内部及び外部マンノース
成分の両方がアセチル化されている。他の構造は、外部
マンノース成分の一部が４−６一位においてピルビル化
され、一部がアセチル化されている。他の構造は外部マ
ンノース成分が４−６位でピルビル化され、内部マンノ
ース威分が６一〇位でアセチル化されている。２つの追
加構造が提供され、１つは４−６位でピルビル化された
外部マンノース成分を有し、他はアセチル化された外部
マンノース成分を有する．また、本発明は上記多糖ポリ
マーの製造方法でもある．本発明の多糖ポリマーは、多
糖を製造する微生物の生合或経路の遺伝子操作により製
造される．特に、キサンタンガムを製造するための微生
物経路は他のポリマー単位を製造するための生体内又は
試験管内システムを作るため操作される．従って、シス
テムは、特に異なる程度までアセチル化もしくはピルビ
ル化された多糖を作り出すため突然変異したアセチラー
ゼＩ１アセチラーゼ■及びケタラーゼ遺伝子の使用によ
り形成される．以下の実施例と共に本発明の好ましい実
施態様を参考にし、本発明の原理を説明する．本発明の
多糖ポリマーは上記に詳細に記載されている．この多糖
ポリマーは無細胞酵素系で試験管内で製造され又は適当
な突然変異株の細胞を培養することにより生体内で製造
される。多塘ポリマーを製造する他の方法も以下に記載
する。
一〇位でアセチル化されているキサンタンガムを含む組
成物が提供される。他の構造は内部及び外部マンノース
成分の両方がアセチル化されている。他の構造は、外部
マンノース成分の一部が４−６一位においてピルビル化
され、一部がアセチル化されている。他の構造は外部マ
ンノース成分が４−６位でピルビル化され、内部マンノ
ース威分が６一〇位でアセチル化されている。２つの追
加構造が提供され、１つは４−６位でピルビル化された
外部マンノース成分を有し、他はアセチル化された外部
マンノース成分を有する．また、本発明は上記多糖ポリ
マーの製造方法でもある．本発明の多糖ポリマーは、多
糖を製造する微生物の生合或経路の遺伝子操作により製
造される．特に、キサンタンガムを製造するための微生
物経路は他のポリマー単位を製造するための生体内又は
試験管内システムを作るため操作される．従って、シス
テムは、特に異なる程度までアセチル化もしくはピルビ
ル化された多糖を作り出すため突然変異したアセチラー
ゼＩ１アセチラーゼ■及びケタラーゼ遺伝子の使用によ
り形成される．以下の実施例と共に本発明の好ましい実
施態様を参考にし、本発明の原理を説明する．本発明の
多糖ポリマーは上記に詳細に記載されている．この多糖
ポリマーは無細胞酵素系で試験管内で製造され又は適当
な突然変異株の細胞を培養することにより生体内で製造
される。多塘ポリマーを製造する他の方法も以下に記載
する。
跋駿宣血炙益金底
非変異キサンタンガムを製造するための無細胞系の使用
に関する基本的方法は、ＩｅｌｐＨ＋Ｌ．，Ｃｏｕｓｏ
，Ｒ．０．、及びＤａｎｋｅｒｔ，Ｍ．Ａ．らのＦＥＢ
Ｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ １３０：２５３〜２５６ （１９
８１）に記載されている。本発明の変異多糖を製造する
ため、この方法の改良法を用いてよいことがわかった。
に関する基本的方法は、ＩｅｌｐＨ＋Ｌ．，Ｃｏｕｓｏ
，Ｒ．０．、及びＤａｎｋｅｒｔ，Ｍ．Ａ．らのＦＥＢ
Ｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ １３０：２５３〜２５６ （１９
８１）に記載されている。本発明の変異多糖を製造する
ため、この方法の改良法を用いてよいことがわかった。
この新規改良法に対し、好適な緩衝剤、好ましくはＥＤ
ＴＡの存在下遺伝子Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ，好まし
くはＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍ ｅｓｔｒｉｓの
微生物の細胞を溶解させ、その後外因性付加構造を作製
できる適当な生合或酵素を得ることにより試験管内無細
胞系が形成される， Ｖａｎｄｅｒｓｌｉｃｅらの米国
特許第４，７１７，４４９号に記載されているこの試験
管内システムの一般的方法は特に本発明に組み込まれる
．他の溶解方法も用いてよく、音波処理、フレンチ圧力
セル、界面活性剤処理、酵素処理及びこれらの組み合せ
を含む。
ＴＡの存在下遺伝子Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ，好まし
くはＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍ ｅｓｔｒｉｓの
微生物の細胞を溶解させ、その後外因性付加構造を作製
できる適当な生合或酵素を得ることにより試験管内無細
胞系が形成される， Ｖａｎｄｅｒｓｌｉｃｅらの米国
特許第４，７１７，４４９号に記載されているこの試験
管内システムの一般的方法は特に本発明に組み込まれる
．他の溶解方法も用いてよく、音波処理、フレンチ圧力
セル、界面活性剤処理、酵素処理及びこれらの組み合せ
を含む。
通常、本発明の変異多糖を製造するため、所望の多糖を
構成するに必要な酵素を有する微生物の溶解産物が適当
な基質とインキュベートされ、この基質は所望のガムに
より異なり、ＵＤＰ−グルコース、ＧＤＰ−マンノース
、ＵＤＰ−グルクロン酸、アセチルーＣｏＡ及びホスホ
エノールピルビン酸を含む。基質の選択は所望の多糖に
より異なる。例えば、非アセチル化多糖は基質としてア
セチルーＣｏＡを除去丁ることにより得られる。
構成するに必要な酵素を有する微生物の溶解産物が適当
な基質とインキュベートされ、この基質は所望のガムに
より異なり、ＵＤＰ−グルコース、ＧＤＰ−マンノース
、ＵＤＰ−グルクロン酸、アセチルーＣｏＡ及びホスホ
エノールピルビン酸を含む。基質の選択は所望の多糖に
より異なる。例えば、非アセチル化多糖は基質としてア
セチルーＣｏＡを除去丁ることにより得られる。
内在基質を除去するための細胞溶解産物の化学的及び／
又は酵素処理は当業者に明らかであろう。
又は酵素処理は当業者に明らかであろう。
さらに、無細胞系は、キサンタン生合成経路の酵素を１
種以上欠く突然変異生物体より形成される。そのような
突然変異由来細胞溶解産物は、その変異のみのため又は
基質と組み合せた変異のため上記変異ガムを形成する。
種以上欠く突然変異生物体より形成される。そのような
突然変異由来細胞溶解産物は、その変異のみのため又は
基質と組み合せた変異のため上記変異ガムを形成する。
一実施態様において、生合或プロセスはポリマー単位へ
の放射ラベルした物質の導入により監視される。当業者
に公知である生合或中間体を同定するため他の方法を用
いてよい。特に、オリゴ糖中間体を分離及び同定するた
めクロマトグラフ法が開発された。これは薄層クロマト
グラフィー及び高速液体クロマトグラフィーを含む。
の放射ラベルした物質の導入により監視される。当業者
に公知である生合或中間体を同定するため他の方法を用
いてよい。特に、オリゴ糖中間体を分離及び同定するた
めクロマトグラフ法が開発された。これは薄層クロマト
グラフィー及び高速液体クロマトグラフィーを含む。
キサンタンの無細胞生合或は、特定のヌクレオチド３種
すべての添加により異なる時間依存性逐次プロセスであ
ることがわかった。ラベルした物質の非特異的導入のバ
ックグランドは最小であり、ガム画分でのキサンタン特
異的ポリマーの検出を妨害しない。
すべての添加により異なる時間依存性逐次プロセスであ
ることがわかった。ラベルした物質の非特異的導入のバ
ックグランドは最小であり、ガム画分でのキサンタン特
異的ポリマーの検出を妨害しない。
多糖生合或経路の多くには脂質キャリャー、特にイソプ
レノイドピロホスフエートの発生が示された。さらに、
キサンタン生合成におけるビロホスホリルに結合した脂
質キャリャーの発生が示された。従って、キサンタン生
合成中間体はこれらのキャリャー脂質により有機可溶性
画分中に回収可能であることがわかった。回収されたオ
リゴ塘はその後穏やかな酸加水分解、例えばｐＨ２、９
０’Ｃで２０分間によりキャリャー脂質を除去され、分
析用にアルカリホスファターゼにより脱燐酸化される。
レノイドピロホスフエートの発生が示された。さらに、
キサンタン生合成におけるビロホスホリルに結合した脂
質キャリャーの発生が示された。従って、キサンタン生
合成中間体はこれらのキャリャー脂質により有機可溶性
画分中に回収可能であることがわかった。回収されたオ
リゴ塘はその後穏やかな酸加水分解、例えばｐＨ２、９
０’Ｃで２０分間によりキャリャー脂質を除去され、分
析用にアルカリホスファターゼにより脱燐酸化される。
中間体生成物を回収するためこの方法を用いることによ
り、試験管内条件において、Ｌ四肚四ｋｎ突然変異体の
ある溶解産物が非変異ガム合或に必要な基質すべての存
在下でさえ非アセチル化又は非ピルビル化キサンタンガ
ムを形成することがわかった。この方法は他の多糖を形
成する細胞溶解産物を同定することができる。
り、試験管内条件において、Ｌ四肚四ｋｎ突然変異体の
ある溶解産物が非変異ガム合或に必要な基質すべての存
在下でさえ非アセチル化又は非ピルビル化キサンタンガ
ムを形成することがわかった。この方法は他の多糖を形
成する細胞溶解産物を同定することができる。
ゑ会ヱ目」４色腹
上記多糖の無細胞合成法の開発は、種々のＸａｎ ｔｈ
ｏｍｏｎａｓ ■炒竺江ｎ細胞がアセチル化もしくは
ピルビル化された、又は非改良のマンノース残基を有す
るキサンタンベースポリマーの合成に必要な酵素をすべ
て有していることを示した。
ｏｍｏｎａｓ ■炒竺江ｎ細胞がアセチル化もしくは
ピルビル化された、又は非改良のマンノース残基を有す
るキサンタンベースポリマーの合成に必要な酵素をすべ
て有していることを示した。
さらに、非アセチル化キサンタンガムを合成するすべて
の細胞は、キサンタンガム合成の間内部又は外部マンノ
ースのいずれかのアセヂル化を止める手段が必要である
。さらに、非アセチル化、非ピルビル化キサンタンガム
を合成するすべての細胞は、アセチル化及びピルビル化
工程の両方においてキサンタンガム合成を止める手段が
必要である。本発明の一実施態様において、この種々の
反応に応答する遺伝子のあるものを変えるため突然変異
誘発が用いられる。
の細胞は、キサンタンガム合成の間内部又は外部マンノ
ースのいずれかのアセヂル化を止める手段が必要である
。さらに、非アセチル化、非ピルビル化キサンタンガム
を合成するすべての細胞は、アセチル化及びピルビル化
工程の両方においてキサンタンガム合成を止める手段が
必要である。本発明の一実施態様において、この種々の
反応に応答する遺伝子のあるものを変えるため突然変異
誘発が用いられる。
限定するものではないが、ＴｎｌＯ ， ＴｎＫ１２（
ＴｎｌＯｄｅｌ １６ ｄｅｌ １７ＫａｎＲ）、及
びＴｎ９０３を含むトランス；ＨソンカＸａｎｔｈｏｍ
ｏｎａｓ 凶シ竺豆ｎを突然変異させるため用いてよ
い。このトランスボゾンは、一実施態様において、テト
ラサイクリン又はカナマイシンに対する耐性を与える。
ＴｎｌＯｄｅｌ １６ ｄｅｌ １７ＫａｎＲ）、及
びＴｎ９０３を含むトランス；ＨソンカＸａｎｔｈｏｍ
ｏｎａｓ 凶シ竺豆ｎを突然変異させるため用いてよ
い。このトランスボゾンは、一実施態様において、テト
ラサイクリン又はカナマイシンに対する耐性を与える。
トランスボゾンは遺伝子に入る能力を有し、コード配列
を中断することにより突然変異をおこす。トランスポゾ
ンは、いわゆる自殺ベクター、例えばｐＲＫ２０１３を
含む種々のベクター上でＸａｎ ｔｈａｍｏｎａｓ
聾肚竺旦ｎに導入される。Ｄｉ ｔｔａ， Ｇ． ，
Ｃｏｒｂｉｎ． Ｄ．及びＨｅｌｉｎｓｋ，Ｄ．Ｒ．ら
のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．＾
．．７７： ７３４７ 〜７３５１ （１９８０）に記
載されているように、ベクターｐＲＫ２０１３はそれ自
身を非腸内細菌、例えばＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ 思
肝並ｋ圏に移す能力を有するが、その宿主内で複製でき
ない。従って、自殺ベクタ一がＸａｎ ｔｈｏｍｏｎａ
ｓ ■肚出豆ｎ細胞の集団に導入され、この集団がそ
の後テトラサイタリンもしくはカナマイシンの攻撃をう
けた場合、生存している各々はトランスボゾンの１つが
Ｘａｎｔｈｏｎｏｍａｓ思ｕ並豆ｎのゲノムに入ったも
のである．そのような攻撃の生存者をキサンタンガム製
造能を失ったものについてスクリーンする．そのような
突然変異体は糸状菌タイプＸａｎ ｔｈｏｎｏｍａｓ
態肛並豆ｎよりムコイドが少ないと考えられる． 本発明の他の実施態様において、それが製造するガムを
アセチル化及び／又はピルビル化しない突然変異体を発
生するため他の突然変異誘発を用いてよい．そのような
方法は当業者に明らかであり、限定するものではないが
、輻射、組換えＤＮＡ法（特に、Ｃａｐａｇｅらの米国
特許出願番号第３３３， ８６８号、ｒＲｅｃｏｓｂｉ
ｎａｎｔ−ＤＮＡ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｐｒｏｄｕｃ−
ｔｉｏｎ ｏｆ Ｘａｎｔｈａｎ Ｇｕｍ Ｊ 、１９
８９年４月３日出願、及び下記例１）及び化学突然変異
誘発物質処理を含む。そのような突然変異誘発法の例は
Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．のＥｘ ｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉ
ｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９７２
） ；Ｄａｖｉｓ， Ｒ．Ｗ． ＋ Ｂｏｓ ｔｅｉｎ
， ｏ．及びＲｏｔｈ，Ｊ．Ｒ．らのＡｄｖａｎｃｅｄ
Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （１９８０
）；及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．＋Ｆｒｉｔｓｃｂ＋Ｅ
．Ｆ．及びＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ． らのＭｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ （１９８２）に記載された
。
を中断することにより突然変異をおこす。トランスポゾ
ンは、いわゆる自殺ベクター、例えばｐＲＫ２０１３を
含む種々のベクター上でＸａｎ ｔｈａｍｏｎａｓ
聾肚竺旦ｎに導入される。Ｄｉ ｔｔａ， Ｇ． ，
Ｃｏｒｂｉｎ． Ｄ．及びＨｅｌｉｎｓｋ，Ｄ．Ｒ．ら
のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．＾
．．７７： ７３４７ 〜７３５１ （１９８０）に記
載されているように、ベクターｐＲＫ２０１３はそれ自
身を非腸内細菌、例えばＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ 思
肝並ｋ圏に移す能力を有するが、その宿主内で複製でき
ない。従って、自殺ベクタ一がＸａｎ ｔｈｏｍｏｎａ
ｓ ■肚出豆ｎ細胞の集団に導入され、この集団がそ
の後テトラサイタリンもしくはカナマイシンの攻撃をう
けた場合、生存している各々はトランスボゾンの１つが
Ｘａｎｔｈｏｎｏｍａｓ思ｕ並豆ｎのゲノムに入ったも
のである．そのような攻撃の生存者をキサンタンガム製
造能を失ったものについてスクリーンする．そのような
突然変異体は糸状菌タイプＸａｎ ｔｈｏｎｏｍａｓ
態肛並豆ｎよりムコイドが少ないと考えられる． 本発明の他の実施態様において、それが製造するガムを
アセチル化及び／又はピルビル化しない突然変異体を発
生するため他の突然変異誘発を用いてよい．そのような
方法は当業者に明らかであり、限定するものではないが
、輻射、組換えＤＮＡ法（特に、Ｃａｐａｇｅらの米国
特許出願番号第３３３， ８６８号、ｒＲｅｃｏｓｂｉ
ｎａｎｔ−ＤＮＡ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｐｒｏｄｕｃ−
ｔｉｏｎ ｏｆ Ｘａｎｔｈａｎ Ｇｕｍ Ｊ 、１９
８９年４月３日出願、及び下記例１）及び化学突然変異
誘発物質処理を含む。そのような突然変異誘発法の例は
Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．のＥｘ ｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉ
ｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９７２
） ；Ｄａｖｉｓ， Ｒ．Ｗ． ＋ Ｂｏｓ ｔｅｉｎ
， ｏ．及びＲｏｔｈ，Ｊ．Ｒ．らのＡｄｖａｎｃｅｄ
Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （１９８０
）；及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．＋Ｆｒｉｔｓｃｂ＋Ｅ
．Ｆ．及びＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ． らのＭｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ （１９８２）に記載された
。
この他に、適当な突然変異体は所望の多糖、例えばアセ
チル化されているがピルビル化されていない、ピルビル
化されているがアセチル化されていない、ピルビル化及
びアセチル化されている、又は内部マンノースはアセチ
ル化されているかもしくは未改良であるが未改良である
外部マンノースを有するキサンタンガムの存在に対し各
突然変異体の培養ブロスをアッセイすることにより検出
される。従って、突然変異体はキサンタンガム経路の種
々の位置でプロックされることがわかった．内部マンノ
ースでアセチル化され及び外部マンノースでアセチル化
された（Ｘ１３９７） 、内部マンノースでアセチル化
され及び外部マンノースでピルビル化された（Ｘ１３９
８） 、内部マンノースでアセチル化され及び外部マン
ノースで未改良の（Ｘ１３９９）、内部マンノースで未
改良であり及び外部マンノース威分の一部がピルビル化
されさらに一部がアセチル化されている（Ｘ１４００）
、内部マンノースで未改良であり及び外部マンノース
でアセチル化されている（Ｘ１４０１） 、内部マンノ
ースで未改良であり及び外部マンノースでピルビル化さ
れている（Ｘ１４０２） 、並びに内部マンノースで未
改良であり及び外部マンノースで未改良である（Ｘ１４
０３〕キサンタンガムを製造するＸａｎｔｈｏａ＋ｏｎ
ａｓ ■肚四紅圏の突然変異体はそれぞれＮｌｌ ６
８０３３． ６８０３４． ６８０３５．６８０３６，
６８０３７． ６８０３８及び６８０３９としてアメ
リカンタイプ力ルチャーコレクション（Ａｓｅｒｉｃａ
ｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）
．Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄに寄託されて
いる． 同じ生成物を得るためアセチラーゼＩ、アセチラーゼ■
及びケタラーゼの酵素阻害剤を用いることは、本発明の
範囲内ではない．この多糖族を製造する他の方法、例え
ば天然キサンタンガムの酵素及び化学分解も考えられて
いる． 突然変異体は、野生タイプＸａｎｔｈＯＩＩＯｎａ３■
鮭並ｋｎの増殖について当該分野において公知の条件で
増殖する。例えば、好適な同化性炭素源、例えばグルコ
ース、スクロース、マルトース、スターチ、複炭水化物
、例えば糖蜜又はコーンシロップ、種々の有機酸等上で
増殖する。炭素源の混合物も用いてよい。供給される炭
素源の濃度は１０〜６０ ｇ ／ ｆである。通常約０
．１〜１０．０ ｇ ／ ｌの有機もしくは無機窒素の
同化性源並びにミネラルも増殖に必要であり、その選択
は当業者において容易である．好適な窒素源の例は、ア
ンモニア塩、硝酸塩、尿素、イースト抽出物、ペブトン
、もしくは他の加水分解した蛋白様物質又はこれらの混
合物である。好適なミネラルの例は、燐、硫黄、カリウ
ム、ナトリウム、鉄、マグネシウムを含み、これらはし
ばしばキレート化剤、例えばＥＤＴＡもしくはクエン酸
と共に加えられる。
チル化されているがピルビル化されていない、ピルビル
化されているがアセチル化されていない、ピルビル化及
びアセチル化されている、又は内部マンノースはアセチ
ル化されているかもしくは未改良であるが未改良である
外部マンノースを有するキサンタンガムの存在に対し各
突然変異体の培養ブロスをアッセイすることにより検出
される。従って、突然変異体はキサンタンガム経路の種
々の位置でプロックされることがわかった．内部マンノ
ースでアセチル化され及び外部マンノースでアセチル化
された（Ｘ１３９７） 、内部マンノースでアセチル化
され及び外部マンノースでピルビル化された（Ｘ１３９
８） 、内部マンノースでアセチル化され及び外部マン
ノースで未改良の（Ｘ１３９９）、内部マンノースで未
改良であり及び外部マンノース威分の一部がピルビル化
されさらに一部がアセチル化されている（Ｘ１４００）
、内部マンノースで未改良であり及び外部マンノース
でアセチル化されている（Ｘ１４０１） 、内部マンノ
ースで未改良であり及び外部マンノースでピルビル化さ
れている（Ｘ１４０２） 、並びに内部マンノースで未
改良であり及び外部マンノースで未改良である（Ｘ１４
０３〕キサンタンガムを製造するＸａｎｔｈｏａ＋ｏｎ
ａｓ ■肚四紅圏の突然変異体はそれぞれＮｌｌ ６
８０３３． ６８０３４． ６８０３５．６８０３６，
６８０３７． ６８０３８及び６８０３９としてアメ
リカンタイプ力ルチャーコレクション（Ａｓｅｒｉｃａ
ｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）
．Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄに寄託されて
いる． 同じ生成物を得るためアセチラーゼＩ、アセチラーゼ■
及びケタラーゼの酵素阻害剤を用いることは、本発明の
範囲内ではない．この多糖族を製造する他の方法、例え
ば天然キサンタンガムの酵素及び化学分解も考えられて
いる． 突然変異体は、野生タイプＸａｎｔｈＯＩＩＯｎａ３■
鮭並ｋｎの増殖について当該分野において公知の条件で
増殖する。例えば、好適な同化性炭素源、例えばグルコ
ース、スクロース、マルトース、スターチ、複炭水化物
、例えば糖蜜又はコーンシロップ、種々の有機酸等上で
増殖する。炭素源の混合物も用いてよい。供給される炭
素源の濃度は１０〜６０ ｇ ／ ｆである。通常約０
．１〜１０．０ ｇ ／ ｌの有機もしくは無機窒素の
同化性源並びにミネラルも増殖に必要であり、その選択
は当業者において容易である．好適な窒素源の例は、ア
ンモニア塩、硝酸塩、尿素、イースト抽出物、ペブトン
、もしくは他の加水分解した蛋白様物質又はこれらの混
合物である。好適なミネラルの例は、燐、硫黄、カリウ
ム、ナトリウム、鉄、マグネシウムを含み、これらはし
ばしばキレート化剤、例えばＥＤＴＡもしくはクエン酸
と共に加えられる。
Ｘａｎ ｔｈｏｍｏｎａｓ ■Ｕ■ｔｒｉｓの増殖に
最適の温度は１８〜３５℃、好ましくは約２７ｓ〜３０
゜Ｃである。
最適の温度は１８〜３５℃、好ましくは約２７ｓ〜３０
゜Ｃである。
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ 田肚勉豆ｎ細胞は、適切な
レベルの溶解した酸素、例えば飽和の約１０％以上を保
つよう空気もしくは酸素を供給することにより好気的に
増殖される。好ましくは、このレベルは約２０％以上に
保たれる。ｐＨはしばしば約６．０〜８．０、好ましく
は約６．５〜７．５に保たれる。
レベルの溶解した酸素、例えば飽和の約１０％以上を保
つよう空気もしくは酸素を供給することにより好気的に
増殖される。好ましくは、このレベルは約２０％以上に
保たれる。ｐＨはしばしば約６．０〜８．０、好ましく
は約６．５〜７．５に保たれる。
本発明の多糖は、好適な方法により発酵ブロスより回収
される。イソブロパノール、エタノール、又は他の好適
なアルコールによる沈殿により本発明の多糖が容易に得
られる．通常、アルコールは、好ましくは塩化カリウム
、塩化ナトリウム又は他の塩の存在下約５０〜７５％（
体積基準）の濃度に加えられる．この他に、ポリマーは
超遠心によりブロスから回収される。
される。イソブロパノール、エタノール、又は他の好適
なアルコールによる沈殿により本発明の多糖が容易に得
られる．通常、アルコールは、好ましくは塩化カリウム
、塩化ナトリウム又は他の塩の存在下約５０〜７５％（
体積基準）の濃度に加えられる．この他に、ポリマーは
超遠心によりブロスから回収される。
強化油回収に用いるための流動性調節溶液も種々の多糖
ポリマーより製造される．約５０〜約３０００ｐｐｍの
濃度の多糖ポリマーの溶液がそのような流動性調節溶液
に適当である．油回収をさらに高めるためこれらの溶液
と共に他の公知の添加剤も用いてよい。そのような添加
剤は、例えば、界面活性剤、アルカリ剤、又は金属もし
くは有機架橋剤を含む。
ポリマーより製造される．約５０〜約３０００ｐｐｍの
濃度の多糖ポリマーの溶液がそのような流動性調節溶液
に適当である．油回収をさらに高めるためこれらの溶液
と共に他の公知の添加剤も用いてよい。そのような添加
剤は、例えば、界面活性剤、アルカリ剤、又は金属もし
くは有機架橋剤を含む。
キサンタンガム様の多塘ポリマーは、食品、化粧品、医
薬配合物、糊、掘削液、印刷インク、等の増粘剤として
及びゲル化剤として用いてよい。
薬配合物、糊、掘削液、印刷インク、等の増粘剤として
及びゲル化剤として用いてよい。
さらに、パイプ内の液体流の摩擦を低下させるために用
いてもよい。
いてもよい。
実』鮎剋
以下の例は、本発明の好ましい実施態様を説明する。
奥上
この例は、キサンタンガムのアセチル化を触媒する酵素
をコード化する２種のＬ仝狙匹１Ｌ櫃の存在を示す。
をコード化する２種のＬ仝狙匹１Ｌ櫃の存在を示す。
Ｃａｐａｇｅらの米国特許出願第３３３， ８６８号は
、キサンタンガム生合或に必要な遺伝子クラスターを含
ムＸ．仝狙匹躬Ｌ櫃ＤＮＡの１６ｋｂセグメントのヌク
レオチド配列を記載している。突然変異はＤＮＡ配列に
よりｖａＬＷされた各遺伝子の不活性化により同定され
た．この突然変異を担持する突然変異体株の遺伝表現型
が決定された。トランスボゾン挿入により生じた遺伝子
下での突然変異（第１ａ図参照）は、検出可能なアセテ
ートを含まないキサンタンガムを形成した。遺伝子Ｇの
挿入変異はキサンタンガム生合或に全く欠陥を形成しな
かった．遺伝子Ｃ欠損した突然変異体は高レベルのキサ
ンタンガムを形成し、このガムはほぼ通常のモル比でキ
サンタンの通常の戊分をすべて含んでいた。この最初の
結果を基準として、遺伝子Ｇがキサンタンの内部マンノ
ースの公知のアセチル化を触媒すると結論付けられたが
、一方遺伝子Ｇ蛋白質の活性は未知のままである。
、キサンタンガム生合或に必要な遺伝子クラスターを含
ムＸ．仝狙匹躬Ｌ櫃ＤＮＡの１６ｋｂセグメントのヌク
レオチド配列を記載している。突然変異はＤＮＡ配列に
よりｖａＬＷされた各遺伝子の不活性化により同定され
た．この突然変異を担持する突然変異体株の遺伝表現型
が決定された。トランスボゾン挿入により生じた遺伝子
下での突然変異（第１ａ図参照）は、検出可能なアセテ
ートを含まないキサンタンガムを形成した。遺伝子Ｇの
挿入変異はキサンタンガム生合或に全く欠陥を形成しな
かった．遺伝子Ｃ欠損した突然変異体は高レベルのキサ
ンタンガムを形成し、このガムはほぼ通常のモル比でキ
サンタンの通常の戊分をすべて含んでいた。この最初の
結果を基準として、遺伝子Ｇがキサンタンの内部マンノ
ースの公知のアセチル化を触媒すると結論付けられたが
、一方遺伝子Ｇ蛋白質の活性は未知のままである。
しかし、遺伝子Ｆ及びＧ（ｇｐＦ及びｇｐＧ）の生戒吻
のアミノ酸配列を予想するためＤＮＡ配列を用いる場合
、この蛋白質が互いに広範な相同を有することがわかっ
た．この発見はｇｐＦ’及びｇＰＧの機能が同じである
ことを示した．遺伝子Ｇを欠損した突然変異体の遺伝表
現型はその後再調査され、この突然変異体により形成さ
れたキサンタンの組或物は正確に定量された．このデー
タは野生タイプＸ．ｃａａ＋ ｅｓｔｒｉｓと比較して
Ｇ一突然変異体により形成されたガムのアセテート含量
がわずか（５％〜１０％）であるが十分低下したことを
示した．従って、キサンタンのアセチル化にｇｐＧがど
んな役割を果たすか調べるため他の実験を行った。
のアミノ酸配列を予想するためＤＮＡ配列を用いる場合
、この蛋白質が互いに広範な相同を有することがわかっ
た．この発見はｇｐＦ’及びｇＰＧの機能が同じである
ことを示した．遺伝子Ｇを欠損した突然変異体の遺伝表
現型はその後再調査され、この突然変異体により形成さ
れたキサンタンの組或物は正確に定量された．このデー
タは野生タイプＸ．ｃａａ＋ ｅｓｔｒｉｓと比較して
Ｇ一突然変異体により形成されたガムのアセテート含量
がわずか（５％〜１０％）であるが十分低下したことを
示した．従って、キサンタンのアセチル化にｇｐＧがど
んな役割を果たすか調べるため他の実験を行った。
ｇｐＧが通常キサンタンガムのアセチル化の１０％に関
与するという仮説は、表面上は遺伝子Ｆのトランスボゾ
ン挿入変異がアセチル化を排除する結果と矛盾する。明
らかに、この突然変異体ガムは１０％の通常のアセテー
ト含量を保たなかった。
与するという仮説は、表面上は遺伝子Ｆのトランスボゾ
ン挿入変異がアセチル化を排除する結果と矛盾する。明
らかに、この突然変異体ガムは１０％の通常のアセテー
ト含量を保たなかった。
しかし、遺伝子Ｆへの挿入によりいわゆる「極性」効果
の結果として遺伝子Ｇの発現を低下させる又は排除する
ことが可能であった， ＴｎｌＯの挿入は通常、Ｋｌｅ
ｃｋｎｅｒ＋Ｎ， らのＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．． ９
７：５６１〜５７５（１９７５）に報告されているよう
に、挿入より、転写によって遺伝子の発現を低下させる
．さらに、Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ．Ｄ．Ｓ．及びＹａｎｏ
ｆｓｋｙ，Ｃ．のＧｅｎｅｔ．９５：７８５〜７９５（
１９８０）に報告されているように、挿入変異を含む遺
伝子に下流遺伝子が「翻訳結合」した場合、この低下は
全く厳しい．翻訳結合は１つの遺伝子の翻訳停止シグナ
ルが隣接する下流遺伝子の翻訳開始シグナルと重ってい
る現象である．そのような結合がおこるケースにおいて
、下流遺伝子の翻訳の開始は結合部におこる上流遺伝子
の翻訳の停止に依存している。従って、結合した遺伝子
の上流での挿入は、この挿入が上流遺伝子の翻訳を早期
に停止させ及びフレームシフトをおこすため下流遺伝子
の発現を劇的に低下させ、又は排除する。
の結果として遺伝子Ｇの発現を低下させる又は排除する
ことが可能であった， ＴｎｌＯの挿入は通常、Ｋｌｅ
ｃｋｎｅｒ＋Ｎ， らのＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．． ９
７：５６１〜５７５（１９７５）に報告されているよう
に、挿入より、転写によって遺伝子の発現を低下させる
．さらに、Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ．Ｄ．Ｓ．及びＹａｎｏ
ｆｓｋｙ，Ｃ．のＧｅｎｅｔ．９５：７８５〜７９５（
１９８０）に報告されているように、挿入変異を含む遺
伝子に下流遺伝子が「翻訳結合」した場合、この低下は
全く厳しい．翻訳結合は１つの遺伝子の翻訳停止シグナ
ルが隣接する下流遺伝子の翻訳開始シグナルと重ってい
る現象である．そのような結合がおこるケースにおいて
、下流遺伝子の翻訳の開始は結合部におこる上流遺伝子
の翻訳の停止に依存している。従って、結合した遺伝子
の上流での挿入は、この挿入が上流遺伝子の翻訳を早期
に停止させ及びフレームシフトをおこすため下流遺伝子
の発現を劇的に低下させ、又は排除する。
ガム遺伝子クラスターのＤＮＡ配列は、遺伝子Ｆの翻訳
停止が遺伝子Ｇの翻訳開始と重っていない、すなわちこ
の２つが「結合」していることを明らかにした（第１ｂ
図参照）．さらに、遺伝子Ｇに対する翻訳開始シグナル
の配列はそれほど強くなく、これは翻訳結合が遺伝子Ｇ
の発現に十分な役割を果たすことを示唆している．この
仮説をテストするため、遺伝子Ｆのコード化配列内で欠
失変異を行った（第２図参照）．この欠失は遺伝子Ｆ内
のＣｌａ Ｉサイトの間の６６０ベースベアーを除去し
た。こ欠失したＤＮＡは遺伝子Ｆのコード化配列内に存
在し、他のＤＮＡは挿入されない。
停止が遺伝子Ｇの翻訳開始と重っていない、すなわちこ
の２つが「結合」していることを明らかにした（第１ｂ
図参照）．さらに、遺伝子Ｇに対する翻訳開始シグナル
の配列はそれほど強くなく、これは翻訳結合が遺伝子Ｇ
の発現に十分な役割を果たすことを示唆している．この
仮説をテストするため、遺伝子Ｆのコード化配列内で欠
失変異を行った（第２図参照）．この欠失は遺伝子Ｆ内
のＣｌａ Ｉサイトの間の６６０ベースベアーを除去し
た。こ欠失したＤＮＡは遺伝子Ｆのコード化配列内に存
在し、他のＤＮＡは挿入されない。
従って、この欠失は遺伝子の大部分（約６０％）を除去
するが、除去されるベースペア一の多くが３で均等に割
ることができるので読取りフレームを変えない。この欠
失変異により形成された変異ｇ ｐ Ｆ （ｇｐＦｄｅ
ｌ）は合計３６４個のア逅ノ酸がら２２０個を失うが、
遺伝子Ｆの翻訳開始及び遺伝子Ｆ翻訳停止は未変化のま
まである。ｇｐＦ’のアミノ酸残基の２／３の除去はす
べての蛋白質活性を除去すると考えられる。従って、こ
の突然変異体からの残留アセチラーゼ活性はすべてｇｐ
Ｇの活性に起因するであろう。
するが、除去されるベースペア一の多くが３で均等に割
ることができるので読取りフレームを変えない。この欠
失変異により形成された変異ｇ ｐ Ｆ （ｇｐＦｄｅ
ｌ）は合計３６４個のア逅ノ酸がら２２０個を失うが、
遺伝子Ｆの翻訳開始及び遺伝子Ｆ翻訳停止は未変化のま
まである。ｇｐＦ’のアミノ酸残基の２／３の除去はす
べての蛋白質活性を除去すると考えられる。従って、こ
の突然変異体からの残留アセチラーゼ活性はすべてｇｐ
Ｇの活性に起因するであろう。
このＣｌａ Ｉ欠失変異は、プラスξドのベクター部位
内に位置し、ＨａｙらのＧｅｎｅ． ３２：３６９〜３
７９（１９８４〕に記載されたトランスボゾンＴｎｌＯ
ｄｅｌ １６工１７の挿入及び他の野生タイプ遺伝子
クラスターを有するプラスミドｐＲＫ２９０−Ｈ３３６
． １３上で行なわれる（第３ａ図）。この欠失したプ
ラスミド（ｐｌ３ｄｅｌｃＩａと呼ぶ）は遺伝子Ｂを失
ったＬ■抑並豆困Ｇｕｍ−欠失株Ｘ１２３１に転化され
、得られる株Ｘ１２３１ （ｐｌ３ｄｅｌｃ１ａ）によ
り形成される多糖を分析した。このガムは低いが十分な
量のアセテートを含み、野生タイブキサンクンにみられ
る量の約１０〜１５％であった．この結果はｇｐＦ’及
びｇＰＧの両方がアセチラーゼであり、キサンタンのア
セチル化体がｇＰＧによりアセチル化されたキサンタン
アセチル化の成分を少量含むｇｐＦにより触媒されるこ
とを示した．しかし、ｇＰＧの活性からではな（ ｇｐ
Ｆｄｅｌの残留活性より得られる変異体Ｘ１２３１ （
ｐｌ３ｄｅｌｃ１ａ）にみられるアセチル化は低レベル
のままである．これを説明するため、ブラスミドｐＲＫ
２９０−Ｈ３３６の重複変異誘導体を構成した。第３ｂ
図に示すように、この重複変異体は遺伝子Ｇ内で遺伝子
ＦΔ１ａＩ欠失変異及び挿入変異（ＫＢａｉｌ）を組み
合せた．この重複変異プラス逅ドｐＨ３３６ＫＢａ＋ｌ
ｄｅｌｃ１ａを株Ｘ１２３１に転移し、形成された多糖
を分析した。Ｘ１２３１ （ｐｌ３ｄｅｌｃ１ａ）によ
り形成されるガムに見られる低レベルアセチル化がｇＰ
Ｇの活性より得られる場合、重複変異体Ｘ１２３１（ｐ
Ｈ３３６ＫＢｍ＋１ｄｅｌｃ１ａ）は遺伝子Ｇ内の挿入
変異にまりｇＰＧ活性を排除すべきであり、アセチル化
が見られない。しかし、Ｘ１２３１ （ｐｌ３ｄｅｌｃ
Ｉａ）中のアセチル化活性源が変異体ｇｐＰｄｅｌであ
る場合、遺伝子Ｇ挿入はアセチル化に影響を与えず、Ｘ
１２３１（ｐｌ３ｄｅｌｃ１ａ）・にみられる同じ１０
％レベルは重複変異株により形成されるガム中にみられ
るべきである。株Ｘ１２３１ （ｐＨ３３６ＫＢｎ＋Ｉ
ｄｅｌｃｌａ）により形成される多糖はアセテートを含
まないことがわかった。このことは、ｇｐＧがキサンタ
ンのアセチル化を触媒せず、野生タイプ株において、ｇ
ｐＧが総アセチル化の約ｌＯ％に関与することが証明さ
れた。
内に位置し、ＨａｙらのＧｅｎｅ． ３２：３６９〜３
７９（１９８４〕に記載されたトランスボゾンＴｎｌＯ
ｄｅｌ １６工１７の挿入及び他の野生タイプ遺伝子
クラスターを有するプラスミドｐＲＫ２９０−Ｈ３３６
． １３上で行なわれる（第３ａ図）。この欠失したプ
ラスミド（ｐｌ３ｄｅｌｃＩａと呼ぶ）は遺伝子Ｂを失
ったＬ■抑並豆困Ｇｕｍ−欠失株Ｘ１２３１に転化され
、得られる株Ｘ１２３１ （ｐｌ３ｄｅｌｃ１ａ）によ
り形成される多糖を分析した。このガムは低いが十分な
量のアセテートを含み、野生タイブキサンクンにみられ
る量の約１０〜１５％であった．この結果はｇｐＦ’及
びｇＰＧの両方がアセチラーゼであり、キサンタンのア
セチル化体がｇＰＧによりアセチル化されたキサンタン
アセチル化の成分を少量含むｇｐＦにより触媒されるこ
とを示した．しかし、ｇＰＧの活性からではな（ ｇｐ
Ｆｄｅｌの残留活性より得られる変異体Ｘ１２３１ （
ｐｌ３ｄｅｌｃ１ａ）にみられるアセチル化は低レベル
のままである．これを説明するため、ブラスミドｐＲＫ
２９０−Ｈ３３６の重複変異誘導体を構成した。第３ｂ
図に示すように、この重複変異体は遺伝子Ｇ内で遺伝子
ＦΔ１ａＩ欠失変異及び挿入変異（ＫＢａｉｌ）を組み
合せた．この重複変異プラス逅ドｐＨ３３６ＫＢａ＋ｌ
ｄｅｌｃ１ａを株Ｘ１２３１に転移し、形成された多糖
を分析した。Ｘ１２３１ （ｐｌ３ｄｅｌｃ１ａ）によ
り形成されるガムに見られる低レベルアセチル化がｇＰ
Ｇの活性より得られる場合、重複変異体Ｘ１２３１（ｐ
Ｈ３３６ＫＢｍ＋１ｄｅｌｃ１ａ）は遺伝子Ｇ内の挿入
変異にまりｇＰＧ活性を排除すべきであり、アセチル化
が見られない。しかし、Ｘ１２３１ （ｐｌ３ｄｅｌｃ
Ｉａ）中のアセチル化活性源が変異体ｇｐＰｄｅｌであ
る場合、遺伝子Ｇ挿入はアセチル化に影響を与えず、Ｘ
１２３１（ｐｌ３ｄｅｌｃ１ａ）・にみられる同じ１０
％レベルは重複変異株により形成されるガム中にみられ
るべきである。株Ｘ１２３１ （ｐＨ３３６ＫＢｎ＋Ｉ
ｄｅｌｃｌａ）により形成される多糖はアセテートを含
まないことがわかった。このことは、ｇｐＧがキサンタ
ンのアセチル化を触媒せず、野生タイプ株において、ｇ
ｐＧが総アセチル化の約ｌＯ％に関与することが証明さ
れた。
班１
この例は、ｇｐＧ （ＬかしｇｐＦでない）によるアセ
チル化に対する標的残基がキサンタン繰り返し単位の外
部マンノースであり、外部マンノースのピルビル化をブ
ロックした際にこのアセチル化が高められることを示す
。
チル化に対する標的残基がキサンタン繰り返し単位の外
部マンノースであり、外部マンノースのピルビル化をブ
ロックした際にこのアセチル化が高められることを示す
。
キサンタン生合成遺伝子クラスタ一の遺伝子Ｌの突然変
異（第１ａ図）は外部マンノースのピルビル化を触媒す
るカタラーゼ酵素を不活性化するため前記に示された。
異（第１ａ図）は外部マンノースのピルビル化を触媒す
るカタラーゼ酵素を不活性化するため前記に示された。
ｇｐＬ活性を欠く突然変異体はビルベートを欠くキサン
タンガムを形成する．しかし、そのような突然変異体の
初期の研究は、この非ピルビル化ポリマーがアセテート
を高レベル、通常０． ８アセテート／マンノース含む
ことを明らかにした．従って、外部マンノースはピルビ
ル化が遺伝学的にブロックされた場合に効果的にアセチ
ル化され、他の研究はこのアセチル化がｇｐＦ’ではな
＜ ｇｐＧにより触媒されることを示した。
タンガムを形成する．しかし、そのような突然変異体の
初期の研究は、この非ピルビル化ポリマーがアセテート
を高レベル、通常０． ８アセテート／マンノース含む
ことを明らかにした．従って、外部マンノースはピルビ
ル化が遺伝学的にブロックされた場合に効果的にアセチ
ル化され、他の研究はこのアセチル化がｇｐＦ’ではな
＜ ｇｐＧにより触媒されることを示した。
２つのアセチラーゼ遺伝子とケタラーゼ遺伝子との及び
互いの相互作用を調べるため、遺伝子Ｆ（アセチラーゼ
Ｉ）、遺伝子Ｇ（アセチラーゼ■）、及び遺伝子Ｌ（ケ
タラーゼ）における突然変異のすべての組み合せを含む
８種の突然変異体株を構威した。ガム遺伝子クラスター
を含むプラスξドｐＲＫ２９０−Ｈ３３６において突然
変異の種々の組み合せを構威した。
互いの相互作用を調べるため、遺伝子Ｆ（アセチラーゼ
Ｉ）、遺伝子Ｇ（アセチラーゼ■）、及び遺伝子Ｌ（ケ
タラーゼ）における突然変異のすべての組み合せを含む
８種の突然変異体株を構威した。ガム遺伝子クラスター
を含むプラスξドｐＲＫ２９０−Ｈ３３６において突然
変異の種々の組み合せを構威した。
この構戒に用いられる遺伝子Ｆ変異は、この遺伝子内で
のフレーム内欠失である。上記のように、この欠失は遺
伝子Ｆ内のＣｌａ Ｉサイトの間の６６０ベースペアー
を除去する．欠失されたＤＮＡは遺伝子Ｆのコード化配
列内に存在し、他のＤＮＡは挿入されない。従って、こ
の欠失は遺伝子の多く（約６６％）を除去するが、欠失
されたベースペアーの多くが３で均等に割ることができ
るので読み取りフレームを変えない。この欠失変異によ
り形成された変異体ｇｐＦ（ｇｐＦｄｅｌ）は合計３６
４個のアξノ酸より２２０個を失なうが、Ｆの翻訳開始
及びＧの開始に結合したその翻訳停止は未変化のままで
ある。ｇｐＦのアξノ酸残基の２／３の除去は上記ｇｐ
Ｆ’活性の除去に示されている。
のフレーム内欠失である。上記のように、この欠失は遺
伝子Ｆ内のＣｌａ Ｉサイトの間の６６０ベースペアー
を除去する．欠失されたＤＮＡは遺伝子Ｆのコード化配
列内に存在し、他のＤＮＡは挿入されない。従って、こ
の欠失は遺伝子の多く（約６６％）を除去するが、欠失
されたベースペアーの多くが３で均等に割ることができ
るので読み取りフレームを変えない。この欠失変異によ
り形成された変異体ｇｐＦ（ｇｐＦｄｅｌ）は合計３６
４個のアξノ酸より２２０個を失なうが、Ｆの翻訳開始
及びＧの開始に結合したその翻訳停止は未変化のままで
ある。ｇｐＦのアξノ酸残基の２／３の除去は上記ｇｐ
Ｆ’活性の除去に示されている。
この突然変異体に用いられる遺伝子Ｇ変異は遺伝子Ｇの
コード化配列を中断するＢａｍＨＩサイトでの遺伝子Ｇ
内の挿入（ＫＢｍｌ）である。挿入されたＤＮＡはＶｉ
ｅｉｒａ．Ｊ．及びＭｅＳＳｉｆｌｇｌＪ．らのＧｅｎ
ｅ， １９：２５９〜２６８ （１９８２）に記載され
ているように、ブラス累ドｐＵＣ４−Ｋの１． ３ ｋ
ｂ Ｋａｎ’ ＤＮＡセグメントを含む制限フラグメン
トであり、これはトランスポゾンＴｎ９０３のカナマイ
シン耐性遺伝子由来である。
コード化配列を中断するＢａｍＨＩサイトでの遺伝子Ｇ
内の挿入（ＫＢｍｌ）である。挿入されたＤＮＡはＶｉ
ｅｉｒａ．Ｊ．及びＭｅＳＳｉｆｌｇｌＪ．らのＧｅｎ
ｅ， １９：２５９〜２６８ （１９８２）に記載され
ているように、ブラス累ドｐＵＣ４−Ｋの１． ３ ｋ
ｂ Ｋａｎ’ ＤＮＡセグメントを含む制限フラグメン
トであり、これはトランスポゾンＴｎ９０３のカナマイ
シン耐性遺伝子由来である。
用いた遺伝子Ｌ変異は２つのタイプである。１つは遺伝
子Ｌのコード化部位でのトランスポゾンＴｎＫ１２の挿
入である。第２のタイプは、カナマイシン及びストレプ
トマイシンに対し遺伝子コード化耐性を有するＴｎＫ１
２の３ｋｂＨｉｎｄｌＩ［の欠失によるこの挿入より得
られる。このＴｎＫ１２欠失変異において、ＴｎＫ１２
ＤＮＡのｌｋｂの挿入は遺伝子Ｌコード化配列内に残
っており、これは遺伝子Ｌ生戒物を挿入不活性化する。
子Ｌのコード化部位でのトランスポゾンＴｎＫ１２の挿
入である。第２のタイプは、カナマイシン及びストレプ
トマイシンに対し遺伝子コード化耐性を有するＴｎＫ１
２の３ｋｂＨｉｎｄｌＩ［の欠失によるこの挿入より得
られる。このＴｎＫ１２欠失変異において、ＴｎＫ１２
ＤＮＡのｌｋｂの挿入は遺伝子Ｌコード化配列内に残
っており、これは遺伝子Ｌ生戒物を挿入不活性化する。
試験管内組換えＤＮＡ法を用いてプラスミドｐＲＫ２９
０−１｛３３６上でこの突然変異の種々の組み合せを行
った。得た８種の変異ブラスξドを、染色体からガム遺
伝子クラスター全体を除去する欠失変異を含むＬ■吐勉
豆亘株Ｘ１２３１へＥ．Ｃｏｌｉより移した。８種の得
られた株Ｘ１３９６ 〜Ｘ１４０３（表１）をポリマー
製造について分析した。
０−１｛３３６上でこの突然変異の種々の組み合せを行
った。得た８種の変異ブラスξドを、染色体からガム遺
伝子クラスター全体を除去する欠失変異を含むＬ■吐勉
豆亘株Ｘ１２３１へＥ．Ｃｏｌｉより移した。８種の得
られた株Ｘ１３９６ 〜Ｘ１４０３（表１）をポリマー
製造について分析した。
表 １
遺伝表現型
十 干
＋ ＋
＋ −’
十一Ｃ
−會 十
−置 十
＠ （一
一 一 Ｃ畠野
生タイプ、プラスくドのｐＲＫ２９０部内にＴｎＫ１２
挿入を有する ’ ＴｎＫ１２挿入変異 Ｃ Ｋ ａ ｎ ｒフラグメント挿入変異’ ＴｎＫ１
２欠失誘導体挿入変異 １フレーム内、非極性欠失変異 株はすべて３００ｍのじゃま板付振盪フラスコ内Ｘ１３
９６” Ｘ１３９７ Ｘ１３９８ Ｘ１３９９ Ｘ１４００ Ｘ１４０１ Ｘ１４０２ Ｘ１４０３ ３．２ｇ／ＩＮ−Ｚ−アミンＡＳ １． ７ ｇ ／ ｌ ＦＩｇＳＯａ ・７Ｈ！
００． ７ ｇ ／ ｌ ＫＨｚＰＯａ４０ ｇ
／ｌ グルコース １９．５ｇ／ｊ！ （２ − （Ｎ−モルホリノ）エ
タンスルホン酸） ５〜１０■／ｌ カナマイシン １ ■／ｌ テトラサイクリン を含む、ｐＨ ７． ０ ０）５０ｒｎｌ ＦＸＣ−Ｒ
ＡＨ−１培地で培養した．温度は３０℃に保った。，約
６０時間のインキエベーション後、培養プロスを２〜４
体積の蒸留水で稀釈し、１０゜Ｃにおける１４．０００
〜１Ｂ．ＯＯＯｇでの３０分の遠心により細胞を除去し
た。２〜３体積の２−プロパノールの添加により懸濁液
よりガムを沈殿させ、前記条件を用いる遠心により集め
た．この沈殿を１００〜３００１ＩＩｉの２０ｍＭ Ｎ
ａＯＨ内に再び水和させ、沈殿を繰り返した。最後にガ
ムを１００ｍの蒸留水に再び水和した。各サンプルをそ
の後１２． ０００〜１４，０００カットオフセルコー
スチューブ内で４２の蒸留水に対し、毎日水を換え４日
間透析した．各精製したガムの三組のサンプルを真空乾
燥により３〜４倍に濃縮し、１２０″Ｃで２．５時間２
Ｍトリフルオ口酢酸中で加水分解した。１． ２ Ｍ
ＮａｚＣＯｚで中和後、この加水分解物を高速液体クロ
マトグラフィ− （ＨＰＬＣ）分析用に０．４５ｍｉｎ
フィルターを通し濾過した。
一 一 Ｃ畠野
生タイプ、プラスくドのｐＲＫ２９０部内にＴｎＫ１２
挿入を有する ’ ＴｎＫ１２挿入変異 Ｃ Ｋ ａ ｎ ｒフラグメント挿入変異’ ＴｎＫ１
２欠失誘導体挿入変異 １フレーム内、非極性欠失変異 株はすべて３００ｍのじゃま板付振盪フラスコ内Ｘ１３
９６” Ｘ１３９７ Ｘ１３９８ Ｘ１３９９ Ｘ１４００ Ｘ１４０１ Ｘ１４０２ Ｘ１４０３ ３．２ｇ／ＩＮ−Ｚ−アミンＡＳ １． ７ ｇ ／ ｌ ＦＩｇＳＯａ ・７Ｈ！
００． ７ ｇ ／ ｌ ＫＨｚＰＯａ４０ ｇ
／ｌ グルコース １９．５ｇ／ｊ！ （２ − （Ｎ−モルホリノ）エ
タンスルホン酸） ５〜１０■／ｌ カナマイシン １ ■／ｌ テトラサイクリン を含む、ｐＨ ７． ０ ０）５０ｒｎｌ ＦＸＣ−Ｒ
ＡＨ−１培地で培養した．温度は３０℃に保った。，約
６０時間のインキエベーション後、培養プロスを２〜４
体積の蒸留水で稀釈し、１０゜Ｃにおける１４．０００
〜１Ｂ．ＯＯＯｇでの３０分の遠心により細胞を除去し
た。２〜３体積の２−プロパノールの添加により懸濁液
よりガムを沈殿させ、前記条件を用いる遠心により集め
た．この沈殿を１００〜３００１ＩＩｉの２０ｍＭ Ｎ
ａＯＨ内に再び水和させ、沈殿を繰り返した。最後にガ
ムを１００ｍの蒸留水に再び水和した。各サンプルをそ
の後１２． ０００〜１４，０００カットオフセルコー
スチューブ内で４２の蒸留水に対し、毎日水を換え４日
間透析した．各精製したガムの三組のサンプルを真空乾
燥により３〜４倍に濃縮し、１２０″Ｃで２．５時間２
Ｍトリフルオ口酢酸中で加水分解した。１． ２ Ｍ
ＮａｚＣＯｚで中和後、この加水分解物を高速液体クロ
マトグラフィ− （ＨＰＬＣ）分析用に０．４５ｍｉｎ
フィルターを通し濾過した。
分析は、Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７イオン交換カラム
（３００Ｘ ７． ８ ｍｍ ）を取り付けたべックマ
ンＨＰＬＣを用いて行った。２１４ｎｍでの紫外吸収に
より有機酸が検出された。中性糖を検出するため屈折率
を用いた．移動相として０．ＯＩＮ ＨｚＳＯ４を用い
４５゜Ｃで０．６ｄ／分の流速でカラムを行った。
（３００Ｘ ７． ８ ｍｍ ）を取り付けたべックマ
ンＨＰＬＣを用いて行った。２１４ｎｍでの紫外吸収に
より有機酸が検出された。中性糖を検出するため屈折率
を用いた．移動相として０．ＯＩＮ ＨｚＳＯ４を用い
４５゜Ｃで０．６ｄ／分の流速でカラムを行った。
各加水分解物中の成分のモル比は、各塘及び有機酸に対
するピークに基づく検量曲線を用いて計算した。
するピークに基づく検量曲線を用いて計算した。
マンノースに対するアセテート及びビルベートのモル比
を表２に示す。
を表２に示す。
表２
マンノースに対するアセテート及びビルベートのモル比
Ｘ１３９６ ＋ Ｘ１３９７ ＋ ＸＦ９８ ＋ Ｘ１３９９ ＋ Ｘ１４００ Ｘ１４０１ Ｘ１４０２ ＋ ＋ ＋ 十 ＋ ０．６６ １．０１ ＋ ０．６３ ０．５１ ＋ ０．１０ ０．４７ ＋ Ｏ．ＯＱ ０．４３ ０．００ ０，３Ｇ ０．００ ０．３９ ０．００ ０．３７ 表２に示したデータについて以下の観察を行なう。
Ｘ１３９６ ＋ Ｘ１３９７ ＋ ＸＦ９８ ＋ Ｘ１３９９ ＋ Ｘ１４００ Ｘ１４０１ Ｘ１４０２ ＋ ＋ ＋ 十 ＋ ０．６６ １．０１ ＋ ０．６３ ０．５１ ＋ ０．１０ ０．４７ ＋ Ｏ．ＯＱ ０．４３ ０．００ ０，３Ｇ ０．００ ０．３９ ０．００ ０．３７ 表２に示したデータについて以下の観察を行なう。
１．遺伝子Ｆ内の６６０ｂｐ欠失は遺伝子Ｆ蛋白賞（ア
セチラーゼ■）を不活性化した， Ｘ１４０２対Ｘ１３
９８参照。
セチラーゼ■）を不活性化した， Ｘ１４０２対Ｘ１３
９８参照。
２．遺伝子Ｇ蛋白質（アセチラーゼ■）はキサンタンを
アセチル化し、カタラーゼが活性である場合野生タイプ
とくらべ低レベルである。例４に記載のＸ１４００対χ
１３９６参照。
アセチル化し、カタラーゼが活性である場合野生タイプ
とくらべ低レベルである。例４に記載のＸ１４００対χ
１３９６参照。
３，ケタラーゼが不活性化された場合、アセチラーゼ■
によるアセチル化は劇的に増す（Ｘ１４００対Ｘ１４０
１） ４． アセチラーゼＩによるアセチル化の程度はケタラ
ーゼの不活性化に対応して増加しない。例４ （７）
Ｘ１３９８対Ｘ１３９９参照。
によるアセチル化は劇的に増す（Ｘ１４００対Ｘ１４０
１） ４． アセチラーゼＩによるアセチル化の程度はケタラ
ーゼの不活性化に対応して増加しない。例４ （７）
Ｘ１３９８対Ｘ１３９９参照。
５． ピルビル化はアセチル化の程度にかかわらずそれ
ほど変わらない。例４のＸ１３９６．Ｘ１３９Ｂ， Ｘ
１４００，及びＸ１４０２参照。
ほど変わらない。例４のＸ１３９６．Ｘ１３９Ｂ， Ｘ
１４００，及びＸ１４０２参照。
このデータは、遺伝子Ｇ蛋白質（アセチラーゼ■）がキ
サンタンの外部マンノースのアセチル化を触媒すること
を示している。これはケタラーゼが活性である場合限ら
れた程度におこるがケタラーゼー変異体では劇的に増す
と考えられる。このデータは、ピルビル化がアセチル化
をブロックするが、アセチル化のレベルにかかわらずピ
ルビル化が変化しないので逆は真でないことを示してい
る。遺伝子Ｆ蛋白質（アセチラーゼＩ）は内部マンノー
スのみのアセチル化を触媒し、米国特許第４．７１３．
４４９号及び米国出願番号第８４４，３３５号のキサン
タンのポリトリマー及びトリテトラマー変異体に対する
データは、ケタラーゼが外部マンノースのみのピルビル
化を触媒することを示している。
サンタンの外部マンノースのアセチル化を触媒すること
を示している。これはケタラーゼが活性である場合限ら
れた程度におこるがケタラーゼー変異体では劇的に増す
と考えられる。このデータは、ピルビル化がアセチル化
をブロックするが、アセチル化のレベルにかかわらずピ
ルビル化が変化しないので逆は真でないことを示してい
る。遺伝子Ｆ蛋白質（アセチラーゼＩ）は内部マンノー
スのみのアセチル化を触媒し、米国特許第４．７１３．
４４９号及び米国出願番号第８４４，３３５号のキサン
タンのポリトリマー及びトリテトラマー変異体に対する
データは、ケタラーゼが外部マンノースのみのピルビル
化を触媒することを示している。
班主
この例は、ｇｐＧ （アセチラーゼ■）がキサンタン繰
り返し単位の内部マンノースのアセチル化を触媒しない
ことを示す。
り返し単位の内部マンノースのアセチル化を触媒しない
ことを示す。
ガム遺伝子クラスタ一の遺伝子■はトランスフエラーゼ
Ｖをコード化し（第１図）、酵素はキサンタン生合成に
おいてマンノースを脂質結合した四糖中間体に加える。
Ｖをコード化し（第１図）、酵素はキサンタン生合成に
おいてマンノースを脂質結合した四糖中間体に加える。
このシステムは米国特許第４．７１３，４４９号に記載
されている。遺伝子■を不活性化する変異は脂質結合し
た四糖を合成する。この四糖繰り返し単位は重合されポ
リテトラマーガムを与え、これはその通常の結合に内部
マンノースを含むがキサンタンガムに通常みられる外部
マンノースを欠いている（第４図）．遺伝子■内に挿入
変異を及び遺伝子Ｆ内にＣｌａ Ｉ欠失変異を含む重複
変異体ブラスミド、ｐＫＢｍ２ｄｅｌｃｌａを構或した
（第５図参照）。この重複変異体プラスミドｐＫＢｍ２
ｄｅｌｃ１ａをその染色体中にガム遺伝子Ｂ及びＣのみ
を含むＸ，ｃａｎ ｅｓｔｒｉｓ欠失株Ｘ１１０６に変
えた。
されている。遺伝子■を不活性化する変異は脂質結合し
た四糖を合成する。この四糖繰り返し単位は重合されポ
リテトラマーガムを与え、これはその通常の結合に内部
マンノースを含むがキサンタンガムに通常みられる外部
マンノースを欠いている（第４図）．遺伝子■内に挿入
変異を及び遺伝子Ｆ内にＣｌａ Ｉ欠失変異を含む重複
変異体ブラスミド、ｐＫＢｍ２ｄｅｌｃｌａを構或した
（第５図参照）。この重複変異体プラスミドｐＫＢｍ２
ｄｅｌｃ１ａをその染色体中にガム遺伝子Ｂ及びＣのみ
を含むＸ，ｃａｎ ｅｓｔｒｉｓ欠失株Ｘ１１０６に変
えた。
ｐＲＫ２９０−ＨＡ３より得られる変異体プラスミドは
ＢもしくはＣを有しないが、残りのガム遺伝子、Ｄ〜Ｍ
をすべて含むので遺伝子Ｂ及びＣは染色体より提供され
る。得られる株、Ｘ１１０６（ｐＫＢａ＋２ｄｅｌｃ１
ａ）又はＸ１４１９をポリマー組戒について２回分析し
た。
ＢもしくはＣを有しないが、残りのガム遺伝子、Ｄ〜Ｍ
をすべて含むので遺伝子Ｂ及びＣは染色体より提供され
る。得られる株、Ｘ１１０６（ｐＫＢａ＋２ｄｅｌｃ１
ａ）又はＸ１４１９をポリマー組戒について２回分析し
た。
両方の分析ともポリマー中のアセテートを検出できなか
った。この結果は、アセチラーゼ■がポリテトラマーの
内部マンノースをアセチル化できないことを示している
。この変異体株において、遺伝子Ｇが変異されておらず
、遺伝子Ｆ変異が遺伝子Ｇの発現に影響を与えないと示
された非極性Ｃｌａ Ｉ欠失であるのでアセチラーゼ■
は活性である。
った。この結果は、アセチラーゼ■がポリテトラマーの
内部マンノースをアセチル化できないことを示している
。この変異体株において、遺伝子Ｇが変異されておらず
、遺伝子Ｆ変異が遺伝子Ｇの発現に影響を与えないと示
された非極性Ｃｌａ Ｉ欠失であるのでアセチラーゼ■
は活性である。
班土
この例は、キサンタンガムの五糖繰り返し単位のアセチ
ル化及びピルビル化の遺伝子調節により形成される多糖
族を含む繰り返し単位を説明する．この繰り返し単位の
構造を第６図に示す。
ル化及びピルビル化の遺伝子調節により形成される多糖
族を含む繰り返し単位を説明する．この繰り返し単位の
構造を第６図に示す。
（ａ）野生タイプ（Ｘ１３９６） ；アセチラーゼ■
−アセチラーゼ■“、ケタラーゼ“ 通常のキサンタンを内部マンノース残基において広くア
セチル化し、外部マンノース残基においてピルビル化す
る。一般的な考えに反し、通常のキサンタンの十分な割
合（１０〜２０％）の外部マンノース残基がアセチル化
される。従って、通常のキサンタン繰り返し単位は外部
マンノースの改良に関し外生である。
−アセチラーゼ■“、ケタラーゼ“ 通常のキサンタンを内部マンノース残基において広くア
セチル化し、外部マンノース残基においてピルビル化す
る。一般的な考えに反し、通常のキサンタンの十分な割
合（１０〜２０％）の外部マンノース残基がアセチル化
される。従って、通常のキサンタン繰り返し単位は外部
マンノースの改良に関し外生である。
（ｂ） Ｌ− （Ｘ１３９７） ；アセチラーゼＩ
＋、アセチラーゼＩＩ ＋、ケタラーゼー このポリマーはピルベートを含まず、結果として外部マ
ンノース残基においてかなりアセチル化されている。内
部マンノース残基は野生タイプと同様かなりアセチル化
されている． （ｃ ） Ｇ− （Ｘ１３９８） ； ７セチ’ｔ−
セＩ” 、７セチラーゼ■−、ケタラーゼ１ このポリマーは野生タイプと同様内部マンノースにおい
てかなりアセチル化されており、外部マンノースは野生
タイプと同様ピルビル化されている。しかし、外部マン
ノースはアセチル化されていない。
＋、アセチラーゼＩＩ ＋、ケタラーゼー このポリマーはピルベートを含まず、結果として外部マ
ンノース残基においてかなりアセチル化されている。内
部マンノース残基は野生タイプと同様かなりアセチル化
されている． （ｃ ） Ｇ− （Ｘ１３９８） ； ７セチ’ｔ−
セＩ” 、７セチラーゼ■−、ケタラーゼ１ このポリマーは野生タイプと同様内部マンノースにおい
てかなりアセチル化されており、外部マンノースは野生
タイプと同様ピルビル化されている。しかし、外部マン
ノースはアセチル化されていない。
（ｄ） Ｇ− ， Ｌ− （Ｘ１３９９） ；アセ
チラーゼＩ゜アセチラーゼ■−、ケタラーゼ このポリマーは内部マンノースの高レベル野生タイプア
セチル化を有するが、外部マンノースは未改良である。
チラーゼＩ゜アセチラーゼ■−、ケタラーゼ このポリマーは内部マンノースの高レベル野生タイプア
セチル化を有するが、外部マンノースは未改良である。
（ｅ） Ｆ− （Ｘ１４００） ；アセチラーゼＩ−
、アセチラーゼ■゛、ケタラーゼ“ このポリマーは内部マンノースは未改良であるが、外部
マンノースは野生タイプと同様に改良されている。すな
わち、外部マンノースはピルビル化されているが、外部
マンノース残基の多くは十分アセチル化されている。
、アセチラーゼ■゛、ケタラーゼ“ このポリマーは内部マンノースは未改良であるが、外部
マンノースは野生タイプと同様に改良されている。すな
わち、外部マンノースはピルビル化されているが、外部
マンノース残基の多くは十分アセチル化されている。
（ ｆ ） Ｆ− ， Ｌ−（Ｘ１４０１） ；
７セチラーゼ！アセチラーゼ■゜、ケタラーゼ このポリマーは未改良内部マンノースを含む。
７セチラーゼ！アセチラーゼ■゜、ケタラーゼ このポリマーは未改良内部マンノースを含む。
外部マンノースはピルビル化されていないが、かなりア
セチル化されている。
セチル化されている。
（ｇ） Ｆ− ， Ｇ− （Ｘ１４０２） ；アセ
チラーゼＩ−アセチラーゼ■一、ケタラーゼ１ このポリマーは内部又は外部マンノース残基のいずれに
おいてもアセチル化されていない．外部マンノースのピ
ルビル化は通常野生タイプと同様におこる。
チラーゼＩ−アセチラーゼ■一、ケタラーゼ１ このポリマーは内部又は外部マンノース残基のいずれに
おいてもアセチル化されていない．外部マンノースのピ
ルビル化は通常野生タイプと同様におこる。
（ｈ） Ｆ− ， Ｇ− ． Ｌ− （Ｘ１４０３
〕 ｉ ７セチラーゼＩ−、アセチラーゼ■−、ケタ
ラーゼーこのポリマーはアセテート又はピルベートを含
まない。内部又は外部マンノース残基のいずれも改良さ
れていない。
〕 ｉ ７セチラーゼＩ−、アセチラーゼ■−、ケタ
ラーゼーこのポリマーはアセテート又はピルベートを含
まない。内部又は外部マンノース残基のいずれも改良さ
れていない。
第１ａ図は、キサンタンの生合或に必要な１２個の遺伝
子のクラスターを含むム■肛聾江ｎの染色体の１６ｋｂ
部位のＢａｍＨＩ制限マップを示し、及びＢａｍＨＩ制
限マップに対するこの１２個の遺伝子の適当な位置を示
す図である。 第１ｂ図は遺伝子Ｆ及びＧ内の制限サイト、並びに遺伝
子Ｆ及びＧの接点におけるＤＮＡ配列を示す図である。 第２図は、ガム遺伝子クラスタ一の遺伝子Ｆ内の欠失変
異（ｄｅｌｃ１ａ）の構成を示す図である。 第３ａ図はブラスミドｐＲＫ２９０−Ｈ３３６由来のプ
ラスミドｐｌ３ｄｅｌｃ１ａの構造を示す図である。 第３ｂ図はプラスミドｐＨ３３６ＫＢｍｌｄｅｌｃ１ａ
の構造を示す図である。 第４図は、キサンタンガムのポリテトラマ一変異体の繰
り返し単位の化学構造を示す図である。 第５ａ図は、ｐＲＫ２９０−｝ＩＡ３由来のブラスミド
ｐＨＡ３ＫＢｍ２ｄｅｌｃｌａの構造を示す図である。 第５ｂ図はＸ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ株Ｘ１１０６に存
在する染色体欠失変異の程度を示す図である。 第６図は、野生タイプＸ．ｃａｍ ｅｓｔｒｉｓ並びに
遺伝子Ｆ ， Ｃ，もしくはＬの変異欠失及びこれらす
べての可能な組み合せにより形成された多糖の繰り返し
単位の構造を示す図である。 遺伝子下内の欠失変異の構成 ＦＩＧ．５ｂ 〈 １４０３により形成される
子のクラスターを含むム■肛聾江ｎの染色体の１６ｋｂ
部位のＢａｍＨＩ制限マップを示し、及びＢａｍＨＩ制
限マップに対するこの１２個の遺伝子の適当な位置を示
す図である。 第１ｂ図は遺伝子Ｆ及びＧ内の制限サイト、並びに遺伝
子Ｆ及びＧの接点におけるＤＮＡ配列を示す図である。 第２図は、ガム遺伝子クラスタ一の遺伝子Ｆ内の欠失変
異（ｄｅｌｃ１ａ）の構成を示す図である。 第３ａ図はブラスミドｐＲＫ２９０−Ｈ３３６由来のプ
ラスミドｐｌ３ｄｅｌｃ１ａの構造を示す図である。 第３ｂ図はプラスミドｐＨ３３６ＫＢｍｌｄｅｌｃ１ａ
の構造を示す図である。 第４図は、キサンタンガムのポリテトラマ一変異体の繰
り返し単位の化学構造を示す図である。 第５ａ図は、ｐＲＫ２９０−｝ＩＡ３由来のブラスミド
ｐＨＡ３ＫＢｍ２ｄｅｌｃｌａの構造を示す図である。 第５ｂ図はＸ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ株Ｘ１１０６に存
在する染色体欠失変異の程度を示す図である。 第６図は、野生タイプＸ．ｃａｍ ｅｓｔｒｉｓ並びに
遺伝子Ｆ ， Ｃ，もしくはＬの変異欠失及びこれらす
べての可能な組み合せにより形成された多糖の繰り返し
単位の構造を示す図である。 遺伝子下内の欠失変異の構成 ＦＩＧ．５ｂ 〈 １４０３により形成される
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、約２：２：１のＤ−グルコース：Ｄ−マンノース：
Ｄ−グルクロン酸比を有する水溶性多糖ポリマーを含む
組成物（Ｄ−グルコース成分はベーター〔１，４〕配置
で結合し、内部マンノース成分は通常グルコース成分に
交互にアルファー〔１，３〕配置で結合し、Ｄ−グルク
ロン酸成分は前記内部マンノース成分にベーター〔１，
２〕配置で結合し、外部マンノース成分はベーター〔１
，４〕配置で前記グルクロン酸成分に結合している）。 ２、前記内部マンノース成分がアセチル化されている、
請求項１記載の組成物。 ３、前記外部マンノース成分がアセチル化されている、
請求項２記載の組成物。 ４、前記外部マンノース成分の一部がピルビル化され、
残りがアセチル化されている、請求項１記載の組成物。 ５、前記外部マンノース成分の実質的すべてがピルビル
化されている、請求項２記載の組成物。 ６、前記外部マンノース成分がピルビル化されている、
請求項１記載の組成物。 ７、前記外部マンノース成分がアセチル化されている、
請求項１記載の組成物。 ８、内部マンノースにおいてアセチル化されておらず及
び外部マンノースにおいてアセチル化されておらずピル
ビル化されていない請求項１記載の多糖ポリマーを合成
できるキサントモナス（￥Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）￥
属の微生物を好適な増殖培地に接種すること、並びに 好適な温度、ｐＨ及び溶解酸素レベルにおいて請求項１
記載の多糖ポリマーを形成するに十分な時間前記接種し
た増殖培地をインキュベートすること、 を含む、請求項１記載の多糖ポリマーの製造方法。 ９、内部マンノースにおいてアセチル化されており及び
外部マンノースにおいてアセチル化されておらずピルビ
ル化されていない請求項２記載の多糖ポリマーを合成で
きるキサントモナス （￥Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）￥属の微生物を好適な増
殖培地に接種すること、並びに 好適な温度、ｐＨ及び溶解酸素レベルにおいて請求項２
記載の多糖ポリマーを形成するに十分な時間前記接種し
た増殖培地をインキュベートすること、 を含む、請求項２記載の多糖ポリマーの製造方法。 １０、内部マンノースにおいてアセチル化されており及
び外部マンノースにおいてアセチル化されておりピルビ
ル化されていない請求項３記載の多糖ポリマーを合成で
きるキサントモナス （￥Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）￥属の微生物を好適な増
殖培地に接種すること、並びに 好適な温度、ｐＨ及び溶解酸素レベルにおいて請求項３
記載の多糖ポリマーを形成するに十分な時間前記接種し
た増殖培地をインキュベートすること、 を含む、請求項３記載の多糖ポリマーの製造方法。 １１、内部マンノースにおいてアセチル化されておらず
及び外部マンノースにおいてアセチル化されておりピル
ビル化されている請求項４記載の多糖ポリマーを合成で
きるキサントモナス （￥Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）￥属の微生物を好適な増
殖培地に接種すること、並びに 好適な温度、ｐＨ及び溶解酸素レベルにおいて請求項４
記載の多糖ポリマーを形成するに十分な時間前記接種し
た増殖培地をインキュベートすること、 を含む、請求項４記載の多糖ポリマーの製造方法。 １２、内部マンノースにおいてアセチル化されており及
び外部マンノースにおいてアセチル化されていないがピ
ルビル化されている請求項５記載の多糖ポリマーを合成
できるキサントモナス （￥Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）￥属の微生物を好適な増
殖培地に接種すること、並びに 好適な温度、ｐＨ及び溶解酸素レベルにおいて請求項５
記載の多糖ポリマーを形成するに十分な時間前記接種し
た増殖培地をインキュベートすること、 を含む、請求項５記載の多糖ポリマーの製造方法。 １３、内部マンノースにおいてアセチル化されておらず
及び外部マンノースにおいてアセチル化されていないが
ピルビル化されている請求項６記載の多塘ポリマーを合
成できるキサントモナス（￥Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）
￥属の微生物を好適な増殖培地に接種すること、並びに 好適な温度、ｐＨ及び溶解酸素レベルにおいて請求項６
記載の多糖ポリマーを形成するに十分な時間前記接種し
た増殖培地をインキュベートすること、 を含む、請求項６記載の多糖ポリマーの製造方法。 １４、内部マンノースにおいてアセチル化されておらず
及び外部マンノースにおいてアセチル化されているがピ
ルビル化されていない請求項７記載の多糖ポリマーを合
成できるキサントモナス（￥Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）
￥属の微生物を好適な増殖培地に接種すること、並びに 好適な温度、ｐＨ及び溶解酸素レベルにおいて請求項７
記載の多糖ポリマーを形成するに十分な時間前記接種し
た増殖培地をインキュベートすること、 を含む、請求項７記載の多糖ポリマーの製造方法。 １５、前記微生物が￥Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐ
ｅｓｔｒｉｓ￥の欠失変異体ケタラーゼ、アセチラーゼ
I 、及びアセチラーゼIIである、請求項８記載の方法
。 １６、前記微生物が￥Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐ
ｅｓｔｒｉｓ￥の欠失変異体ケタラーゼ及びアセチラー
ゼIIである、請求項９記載の方法。 １７、前記微生物が￥Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐ
ｅｓｔｒｉｓ￥の欠失変異体ケタラーゼである、請求項
１０記載の方法。 １８、前記微生物が￥Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐ
ｅｓｔｒｉｓ￥の欠失変異体アセチラーゼ I である、
請求項１１記載の方法。 １９、前記微生物が￥Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐ
ｅｓｔｒｉｓ￥の欠失変異体アセチラーゼIIである、請
求項１２記載の方法。 ２０、前記微生物が￥Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐ
ｅｓｔｒｉｓ￥の欠失変異体アセチラーゼ I 及びアセ
チラーゼIIである、請求項１３記載の方法。 ２１、前記微生物が￥Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐ
ｅｓｔｒｉｓ￥の欠失変異体アセチラーゼ I 及びケタ
ラーゼである、請求項１４記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US38462189A | 1989-07-25 | 1989-07-25 | |
| US384621 | 1989-07-25 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03164143A true JPH03164143A (ja) | 1991-07-16 |
| JP3560968B2 JP3560968B2 (ja) | 2004-09-02 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19507390A Expired - Lifetime JP3560968B2 (ja) | 1989-07-25 | 1990-07-25 | キサンタンガムのアセチル化及びピルビル化の遺伝子調節 |
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| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0410326B1 (ja) |
| JP (1) | JP3560968B2 (ja) |
| AT (1) | ATE172498T1 (ja) |
| CA (1) | CA2021414C (ja) |
| DE (1) | DE69032707T2 (ja) |
| DK (1) | DK0410326T3 (ja) |
| ES (1) | ES2125850T3 (ja) |
| FI (1) | FI903716A7 (ja) |
| NO (1) | NO300852B1 (ja) |
| SG (1) | SG49227A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7923231B2 (en) * | 2004-12-17 | 2011-04-12 | Cargill, Incorporated | Production of glucuronic acid using myo-inositol oxygenase from cryptococcus neoformans |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69233141T2 (de) * | 1991-05-07 | 2004-04-08 | Pharmacia Corp.(N.D.Ges.D.Staates Delaware) | Genetische kontrolle zur acetylierung von polysacchariden der art xanthan |
| US6174524B1 (en) | 1999-03-26 | 2001-01-16 | Alcon Laboratories, Inc. | Gelling ophthalmic compositions containing xanthan gum |
| US6261547B1 (en) | 1998-04-07 | 2001-07-17 | Alcon Manufacturing, Ltd. | Gelling ophthalmic compositions containing xanthan gum |
| PT1225898E (pt) | 1999-11-01 | 2003-10-31 | Alcon Inc | Composicoes farmaceuticas contendo um farmaco antibiotico de fluoroquinolona e goma xantana |
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|---|---|---|---|---|
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-
1990
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- 1990-07-20 DK DK90113985T patent/DK0410326T3/da active
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- 1990-07-24 NO NO903283A patent/NO300852B1/no not_active IP Right Cessation
- 1990-07-25 JP JP19507390A patent/JP3560968B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7923231B2 (en) * | 2004-12-17 | 2011-04-12 | Cargill, Incorporated | Production of glucuronic acid using myo-inositol oxygenase from cryptococcus neoformans |
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