JPH03164192A - 双特異性抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は一抗体分子上に異なる抗原特異性を持った双特
異性抗体並びにその製法、その適用及び該抗体を含有す
る薬剤に関する。

〔従来の技術〕

従来、血栓症の治療には線溶療法が用いられてきた。こ
れは主に、血栓中の主要な夕冫パクであるフイプリンを
溶解させるもので、フィブリン溶解酵素であるプラスミ
ンを生成するブラスミノーゲン７クチベーターが用いら
れている。

最近では、プラスミノーゲンアクチベーターの中にもフ
イブリン親和性の高いものと低いものかあることがわか
り、フィブリン親和性の高い組織型プラスミノーゲンア
クチベーターやプロウロ午ナーゼ等が用いられるように
なった。そして更に、フィブリン親和性を高めるため、
フイフリン特異抗体にブラスミノーゲン７クチペーター
を化学的に共有結合した複合体が作成されている（ラン
ゲＭ．　Ｓ．　（　Ｒｕｎｇｅ　Ｋ　Ｓ．　）らＰｒｏ
ｃ．Ｎｓｈ　　　Ａ＋−Ｊ　　　Ｐ−！　　　ｔ＋　　
　＋　　　Ｈ　　　＋−　　　　−一方、血小板の活性
化は血栓形成の重要な引金であり、血小板が活性化され
ている状態は、血栓準備段階又は血栓傾向にあるとみな
すことができる。そして最近、活性化血小板の膜表面に
特異的に出現し、休止血小板上には出現しない分子量１
４万の糖夕冫パク質が同定され、その特異抗体を用いた
血栓部位の像映診断の可能性が示された（バラグリカＴ
．　Ｋ　（　ＰａｒａｂｒｉｃａＴ．　Ｋ　）らＥ’ｒ
ｏｃ．　Ｎａｔ１、　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．　Ｓ
．　Ａ．　８　６１０３６（１９８９））。

〔発明が解決しようとする課題〕

一般に動脈内で形成される血栓は血小板か主体となり、
静脈内血栓は血小板及びフイブリンが主体となるとされ
ている。したかって、従来のように単にフイブリンをタ
ーゲットとする線溶療法では血栓溶解剤のフイブリンに
対する親和性をいくら高めても、あくまでも形成された
血栓のフイブリンに対する溶解力の増強にしかならず、
血栓形成の非常に初期段階での阻害効果、そして血栓形
或予防効果を希望することばむずかしかった。また上記
のごとき血栓溶解剤と抗体を化学的に結合した場合、そ
の複合体は安定性に欠け、更に血栓溶解剤の活性自身が
化学的結合工程（こより低下してしまう危険があった。

本発明は上記従来技術の血栓溶解剤の問題点を克服する
ためになされたものであり、血栓形成部位、更には血栓
形成準備段階の部位へ、抗血栓性物質を特異的に、安定
に、更には活性化した状態で輸送、トラツブする化合物
を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、一抗体分
子上に活性化血小板抗原特異性と抗血栓性物質特異性と
いう異なる抗原特異性を持つことを特徴とする双特異性
抗体に関し、本発明の第２の発明は、活性化血小板抗原
特異抗体及び抗血栓性物質特異抗体を原料とし、これら
を酵素消化し、各抗体のＨ鎖間のジスルフィド結合を還
元した後、両抗体断片の各々のＨ鎖同志を再酸化する工
程を含むことを特徴とする上記双特異性抗体の製造方法
に関し、本発明の第３の発明は、上記双特異性抗体を単
独、又はあらかじめ抗血栓性物質と混合し、これらを血
液循環器系中に注入することを特徴とする血栓部位への
抗血栓性物質の輸送方法に関し、更に本発明の第４の発
明は、上記双特異性抗体、又は双特異性抗体と抗血栓性
物質の混合物を有効成分とすることを特徴と丁る抗血栓
性薬剤に関する。

前記課題は、活性化血小板抗原特異性と抗血栓性物質特
異性という異なる抗原特異性を待った双特異性抗体によ
って解決される。双特異性抗体はニソノフ（　Ｎｉｓｏ
ｎｏｆｆ）らによる２種類のウサギ抗体から化学的方法
によって調製されたことに代表される種々の公知の方法
が報告されている（　Ｎｉｓｏｎｏｆｆ　Ａ．　，　　
Ａｒｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｒｗ　Ｂｉｏｐｈｙｓ．，−
旦−２　　４６０（１９６１）．ハンマーり冫グＵ（Ｈ
ａｍｍｅｒｌｉｎｇ　Ｕ）　，　　Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍ
ｅｄ．，　　１　２　８　　１４６１（ｌ９６８），　
　ラソＶ．　（　Ｒａｇｏ　Ｖ．　），　Ｆｅｄ．　Ｐ
ｒｏｃ．Ｂｒｅｎｎａｎ　Ｋ　），Ｓｃｉｅｎｃｅ　，
　　２　２　９　　　８　１　　（１９８５））。

すなわち、これらの方法の基本工程は以下のごとくであ
る。この分野でよく知られた方法で２種の抗原に対する
抗体を各々作成する。続いて、各抗体をペブシンのよう
な適当なプロテアーゼで消化し、Ｆ（ａｂつ，断片を生
成させる。次いで各Ｆ（ａｂ’），断片を■鎖同志を結
合しているジスルフィド結合を還元するのに充分な条件
にかけて、Ｆ（ａｂ’），を二つの半分子（Ｆａｂ’）
に開裂させる。次いで一方の抗体由来のＦ　ａ　ｂ’を
他の抗体由来のＦａｂ’と混合し、結合させうる条件下
で再酸化し、双特異性抗体を作成する。次いで、この双
特異性抗体を混合物から分離する。一つの分離方法は混
合物を双特異性抗体の両半分のいずれかに特異的に結合
しうる抗原を含有したアフィニテイーマトリックスと接
触させ、次いで結合した画分を溶出させ、これを他の半
分子を特異的に結合しうる抗原を含有するアフイニテイ
ーマトリックスと接触させることである。この第２の一
　Ｌ　　ｎ　　＋’＋　　ｈ　−ｖ　　ｒｗ　　を七　
ム　ｌ　　　Ｊ−　ｍオ　Ｌｋ　Ａ！　亡Ｈ　　Ｊｋ　
　Ｊ−＋　　−ｆ’　　１　　．　　１　　７ク特異性
抗体である。

活性化直小板特異抗体としては、活性化血小板の膜表面
に特異的に出現し、休止血小板には出現しない抗原を認
識する抗体が望ましく、例えば本発明者らが作成したＧ
ＭＰ　−　１　４　０抗原を認識するモノクローナル抗
体ＰＬ７　−　６が挙げられる。抗ＧＭＰ　−　１　４
　０モノクローナル抗体は、ケーラー（　Ｋ８ｈｌｅｒ
）らの方法（ネーチャ（Ｎａｅｕｒｅ）　，　　２　５
　６　，　　４　７　６　（　１　９　７　５　）　）
を用い調製することかできる。例えばＢ　ａ　ｌ　ｂ／
ｃマウスの腹腔内にＧＮＰ　−　１　４　０または洗浄
血小板を免疫し、４週間後に追加免疫を行い、その３日
後にマウスより牌臓を摘出する。牌臓細胞とマウスミエ
ローマ細胞とを、ポリエチレングリコールの作用により
融合させ、そして常法により９６穴プレート中にて培養
する。各培養液の上清を採取し、ＥＬＩＳＡ法により特
異的抗体を産生じている細胞を選択し、更に限界希釈法
によりクローニングを行い、抗ＧＭＰ　−　１　４　０
モノクロナール抗体産生細胞（ハイプリドーマ）を取得
する。

取得されたハイプリドーマとしては例えばハイプリドー
マＰＬ７−６　　（　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ＰＬ７−　
６　（ＦＥＲＭＰ−１１０７３））があり、このハイプ
リドーマは培養液中に抗ＧＭＰ　−　１　４　０モノク
ロナール抗体ＰＬ７−６を分泌し、市販の無血清培地な
どを用いてハイグリドーマを培養しその上清から硫安塩
折などの操作により抗体画分を得ることができる。また
同系のマウス体内にて、ハイプリドーマを培養し、その
動物の体液より同様の操作により抗体画分を得ることも
できる。

一方、抗血栓性物質特異抗体としては、血栓及び血小板
活性化、凝集の予防、治療に用いられる化合物に対する
抗体であり、例えば抗ｔＰＡモノクローナル抗体があり
、中でも山本らの報告（　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ　，　５　０　，　６　３　７　−６４６
（１９８８））にあるモノクロナーノレ抗体Ｃ９−５，
Ｋ８−２等はｔＰＡと結合することでｅＰＡの活性を増
大する抗体であり、このような抗血栓性物質の活性化能
力を伴った抗体の利用は更に適している。

またこれら抗体としては各種動物由来のポリクローナノ
レ抗体はもちろん利用可能であるが、モノクローナル抗
体が更番こ適している。特にインビボ（　ｉｎ　ｖｉｖ
ｏ　）での応用においてはキメラ抗体の利用が最適であ
り、キメラ抗体の作成はウインターＧ．　（　Ｗｉｎｔ
ｅｒ　Ｇ．　　）ら（　Ｎａｔｕｒｅ　３３２３２３（
１９８８））の方法により広く一般化されてきた方法が
利用できる。

更に本発明による双特異性抗体は相応する抗血栓性物質
を本抗体とあらかじめ反応させておくことにより、血栓
部位を溶解したり、血小板の活性化、凝集を抑制するこ
とのできる抗血栓性物質を血栓形成部位に特異的に導く
ために使用することができる。このような抗血栓性物質
としては例えばｔＰＡ　，ウロキナーゼ、ストレブトキ
ナーゼ、プロウロキナーゼ、抗血小板剤等を使用できる
。また、本抗体そのものを血液循環器系中に注入するこ
とによっても、生体由来の抗血栓性物質を血栓部位にト
ラツブさせ濃縮本発明の双特異性抗体の有効量を含む抗
血栓性薬剤を臨床において投与する場合、経口又は非経
口経路により投与される。その剤形は錠剤、糖衣錠、丸
剤、カプセル剤、散剤、トローチ剤、液剤、坐剤、注射
剤などを包含し、これらは医薬上許容される賦形剤、崩
壊剤、結合剤、展着剤、滑沢剤、色素、剤皮剤、希釈剤
を配合して製造される。例えば、注射用蒸留水又は緩衝
液１〜５Ｍ当り、この双特異性抗体１〜５×１０〜１０
１ｇを溶解して調製し、また必要に応じて、例えばヒト
血清アノレプミン、乳糖、グルコース、サツカロース、
デキストリン、マンニット、イノシット、シクロデキス
トリン等の糖類、グルタミン、グノレタミン酸、アスパ
ラギン、アスパラギン酸、グリシン、アラニン等のアミ
ノ酸類を０．１％以上、好ましくは０．　２〜１０％濃
度として添加調製し、凍結乾燥又は真空乾燥等の通常の
乾燥手段によって調製でき、用時溶解用注射剤として製
剤化すればよい。また前述の抗血し、用時、双特異性抗
体と混合してもよく、あらかじめ混合した後、注射剤型
としておいてもよい。この際、用いる双特異性抗体の量
に比較して、抗血栓性物質は等モル以上使用するのが好
ましい。

本発明の双特異性抗体を含む抗血栓性薬剤の人体投与量
は通常１日当り、双特異性抗体として１〜５　０　０　
０Ｔｎ９であるが、症状の軽重、性別、年令等に応じて
適宜増減して差支えない。

〔作用〕

次に本発明の双特異性抗体の生理活性を実験例により示
す。

実験例１　ウサギ頚静脈モデルにおける抗血栓作用 コレン（　Ｃｏｌｌｅｎ）ら（　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉ
ｎｖｅｓｔ．　　７　１３６９（１９８３））の方法に
準じて行った。

家兎（２．４±０．　２　６　ｋ９　）を７セトブロタ
ミンとケタミンにより麻酔する。頚部に正中線切開を行
い、ここから頚静脈を露出させ、単離する。

外頚静脈を切断し出血が収まった後血管タランプで該頚
静脈を閉鎖する。該頚静脈中に約５　０　０　０　０　
０　ｃｐｍの１′工一標識ヒト●フイプリノーゲン１０
μｌ１濃縮ヒト赤血球１００μｌ１新鮮ヒト多血小板血
漿１　０　０　μ１１０．　５　Ｍ　ＣａＣＬ＊を１０
μｊ１トロンピン（　８　ＮＩＢユニット）１０μｌを
注入する。３０分後、クランブをはずし、血流を再開す
る。次に各種濃度のｔＰＡと双特異性抗体の混合物又は
対照薬物液をハーバード（Ｈａｒｖａｒｄ　）注入ポン
プを使用し耳の末梢静脈より４時間注入する。４時間後
上記外頚静脈部を単離、取除き、該頚静脈内に形成され
た血栓中に取込まれた放射能活性を測定した。

血栓溶解率は次式により求めた。

血栓溶解率（％）＝ユニ立　×　１００Ｄ ここでＤは、生理食塩水を添加した時の血栓中に取込ま
れた放射能活性を示し、Ｃは薬剤添加時の血栓中に取込
まれた放射能活性を示す。

その結果を第１表に示す。

ｔＰＡと双特異性抗体混合物を用いた場合、対照薬剤と
してのｔＰＡ単独又は正常マウスＩｇＧとＬＰＡの混合
物に比べ明らかに高い血栓溶解率を示した。

第　　１　　表 双特異性抗体（２００ｌｎ９） ｔＰＡ　　　　　（　１０万単位）５８双特異性抗体（
２００１９）４２ マウスＩｇＧ（２００！ｎ９） 仁ＰＡ　　　　　（１０万単位）１８ 仁ＰＡ　　　　　（１０万単位）２０ 実験例２　急性毒性試験 家兎（２．４±０．　２　６　ｋ９　）一群５匹に仁Ｐ
Ａ一双特異性抗体混合物の生理食塩水溶液をｔＰＡ活性
として１０００００ユニット／匹、双特異性抗体量とし
て２００ｒｎ９／匹静脈内投与を行い、週間経過を観察
した。いずれの家兎も生存し、異常は認められなかった
。

以上の実験から明らかなように、本発明の薬めて有用で
ある。

〔実施例〕

次に本発明の実施例を挙げて具体的に述べるが、本発明
はこれによって何ら限定されるものではない。

実施例　１　双特異性抗体の製造 ＧＭＰ　−　１　４　０に対するモノクローナノレ抗体
ＰＬ７−６、及びｊＰＡに対するモノクローナル抗体Ｋ
８−２のそれぞれをイムノピュア（　ＩｍｍｕｎｏＰｕ
ｒｅ）（登録商標）　Ｆ（ａｂ’）ｔブレパレーション
キット（　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　）　（ピ
アス社製）を用いベプシンで処理しＦ（ａｂ’）ｔ断片
を作成した。次いで、２種のＦ　（　ａ　ｂ’）．断片
を下記のごとく還元し、再酸化し双特異性抗体を生成し
た。まず２０ｍ９の各々のＦ　（　ａ　ｂ’）．断片を
混合し、０．ＯＩＭメルカブトエチルアミンにより３７
℃、ｐＨ５で１時間還元して、これら断片をＨ鎖とＬ鎖
との間の結合を破壊することなしに半分子Ｆａｂ’に分
断した。

この混合物をホウ酸生理食塩バッファ一（　ｐＨを行っ
た。

実施例　２　双特異性抗体の精製 正常人からクエン酸添加採直した血液より７００ｇｌ５
分間遠心分離処理にて血小板画分を得たのち、ＲＣＤ溶
液（３６ｍＭクエン酸、５　ｍＭグルコース、ｌ　ｍＭ
　ＭｇＣＬ　、５　ｍＭ　　ＫＣＬ　，　１　０　３ｍ
Ｍ　　ＮａＣ１　，　２　０　ｎｇ　／　１７１４！プ
ロスタグランジンＥ，　）で２回遠心洗浄しγこ血小板
を、更にアルプミンデンシティグラジエント（　ａｌｂ
ｕｍｉｎ　ｄｅｎｓｉｔｙｇｒａｄｉｅｎｔ）法で洗浄
し、ｃａｔ＋を含まないヘペスータイロード（　ＨＥＰ
ＥＳ　−　Ｔｙｒｏｄｅ）緩衝液で再浮遊して洗浄血小
板を得た。次にこの洗浄血小板に終濃度１％となる様に
トリトンＸ−１００界面活性剤を添加し、その可溶性画
分を小麦胚凝集素（　ｗｈｅａｔ　ｇｅｒｍ　ａｇｇｌ
ｕヒｉｎｉｎ　）固定化アガロース力ラムに通じて、カ
ラムに吸着した両分を０．１阿グリシンーＨＣＩ緩衝液
（ｐＨ２．２）にて溶出させ、精！ｌ！ｃＭｐ−１４ｏ
を調製した。このＧＭＰ　−　１　４　０をＣＮＢｒ活
性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　）　４　Ｂ　
（ファルマシア社製）に共有結合し、ＧＮＰ　−　１　
４　０７フィニティー担体を作成した。一方ｅｐＡ（コ
スモバイオ社製）　ｔ　ＣＮＢｒ活性化セファロース４
Ｂに共有結合させ、ｔＰＡアフイニティー担体を作戒し
た。実施例１の混合物を０．１Ｍトリスー｝ＩＣＬバッ
ファ一（　ｐＨ７．５）で平衡化させたＧＮＰ　−　１
　４　０セファロース４Ｂカラムに通し、次いで０．１
Ｍトリスー１１Ｃｌ（ｐＨ７．５）で洗浄し、更に０．
１Ｍグリシン（ｐＨ２．５）で抗ＧＭＰ特異性含有画分
を溶出させ、次いでトリスにて中和した。更に、これを
平衡化したｔＰＡ−セファロース４Ｂカラムに通し、Ｏ
、１ＭトリスーＨＣＩで洗い、次いでＯ．１Ｍグリシン
（ｐＨ２．５）で抗ｔＰＡ特異性含有画分を溶出させ、
トリスにて中和した。以上のようにして、抗ＧＭＰ　−
　１　４　０特異性と抗ｔＰＡ特異性を同一抗体分子上
に有する双特異性抗体を得た。

丈施例　３　　ｔＰＡのＧＭＰ　−　１　４　０抗原へ
のターゲツテイング ＧＭＰ　−　１　４　０抗原を担体としてのポリスチレ
ンマイクロプレート上に固定し、１％ＢＳＡでプロック
後洗浄したのち、実施例２で得られた双特異性抗体（２
０ｎＭ）とｔＰＡ　（　２　０　０ｎＭ）をあらかじめ
混合した液を加えインキユベートする。

次いで洗浄後、ｔＰＡの発色基質である０．　８　ｍＭ
Ｓ−２２８８（第一化学社製）を加え、４０５ｎｍの発
色を測定した。比較のために、双特異性抗体の代りに正
常マウスＩｇＧ　（　Ｋ　８　−　２、ＰＬ７−６）を
用いた場合、又はＧＮＰ　−　１　４　０抗原を固定し
なかった場合について上記と同様に行った。４０５ｎｍ
の発色の比較は、本発明による双特異性抗体が活性化血
小板膜上に特異的に出現丁るＧＭＰ　−　１　４　０抗
原に特異的にｔＰＡをターゲツテイングすることを示し
、一方、対照抗体又は対照抗原ではｔＰＡのターグッテ
ィングが全く行われないことを示した。

実施例　４　双特異性抗体製剤 双特異性抗体４０重量部（以下部と略す）、ヒトアルプ
ミン２０部、サッカロース２０部に対し、生理的食塩水
を加え、全量を２０００部イプを用いて除菌ろ過する。

このろ液２ｇを１　０　．ｎｌのバイアル瓶にとり凍結
乾燥し、ｌバイアルに該双特異性抗体４０’％ｌを含む
凍結乾燥注射剤を得た。

〔発明の効果〕

以上詳細に説明したように、本発明により、一抗体分子
上に活性化血小板抗原特異性と抗血栓性物質特異性を持
った双特異性抗体が提供され、これを用いた血栓形成部
位への抗血栓性物質の輸送（ターゲッティング）方法及
び抗血栓性薬剤が提供された。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一抗体分子上に活性化血小板抗原特異性と抗血栓性
   物質特異性という異なる抗原特異性を持つことを特徴と
   する双特異性抗体。 ２、活性化血小板抗原特異抗体及び抗血栓性物質特異抗
   体を原料とし、これらを酵素消化し、各抗体のＨ鎖間の
   ジスルフィド結合を還元した後、両抗体断片の各々のＨ
   鎖同志を再酸化する工程を含むことを特徴とする請求項
   １記載の双特異性抗体の製造方法。 ３、請求項１記載の双特異性抗体を単独、又はあらかじ
   め抗血栓性物質と混合し、これらを血液循環器系中に注
   入することを特徴とする血栓形成部位への抗血栓性物質
   の輸送方法。 ４、請求項１記載の双特異性抗体、又は該双特異性抗体
   と抗血栓性物質の混合物を有効成分とすることを特徴と
   する抗血栓性薬剤。