JPH03164165A - 細胞培養装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［技術分野］ 本発明は半透性の中空繊維を使用して細胞をインビトロ
で生育するための細胞培養装置に関する。

［従来の技術］ 米国特許第３８２１０８７号及び第３８８３３９３号に
は、培養室で細胞を培養することが記載されている。

その培養室には半透性の中空繊維の束が通されており、
酸素含有栄養素溶液がそこを流れる。酸素と栄養素は、
流動する富酸素化した栄養素媒体から、半透性の細胞膜
を通って培養室内に拡散し、一方、細胞老廃物、例えば
乳酸と、所望生成物、例えばホルモンは、培養室から繊
維の壁を通過して流動する溶液中に拡散する。これら従
来装置の目的は、器官状構造の製造を目論んで、半透性
繊維に付着させて細胞を三次元層に生育させることにあ
る。

公知の中空繊維培養システムに於いては、培養液のｐｌ
ｌを維持する上で重炭酸塩緩衝液を含む培地を使用する
のが通例である。しかし、この緩衝系の能力には限界が
あり、実際にこの緩衝系では特に静的な培養域でｐｌｌ
勾配が発生する。これに加えて、従来装置の栄養素の流
れは、培養生育に必要な酸素の搬送体でもあるので、水
溶岐中への酸素の溶解量が不足すると、培養液は繊維束
の入口端に向けて酸素が涸渇するようになる。また、こ
の栄養素の流れは、培養液から膜を通って拡散する乳酸
塩のような代謝老廃物を除去するための搬送体ともなる
の、で、その様な代謝産物の量を許容範囲内に維持する
には、栄養媒体を連続的に除去しなければならない。こ
のため、高価な栄養媒体が徒費される。

［発明の詳述］ 本発明の目的は、従来装置と同タイプであるが、従来装
置の上記したような問題点を伴うことがなく、しかも、
より一層融通性ある培養条件の調節を可能にする細胞培
養装置を提供することにある。

従って、本発明に係る細胞培養装置は、栄養素及び接種
細胞の導入口と、培養された細胞及び細胞生成物の排出
口を備え、波状培地で製造を培養するチャンバーと、 前記のチャンバー内に収められた中空の半透性繊維束か
らなり、水性流体流を通過させるための入口と、培養細
胞生成物を除去するための出口を備え、生成物を繊維壁
を通して細胞培地から繊維内を流れる流体流に移行させ
るのに使用される第１の繊維束と、 前記のチャンバー内に収められた中空の半道性繊維束か
らなり、富酸素化されたガス流の入口を備え、中空繊維
の壁を介して酸素含有ガス流を培地内に適し、ガス状老
廃物を培地からガス流に通すために使用される第２の繊
維束、とからなる。

ここで「束」とは、適当な任意の構造に繊維が配列され
たものを意味する。

透析流としても作用する水性流体は、栄養素液を含有し
ている。

本発明の一具体例では、チャンバーは実質的に円筒状で
あって、第１及び第２の繊維束はそのチャンバー内を横
切って、第１の繊維束が第２の繊維束の上方に平行に配
列されるよう、配置されている。一般に、下方の束をガ
ス移送繊維で構或させることが好ましい。別法として第
１及び第２の繊維束を、酸素と栄養素が繊維の回りの栄
養素媒体にできる限り均一に供給され、濃度勾配が最少
になるように、親密に混或させることもできる。

第２の具体例では培養チャンバーは実質的に四角形で、
適当な形状のガスケットで分離された一連のプレートか
らなる。一連のプレートは頂部プレートと底部プレート
との間で、タイロッドにより互いに締付けられる。各プ
レートの中央開口部には、そこを横切って第１又は第２
の繊維束の層が平行に張設され、繊維の端部は適当な重
合体エラストマーボッティング（固定）化合物により固
定される。繊維の管孔はプレートに形成されたマニホル
ドチャンネルにより、入口及び出口に接続される。これ
らのチャンネルはプレートの間で相互に接続され、第１
及び第２繊維束に対して別々の入口及び出口を形成する
。好ましくはプレートは交互に配列され、その数は反応
器の容積を決定する。さらにまた、各プレートを二つの
タイプの繊維が二つの平行な層を成して含まれるように
構或することも可能であって、この場合は各プレートの
上表面及び下表面に別々の、恐らくジクザク形のマニホ
ルドチャンネルが形成される。つまり、各プレートは二
つの繊維について別々の入口と出口を持ち、これらの入
口と出口は他の全てのプレートの入口と出口と相互に接
続され、直列又は並列で繊維の集合体が形或されるよう
に配置することができる。

第３の具体例では、第１及び第２の繊維束が実質的に垂
直方向に配列される。通常、各タイプの繊維は交互に単
一層と・して配列され、各タイプの繊維について共通の
入口と出口を持った単一ユニットを形成するように結合
される。この配置によれば、繊維の構造的正確度が向上
し、実質的に自己支持可能なマトリックスとなる。繊維
は他の繊維に対してＯ〜９０度のいずれかの角度で配置
することも可能である。二つ以上の繊維束を使用する場
合、これらは通常同じ角度で配置される。

本発明に於いては、必須の栄養素の大部分が第１繊維束
を経て間接的に、あるいは直接培養チャンバーに供給さ
れる。第２のケースでは、栄養素溶液の一部としてチャ
ンバーに供給される液体を補償するために、半透性の第
１繊維束を通る正味の流出流がある。この正味の流出流
があると、細胞がはとうせい繊維の細孔に詰って液体の
通過を閉塞ないしは妨害するので、ある種の繊維構造で
は不都合を起こす。従って、チャンバー内に中空で半透
性の第３の繊維束を設け、純粋な拡散移送により栄養素
を培地に供給するのが有利である。

栄養素は次いで繊維の壁を通って培地に拡散する。

この方法では繊維の壁を通過する液体の正味のバルク流
はない。別法として、繊維のタイプと細孔径を正しく選
ぶことにより、第３の繊維束を使用して、培養中の細胞
系が必要とする完全な栄養素を培地に供給し、同時に第
１の繊維束と同じように、高分子量の代謝物と生成物を
培養液から除去することも可能である。

第１の束の繊維は一般に親水性の半透性膜材料からなり
、このものは繊維の内側に主要な膜面を有し、外層が海
綿状である非対称膜構造を有している。典型的には、こ
の繊維はポリスルホンから製造され、適当には親水性膜
を形成されるよう処理されている。細孔径及び分子量分
画が同一又は相違する同様な材料が、任意に使用される
第３の繊維束に使用できる。富酸素化ガス流用の第２繊
維束は、好ましくは疎水性で多孔性の材料、取りわけポ
リブロブレンから製造される。

第１の具体例に於いて、繊維の長さは１００ＩＩＩ１以
上で、その上限は５００　ＩＩｌｉ程度である。束は典
型的にはｌ００〜１０００本の繊維を含み、繊維の直径
は２８０ミクロン、壁の厚さは４０ミクロンである。全
培養液の容量が約２５０　ｍｌである場合、この束の繊
維表面積対培養液容量の比率は０．５〜５．Ｏｃｊ／Ｉ
１であって、これは従来の装置のそれが約５０ｃｄ／ｌ
１であるのとは対照的である。

第２の好ましい具体例では、繊維がプレートに取付けら
れ、親水性繊維と疎水性繊維とが交互に層状に配列され
る。繊維の長さは第１の具体例と同様であって、表面積
と培養液容量との比率も同様である。この態様では個々
のプレートの正確性をテストでき、また束の中の繊維の
数を変更するのにも便利である。寸法を大型にした場合
には、支持体を使用することもできる。

第３の好ましい具体例での好ましい繊維配列は、親水性
繊維の層と疎水性繊維の層とを交互に並べたマトリック
スであって、この場合、培養液はこのマトリックスに対
して直角に移動する。この装置に於ける繊維表面積対培
養容積の比率は、典型的には第１具体例の場合と同様で
あるが、混合様式が可変であることから、より短い繊維
を、例えば５０〜２５０ｆｆｌ−の繊維を使用すること
もできる。

ｐｌｌ調節のためには、酸素含有ガスに炭酸ガスを含ま
せることが有効である。本発明の装置にはまた、適当な
ｐｈ計と温度計を付設することができ、さらに培地への
細胞の接種及びサンプリングのための開口部を設けるこ
とができる。

本発明の装置は細胞自体の生育に使用できる外、酵素、
ホルモン、モノクローナル抗体等の細胞内又は細胞内生
成物を得るための細胞の培養にも使用することができる
。細胞生戊物には好ましくない低分子量の生成物も含ま
れるが、これらは流通する液体流に送られる。これらの
老廃物は、水性流体流、典型的には水又は等浸透圧の塩
水溶液を親水性繊維束の管孔に流すことにより、透析で
除去される。必要に応じて、この水性液体には越礎栄養
素媒体を含ませても差支えない。望ましい細胞生成物は
培地内に保持することもできれば、半透性繊維の細孔径
を適当に選択することにより、流通液体流に拡散させる
こともできる。

炭酸ガスやアンモニアのような望ましくないガス状老廃
物は、第２の繊維束に除去される。

培養チャンバー内に均質条件を確保し、装置内の物質移
動特性を改善するために、本発明の装置には繊維束に対
して培養液を動かすための混合機を取付けてガス及び液
状栄養素と生成物の移動を改善することが好ましい。最
初の二つの具体例では、チャンバーは部分的に培地で満
たされているだけなので、チャンバーを横方向又は水平
方向に動かす（例えば毎分８〜３０回）振動装置を設け
ることができる。培養液上部の空間は、培養液を温和に
動かすことを可能にするので、細胞を損傷することがな
い。そして、培地上部の空間は外部から遮断されている
ので、その容積は内部圧力と栄養素ラインの静水圧との
バランスによって、一定に保持される。最初の二つの具
体例での混合方法は、噛乳類細胞を成功裡に培養するに
必要な低剪断を提供し，、内部攪袢の必要性を排除する
。これ以外の振動メカニズムも採用可能である。

さらに好ましい具体例では、繊維の両側に変型可能な細
胞膜が設けられる。この細胞膜は同時に内側及び外側に
動けるよう配置され、これにより液状培地は静止してい
る繊維束に強制的に通過せしめられる。細胞膜は、例え
ば０．２５〜１ヘルツで作動する適当な往復運動式波圧
メカニズムに取付けることにより、一斉に変型させるこ
とができる。

本発明の重要な利点は、ガスと栄養素流が、従来技術と
は対照的に、分かれていることである。

このことはガスと栄養素流の個別調節を可能にし、従っ
て培地の組成調節に容易にする。培地に炭酸ガスを均一
に導入できることは、培地内の好ましくないｐｎ勾配の
発生を軽減させる。さらに、混合手段はチャンバー内及
び主要な流れの組成を実質．的に均質にするので、これ
らを個々に取扱うことができ、従って、使用する栄養素
供給流の濃縮を可能にする。単一の繊維束を使用する従
来の装置では、再循環させる栄養素溶液に酸素と炭酸ガ
スを供給するためには、分離装置を必要としたが、本発
明ではその必要がなく、単一構造とすることができる。

本発明の培養装置は大量生産に適し、洗浄及び再消毒を
必要としない使い捨て装置に適している。

本発明の具体例を添附図面を参照しながら、以下に記述
する。

第１図に略図的に示す細胞培養装置は、坐化学的に和合
性を持つ適当な材料で作成された剛性管体、すなわち平
行に隣接したチャンバー１からなり、その両端は端板２
，３で密封されている。チャンバーの下側には緩く結束
された２木の中空半透性繊維束５．７が収められ、これ
らは両方の端板を通過してチャンバーの全長に亘って伸
びている。２本の束は上下に配置され、上方は透析液体
（及び任意的に栄養素）用の親水性繊維束であり、下方
は富酸素化ガス用の疎水性繊維束である。チャンバーの
下の振動テーブル（図示略）から与えられるチャンバー
の温和な振動の下に、細胞と培地が自由に繊維の周囲を
循環できるように、各繊維は相互に間隔を保っている。

中空の繊維束は、適当な重合体エラストマーによって、
例えば医薬級のポリウレタンによって、チャンバーの端
板に気体及び液体が漏洩しないよう取付けられる。つま
り、繊維束内に液体と気体を圧送できるよう、中空繊維
は外部回路と接続される。

チャンバーにはまた、栄養液の入口９とサンプリング口
Ｌ１が設けられており、細胞の導入又は培地のサンプリ
ングに際しては、注射器又は他の試料採取具がこのサン
プリング口に挿入される。チャンバーは振動攪拌ができ
るように半分だけが培地で満たされる。

第１の繊維束５は典型的には２４０問の長さ（繊維数約
３００〜８００本）にあり、塩水及び任意的な栄養液の
入口１５と、細胞生成物を含有する溶液の出口ｌ６を備
え、細胞生成物含有溶液はラインｌ７から吹出し弁１８
に流れ、ここに於いてその一部は抜出され、残部はライ
ン１９を経て透析物貯Ｗ４２０に戻される。メイクアツ
ブ透析物流２１は、フィルター２７を通して貯槽２０に
供給され、これにより抜出し分が補充される。透析物は
ボンブ２２及びライン２３を経由して、八口１５に循環
される。

酸素と炭酸ガスを供給するための中空半透性繊維の第２
の束７（繊維数約１００本）は、入口２６とバクテリア
フィルター２５で保護された出口２４を備えている。適
当な加圧供給源からの空気／酸素流は、培地のｐＨに依
拠するｐＨＩｌ節器（図示略）にて作動されるソレノイ
ド弁で調節ざれた加圧二酸化炭素流と混合される。

この混合流はフィルター３０を通過し、ライン３２を経
て入口２６に送られる。出口２４からのガスは殺菌泡箱
（図示略）を経て、好ましくは人気中に放出される。培
養チャンバーからの蒸気損失を減少させるために、必要
ならば、繊維の管孔に導入するに先立って、加湿器２８
に通すことも可能である。出口２４からのガスは大気中
に放出される。

装置の組立てには、二つの異なったタイプの中空繊維が
使用される。第１のタイプの中空繊維は這析物と任意の
栄養素を通過させる第１の繊維束５に使用されるもので
、このものは薄い壁を持った親水性の半透性繊維からな
り、ほほ対称的な膜構造と海面状の外層を有している。

定型的には、高い流量の透析膜（ボリスルホン繊維のよ
うな）に使用されると同様な繊維が使用される。これら
の繊維の壁の厚さは約４０ミクロンで、内部の管孔直径
は１８０　ミクロンであり、拡散及び対流により溶質の
移動を許すものである。膜の平均細孔寸法は、培養で得
られた細胞生戊物が培養室に残り、望ましくない低分子
量の細胞代謝物が半透性繊維の壁を通って繊維の管孔を
流れる透析物流に移行できるような寸法に選ばれる。繊
維束の表面積、細孔容積及び壁の厚さは、制御可能な範
囲内で代謝を妨害又は抑制できるよう選定される。

第２のタイプの繊維は、酸素及びＣＯ２を供給するため
の第２繊維束７に使用されるものであって、このものは
疎水性で多孔性の中空繊維で作られている。この繊維は
典型的には多孔性のボリブロピレン製であって、親水性
繊維と同様な寸法を有している。疎水性繊維は培地にガ
ス状栄養素を供給し、液中に溶けた望ましくないガス状
代謝物を除去するために使用される。操作中は空気と二
酸化炭素の混合物が繊維の管孔に送られる。二酸化炭素
は培地のｐｌ１を維持するために、空気に添加されるが
、その添加量は培養条件が所定の範囲に維持されるよう
、培養液のｐＨを直接監視する適当なｐｌｌ調節器によ
り変化させることができる。

新鮮な栄養素用の貯槽（図示略）を用意することもでき
、その貯槽からは新鮮な栄養素が入口９を経て培地に連
続的又は間欠的に供給される。入口９に接続するライン
は、必要に応じて、培養液の一部を時々除去するのにも
使用することができる。チャンバー内の演レベルは、内
部の静水圧が第１繊維束５を流れる液体の流出量が一定
に保持されるまで増大する。

第１図に示す反応器は、オートクレープ中又は加圧下の
回路を通じてスチームで殺菌可能な材料で製造される。

第２〜４図は第１図に示したものと同タイブの第２の具
体例を示し、そこでは再循環される栄養素流用の第２繊
維束が付設されている。第１図と同一部分には同一番号
が付されている。

第１及び第２の繊維束５．７は、それぞれ透析物流とガ
ス流に使用される。中空半透性繊維がらなる第３の束６
は、栄養素溶液貯槽（図示略）と、栄養素溶液を第３繊
維束に再循環するためのポンプに繋れ、これにより栄養
素は半透膜を通って、培地１３に拡散する。繊維の三つ
の束は、培地内での栄養素の濃度勾配が最少になるよう
、親密に混成されている。

開口９はｐｌ１センサー又は温度計用に設けられている
。

第５図は第３の具体例を示し、ここでは２本の繊維束が
直角に配されている。

培養室は二つの半体５０及び５ｌで構成され、各半休に
はそれぞれ端板５２．　５３が設けられている。各端板
はゴム製ダイアフラムでシールされた円形開口を有し、
ダイアフラムは出口５５、　５７が設けられたシリンダ
ー５５の口部を覆っている。出口５５、　５７は一定容
積の往復運動式液圧発生装置（往復運動ピストンのよう
な）に接続されており、ダイアプラムの一方が出っ張る
と、他方が引っ込むので、チャンバー５０．　５１内の
培地は、約５ヘルツの振動数で左右に周期的に移動する
。

二つのチャンバー半体の間の矩形領域６０には、マトリ
ックス６ｌが配され、このマトリックスは直角に並べら
れた２本の繊維束からなる。繊維はマトリックスの厚さ
全体に亘って、交互に配置されている。入口Ｂ２と出口
６３は、垂直方向に配置された第１繊維束用のものであ
る。入口６４と出口６５は水平方向に配置された第２繊
椎束用のものである。

栄養素溶液の入口６Ｂはチャンバー半体５０に設けられ
、ここにはｐｌｌ計６７も設置される。

先の二つの具体例と同様に、栄養素溶液用に第３の繊維
束を追加することもできる。

装置の容量を増大するために、必要に応じて二つもしく
はそれ以上のモジュール方式の矩形領域を組込むことが
できる。

中空繊維を使用する細胞培養装置は、細胞を高濃度で、
例えばＩＩＩ１１当り１０８１１１の細胞を培養するこ
とが可能であって、容量基準で言えば、これは約ｌＯ％
の細胞濃度に相当する。ｐｌ１はガス流の炭酸ガス含量
を調節することによって、７近辺に維持される。培地中
の酸素濃度は飽和濃度の１０〜６０％に調節される。濃
度及びｐｌｌの勾配発生を回避するために、第１及び第
２の具体例では振動テーブルを約１ヘルツで振動させる
が、第３の具体例に於ける脈動チャンバーは、約５ヘル
ツで脈動せしめられる。この装置は長期培養実験に適し
ており、ある細胞系について少なくとも４０日間の培養
を行うのに使用できる。また、この装置は付帯細胞又は
非付帯細胞等の広範囲に亘る細胞の培養に適している。

第７〜８図は、二つのタイプの繊維束を有する円筒状培
養室の端部キャップの詳細を示すものである。

円筒状ハウジング２゛の領域１′には、第７図に示す断
面から明らかなように、繊維束が別の態様で配置されて
いる。予めハウジングの各端部に取付けられている星型
プレートによって、二つの繊維束３′及び４′と５゛は
分離、固定されている。これらのプレートは中央部及び
周辺部に、穴１８゜及びｌ９゜を有し、そこから繊維束
を引きだすことができる。適当な材料の緩い網で作られ
たカプセル７゛は、中央の繊維束３′に設けられる。

これにより外リング内の束４゛５−から中央の繊維束３
′を分離させたり、集中させたりすることができる。ハ
ウジング端部のシール、ボッティング領域での繊維束の
分離及び繊維束と外部媒体回路との接続は、二つの部品
からなるスクリュー式端部キャップ８′によって達成さ
れる。Ｏリング１１’及び１２’を挿入するための二つ
の円形溝は、端部キャップの底部９゛に設けられている
。これらのＯリングは親水性中空繊維束の領域を、ボッ
ティング材料の切断面で疎水性繊維束４゛，５″の領域
から分離すると同時に、ボッティング領域全体を外側か
ら隔絶する。底部部品に於ける凹部｛３”及び１４’は
Ｏリング１１’　と１２’の間と、中央のＯリングｌｌ
゜の中に形成されている。これにより二つの区画を形成
することができる。これらの区画を、対応する液状媒体
用回路とガス状媒体用回路と接続するのは、コネクター
｛５゜とｌ６゜であって、これらは底部部品に挿入され
る。スクリュ一部品ｌＯ゜は旋回ナットのように形威さ
れ、これを捩込むと底部部品９゛をポッティング領域に
押圧する。ボッティング領域は、管状延長部ｌ７により
、部分的に当該領域に進入している足型プレートから、
ハウジング領域の内側に向けて動くことがない。

第８〜９図に示す端部キャップ構造では、第３の別のタ
イプの繊維束を組込むことができる。その配置例では、
Ｏリングｔ１とｌ２゜が゜、取除かれる繊維束の露出端
に対応する断面を有するｑｉーの円形ガスケット２『に
交換されている。端部キャップ部材８′の端部９′には
、切除したガスケットの断面に適合するようネジ付き穴
が形成されている。この方法では、三つ又はそれ以上の
区画が形成され、それらはそれぞれの繊維管孔を外部の
液体回路及びガス回路と接続する。これらの区画と外部
回路との接続は、ネジ付きの管状コネクターで行なわれ
る。端部に作用するネジ部材ｌＯ゜は、ボッティング賄
域１′に対してガスケット２０゜を抑圧する。

二重繊維培養装置の別の変更例は第ｌＯ〜１１図に示さ
れ、それは単一のフレーム１０１から作られたハウジン
グからなる。中空繊維１０２はフレームを横切って張設
され、その端部は適当な重合体エラストマーからなるボ
ッティング化合物で固定される。繊維の開門はマニホル
ドチャンネルＩ０３及び１０４と連絡し、マニホルドチ
ャンネルはボティング領域１２３内に形戊される。予め
チャンネル内に形成した穴１０５及びｌＯ６により、チ
ャンネルを介して適当な媒体を第２のフレームに出入れ
することが可能である。二つのマニホルドチャンネルに
分かれている第２の一対の穴１０７と１０８は、第２の
タイプの繊維を備えた第２フレームへの別の入口となる
。各フレームは第Ｕ図に示すガスケット１０９により、
互いに分離され、シールされている。

そして、各フレームは親水性繊維Ｕｔと疎水性繊維１１
０が交互に位置するよう配置される（第１１図参照）。

こうして組立てられる反応室は、親水性繊維と疎水性繊
維の層が順番に、かつ一様に充填されたものとなる。反
応室の容積はフレームの数によって決定される。フレー
ムはナットとボルト１１５により、頂板１１３と底板１
１４との間に同定され、これによりフレームは互いにし
っかりと圧接される。

頂板及び底板の穴１１８，　１１７，１１８，１１９は
、フレームのマニホルドチャンバーに対する液状媒体及
びガス状媒体の出入りを許容する。この様なフレーム構
造をとると、各フレームを通して媒体を対向流及び斜行
流で通過させることができる。ガスのヘッドスペースを
確保するために、中空繊維を持たないをスペーサフレー
ム１２０が、頂板と第１の中空繊維フレームとの間に設
置され、中空繊維の備えたフレームだけが細胞培養培地
に浸漬するようにする。第１図に示した装置と同様に、
頂板には栄養素溶液の入口１２１とサンプリングロ１２
２が設けられる。

第１２〜１３図に示すような配置では、二つの異なるタ
イプ（例えば親水性と疎水性）の中空繊維１０２’．ｌ
２４゜が、単一のフレーム１０１’を横切って張設され
る。フレームの両端にはフレームの上面及び下面に別々
のボッティング領域が形成される。

このボッティング領域は、第Ｕ図に示すガスケット　１
０９のシーリング面の役目を担うものである。

ボッティング領域にはマニホルドチャンネルｌ０３゜，
１０４’．ｌ２５’及び１２Ｂ’が設けられ、これらは
それぞれ穴１０５゜．１０Ｂ’，１０７’及び１０８′
に接続される。これらの穴は、繊維が直列又は並列で機
能するように、プレートを一つのグループに組立てられ
るよう設けることも可能である。

第１４〜１６図は別の二重繊維プレート構造を示すもの
であって、その構造は次の点を除いて第ｌ２図に示すも
のと同はである。すなわち、この態様ではマニホルドチ
ャンネル１０３゜，ｌ２５゜と１０４゜，１２６゜とが
それぞれの各々の上方に置かれ、チャンネル１３０゜と
１２５゜はウエブ１３０’で分離され、ちゃんねる１０
４゜と１２Ｂ”はウエブ１３１゜で分離されている。そ
の他の参照番号は第１２図のそれと同じである。

培養装置の第５の具体例では、第ｌ７図に示すように、
媒体のポンプが静水圧駆動系に置換されている。第１図
と同様な部品に同じ参照番号が付されている。栄養素溶
液は反応室１の上方に懸垂されているボトル３３に満た
されている。栄養素媒体は親水性の中空繊維５に、シン
グルパスモードで流れ、媒体収集ボトル３４に集められ
る。流量は医療用チューブ点滴と同様に、ローラークラ
ンプ３５及びドリップチャンバー３Ｂで調節される。シ
ングルパスした栄養素溶液の組成が再使用を許すようで
あれば、栄養素媒体を親水性中空繊維に逆方向で循環さ
せることができる。この逆方向流れは、収集ボトル８４
を上昇させ、空のボトル３３を下降させることにより実
現する。この操作は栄養素の組成が再使用に適さなくな
るまで繰返すことができる。第１７図に示す態様によれ
ば、予め殺菌した栄養素溶液にボトルを使用することが
でき、またポンプを用いずに栄養素溶液を移動させるこ
とができる。

第ｌ８図は培養装置の第６の具体例を示し、このものは
先の第５具体例と大部分で同じである（同一部品には同
一番号を使用）が、相違点は当該装置を使用して実施さ
れた以下に述べる実施例で明らかにされる。

実施例１ 第１８図に示すようなポリカーボネート透析／％ウジン
グ１（西独、Ｐｒｅｓｅｎｉｕｓ　ＡＧ社製）に、ポリ
ウレタンエラストマーを使用して２本の繊維束５．６を
固定した。２木の繊維束は一方の繊維束５が他方の繊維
束６の上に位置するように平行に配置した。下方の繊維
束６は、外径６００ミクロン、壁の厚さ４０ミクロンの
多孔性で疎水性のボリプロビレン中空繊維（西独、Ｅｎ
ａｋ社製）３２０本を含んでいる。上方の繊維束５は外
径２８０ミクロン、壁の厚さ４０ミクロンの親水性ボリ
スルホン繊１ｉ（西独、ｐｒｅｓｅｎｔｕｓ　ＡＧ社製
のＰＳ　Ｂｏｏ、呼称分子量分ｉｉ！３万ダルトン）を
８３２本含んでいた。培養容器の外部毛細管容積は５０
０　ｍｌであって、内部の長さは２４０ｏ１中心部は４
７　ａｈａであった。繊維束は第１８図に示すように外
部の管状ライン及び貯槽と接続されている。培養容器と
これに付帯する管系は、標準的な実験室オートクレープ
で、　１２１”ｃで４５分間処理した。殺菌したエアー
ワークステーション中で、培養容器をＬｕｅｒｌｏｋコ
ネクターにて、栄養素貯槽と使用済み栄養素貯槽とに接
続した。装置の取扱いと組立てを容易にするために、貯
槽をオートクレーブで処理した。培養容器を可変速の振
動装置４３　（Ｓｔｕａｒｔ　Ｓｃｉｅｎｔ１ｒ１ｅ　
ＬｉｄのＳＴＲＩ５）に載置し、その台を携帯用の３７
℃キャビネット（Ｓｔｕａｒｔ　Ｓｅｔｃｎｔｉ［’ｌ
ｃ社製）で覆った。接種に先立ち、容器と繊維を周到に
乾燥し、ポリブロビレン繊維束の管孔に、約７．５％の
ＣＯ２を含有する乾燥した周囲の空気を通過させて条件
付けを行った。空気の供給は小型の空気ボンブで行い、
調圧器を介して液状ＣＯ　ボトル４０からＣＯ２を供給
した。二つの２ 流れの流量は、小型の調節器とＰＩｏｔｓＬａｔ自動ガ
ス流ｆｆｉ調節器（Ｐｌａｔｏｎ　Ｐｌｏｖｂｌｔｓ　
）との組合せで調節した。

容器内での培養に使用した媒体は、グルコース初期濃度
２０００　ＩＩｔｇ／リットルに調製されたＲＰＭｌ１
６４０（Ｎｏｒｔｈｕｍｂｒｉａ　Ｂｌｏｌｏｇｌｃａ
ｌｓ　Ｌｔｄのｍ４０４）に、牛の胎児の血清（Ｎｏｒ
ｔｈｕｍｂｒｉａ　Ｂｌｏｌｏｇｌｃａｌｓ　Ｌｔｄ製
）を１０％補充したものである。透析物には血清を含ま
ないＲＰＭＩ１６４０を使用した。培養液のｐｌｌを視
覚的に認識できるようにするために、フェノールレッド
を媒体に混合した。

ハッカネズミのハイブリドーマ細胞系（ＡＴＴＣＩ１１
’３１２４ラインＤＢ９０８）とヒトＩｇＧと豚のイン
スリンを実験に選んだ。組織培養フラスコから得た中間
生育層の培養液を、１０％の牛の胎児の血清を含んだ新
鮮な媒体に懸濁させ、初期細胞濃度をｌ．ＯＸ１０”／
ＩＩｌに希釈した。培養容器に注射器４ｌを使用して試
料口１１から２５０　ｍｌの培養液を接種した。

この操作中、チャンバーのベントロ４２を開放し、ヘッ
ドスペース中のガスを置換した。接種完了後、ベント口
と試料口を閉鎖した。培養液は２５０　ｍｌのヘッドス
ペースを残して、５０％の容量で反応器に満した。この
培養液を、毎分１５サイクル、振動角度６度にセットし
た振動装置により混合した。

繊維の管孔には、３７℃キャビネットの外側に置いた栄
養素ｌｒ？槽３３からの栄養素を、嬬動ボンプ２２（Ｗ
ａｔｓｏｎ　Ｍａｒｌｏｖの１０１０／Ｒ）にて、初期
流＠　１００ａｔ／日で供給した。ガスの供給は炭酸ガ
ス濃度約７、５％で１５０　ＩＩｆ／分を調節した。出
口からのガスは、消毒した泡ｆｉ４５に通した。媒体の
Ｉ）Ｉ１を維持するために、供給物貯槽には空気／炭酸
ガス混合物を供給した。

反応物流及び廃棄物流を注射器にて毎日採取した。培養
液中の細胞数を血球Ｊ１で測定した。細胞の生育力は、
トリバンブルー排除染色（シグマケミカル社のＴ−８１
５４）で測定した。培養液及び廃棄物流中のグルコース
濃度は、バーンハム・トリンダー（Ｂａｒｎｈａｍ　＆
　Ｔｒｌｎｄｅｒ　）の酵素法（Ａｎａｌｙｓｔｌ９７
２年第１９２巻第１４２〜１４５頁参照）にて評価した
。両方の試料での乳酸塩の蓄積は、シグマ乳酸塩キット
（シグマケミカル社のキット８２Ｂ−ＵＶ）で測定した
。

抗体の濃度はハツカネズミのＩｇＧについて、標準サン
ドウィッチＥＬＩＳＡで測定した。プレートをアンチマ
ウスＩｇＧ　　（ヤギ）（シグマケミカル社のＭ−３（
１　１４）で被覆し、ＢＳ八でブロックし、セイヨウワ
サビペルオキシダーゼ複合アンチマウス（ヒツジ）　　
（ＳＡＰＵ　８０８１−２０１　）で分析した。ＴＭＩ
３（１３ＤＩ１ケミカルズ）をクロモゲンとして使用し
、プレートを４５０　ｎｍで読取った。試料は１　ｍｌ
当り　ｉｅ，ｓ．４．２．１及び０．５ナノグラムに希
釈した純粋な標準ＩｇＧ　　（シグマゲミカル社の１−
５３８１）に対して１：２万、１：４万及び１：８万の
希釈率で分析した。

培養が進行し、グルコースの消費速度が増大するに従い
、透析物と栄養素流の流量を調節し、反応器内の残存グ
ルコース濃度を１０００冒ｇ／リットルに保持した。

細胞培養濃度は１５日間で８．Ｑ５　Ｘ　１　０Ｂに上
昇し、ｌ６日目に実験を停止する前の生育力は９０％で
あった。１日当りのグルコースの見積消費量は、培養液
１　ｍｌ当り３．６３　Ｂに増加した。抗体濃度は初明
１Ｍ　５．８　ｕｇｒａｍｓ／ｉｆから１６日後の最終
値４６５ｕｇｒａｍｓ／ｏ＋ｌに増加した。排出される
廃棄物流についても抗体を分析したところ、検出できな
かった。

反応物及び廃棄物のグルコール及び乳酸塩濃度は、採用
した流量ではほとんど同じであった。

実施例２（比較例） 実施例１と並行して比較実験を行った。この実験では実
施例１と同様に１０％の子牛胎児血清を補充したＲＰＭ
Ｉ　１６４０を使用し、ほぼ同じ初期細胞濃度の同じ培
養演２５０ｍｌを、２５０　ａｌｌのＴｅｃｈｎｅ攪け
フラスコに接種して行った。フラスコを４Ｏｒｐｍにセ
ットした電磁攪拌機の上に載置した３７℃キャビネット
内に保持した。培養液を日毎に採取し、４口目には生育
力８０％で最大細胞濃度９．２Ｘ　１　０５を検出した
。その後生育力は６日目まで減少し、２％以下に低下し
た。最大抗体レベルは４２．＋１６　ｕｇｒａｓｓ／ｍ
ｌであった。血清１　ｍｌ当りの抗体生成量は４２ｇ．
８　ｕｇｒａｍｓであるが、これは実施例１での生或量
である血清１　ｍｌ当り４Ｂ５０．Ｏ　ｕｇｒａｓｓに
比較して極めて対照的である。

【図面の簡単な説明】

第１図は付帯機器を備えて平行繊維束を有する本発明の
装置の第１具体例の略図である。 第２図は３本の繊維束を有する第２具体例の側面図であ
る。 第３図は第２図の平面図である。 第４図は第２図の端面図である。 第５図は２本の繊維束が直交した第３の具体例を示す透
視図である。 第６図及び第７図はタイプが異なる２本の繊維束を有す
る管状チャンバーの端部を示す縦断面図及び横断面図で
ある。 第８図及び第９図は３本の異なる繊維束を有するチャン
バ一端部を示す第７〜８図と同様な縦断面図及び横断面
図である。 第ｌＯ図は第１のタイプのフレームに繊維束を直列に張
設した本発明の第４の具体例を示す斜視図であり、第１
１図は第ｌＯ図に示すフレームを組立てた場合の部分断
面図である。 第１２図はに第２のタイプの繊維束を備えた第２のタイ
プのフレームの平面図であり、第１３図はのＡ−Ａ線で
の断面図である。 第１４図は二つのタイプの繊維束を張設した第３のタイ
プの平面図であり、第１５図及び第１６図はそれぞれ第
１４図のＣ−Ｃ線及びＢ−Ｂ線に於ける断而図である。 第１７図は栄養素媒体が繊雑束の一つに静水圧で供給さ
れる装置の第５の具体例を示す略図である。 第１８図は実施例１で使用した装置の第６の具体例を示
す略図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、栄養素及び接種細胞の導入口と、培養された細胞及
   び細胞生成物の排出口を備え、液状培地で細胞を培養す
   るチャンバーと、 前記のチャンバー内に収められた中空の半透性繊維束か
   らなり、水性流体流を通過させるための入口と、培養細
   胞生成物を除去するための出口を備え、生成物を繊維壁
   を通して細胞培地から繊維内を流れる流体流に移行させ
   るのに使用される第１の繊維束と、 前記のチャンバー内に収められた中空の半透性繊維束か
   らなり、富酸素化されたガス流の入口を備え、中空繊維
   の壁を介して酸素含有ガス流を培地内に通し、ガス状老
   廃物を培地からガス流に通すために使用される第２の繊
   維束、 からなる細胞培養装置。 ２、栄養素媒体をチャンバーに適し、任意に高分子量代
   謝物を除去するための第３の中空半透性繊維束を、さら
   に設けた請求項１記載の装置。 ３、繊維の束がチャンバー内で実質的に平行に並んでい
   る請求項１又は２記載の装置。 ４、酸素含有ガスを流すための第２の繊維束が、最下段
   の繊維束である請求項３記載の装置。 ５、培養チャンバーが平らな多数の平行プレートによっ
   て少なくとも部分的に区画され、各プレートは複数の繊
   維を備え、繊維の対向端はそれぞれプレートに設けた入
   口マニホルド及び出口マニホルドと連通し、各プレート
   にはプレートを通して入口マニホルド及び出口マニホル
   ドと連通する入口穴と出口穴を設け、プレートを積層さ
   せた際に入口穴と出口穴がそれぞれ一線に並んだ入口チ
   ャンネル及び出口チャンネルを形成するようにした請求
   項１又は２記載の装置。 ５、二つ以上の異なる一連のプレートを有し、各系列の
   プレートが単一の繊維を備えてそれぞれの繊維束を構成
   し、かつ各系列が独自の入口チャンネルと出口チャンネ
   ルを備えている請求項５記載の装置。 ７、各プレートが少なくとも二つのタイプの繊維を複数
   本有し、各タイプの繊維がそれぞれの繊維束の一部を構
   成し、各タイプの繊維にそれぞれ入口チャンネル出口チ
   ャンネルに連通する入口マニホルドと出口マニホルドを
   設けた請求項５記載の装置。 ８、繊維束が層状に配置され、個々の束の繊維が間隔を
   置いて実質的に等角度で伸びている請求項１又は２記載
   の装置。 ９、水性流体を搬送する第１の束の繊維が、親水性半透
   性膜材料で構成される請求項１〜８のいずれか１項記載
   の装置。 １０、酸素含有ガスを搬送する第２の束の繊維が、疎水
   性の多孔性材料で構成される請求項１〜９のいずれか１
   項記載の装置。 １１、培養容積に対する全繊維の表面積の比率が、０．
   ５〜５．０の範囲にある請求項１〜１０のいずれか１項
   記載の装置。 １２、繊維束に対して液状の培地を動かすための混合手
   段をさらに備えている請求項１〜１１のいずれか１項記
   載の装置。 １３、細胞を含有する液状の培地を用意し、培地を通る
   中空の半透性繊維の第１の束に、水性流体を通過させて
   培地から培養細胞生成物を水性液体に除去し、培地を通
   る中空の半透性繊維の第２の束に、酸素含有ガス流を通
   過させて培地に酸素を供給すると共に、ガス状老廃物を
   培地からガス流に除去することを包含する細胞培養法。 １４、水性流体が栄養素媒体を含有する請求項１３記載
   の方法。 １５、培地内を通る第３の中空半透性繊維束に栄養素媒
   体を通すことによって、栄養素が培地に供給される請求
   項１３記載の方法。 １６、第３の繊維束を介して高分子量の生成物を培地か
   ら除去する請求項１５記載の方法。