JPH03164196A - プロテアーゼ阻害因子のスクリーニング法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、プロテアーゼの阻害因子についてスクリーニ
ングする方法に関する。第１の方法は、プロテアーゼの
発現がバクテリアの菌株に対して毒性であるように、グ
ラスミドを構成することを包含する。次いで、問題の化
合物を、毒性のプロテアーゼを阻害し、そしてバクテリ
アの菌株が殺されるのを防止するものについてスクリー
ニングすることができる。阻害は、プロテアーゼの遺伝
情報を指定するプラスミドによるバクテリアの菌株の首
尾よい形質転換により検出される。第２の方法は、アッ
セイできる活性を有するタンパク質中に挿入されるプロ
テアーゼ切断部位を含有する、融合タンパク質の構成を
包含する。化合物をプロテアーゼの阻害についてスクリ
ーニングし、この化合物は色、光または夕冫バク質の活
性の変化についてアッセイすることによって検出する。

ＨＩＶブロテアーゼおよびポリオ３Ｃプロテアーゼは、
これらの方法において使用できるプロテアーゼの例であ
る。

プロテアーゼは１つのクラスのタンパク質であり、それ
らのあるのはヒトの病気に関係づけられてきている。例
えば、ヒトのレニンは血管作動性ベプチドのアンギオテ
ンシンのプラスミド中の形戊におけるその役割により、
高血圧に関係付けられているアスバルチルプロテアーゼ
である（引用文献ｌ）。プロテアーゼのトリプシンおよ
びエラステアーゼは気腫の開始に参加する（２、３）。

ヒトの免疫欠損ウィルス（「ＨＩＶ」）に関連するプロ
テアーゼはとくに重要である。ポリオプロテアーゼは、
また、重要である。

ＨＩＶの一次翻訳産生物は、ｇａｇおよびプール遺伝子
によりエンコードされるポリタンパク質の前駆体を包含
する（４）。ｇａｇ遺伝子はカプシドタンパク質をエン
コードする；　ｐ　ｏ　Ｉ遺伝子はウィルスの酵素をエ
ンコードし、１０ｋｇのウィルスプロテアーゼ、６６ｋ
ｄの逆トランスクリブターゼおよび３４ｋｄのエンドヌ
クレアーゼからなる（５）。これらの夕冫パク質の産生
は、ウィルスプロテアーゼによりこれらのポリタンパク
質の切断に依存し、前記ウィルスプロテアーゼはｐｏ．
Ｉボリタンパク質の自己消化により発生する。

ウィルス特異的酵素として、プロテアーゼはウィルスの
複製を阻害する薬物の魅力ある標的であり、そして集中
的な標準の焦点となった。ｐｏ＋配列（ヌクレオチド１
８３３−２１２９）は或熟９９アミノ酸プロテアーゼを
産生し（６）、アミノ末端にプロリンおよびカルボキシ
末端に７工二ルアラニンをもつ（７；Ｇｒａｖｅｓ）．
ＱＱ７ミノ酸プロテアーゼはアスパラギン酸プロテアー
ゼ族と相同性であり（８）、そしてペプスタチンＡによ
り阻害される（９）。触媒のＡｓｐ２５残基において突
然変異した組み換えプロテアーゼは、バクテリアの発現
系および生体外で酵素的に不活性であり（５、６）そし
てこの部位において突然変異したウィルスは非感染性で
ある（６）。プロテアーゼは最近Ｅ．ｃｏｌｉから精製
され、そして結晶化された（１０）。

現在、ＨＩＶにより引き起こされると信じられる、後天
性免疫欠損症候群（「エイズ」）に対する治療剤の開発
に対する緊急な要求が存在する。

ＨＩＶプロテアーゼに対して選択的である因子は、ＨＩ
Ｖの複製を阻害する働きをし、こうしてエイズの処置に
８いて効果的であろう。こうして、このよラなＨＩＶプ
ロテアーゼの阻害因子についてスクリーニングする方法
が必要とされている。

ＨＩＶプロテアーゼをアッセイする現存する方法は、ポ
リタンパク質またはオリゴペプチドの基質を利用し、そ
して切断産生物の存在の確証にゲル電気泳動または高性
能液体クロマトグラ７イーを必要とする（１１〜１６）
。多数の試料のために最近開発された他の方法は、共鳴
エネルギーの移送（ｌ７）および放射線産生物の解放を
包含する。これらの方法は、多数の試料中のプロテアー
ゼのアッセイのために容易には適合させることができな
い。

したがって、本発明の目的は、プロテアーゼ阻害因子を
同定するスクリーニング法を開発することである。

本発明の特定の目的は、ＨＩｖプロテアーゼ阻害因子を
を同定するスクリーニング法を開発することである。

本発明の他の目的は、ポリオブロテアーゼ阻害因子を同
定するスクリーニング法を開発することである。

本発明は、プロテアーゼ酵素を阻害する化合物本発明の
１つの実施態様において、この方法は、まず、Ｔ７プロ
モーターの制御下にプロテアーゼをエンコードするＤＮ
Ａ配列を有するプラスミドを構成することに基づく。次
に、バクテリアの発現菌株に対するプロテアーゼの毒性
のために、プラスミドにより形質転換されない、バクテ
リアの発現菌株を選択する。次いで、スクリーニングす
べき化合物をプラスミドと一緒にバクテリアの菌株に添
加する。バクテリアの菌株が殺されず、そして形質転換
体を産生ずる場合、その化合物はプロテアーゼの阻害因
子として同定される。

とくに、本発明の第ｌ実施態様は、ＨＩＶプロテアーゼ
の遺伝情報を指定するＤＮＡ配列を含有するｐ　ＰＤＢ
　ｌ　６およびｐＭａ　ｅ　２と表示するプラスミド構
虞体を提供する。これらのグラスミドは、ＢＬ２　１　
（ＤＥ３）と表示するＥ．ｃｏｌｉ菌株中で形質転換体
を産生じない。こうして、そのプラスミドからのＨＩＶ
プロテアーゼの発現はこのＥ．ｃｏｌｉｌｉ株に対して
毒性であると思われる。この発見は、ＨＩＶプロテアー
ゼを阻害する因子を同定する方法を示唆する。ｐＰｏｌ
ｉｏプロテアーゼ３Ｃと発見する同様なプラスミド構成
体は、ポリオプロテアーゼについて記載し、これを使用
してポリオプロテアーゼ阻害因子についてスクリーニン
グすることができる。

本発明の第１実施態様の他の面Ｉ：おいて、ＨＩＶプロ
テアーゼを阻害する化合物についてスクリニングする方
法を記載する。Ｔ７プロモーターの制御下にＨＩＶプロ
テアーゼをエンコードするＤＮＡ配列を有するプラスミ
ドを構成する。次に、プラスミドにより形質転換され、
次いで誘発因子によるプロテアーゼ合成の誘発により殺
される、バクテリアの菌株を選択する。次いで、阻害活
性についてスクリーニングすべき化合物を、誘発因子と
一緒に、形質転換されたバクテリアの菌株に添加する。

誘発された細胞が殺されない場合、この化合物はＨＩＶ
ブロテアーゼの阻害因子として同定される。

本発明の第２の実施態様において、この方法は、潜在的
阻害因子の化合物の存在下または不存在下にプロテアー
ゼ酵素と組み合わせたとき、色、光または活性の変化に
ついてアッセイすることができるタンパク質の選択を包
含する。

次に、プロテアーゼ酵素の切断部位を含むペプチドの遺
伝情報を指定する、異種ＤＮＡ配列を、選択したタンパ
ク質の遺伝情報を指定する遺伝子中６こ挿入する。融合
した遺伝子を適当な発現系中に挿入し、そして融合タン
パク質内に埋め込まれた異種ＤＮＡ配列により遺伝情報
を指定されるペプチドを認識しかつ切断する、プロテア
ーゼ酵素と組み合わせ、こうしてプロテアーゼ酵素はプ
ロテアーゼ酵素の切断部位を切断し、次いでこの部位は
発現された融合夕冫パク質を不活性化する。

この活性の損失は、色の変化、光の変化によるか、ある
いは活性の損失を直接監視することによって監視する。

スクリーニングすべき化合物をアッセイ系中に含め、そ
して夕冫パク質が切断されず、前述の方法のいずれかに
より監視するとき、活性を維持する場合、その化合物は
プロテアーゼ酵素の阻害因子として同定される。

とくに、本発明の第２実施態様はｐｌ＋ＩＱｓａＵと表
示するプラスミド＊ｔＩ．を提供し、これはデカベブチ
ドのＨＩＶプロテアーゼ切断部位の遺伝情報を指定する
ＤＮＡ配列がその中に挿入された、β−ガラクトシダー
ゼのための遺伝子を含む。

アッセイするとき、この融合タンパク質はβ−ガラクト
シダーゼ活性を保持する。ＨＩＶプロテアーゼは融合タ
ンパク質を切断しそして不活性化する。

ＨＩＶプロテアーゼの潜在的な阻害化合物はβ−ガラク
トシダーゼ活性を監視することによってスクリーニング
され、こうしてβ−ガラクトシダーゼ活性の維持はその
化合物が切断を防止し、モしてＨＩＶプロテアーゼを阻
害することを示す。

ｐ　Ｚ　Ｍ　３　Ｃ　Ｓ　ａ　ｕと表示する同様な構成
体は、ポリオ３Ｃプロテアーゼ切断部位の遺伝情報を指
定するＤＮＡ配列がその中に挿入された、β−ガラクト
シダーゼの遺伝情報を指定する遺伝子を含む。

この構成体を使用し、ＨＩＶブロテアーゼについて前述
した手順に同様な手順を使用して、ポリオ３Ｃプロテア
ーゼを阻害する化合物についてスクリーニングする。

本発明は、プロテアーゼ、例えば、ＨＩＶプロテアーゼ
、レニン、トリプシン、エラスターゼおよびポリオプロ
テアーゼの阻害因子についてスクリーニングする２つの
方法に関する。各スクリーニング方法は、まず、ＨＩＶ
プロテアーゼについて、次いでポリオプロテアーゼにつ
いて説明する。

これらの方法は、また、本発明の原理に従い他のプロテ
アーゼとともに使用するために適合することができる。

｝｛ＩＶプロテアーゼの阻害因子についてスクリーニン
グする方法は、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株に対して毒性であるＨ
ＩＶプロテアーゼを発現するプラスミドの構成に関する
。この毒性は、次いで、ＨＩＶプロテアーゼを阻害する
因子についてスクリーニングするために有用である。

ＨＩＶプロテアーゼを研究するために、そのプロテアー
ゼを工冫コードするＨＩＶｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド
１６４１−２１２２に相当する、λＢ｝｛５　（４）か
らのＢｇｌｌｌ−Ｄｒａｌは、ファージＴ７プロモータ
ー（ｌ９）を含有する前に調製した発現ベクター中にサ
ブクローニングし、プラスミドｐＰＤＢｌ６をつくる（
第１図）。ｐＰＤＢ　ｌ　６の構成をＥ．ｃｏｌｉ　　
ＤＨ５α（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ、マリ
イランド州ガイサーバーグ）中で実施した後、発現菌株
、ＢＬ２１　（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中に形質転換する。

この構成はＴ７　ＲＮＡポリメラーゼを含有せず、した
がって、ＨＩＶブロテアーゼを発現することができない
菌株、例えば、ＤＨ５α中で実施することが必要である
。なぜなら、ＨＩＶプロテアーゼの発現は発現菌株に対
して毒性であることが示されるからである。

グラスミドｐ　ＰＤＢ　ｌ　６を収容するＥ．ｃｏｌｉ
菌株ＤＨ５αは、アメリカン・タイプ・カノレチャー・
コレクション（ｔｈｅ　　ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　
　Ｃｕｌｔｕｒｅ　　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に受託さ
れ、モしてＡＴＣＣ受託番号６８００５を割り当てられ
た。プラスミドｐＰＤＢｌ６は、従来の技術（２０）に
従い、この菌株を培養で増殖し、開いた細胞（ｏｐｅｎ
　　ｃｅｌ＋）を破壊し、遠心し、そして上澄み液から
プラスミドを単離することによって得ることができる。

発現菌株Ｅ．ｃｏｌｉ　　ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ
Ｓは、誘発可能なｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下に
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの染色体のコピー、およびＴ７
リゾチームをエンコードするクロラムフェニコール抵抗
性プラスミドを含有し、前記Ｔ７１Ｊゾチーム誘発の不
存在下にＴ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写を阻害する
（２１，２２）。

ｐ　ＰＤＢ　ｌ　６を収容する細胞は！ＢＳメチオニン
の存在下に誘発因子Ｉ　ＰＴＧで誘発され、そしてタン
パク質合成はｌ５％のポリアクリアミドゲル（ｌ５ｍＱ
の３０％のアクリルアミド、１．３ｍαの２％のビスア
クリルアミド、１１．２ｍＱのｌモルのトリスＣ　ｌ　
　（ｐＨ８．７）　、０．１５ｍ（２の２０％のＳＤＳ
，２．３５ｍＱのＨｔＯ１２５μｆｆのＮ，Ｎ．Ｎ’　
．Ｎ’　−テトラメチルエチレンジアミンおよび１００
μＱの１０％の過硫酸アンモニウムからなる（２０））
を使用するドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミ
ドゲルの電気泳動（　ｒＳＤＳ−ＰＡＧＥＪ　）　、お
よびオートラジオグラフィーにより検査する。ｐＰＤＢ
ｌ６中のＨＩＶ　　ＤＮＡ断片は、１８ｋｄの一次翻訳
産生物をエンコードすることが期待される。その代わり
、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより示されるように、ｌＯｋｄの
主なバンドは誘発のときに観察される（第２Ａ図、レー
ン２）。この観察は１８ｋｄのプロモーターが７ェニル
アラニンープロリン結合において成熟１０ｋｄプロテア
ーゼ（生物学的に活性な形態）への効率よい自己消化と
一致し、そして前に報告された結果（５、７）と一致す
る。　オートラジオグラフィーにより検出されるｌＯｋ
ｄのＨＩＶプロテアーゼのバンドはクーマッシ−（Ｃ．
ｏ　ｏｍａ　ｓ　ｓ　ｉ　ｅ）ブルーの染色により可視
ではなく、このタンパク質が低いレベルでのみ作られる
ことを示唆する。従来、Ｔ７プロモーターの制御下のク
ローニングされた遺伝子の発現の絶対的レベルは、リゾ
チームによるＴ７ＲＮＡボリメラーゼ不活性化（２２）
のために、対応するリゾチームを欠く菌株（ＢＬ２１　
（ＤＥ３）（２１））におけるよりＢＬ２１　（ＤＥ３
）ｐＬｙｓＳにおいて低いことが決定された。しかしな
がら、Ｅ．ｃｏｌｉに対して毒性であるＴ７プロモータ
ーの制御下に遺伝子は、リゾチームのプラスミド、ｐＬ
ｙｓＳを欠＜ＢＬ２１　（ＤＥ３）（２１）中で安定な
形質転換体を産生しないであろう。

ＨＩＶプロテアーゼの発現レベルを増加する試みにおい
て、発現薗株ＢＬ２１　（ＤＥ３）の使用を出願人は研
究した。２つの実験の結果を表■に示す： 表！ Ａ． ｐＰＤＢｌ６ ｐＰｏｌｌ ＋）ＰＯｌ２ Ｂ． ｐＭａｅ２ ｐ４８Ｍａｅ６ ｐＰｏ１１ Ｏ 表Ｉ．ＨＩＶブロテアーゼ構成体によるＢＬ２１（ＤＥ
３）［１株の形質転換。ｐＬｙｓｓプラスミドを含有す
るか、あるいは欠＜ＢＬ２　１　（ＤＥ３）細胞は、標
準の塩化カルシウム手順（２０）により受容能力をもつ
ようにされる。５０ｎｇのプロテアーゼまたは対照プラ
スミドを各形質転換のために使用する。プラスミドｐＰ
ＤＢｌ６およびｐＭ　ａ　ｅ　２は従来記載されたよう
なものである；プラスミドｐ　Ｐ　４　８　Ｍ　ａ　ｅ
　６は、アミノ酸２９に点突然変異をもつＨＩＶプロテ
アーゼを工冫コードする。プラスミドｐＰａｌｌおよび
ｐＰｏ　ｌ　２はポリオポリメラーゼをエンコードする
（ｌ９）。

対照としていくつかのプラスミドは菌株ＢＬ２１（ＤＥ
３）およびＢＬ２１　（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを等しくよ
く形質転換するが、ＨＩＶプロテアーゼをエンコードす
るプラスミドｐＰＤＢ１６およびｐ　Ｍ　ａ　ｅ　２は
ＢＬ２１　（ＤＥ３）中で形質転換体を産生しない。こ
れらのデータが強く示唆するように、ｐＰＤＢｌ６また
はｐＭａｅ２からの発現はＥ．ｃｏｌｉ　　ＢＬ２１（
ＤＥ３）に対して毒性である。この毒性は、次に、ＨＩ
Ｖプロテアーゼを阻害する因子を同定する方法を示唆す
る．ＨＩＶプロテアーゼの見掛けの毒性は、その固有の
酵素活性のためであるか、あるいはこのタンパク質のあ
る他の効果のためであろう。この問題の回答は、ＢＬ２
１　（ＤＥ３）の生存能力ある形質転換体についてスク
リーニングすること６こよりＨＩＶプロテアーゼの突然
変異体を単離することによって得られる。ＨＩＶプロテ
アーゼ中への突然変異を導入するために、プラスミドｐ
ＰＤＢｌ６をまずＥ．ｃｏＬｉ菌株ＬＥ３０ｍｕｔＤ（
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリーニュー
ヨーク州コールドｅハーバー）中に形質転換する。この
菌株は野生型と比較してｌＯエ〜ｌ０１より高い頻度の
自発的突然変異を有する。グラスミドは５０，０００の
プールしたＬＥ３０ｍｕｔＤの形質転換体から調製され
、そしてこの集合的プラスミドをＢＬ２　１　（ＤＥ３
）の形質転換に使用する。ほぼ１５０コロニーが得られ
る。これらのコロニーは、細胞を０５メチオニンでＩＰ
ＴＧの存在下に標識し、次いで前述の系を使用するＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラ７イーにより、Ｈ
ＩＶプロテアーゼの産生について検査する。第２図に示
すように、これらの推定上の突然変異体は野生型クロー
ンについて観察される１０ｋｄタンパク質を産生しない
。その代わりに、それらは１８ｋｄ　（レーンＭ３、Ｍ
４、Ｍ５）のタンパク質あるいはｌ　８ｋｄより小さい
タンパク質を産生ずるが、１０ｋｄ（レーンＭ２、Ｍ６
、Ｍ７）を産生じない。これらのタンパク質はＩＰＴＧ
を使用する誘発とのときにのみ観察され、それらはＴ７
プロモーターの制御下にあることを示す。さらに、これ
らの推定上の突然変異体から単離されたグラスミドをＥ
．ｃｏｌｉからのＤＮＡ依存性転写一翻訳系に添加し、
標識した細胞中に見られるものと同一の大きさのタンパ
ク質はＴ７ＲＮＡポリメラーゼの存在下においてのみ観
察される。

特定の遺伝子の病変が誘発可能なタンパク質の変更した
大きさと相関関係があるかどうかを決定するために、各
推定上の突然変異体のＨＩＶ　　ＤＮＡインサートを配
列決定する。ＢＬ２１（ＤＥ３）生き残りの第１群は１
　８ｋｄのタンパク質を産生ずる８つのクローン（Ｍ３
、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ８、Ｍ９、Ｍ１２、Ｐ２、およびＰ５
）、１８ｋｄより小さいタンパク質を産生ずる７つのク
ローンＣＭ２、Ｍ６、Ｍ７、ＭＩＯ，ＭＩＬ　Ｐ４９お
よびＰ７４）、およびＩ　ＰＴＧで誘発したときタンパ
ク質を産生しない３つのクローン（Ｍｌ、Ｐ３、および
Ｐ２６から構成されている。

配列決定の結果を表ＸおよびＩＩＩに示す．表ＩＩはＨ
ＩＶプロテアーゼのナンセンス突然変異を表す。

表ＩＩ Ｐ２６　　　　　ＣＡＧ　−”　　ＵＡＧ，　ｎｔ　６
０Ｍ７　　　　　　ＣＡＡ　−＝　　ＵＡＡ，　ｎｔ　
２２５Ｐ４９　　　　　ＣＣ；Ａ−ｈＵＧＡ，　ｎｔ　
２２ｇＭ１０．ＭＩＩ　　Ｇの挿入，　ｎｔ　２５９，
　Ｕ（；Ａ．　ｎｔ　２９３Ｍ２　　　　　Ｇの欠失，
　ｎｔ　３５２，　ＵＡＡ．　ｎｔ　３７３Ｐ７４　　
　　Ｇの挿入，　ｎｔ　３５３，　ＵＧＡ，　ｎｔ　３
８３Ｍ６，Ｐ５２　　　ＣＡＧ　−”　　ＵＡＧ，　ｎ
ｔ　３８７表ＩＩ。ＢＬ２１　（ＤＥ３）生き残りから
のｐＰＤＢｌ８の全体のｓｏｏｂｐのプロテアーゼイン
サートをＤＮＡ配列の分析にかけ、そして未或熟の停止
コドンを同定する．クローンＰ２６は２ｋｄの切頭プａ
テアーゼを工冫コードし、このプロテアーゼは、多分そ
の大きさが小さいのために、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質の
ｌＩ［識のとき検出されない．各他のクローンは標識づ
けにより検出される１８ｋｄより小さい夕冫バク質をエ
ンコードスル（曽照、填２Ｂ閏、レーンＭ９−　ＭＲ−
　ＦＩＪ７）１　８ｋｄより小さいタンパク質を産土す
る各クローンは、未戊熟の翻訳停止コドンを含有する（
表ＩＩ）。クローンＭ６、Ｍ７、およびＰ４９の未戊熱
の停止コドンは、Ｃ−Ｕの翻訳から生ずる。

クローンＭ２、ＭＩＯ，Ｍｌｌ、およびＰ７４について
、５または６Ｇのストレッチ（ｓｔｒｅｃｔｈ）内のＧ
結果の挿入または欠失は、示すように停止導くであろう
、翻訳の７レームシ７トを生ずる（表ＩＩ）。各場合に
おいて、トランジションまたはフレームシフトが起こる
かどうかにかかわらず、ＤＮＡ配列から予測されるプロ
テアーゼの大きさは誘発のとき観測されるタンパク質の
大きさときわめてよく一致する（第２Ｂ図）。

ＩＰＴＧを使用する誘発のとき標識されたタンパク質を
明らかに産生じないクローンＰ２６は、ヌクレオチド６
１に未戊熟の翻訳停止コドンを含有することが示された
（表ＩＩ）。この構成の誘発のとき期待される切頭タン
パク質はほぼ２ｋｄであり、そしてプロッチ（Ｐ１０ｔ
ｃｈ）ら（ｌ９）のそれに基づく、使用するゲル系によ
り分解するためには小さすぎる。クローンＭｌ８よびＰ
３は、また、ＤＮＡ配列の分析にかけ、そして野生型プ
ロテアーゼを工冫コードすることが発見された。全体の
プラスミドを菌株ＬＥ３０ｍｕｔＤ中で突然変異誘発さ
せるので、これらのクローンは、Ｔ７プロモーターの制
御下の遺伝子からの転写または翻訳を防止する｝ＩＩＶ
プロテアーゼ領域より外側の突然変異、例えば、プロモ
ーター領域それ自体またはリポソーム結合部位において
突然変異を含有することができる（２ｌ）。

１８ｋｄのタンパク質を産生ずる各クローンについて、
単一のアミノ酸置換に導く単一のヌクレオチドの突然変
異はＤＮＡの配列決定により検出される（表１　１　１
）。ｌ８クローンの第１群を使用するこれらの最初の結
果が得られた後、誘発のとき１８ｋｂのタンパク質を産
生ずるクローンのいんを詳細に検査する。各突然変異に
ついて決定された特定のアミノ酸の変化を表ＩＩＩに要
約する。

表ＩＩＩ クローン 位置 突然変異 ヌクレオチド　アミノ酸 Ｐ５７ Ｐ４６ Ｐ１２．Ｐ３７ Ｐ３２ Ｐ２９ Ｍｌ２ Ｐ４８ Ｐｌ５ ＵＣＣ−ＵＵＣ Ｓｅｒ　　Ｐｈθ ＣＡＧ−ＣＧＧ Ｇｉｎ　　Ａｒｇ ＡＵＧ−ＡＡＣ １１ｅ　　Ａｓｎ ＡＵＡ−ＡＣＡ ｌｉｅ　　Ｔｈｒ ＧＣＵ−ＡＣＵ Ａｌａ　　丁ｈｒ ＧＧＡ−ＡＧＡ ＧＩＹ　　Ａｒｇ ＧＡＵ４ＧＧＵ Ａｓｐ　Ｇｌｙ ＡＣＡ→ＧＣＡ ↑ｈｒ　　Ａｌａ ＰＩ，Ｐ５，Ｐ８０ Ｐ６６ Ｍ３　，　Ｍ５ Ｐ３１．Ｐ４４ Ｐ２４ Ｐｌ３，Ｐ４７，Ｐ６ｇ 旧，Ｐ７３ Ｐ４５．Ｐ７９ ＵＵＧ−ＵＣＧ Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ ＡＡＡ−ＧＡＡ Ｌｙｓ　　Ｇｌｕ ＡＵＡ−ＡＣＡ １１ｅ　　Ｔｈｒ ＡＵＵ−ＡＣＬＴ ｌｉｅ　　Ｔｈｒ ＵＡＵ−ＩＣＡＵ Ｔｙｒ　　Ｈｉｓ ＧＡＵ−ＧＵＵ Ａｓｐ　Ｖａｔ ＡＵＣ−ｈＡＣＣ ｌｉｅ　　Ｔｈｒ ＧＧＵ−ＧＡＵ Ｇｌｙ　Ｈｉｓ ＡＣＡ−ＡＬＩＡ Ｔｈｒ　　Ｉｌｅ ＵＵＡ４ＵＣＡ ■ｏ．Ｉ　Ｃ：ｌ，い Ｐ２．Ｐ８　　　　　　　４３６　　　　　　　７７　
　　　ＧＵＡ−ＧＣＡＶａｌ　　Ａｌａ Ｐ２２　　　　　　　　　４４２　　　　　　　７９　
　　　ＣＣＵ−ＣＵＵＰｒｏ　　Ｌｅｕ Ｐ３８　　　　　　　　　４６０　　　　　　　８５　
　　　　ＡＵＵ−ＡＣＵｌｉｅ　　Ｔｈｒ Ｐ９　　　　　　　　　　４６３　　　　　　　８６　
　　　　ＧＧＡ→ＧＡＡＧｌｙ　Ｇｌｕ Ｐ５０　　　　　　　　　４６５　　　　　　　８７　
　　　　ＡＣ；Ａ−ＧＧＡＡｒｇ　Ｇｌｙ Ｐ２７　　　　　　　　　４８４　　　　　　　９３　
　　　　ＡＵＵ４ＡＣＵＩＩｅ　Ｔｈｒ 表ＩＩＩ。ｌ　８ｋｂのタンパク質の前駆体を産生する
ＢＬ２１　（ＤＥ３）生き残りからのｐＰＤＢｌ６の全
体の５００ｂｐのプロテアーゼインサート（参照、この
説明および第２Ｂ図）をＤＮＡ配列の分析にかけ、そし
て単一の点突然変異を各クローンにおいて同定する。ヌ
クレオチドおよびアミノ酸の番号を第１図に記載する。

すべてにおいて、２４の異なる点突然変異を同定する。

これらの突然変異の６つ、すなわち、アミノ酸Ｉ１ｅ　
　３、ｌｉｅ　　４７、ｌｉｅ　　５０、Ｇｌｙ　　７
３、Ｔｈｒ　　７４およびＶａｌ　　７７における突然
変異を２つの独立のクローンにおいて同定される。Ｌｅ
ｕ　　３８およびＩｌｅ　　６６における突然変異の各
々は３つの独立のクローンにおいて同定される。突然変
異はある他の既知の突然変異（例えば、Ａｓｐ２５にお
ける突然変異）を得ないで再分離されるので（４、５）
、突然変異誘発したプラスミドのプールから姉妹プラス
ミドを検出することができる。

これらの突然変異のあるものをＨＩＶプロテアーゼ内の
アミノ酸の提案した機能に従い群に分けることができる
。トリプレットＡｓｐ％Ｔｈ　ｒ，およびＧ１ｙは、ア
スパルチルプロテアーゼの族を通じて保存され（８）そ
して残基２５、２６、および２７におけるＨＩＶプロテ
アーゼの活性部位を突き止めることを促進する。これら
の残基におけるか、あるいはそれらの付近の突然変異は
、プロテアーゼを触媒部位の崩壊により酵素的に不活性
とするであろう、ＨＩＶプロテアーゼの三次元の構造は
最近解明され、そしてＡｌａ　　２２、Ｇｌｙ　　２７
、Ａｓｐ　　２９、Ｔｈｒ　　３１，１１ｅ　８５、ｃ
ｒｙ　　８６、およびＡｒｇ　　８７における本発明の
突然変異は活性部位の裂け目（ｃｌｅｆｔ）内に存在す
ると思われる。本発明において、また、プロテアーゼ内
の水素結合に参加することが提案されているアミノ酸中
に、Ａｌａ　　２２、Ｌｙｓ　　４５、Ｉｌｅ　　４７
、Ｉｌｅ６６、Ｇｌｙ　　７３、Ｖａｔ　　７７、およ
びＩ１ｅ　８５を包含する、突然変異が発見された。

最後に、プロテアーゼは、多分、Ｘ線結晶構造に基づく
二量体であり（１０、２４）、そして本発明におけるＧ
ｌｙ　　２７、Ｉｌｅ　　５０、および１１ｅ　　９３
に８ける突然変異は二量体の形虞を妨害するであろう。

レブ（Ｌ　ｏ　ｅ　ｂ）ら（２５）は、ＨＩＶプロテア
ーゼのアミノ酸２ｌおよび４６の間の広範な部位特異的
突然変異を実施し、次いでプロセシング活性を決定した
。ほとんどのミスセンス突然変異は、レトロウィルスの
プロテアーゼの間に高度に保存される領域内のプロセシ
ングを壊滅した。これらの突然変異は、Ａｓｐ　　２９
→Ｇｌｙ，およびＴｈｒ　　３１−Ａｌａを包含し、本
発明の結果と一致する。しかしながら、レブ（Ｌｏｅｂ
）らのアプローチと対照的に、突然変異を単離する本発
明の方法は、非機能的プロテアーゼについてのみ選択す
るように思われる。レこれはブ（Ｌｏｅｂ）らが決定し
たアミノ酸２１−４６中の３１突然変異と一致し、これ
ら突然変異はプロセシングをほとんどあるいはまったく
もたなかった。これらの突然変異のいずれも本発明のス
クリーンと通って出てこない。本発明の結果は、また、
プロテアーゼ全体を通じた点突然変異が、保存された領
域の外部にあり、酵素の活性を破壊することができるこ
とを示す（表ＩＩＩ）。

クラウスリッチ（Ｋｒａｕｓｓｌｉｃｈ）ら（２６）は
、１８ｋｄのＨＩＶプロテアーゼからのカルボキシ末端
の１７アミノ酸の欠失が、或熟１０ｋｄプロテアーゼを
遊離するであろう自己消化を防止することおよび、さら
に、前駆体がｇａｇ基質トランス（ｔｒａｎｓ）におい
て切断することができないことを示した。同様な結果は
ハンセン（Ｈａｎｓｅｎ）ら（２７）により得られた。

本発明の点突然変異のうちの４つ、すなわち、■１ｅ　
　８５、Ｇｌｙ　　８６、Ａｒｇ　　８７、およびＩＩ
ｓ　　９３において点突然変異は、これらの１７力ルボ
キシ末端のアミノ酸内に存在する。

本発明の結果は、１８ｋｄのプロテアーゼ前駆体が自己
消化することができなく、そして明らかにＢＬ２　１　
（ＤＥ３）に対して毒性でないことを示す。続く議論に
より拘束されないで、本発明において、１０ｋｄの戊熟
プロテアーゼは同定されない必須Ｅ．ｃｏｌｉタンパク
賞を消化することによってその毒性作用を及ぼし、そし
て１８ｋｄの前駆体はこの消化を実施することができな
いことが提案される。戒熟した１０ｋｄのプロテアーゼ
を発生することができないことは、触媒活性に要求され
るアミノ酸の突然変異から生ずるか、あるいは切断可能
なＰｈｅ−Ｐｒｏ結合（或熟プロテアーゼのアミノ酸−
ｌ〜＋１に位置する）の崩壊から生ずることができ、こ
うして１８ｋｄの前駆体の自己消化は起こることができ
ないであろう。

本発明において、Ｓｅｔ−４、Ｇｌｎ　　２、およびＩ
ｌｅ　　３における突然変異（表ＩＩ）はｐｈｅ−Ｐｒ
ｏ結合を切断不可能とすることが提案される。レブ（Ｌ
　ｏ　ｅ　ｂ）ら（２５）はｐｏｌポリタンパク質（こ
れはプロテアーゼ、逆トランスクリプターゼ、およびエ
ンドヌクレアーゼをエンコードする）の部位特異的突然
変異を使用して、上流のＰｈｅ−Ｐｒｏ結合に置換を導
入した。１つのクラスの突然変異は自己消化に欠けるが
、なお非突然変異の逆トランスクリプターゼおよびエン
ドヌクレアーゼの境界で切断することができる。

このプロセシングは、少量の検出されない戊熟プロテア
ーゼからか、あるいは活性を保持した前駆体から生ずる
。戊熟ゾロテアーゼを遊離することができない他のクラ
スの突然変異は、また、逆トランスクリブターゼおよび
工冫ドヌクレアーゼを発生するためには切断において非
効率的である。

ＢＬ２　１　（ＤＥ３）の安定な形質転換のための要件
である、本発明の突然変異を検出する方法は、酵素的に
不活性である１　８ｋｄの前駆体について選択すること
ができる。

ＢＬ２　１　（ＤＥ３）の生存能力尤の戊熟プロテアー
ゼの作用を直接検査するために、本発明はｌＯｋｄのプ
ロテアーゼのみをエンコードし、前駆体の自己消化の必
要性をバイパスするプラスミドを構成する（第１図）。

表！Ｂに示されているように、野生型ＨｒＶの１　０ｋ
ｄプａテアーゼのグラスミド（ｐＭａｅ２）は菌株ＢＬ
２１　（ＤＥ３）を首尾よく形質転換することができな
いが、ＢＬ２１　（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを形質転換する
ことができる。プラスミドｐ　Ｐ　４　８　Ｍ　ａ　ｅ
　５は、アミノ酸２９に点突然変異をもつプロテアーゼ
をエンフードし（表ＩＩＩ）、両者のＥ．ｃｏｌｉ菌株
を形質転換することができる。

ＨＩＶプロテアーゼがＢＬ２　１　（ＤＥ３）に対して
毒性であるというそれ以上の証拠は、ＩＰＴＧの存在下
の培養物の生き残りの検査により提供される。この実験
において、野生型プロテアーゼ（ｐ　ＰＤＢ　ｌ　６）
または突然変異プロテアーゼ（ｐＰ４８）を収容するＢ
Ｌ２　１　（ＤＥ３）ｐＬｙ　ｓＳ細胞の培養物を対数
中期に増殖し、そしてプロテアーゼの合皮を［　ＰＴＧ
で誘発する。生存能力のある細胞の数を、培養物のアリ
コートをコロニー形戊単位に平板培養することによって
決定する。

１．０ミリモルまたは０．１ミリモルのＩ　ＰＴＧに３
０分間暴露した後、野生型プロテアーゼを収容する細胞
は、未処理細胞と比較して、ほぼ４対数の殺しを経験す
る。対照的に、突然変異プロテアーゼを収容する細胞は
Ｉ　ＰＴＧの添加により影響を受けない。これらのデー
タが示すように、ＨＩＶプロテアーゼはＢＬ２　１　（
ＤＥ３）に対して極めて毒性である。同様に、野生型の
ｌ　Ｏｋｄのプロテアーゼをエンコードするプラスミド
（ｐＭａｅ２）を収容する細胞は、対応する突然変異グ
ロデアーゼをエンコードするプラスミド（ｐＰ４８　Ｍ
　ａ　ｅ　６　）を収容する細胞よりも、Ｉ　ＰＴＧに
対して有意により感受性である。

プラスミドｐＰ４８を収容するＥ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２
１　（ＤＥ３）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション（ｔｈｅ　　Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐ
ｅ　　Ｃｕｌｔｕｒｅ　　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に受
託され、モしてＡＴＣＣ受託番号６８００４を割り当て
られた。このプラスミドを収容する菌株を次の１つの方
法に付してｐＰ４８を欠失して、ｌ：．ｃｏｌｉ菌株Ｂ
Ｌ２１（ＤＥ３）を残すことができる（２８、２９）。

■）プラスミドの複製を優先的に阻害する因子、例えば
、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、クイナタリン
、または臭化エチジウムを使用するキュアリング：例え
ば、ＢＬ２　１　（ＤＥ３）／ｐＰ４８を液状培養物中
で一夜増殖する。この培地はＮ　ａ．　Ｏ　ＨでｐＨ７
．６に調節したｌ　Ｏ　ｇ／Ｑのペプトンおよび１　０
　ｇ／Ｑの酵母エキスである。

次いで、１０４／Ｑの細胞を１０〜１００μｇ／ｍ＋２
（１０μｇ　／　ｍ　Ｑの増分）のアクリジンオレンジ
を含有するｌ系列の管中に接種する。この培養物を暗所
で３７℃において一夜インキユベーシヨンする。増殖を
示した最高磯度のアクリジンオレンジを含有する培養物
からのＬＢ平板上に、細胞をストリーキングする。個々
のコロニーをカナマイシン抵抗性について試験する。カ
ナマイシン感受性であるコロニーはｐＰ４８を損失して
いるので、Ｅ．ｃｏｌｉｌ株ＢＬ２　１　（ＤＥ３）の
みが残る。

２）自発的キュアリング：例えば、ＢＬ２１（ＤＥ３）
／ｐＰ４８をカナマイシンを欠＜ＬＢグロス中で数回定
常期に増殖させる。細胞をＬＢ平板上にストリーキング
する。個々のコロニーをカナマイシン抵抗性について試
験する。カナマイシン感受性であるコロニーはｐＰ４８
を損失しているので、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１　（Ｄ
Ｅ３）のみが残る。

３）ＤＮＡジャイレースを阻害する因子、例えば、クメ
ルマイシンまたはノボビオシンを使用するキュアリング
：この方法はアクリジンのキュアリングと同一であるが
、ただしキュアリング因子はｌ〜７μｇ　／　ｍ　Ｑで
使用する。

４）この方法はＲＮＡポリメラーゼを阻害する因子、例
えば、り７アンビシンを使用するキュアリング：この方
法はアクリジンのキュアリングと同一であるが、ただし
キュアリング因子は５〜ｌＯμｇ／ｍＱで使用する。

１８ｋｄまたはｌＯｋｄのプロテアーゼの野生型または
突然変異の変異型をエンコードするプラスミドを収容す
る細胞によりＩ　ＰＴＧの誘発のとき産生されるタンパ
ク質の量を、３ＩＳメチオニンの標識つけおよび免疫沈
澱により、次いでゲル電気泳動およびオートラジオグラ
７イーにより検査する（第４図）。それぞれ、１８ｋｄ
の前駆体およびｌＯｋｄのプロテアーゼをエンコードす
る、突然変異ｐ４８およびｐＰ４８Ｍａｅ６（レーン２
および４）は、対応する野生型クローンＰＤＢ（レーン
ｌ）およびＭａｅ２（レーン３）よりｌＯ＠多い産生ず
ることが推定される。突然変異と比較して、産生される
野生型プロテアーゼの量の減少は、多分Ｉ　ＰＴＧを使
用する誘発のとき野生型プロテアーゼの殺しのためであ
る（第３図）。

しかしな力【ら、予期せざることには、突然変異はなお
非常に低いレベルのプロテアーゼまたは前駆体を、それ
らの毒性の欠如にかかわらず、産生する。突然変異は対
応する部位のクーマッシープルーの染色により検出する
ことができない。異なる遺伝子はＴ７系において異なる
効率で発現される（２ｌ）ので、その毒性が明らかに軽
減されるときでさえ、過剰産生ずるＨＩＶブロテアーゼ
に対するバリャーが存在することがある。

ＨＩＶプロテアーゼは種々のＥ．ｃｏｌｉ　　Ｋ１２菌
株中で首尾よく発現された（５、６、７、９、２７）が
、少ナくトもＨＢ　ｌ　０　１　ｉ：オ１，’テ、プロ
テアーゼ合成の誘発のとき増殖の阻害は報告された（３
０）。ＨＩＶプロテアーゼは、Ｅ．ｃｏ＋ｉ　　Ｂ菌株
であるＢＬ２１　（ＤＥ３）に対してことに毒性である
ことがある。Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２　１　（ＤＥ３）２　
１に対するＨＩＶプロテアーゼの毒性は、゛プロテアー
ゼが機能的に適切であることを示すと思われる。この出
願に報告されている結果と対照的に、クラウスリッチ（
Ｋ　ｒ　ａ　ｕｓｓｌｉｃｈ）ら（１５）はリゾチーム
のプラスミドを欠く菌株ＢＬ２　１　（ＤＥ３）中のＨ
ＩＶプロテアーゼの発現を報告している。クラウスリツ
チ（Ｋ　ｒ　ａ　ｕ　ｓ　ｓ　１　ｉ　ｃ　ｈ）らのプ
ロテアーゼ構成体と本発明のそれとの間の差は、ＢＬ２
１（ＤＥ３）がｐ　ＰＤＢ　ｌ　６により形質転換する
ことができないという一定した観察を説明することがで
きる。本発明の１８ｋｄの前駆体のアミノ末端は、単一
のメチオニン残基により先行されるｐｏｌ遺伝子のコド
ンｌであるが、タラウスリッチ（Ｋｒａｕｓｓｌｉｃｈ
）らのそれはファージＴ７遺伝子１０から１２アミノ酸
により先行されるｐｏｌ遺伝子のコドン５である（２６
）。さらに、本発明の新規なプロテアーゼ構成体はカナ
マイシンに対する抵抗性をエンコードするが、アンビシ
リンに対するそれを工冫コードしないグラスミド上に存
在する。しかしながら、プロテアーゼは、また、アンピ
シリン抵抗性を特定しないベクター上に導入するとき、
ＢＬ２　１　（ＤＥ３）に対して毒性であり、ＨＩＶプ
ロテアーゼの推定上の標的は多分カナマイシン抵抗性を
与えるホスホトランスフエラーゼではない。

ベプチド基質を使用する最近の研究は、ＨＩＶプロテア
ーゼによる切断について同定された最小の配列の要件を
有し、そして７程度に少ないアミノ酸は十分である（１
１１２、１６）。こうして、プロテアーゼの推定上の標
的であるバクテリアのタンパク質は、自然ｇａｇおよび
ｐｏ１基質に対する相同性を有することはほとんど必要
ではない。Ｅ．ｃｏｌｉＩｉ株ＢＬ２１　（ＤＥ３）に
対するＨＩＶプロテアーゼの毒性は、この重要なウィル
スの酵素の突然変異を単離する方法、および、より重要
ことには、ＨＩｖの感染の治療に有用なプロテアーゼ阻
害因子についてスクリーニングする可能性を提供する。

本発明は、ＨＩＶプロテアーゼのグラスミドｐＰＤＢｌ
６およびｐＭａｅ２がＥ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２　１　（
ＤＥ３）を首尾よく形質転換することができないことを
実証する（表■）。スクリーンとして、これらの形質転
換は潜在的ＨＩＶプロテアーゼ阻害因子の存在下に試み
られる。首尾よい形質転換はプロテアーゼの阻害因子を
同定する働きをする。他の実験において、本発明は、ま
た、ＨＩＶプロテアーゼを工冫コードする７アージはＥ
．ｃｏｌｉｌｉ株ＢＬ２　１　（ＤＥ３）Ｆ＋をトラン
スフェクションすることができないことを実証する。こ
れらのトランス７エクシ３ンは、また、潜在的ＨＩＶブ
ロテアーゼ阻害因子の存在下に試みられる。

スクリーニングの第１の方法は、ＨＩｖプロテアーゼの
プラスミドｐ　ＰＤＢ　ｌ　６またはｐ　Ｍ　ａ　ｅ２
を使用して形質転換したＢＬ２１　（ＤＥ３）ｐＬｙｓ
Ｓの使用を包含する。Ｉ　ＰＴＧによりプロテアーゼの
合成の誘発は、第４図において実証されるように、これ
らの細胞を殺す。潜在的プロテアーゼ阻害因子は、誘発
された細胞の死亡を防止することができる。

第ｌのＨＩＶプロテアーゼのスクリーニング方法を使用
する前の実験は、ポリオプロテアーゼの阻害を同定する
ために適合することができる。本発明のこの実施態様の
出発材料は、ポリオウィルスｌ型（Ｍａｈｏｎｅｙ菌株
）であり、これはアメリカン・タイプ・カルチャー・フ
レクション（ｔｈｅ　　Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ
　　Ｃｕｔｔｕｒｅ　　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に前に
受託されており、そしてＡＴＣＣの受託番号ＡＴＣＣＶ
Ｒ−５９を割り当てられている。このポリオウィルスの
菌株を使用して、後述するｌ系列の工程によりポリオプ
ロテアーゼ３Ｃを発生させる。

要約すると、ポリオウィルス菌株ｌをまず使用してプラ
スミドｐＴ７ｐｖｌ−５を発生させる（３ｌ）。このプ
ラスミドは、前述のＴ７プロモーターの制御下にポリオ
ウィルス菌株ｌのための全体のｃＤＮＡ配列を含有する
。次いで、ポリオプロテアーゼ３Ｃをこのプラスミドか
らサブクローニングする。

詳しくは、第１工程において、ｃＤＮＡをポリオウィル
ス菌株ｌかも調製し、そして標準の技術によりＴ７ベク
ター中にサブクローニングしてｐＴ７ｐｖｌ−５を構成
する。ポリオプロテアーゼ遺伝子（ヌクレオチド５４３
８−５９８６）を、プラスミドｐＴ７ｐｖ！−５からＡ
ｓｕＩ制限断片（ヌクレオチド５４３５−５９５３）と
して切除する。合或オリゴヌクレオチドを使用して、上
流および下流の解読配列を再びつくり、そして翻訳開始
コドンおよび停止コドン、ならびに第１図に関して前述
のＮｄｅｌおよびＢａｍＨＩ制限部位を形戊する。この
手順に従い、Ｔ７プロモーターの制御下にポリオプロテ
アーゼ３Ｃを有するプラスミドが生ずる。

ＨＩＶプロテアーゼを使用する実験類似する実験におい
て、ポリオプロテアーゼ３Ｃは、また、Ｅ．ｃｏｌｉ菌
株ＢＬ２　１　（ＤＥ３）に対して毒性である。下表Ｉ
Ｖに示すように、ポリオプロテアーゼ３Ｃを有するプラ
スミドはＢＬ２１（ＤＥ３）を首尾よく形質転換するこ
とができないが、ＢＬ２１　（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを形
質転換する。

対照プラスミドｐＰａｌｌ（表■に記載するようにポリ
オボリメラーゼをエンコードする）は、ほぼ等しい効率
で両者の菌株を形質転換する：表ＩＶ ｐＰｏ　１　ｉ　ｏプロテアーゼ３Ｃ　　　０　　　　
　１５０ｐＰａｌｌ これらのデータが示すように、ポリオブロテアーゼ３Ｃ
は、ＨＩＶプロテアーゼと同様に、Ｔ７プロモーターの
制御下に配置されるとき、このＥ．ｃｏｌｉ菌株、ＢＬ
２　１　（ＤＥ３）に対して毒性である。したがって、
ボリ才プロテアーゼ阻害因子についてスクリーニングす
る方法は容易に案出することができる。このようなスク
リーンにおいて、試験すべき化合物は、バクテリア菌株
ＢＬ２１（ＤＥ３）の殺しを防止し、そしてポリオプロ
テアーゼ３Ｃを工冫コードするプラスミドによるその菌
株の形質転換を首尾よく可能とすることによって、ポリ
オプロテアーゼ阻害因子であることが示される。

次に、ＨＩｖプロテアーゼおよびポリオプロテアーゼ３
Ｃを使用する結果はプロテアーゼ阻害因子のための遺伝
子のスクリーンの基準を提供する。

ヒトの病気に関係付けられてきている他のプロテアーゼ
を阻害する化合物、例えば、ヒトのレニン、トリプシン
およびエラスターゼはとくに重要である。

特定の標的プロテアーゼをプラスミド中にＴ７プロモー
ターの制御下に配置する。次に、この系は、菌株ＢＬ２
１　（ＤＥ３）　ｐＬ４ＳＳが形質転換されるようにさ
え、その菌株を形質転換することができないことによっ
て、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に対して毒性
であることが示される。次いで、潜在的プロテアーゼ阻
害因子の化合物をスクリーニングする。阻害活性を有す
る化合物は、ＢＬ２１（ＤＥ３）に対するプロテアーゼ
の毒性を遮断し、これによりその菌株の形質転換を可能
とするものであろう。

プロテアーゼ酵素の阻害因子についてスクリーニングす
る第２の方法は、プロテアーゼ切断部位を導入したリポ
ータータンパク質（アッセイ容易なタンパク質を意味す
る）からなる融合タンパク質の構成に関する。切断部位
は問題のプロテアーゼの自然基質の一部分に相当する。

選択したリポータータンパク質は、プロテアーゼ酵素と
組み合わせたとき、色、光または活性の変化についてア
ッセイすることができる。切断部位を導入してプロテア
ーゼの「切断カセット」をつくることは、リポータータ
ンパク質の活性を破壊しない。こうして、融合タンパク
質はアッセイ系において使用してプロテアーゼ阻害因子
についてスクリーニングすることができる。

プロテアーゼ酵素をプロテアーゼ切断部位を含有する融
合タンパク質に添加するとき、プロテアーゼはプロテア
ーゼ部位において切断し、これによりリポータータンパ
ク質を不活性化する。この活性の損失は色の変化、光の
変化によるか、あるいは活性の損失を直接監視すること
によって監視する。スクリーニングすべき化合物をアッ
セイ系に含め、そしてリポータータンパク質が切断され
ず、そして前述の方法のいずれによって監視するとき、
活性を維持する場合、プロテアーゼ阻害因子として同定
される。

融合タンパク質の構成に利用されそして色指示化合物を
使用して色の変化を監視することによってアッセイされ
る、リポータータンパク質の例は、β−ガラクトシダー
ゼ、アルカリ性ホス７アターゼ、β−グルクロニダーゼ
およびアセチルトランスフェラーゼを包含する。この系
は抗体抵抗性を特定するタンパク質、例えば、β−ラク
タマーゼに適合させることができる。本発明の好ましい
実施態様において、β−ガラクトシダーゼをリポーター
タンパク質として使用する。

Ｅ．ｃｏｌｉの１ａｃＺ遺伝子によりエンコードされる
β−ガラクトシダーゼ酵素は、ラクトースをグルコース
およびガラクトースへの転化の因子であり、炭素源とし
てラクトースの利用を可能とする（３２）。β−ガラク
トシダーゼは、また、着色した化合物に転化されるいく
つかの他の基質の加水分解を触媒するので、β−ガラク
トシダーゼは広い範囲の生物学的プロセスを監視するた
めの道具として価値がないことが証明された。例えば、
β−ガラクトシダーゼの融合は転写および翻訳の調節の
研究に使用されてきている（３３、およびその中の参考
文献）。β−ガラクトシダーゼへの異種のタンパク質の
融合は、そのタンパク質の精製を促進する（３４〜３７
）。さらに、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端の中断
は、ｐＵＣプラスミド系列を使用するとき、所望のコロ
ニーの同定の基準である（３８）。

外来タンパク質配列をβ−ガラクトシダーゼの特定の領
域中に挿入し、β−ガラクトシダーゼの活性を保持しか
つプロテアーゼへの外来配列のアクセスを可能とするこ
とができるという、本発明において発見は新規である。

プロテアーゼの切断カセットの特定の場合において、β
−ガラクトシダーゼが今度は切断され、そして同種のプ
ロテアーゼにより不活性化されうるという事実は、プロ
テアーゼ活性を監視しかつこれらの重要な酵素の阻害因
子を探索する手段を提供する。

適当な色指示化合物の例は、Ｘ−ｇａｌおよびファスト
・ブルー（Ｆａｓ　ｔ　　ｂ　Ｉｕｅ）ＲＲを包含する
。夕冫バク質、例えば、β−ガラクトシダーゼはＸ−ｇ
ａｌと反応して青色を生或する；タンパク質が不活性化
されるとき、色の変化は観察されない（白）。タンパク
質とファスト・プル−ＲＲとの同様な反応は赤色を生成
する；不活性化のとき、色の変化は観察されない（自）
．あるいは、タンパク質が生物発光または化学発光の有
機体から誘導されたタンパク質の光を放射する化学反応
を触媒するように、タンパク質を選択する。しかしなが
ら、夕冫バク質がプロテアーゼ酵素により切断されると
き、反応は・起こらず、光は放射されない。光は肉眼で
観察し、分光光度計で測定するか、あるいはＸ線７イル
ム上に記録することができる。好ましい実施態様におい
て、使用するリポータータンパク質はルシフェラーゼで
ある。

さらに、プロテアーゼによる不活性化は、基質との反応
においてタンパク質の活性を直接測定する、生体内系に
より監視することができる。

本発明の第２実施態様の変法のすべてにおいて、融合タ
ンパク質は適当な発現系において発現される。宿主はバ
クテリア、酵母曹、昆虫の細胞、啼乳動物の細胞系また
は任意の他の適当な宿主発現系である。好ましい実施態
様において、宿主はＥ．ｃｏｌｉの菌株である。

本発明の第２のスクリーニング方法の典型として、β−
ガラクトシダーゼでＨＩＶプロテアーゼの阻害因子につ
いてスクリーニングするアッセイ系の構成および使用を
ここで記載する。

最初の工程はβ−ガラクトシダーゼの遺伝情報を指定す
る遺伝子を含有するグラスミドを構成することである。

Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＭＣ１０６１（ａｒａＤ１３９、Δ（
ａｒａ，ｌｅｕ）７６９７、ΔｌａｃＸ７４、ｇａ　Ｉ
Ｕ，ｇａ　ＩＫ，ｈｓｄＲ，ｓｔｒＡは７アーマシア（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から入手する。Ｅ．ｃｏｌｉのβ
−ガラクトシダーゼを含有するプラスミドＰＺＭＩは、
ｐｃＨ１１０（７アーマシア）から誘導する。プラスミ
ドｐｃＦＨｌｌＯはＥｃｏＲ１部位を含有し、コノ部位
はβ−ラクタマーゼ遺伝子を含有するｐＣＦＨＩＩＯか
らの小さいＰｓｔｌ／ＢａｍＨＩ断片を、その断片上に
通常存在するＥｃｏＲＩ部位を欠＜ｐＢＲ３２２の変異
型からの対応するＰｓｔ１　／　Ｂ　ａ　ｍ　Ｈ　Ｉ断
片と置換することによって欠失される。次に、β−ガラ
クトシダーゼ遺伝子のカルボキシ末端を含有するＥｃｏ
ＲＩ／ＢａｍＨＩ断片を、オリゴヌクレオチド： ５’　ＡＡＴＴＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＧＣＣＧＧＴＣＧ
ＣＴＡＣＣＡＴＴＡＣＣＡＧＴＴＧＧＴＣＴＧＧＴＧＴ
ＣＡＡＡＡＡＴＡＡＴＡＡＧ３’３’　　　ＧＧＴＣＧ
ＡＣＴＣＧＣＧＧＣＣＡＧＣＧＡＴＧＧＴＡＡＴＧＧＴ
ＣＡＡＣＣＡＧＡＣＣＡＣＡＧＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴ
ＣＣＴＡＧ５’で置換し、これはβ−ガラクトシダーゼ
のカルボキシ末端を再びつくりそしてその遺伝子の末端
に２つの停止コドンを配置する。この生ずるプラスミド
をｐ　Ｚ　Ｍ　ｌと表示する。

次の工程は、各々がｔａＣプロモーターの制御下にある
、それぞれ、野生型および突然変異Ｈｌ■プロテアーゼ
を工冫コードするプラスミドを構成することである。こ
れらのプラスミド、ｐｌ＋ＩＱおよびｐｌ５−ＩＱと表
示する、は次のようにして＊Ｘする：前述のような、ｐ
Ｍａｅ２（野生型）またはｐＰ４８Ｍａｅ６（突然変異
）からのプロテアーゼ遺伝子を、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ
断片として切除し、クレノー酵素により平滑末端とし、
そしてｐＫＫ２２３−３　（ファーマシア）のＳｍａ部
位中に結合して、ｐｌ＋およびｐｌ５−をつくる。次い
で、Ｈｌ’／プロテアーゼ遺伝子を含有するｐｉ＋およ
びｐｌ５−からのＳｐｈｌ／ＡＩｗＮＩ断片を、ｐＧＥ
Ｘ２Ｔ　Ｃファーマシア）からのｌａｃｒＱ遺伝子を含
有するＰｖｕ　１／　Ａ　Ｉ　ｗ　Ｎ　Ｉ断片に結合し
、ｐｌ十ＩＱおよびｐ１５−ＩＱをつくる（第５図Ａ）
。ポリリンカーｐｌ＋ＩＱおよびｐｌ５−ＩＱ中のＢａ
ｍＨＩ制限部位を欠失するために、これらのグラスミド
を部分的にＢ　ａ　ｍ　Ｈ　Ｉで消化し、クレノー酵素
により平滑末端とし、そして結合する。生ずるプラスミ
ド、ｐｌ＋ｒＱＢおよびｐｌ５−ＩＱＢと表示する、は
ｔａｃプロモーターのすぐ上流に独特ＢａｍＨＩを含有
する。

その後、オリゴヌクレオチドをプラスミドｐＺＭ−１の
β−ガラクトシダーゼ遺伝子中に挿入することによって
、ＨＩＶプロテアーゼ切断部位をβ−ガラクトシダーゼ
中に挿入する。ｇａｇおよびｇａｇ／プールポリタンパ
ク質の異なる切断部位にまたがる合或ペプチドを使用す
る、いくつかの実験室からの研究において、ＨＩＶプロ
テアーゼによる切断のための最小アミノ酸配列の要件が
決定された（ＩＬｌ２、ｌ５、１６）。ｐ６／ＰＲ部位
は生体外で最も効率よく切断され、そして７程度に少な
いアミノ酸は切断のために十分である（１５）。これら
の最小の要件に基づいて、■系列のオリゴヌクレオチド
（「切断カセット」）を合虞する。これらのオリゴヌク
レオチドはｐ６／ＰＲ接合にまたがる１０アミノ酸に相
当し、そして、イン７レームで、プラスミドｐＺＭｌの
β一ガラクトシダーゼ遺伝子の６つの異なる位置中に挿
入するための適当な粘着末端を含有する（第５図Ｂ）。

デカペグチドＶａ　Ｉ−Ｓｅ　ｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐ
ｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｉ　　Ｉｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕは
、ＨＩＶ　　ｇａｇ／ｐｏｔポリタンパク質のｐ６／Ｐ
Ｒ切断部位に相当する。このデカベプチドをエンコード
する６対のオリゴヌクレオチド（「切断カセット」）を
合成する。オリゴヌクレオチドは通常、各オリゴヌクレ
オチド対中のデカペプチドを工冫コードする、Ｈｉｎｄ
ｌＩＩ制限部偉（下線を引いた）を含有する、下に示す
ＤＮＡ配列を有する： Ｖａｔ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇ
ｉｎ　ｌｉｅ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ５’ＧＴ．Ａ　ＡＧＣ　
ＴＴＴ　ＡＡＣ　ＴＴＣ　ＣＣＴ　ＣＡＧ　ＡＴＣ　Ａ
ＣＴ　ＣＴＧ　３’３’ＣＡＴ　ＴＣＧ　ＡＡＡ　ＴＴ
Ｇ　ＡＡＧ　ＧＧＡ　ＧＴＣ　ＴＡＧ　ＴＧＡ　ＧＡＣ
　５’各対は、９２Ｍ１のＥ．ｃｏｌｉのβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子の独特ＢｓｓＨ２、Ｃ　１　ａ　１　ｓ
Ｄｒａ　Ｉ　Ｉ　Ｉ％ＥｃｏＲＩ，Ｓａｕ　１またはＳ
ｓ（■制限部位中に、適切なリーディングフレームで、
挿入するために設計した異なる粘着末端を特定する追加
のヌクレオチドを含有する（第５図Ｂ）。

β−ガラクトシダーゼ中の６つの異なる部位を選択する
。なぜなら、それらはｐ　Ｚ　Ｍ　ｌ内の独特制限部位
であるからである。そして、切断カセットは後述する簡
素化したクローニング手順により挿入することができる
。６対のオリゴヌクレオチドの完全なＤＮＡ配列は、次
の通りである（ＨＩＶ切断部位は括弧で区切ってある）
： ＥＣＯＩ／２　（ｘＲ［粘着末端）： ５’　ＡＡ　ＴＴＴ　［ＧＴＡ　ＡＧＣ　ＴＴＴ　ＡＡ
Ｃ　ＴＴＣ　ＣＣＴ　ＣＡＧ　ＡＴＣＡＣ：Ｔ　ＣＴＧ
ＩＣ　　　　３’ ３’　　　　Ａ　［ＣＡＴ　ＴＣＧ　ＡＡＡ　ＴＴＧ　
ＡＡＧ　ＧＧＡ　ＣＴＣ　ＴＡＧＴＧＡ　ＧＡＣＩ　Ｇ
ＴＴ　ＡＡ　５’ＳＳＴＩ／２　（ｘｓｓｔｌ粘着末端
）：５’　　　　Ｇ　［ＧＴＡ　ＡＧＣ　ＴＴＴ　ＡＡ
Ｃ　ＴＴＣ　ＣＣＴ　ＣＡＧ　ＡＴＣＡＣＴ　ＣＴＧＩ
ＣＡＧ　ＣＴ　３’ ３’　ＴＣ　ＧＡＣ　［ＣＡＴ　ＴＣＧ　ＡＡＡ　ＴＴ
Ｇ　ＡＡＧ　ＧＧＡ　ＧＴＣ　ＴＡＧＴＧＡ　ＧＡＣＩ
　Ｇ　　　５’ ＣＬＡＩ／２　（ｘｃ１ａｌ粘着末端）５’Ｃ　［ＧＴ
Ａ　ＡＧＣ　ＴＴＴ　ＡＡＣ　ＴＴＣ　ＣＣＴ　ＣＡＧ
　ＡＴＣ　ＡＣＴ　ＣＴ］３′ ３’　　［ＡＴ　ＴＣＧ　ＡＡＡ　ＴＴＧ　ＡＡＧ　Ｇ
ＧＡ　ＧＴｃＴＡＧ　ＴＧＡ　ＧＡＧＩＣ　　５’ ＤＲＡｌ／２　（ｘＤｒａｌｌｌ粘着末端）５’Ｇ　［
ＧＴＡ　ＡＧＣ　ＴＴＴ　ＡＡＣ　ＴＴＣ　ＣＣＴ　Ｃ
ＡＧ　ＡＴＴ　ＡＣＧ　ＣＴ］３′ ３’Ｃ　ＧＡＣ　［ＣＡＴ　ＴＣＧ　ＡＡＡ　ＴＴＧ　
ＡＡＧ　Ｇ（１；Ａ　ＧＴＣ　ＴＡＡ　ＴＧＩ５′ ＳＡＵＩ／２　（ｘＭｓｔｌｌｓａｕｌ粘着末端）５’
　　Ｔ　ＧＡＡ　　［ＧＴＡ　ＡＧＣ　ＴＴＴ　ＡＡＣ
　ＴＴＣ　ＣＣＴ　ＣＡＧ　ＡＴＴＡＣＧ　ＣＴ（；］
ＡＣ　　　　　　３’３’　　　　Ｔ　　［ＣＡＴ　Ｔ
ＣＧ　ＡＡＡ　ＴＴＧ　ＡＡＧ　ＧＧＡ　ＣＴＣ　ＴＡ
ＡＴＧＣ　ＧＡＣＩ　　ＴＧＡ　ＣＴ　５’ＢＳＳＬ／
２　（ｘＢｓｓＨ２粘着末端）５’　　ＣＧ　ＣＧＡ　
　［ＧＴＡ　ＡＧＣ　ＴＴＴ　ＡＡＣ　ＴＴＣ　ＣＣＴ
　ＣＡＧ　ＡＴＴＡＣＧ　ＣＴＧ］Ａ　　　　　　３’ ３’　　　　　Ｔ　　［ＣＡＴ　ＴＣＧ　ＡＡＡ　ＴＴ
Ｇ　ＡＡＧ　ＧＧＡ　ＧＴＣ　ＴＡＡＴＧＣ　ＧＡＣＩ
　　ＴＧＣ　ＧＣ　５’クローニング手順を簡素化する
ために、各オリゴヌクレオチＦ対の粘着末端のみは標的
制限部位に類似し、こうしてβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子中の首尾よい結合はその制限部位を破壊するようにす
る。したがって、ｐ　Ｚ　Ｍ　ｌ中のオリゴヌクレオチ
ドの挿入後、結合混合物を標的制限酵素で消化して、残
留する親プラスミドｐ　Ｚ　Ｍ　１を直線化する。エタ
ノール沈澱後、消化した結合混合物をＥ．ｃｏｌｉ菌株
ＭＣｌ０６１の形質転換のために使用する。正しいクロ
ーンを新しいＨｉｎｄＩＩ１部位の存在により同定する
。この方法は高い比率の正しいクローンを産生じ、そし
てベクターのホスファターゼ処理およびオリゴヌクレオ
チドキナーゼ処理の必要性を排除する。

生ずるプラスミドを、それぞれ、ｐＺＭ−Ｂｓｓ，ｐＺ
Ｍ−Ｃ　ｌ　ａＡｓ　　ｐＺＭ−Ｄｒａ，ｐＺＭ−Ｅｃ
ｏ％ｐＺＭ−Ｓａｕ，およびｐＺＭ−Ｓｓｔと表示する
。また、ＨＩｖプロテアーゼにより認識されない、無関
係のデカペプチドＧｌｕ−Ｓｅｔ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａ
ｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙ　ｓ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｔｙ　
ｒをエンコードする、切断カセットを逆向きでを含有す
る、プラスミドｐＺＭ−ＣｌａＢを構成する。各場合に
おいて、β一ガラクトシダーゼ遺伝子内の切断カセット
の挿入はＤＮＡ配列決定により確証する。

所望のβ−ガラクトシダーゼ活性が切断カセットの挿入
にかかわらず保持されたかどうかを確証するために、各
構成体を収容するＥ．ｃｏｌｉ菌株ＭＣｌ０６１をＸ−
ｇａｌ平板上で平板培養する。このアッセイにおいて、
機能的β−ガラクトシダーゼは青色のコロニーを形戊す
るが、β−ガラクトシダーゼ活性の欠如は白色のコロニ
ーを産生ずる。後述する手順を使用して、各構成体を、
また、定量的β−ガラクトシダーゼ活性について、およ
びそれが生体外および生体内でＨＩＶプロテアーゼによ
り切断されたかどうかについて試験する。表Ｖにこのア
ッセイの結果を記載する。

考！ 切断カセット構成体のβ−ガラクトシダーゼ活性、およ
び引き続＜ＨＩＶプロテアーゼによる切断に対する感受
性ｐＺＭ−Ｂｓｓ　　　　　　青　　　　　　　５　　
　　なしｐＺＭ−Ｃｌａ　Ａ　　　　　青　　　　　　
１０　　　　　なしｐＺＭ−Ｃｌａ　Ｂ　　　　　青　
　　　　　１６３　　　　　なしｐＺＭ−Ｄｒａ　　　
　　　白　　　　　　　０　　　　なしｐＺＭ−Ｅｃｏ
　　　　　　青　　　　　　　２　　　　なしｐＺＭ−
Ｓａｕ　　　　　　　青　　　　　　　６３　　　　　
ありｐＺＭ−Ｓｓ　Ｌ　　　　　　白　　　　　　　Ｏ
　　　　なしｐＺＭｌ　　　　　　　　青　　　　　１
ｌ７９　　　　　なしなし　　　　　　　白　　　　　
　　Ｏなし なし なし ｎ．ｄ−” なし あり ｎ．ｄ． ｎ．ｄ． β−ガラクトシダーゼ活性はＯＮＰＧの加水分解により
決定する。

ＨＩＶプロテアーゼによるβ−ガラクトシダーゼの切断
はウエスタン分析により決定する（参照、第６図および
第８図）ｎ．ｄ．一実施せず。

Ｓａｕ　Ｉ、ＣＩａＩ、ＢｓｓＨ２またはＥｃｏＲ１部
位における切断カセットの挿入は青色のコロニーを生じ
、β−ガラクトシダーゼの酵素活性が保持されることを
示す。それがＨＩＶプロテアーゼ切断部位と無関係のデ
カペプチドをエンコードするするようなＣｌａ１部位中
の反対の向きの切断カセットの挿入（表Ｖ，ｐＺＭ−Ｃ
　１　ａＢ）は、また、青色のコロニーを形或する。こ
れらのデータが示すように、β−ガラクトシダーゼタン
パク質はいくつかの位置における挿入に耐えることがで
き、そしてなお検出可能な酵素活性を保持する。結局、
ＤｒａｌｌｌまたはＳｓｔｌにおける挿入は、これらの
構成体を収容するコロニーが白色であるので、β−ガラ
クトシダーゼ活性を破壊する。

ｐＺＭプラスミドＢｓｓ％Ｃ１ａＡＳ　ＣｌａＢ，Ｅｃ
ｏおよびＳａｕを収容する苗株の青色の強度は、かなり
の変動を示し、そして各場合において、親のプラスミド
ｐＺＭｌが与えるそれより強度が低い。β−ガラクトシ
ダーゼ活性はＯ−ニトロ７エニルーβ−Ｄ−ガラクトシ
ド（Ｏ　Ｎ　Ｐ　Ｇ）の加水分解により定量される（３
９）。平板は５−ブロモー４−クロロー３−インドリル
ーβ一Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａ＋）を４０ｔｔｇ／
ｍＱで含有する。このアッセイはミラー（Ｍｉｌｌｅｒ
）により記載されるもの変法を使用する（４０）。細胞
をルリア（Ｉ−ｕｒｉａ）ブロス中で０．　５　（６０
０ナノメーター）の吸収に増殖する。細胞（０．５ｍＱ
）を沈澱させ、そして２ｍＱのＺ緩衝液（０．１モルの
Ｎａ３Ｐ　ｏ４，　Ｐ　Ｈ　７　−　Ｏｓ　　１ミリモ
ルのＭｇＳＯａ　、Ｏ−　２ミリモルのＭ　ｎ　Ｓ　Ｏ
　．、０．１モルのβ−メルカプトエタノール、０．２
ｍｇ／ｍＱのＣＴＡＢ　（ヘキサデシルトリメチルアン
モニウムプロマイド）　、０．１ｍｇ／ｍ（１のナトリ
ウムデオキシコレート）中に再懸濁し、そして２８°Ｃ
において５分間インキユベーションする。次に、Ｏ．ｌ
モルのＮａｓＰＯ＊ｓ　ＰＨ７−　０中の０．６ｍｇの
４ｍｇ／ｍ（２のＯＮＰＧを添加し、そしてこの溶液が
黄色になるまで（１０分〜−夜）２８℃においてインキ
ユベーションする。

この反応を停止するために、１．３ｍＱの１モルのＮａ
，Ｃｏ，を添加する。次いで、吸収を４２０および５５
０ナノメーターにおいて読む。β−ガラクトシダーゼの
単位を次の方程式を使用して計算する： 単位−［　（Ａ．ｚｏ−　１．　７　ｓ）　ＸＡｓｓｏ
ｌ　／　（ｔ　ｘｖＸＡ．。。） ここで八一吸収、ｔ一反応時間（分）、モしてＶ一使用
しｔ；培養物の体積（ｍａ）。定量的アッセイの結果を
、また、表Ｖに示す。青色のコロニーは、約１０倍少な
い（ｐＭＺ−Ｃ　１　ａ　Ｂ）　〜５　００倍少ない（
　ｐＭ　７．　−　Ｅ　ｃ　ｏ　）の範囲の、親のｐＺ
ＭＩより有意に低いβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。

次ににより拘束されないで、切断カセットの挿入のとき
観測されるβ−ガラクトシダーゼ活性の減少は、その酵
素的機能を減衰するこのタンパク質の構造の変化からか
、あるいは野生型酵素活性を示すが、減少した量で存在
するβ−ガラクトシダーゼン切断カセットタンパク質か
らか、あるいはこれらの２つの因子の組み合わせから生
じ得ることが提案される。期待するように、白色のクロ
ーンｐＭＺ−ＤｒａおよびｐＭＺ−Ｓｓｔはこのアッセ
イにおいて検出可能なレベルのβ一ガラクトシダーゼ活
性を産生じない。

次に、β−ガラクトシダーゼ／切断カセットタンパク質
を、生体外のＨＩＶブロテアーゼによる切断に対する感
受性について試験する。プロテアーゼのプラスミドｐ　
ｌ＋ＩＱおよび他のプラスミドＩ）１５−ＩＱを収容す
る、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＭＣ１０６１の２つの試料を０．
５吸収単位（５９５ナノメートル）に増殖する。プロテ
アーゼ合或をＩ　ＰＴＧをｌミリモルに添加して誘発す
る。１時間後、細胞を沈澱させ、０．６６体積のＭ緩衝
液（５０ミリモルの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスル
ホン酸（ＭＥＳ）、ｐＨ６、ｌミリモルのジチオスレイ
トール、および２５ミリモルのＮａＣｌ）１ミリモルの
ＥＤＴＡｊ−ｊよびｌｍｇ／ｍ＋２のリゾチームを含有
する、中に再懸濁させ、そして氷上でｌＯ分間インキユ
ベーションする。細胞を沈澱させ、そして０．１体積の
Ｍ緩衝液中に再懸濁させ、そして３回の凍結／融解サイ
クル（ドライアイス／エタノール中の急速な凍結、およ
び氷水中のゆっくりした融解）により溶菌する。最後の
融解後、抽出物を遠心し、そして透明な上澄み液をプロ
テアーゼ源として使用する。

同一方法を使用して、前述のｐＺＭプラスミドの系列を
収容するＥ．ｃｏｌｉ　　ＭＣｌ０６１からのβ−ガラ
クトシダーゼを含有する抽出物を調製するが、ただしＩ
　ＰＴＧを省略し、モしてＯ．１体積のＭ緩衝液を凍結
／融解サイクルに使用する。切断反応のために、２０μ
αのβ−ガラクトシダーゼ抽出物を典型的には５μＱの
プロテアーゼ抽出物とともに３７℃において１時間イン
キユベーションし、次いでインキュベーション反応物を
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動にかける。

β−ガラクトシダーゼをウェスタン・プロット分析によ
りマウス抗β−ガラクトシダーゼボリクローナル血清（
シグマ）およびイムノセレクト（ＩｍｍｕｎｏＳｅ　Ｉ
ｅｃ　ｔ）キット（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリー
ズ）を使用して可視化する。ＨＩＶ　　ｇａｇポリタン
パク質（ｎｔ１　０　９　−　１　４　１　７）　　（
４）　ｉ：相当ｔ６”ｓ　）ｆ−Ａ−ニン標識した対照
基質を、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１　（ＤＥ３）ｐＬｙ
ｓＳ中でＴ７プロモーターから産生ずる。

野生型プロテアーゼ（ｐｌ＋ＩＱからの）を含有するが
、突然変異プロテアーゼ（ｐ１５−ＩＱからの）を含有
しない、Ｅ．ｃｏｌｉｉｌ株ＭＣＩ０６１の抽出物は、
ＨＩＶプロテアーゼのｔ；めの自然基質であるｇａｇボ
リタンパク質を切断することができる（第６図Ａ）。β
−ガラクトシダーゼ／切断カセット構成体を収容するＥ
．ｃｏｌｉの抽出物を、野生型または突然変異のＨＩＶ
プロテアーゼとともにインキユベーションし、モしてβ
−ガラクトシダーゼの切断をウェスタン分析により抗β
−ガラクトシダーゼ抗体を使用して監視する（第６図Ｂ
）。ｐ　Ｚ　Ｍ　ｌにより工冫コードされる自然β−ガ
ラクトシダーゼはこれらのインキュベーシ鱈ンにより影
響を受けない（レーン４〜６）。検査したβ−ガラクト
シダーゼ／切断カセットタンパク質の６つのうちで、５
つ（ＢｓｓＳＣｌａＡ，Ｄｒａ，ＥｃｏおよびＳｓｔ）
は、対照として使用した逆デカペプチドの挿入を含有す
るＣｌａＨのクローンのように、同様にＨＩＶプロテア
ーゼにより消化されない（表Ｖ）。

対照的に、２つの独立のｐＺＭ−Ｓａｕクローンにより
エンコードされるβ−ガラクトシダーゼ／切断カセット
は野生型ＨＩＶプロテアーゼにより切断され（レーン８
および１ｌ）、ほぼ１００ｋｄの切断産生物を産生じ、
これはアミノ末端から８０アミノ酸に位置するＳａｕ　
Ｉ挿入部位における切断と一致する。ほぼ８ｋｄの他の
期待する切断産生物は検出されず、そして不安定である
ことがある。突然変異のＨＩＶプロテアーゼを使用する
ｐＺＭ−Ｓａｕβ−ガラクトシダーゼ／切断カセットの
誘発（第６図Ｂ１レーン９および１２）は切断を産生ず
ることができず、切断の事象がＨ■ｖプロテアーゼによ
り仲介されるが、Ｅ．ｃｏ１ｉプロテアーゼにより仲介
されないことを示す。

β−ガラクトシダーゼ／切断カセットクローンにおける
β−ガラクトシダーゼ活性の減少についての基準をさら
に検査するために、β−ガラクトシダーゼの量をウェス
タン分析により抗β−ガラクトシダーゼ抗体を使用して
定量する。ｐＺＭ−Ｓａｕ構成体は、親のｐ　Ｚ　Ｍ　
ｌと比較して、有意に少ないβ−ガラクトシダーゼタン
パク質を有することが発見された（第６図Ｂ，レーン４
におけるβ−ガラクトシダーゼのバンドの強度とレーン
７および１０におけるそれと比較する）。この差はｐＺ
Ｍ１およびｐＺＭ−Ｓａｕを収容する細胞の異なる希釈
物のウェスタン分析によりより正確に定量され、そして
ｐＺＭ−Ｓａｕクローンは親のｐ　Ｚ　Ｍ　ｌより約１
０〜２０倍少ないβ−ガラクトシダーゼ活性を有するこ
とが決定される（データは示されていない）。こうして
、ｐＺＭ−ＳａＵについて、ほぼ野生型レベルの酵素活
性をもつβ−ガラクトシダーゼタンパク質の減少は、Ｘ
−ｇａｌ平坂上でおよびＯＮＰＧアツセイにおいて観測
されるβ−ガラクトシダーゼの活性の減少を説明できる
であろう（表Ｖ）． 他の切断カセットのクローンについてのウェスタン分析
は、酵素活性のそれらの減少を説明するために十分なβ
−ガラクトシダーゼのレベルの同様な減少を実証する．
ｐＺＭ−Ｄｒａ８よびｐＺＭ−Ｓｓｔによりエンコード
される非機能的β一ガラクトシダーゼタンパク質は、同
様に減少した量で存在する。ｐ　Ｚ　Ｍ　ｌによりエン
コードされる自然β−ガラクトシダーゼ、および変更し
たβ一ガラクトシダーゼ／切断カセットタンパク質は、
β−ガラクトシダーゼ遺伝子中の切断カセットの挿入に
よってのみ異なる、同一のベクターから発現されるので
、β−ガラクトシダーゼ／切断カセットタンパク質は自
然タンパク質より安定性に劣る。

他の実験において、ＨＩＶプロテアーゼの既知のＨＩＶ
プロテアーゼであるペプスタチンＡ（３４）は、ＨＩＶ
ブロテアーゼとインキユベーションしたβ〜ガラクトシ
ダーゼ／切断カセットタンパク質ｐＺＭ−Ｓａｕの切断
がこの化合物により阻害されるかどうかについて試験す
る。ペプスタチンＡは、ｌμｇ／ｍ＋２において、変更
しｔ；β−ガラクトシダーゼの切断を完全に阻害し、さ
らに切断がＨＩＶブロテアーゼのためであることを示す
（第７図）。

生体外の結果は、ｐＺＭ−Ｓａｕ構成体を除外して、β
−ガラクトシダーゼ／切断カセットタンパク質がＨＩＶ
プロテアーゼにより切断されないことを実証する。プロ
テアーゼ抵抗性タンパク質における切断カセットは、夕
冫バク質の内部中に埋め込まれ、それゆえ生体外アツセ
イにおいてプロテアーゼに対してアクセス不可能である
。この理由で、次に、これらのβ−ガラクトシダーゼ／
切断カセットタンパク質と同一の細胞中にＨＩＶプロテ
アーゼを導入して、生体内の同時の翻訳切断を可能とす
ることは有用である。

ｐＺＭ−Ｓａ．ｕにより生体内でエンコードされるβ−
ガラクトシダーゼ／切断カセットの切断について試験す
るために、この変更したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を
プラスミドｐｌ＋ＩＱおよびｐ１５−ＩＱ中にサブクロ
ーニングし、これらのプラスミドは、それぞれ、野生型
および突然変異のＨＩＶプロテアーゼをエンコードする
。詳しくは、ｐＺＭ−Ｓａｕからの変更したβ−ガラク
トシダーゼ遺伝子をＳｔｕｌ−ＢａｍＨＩ断片として切
除し、そしてｐｌ＋ＩＱおよびｐｌ５−ＩＱのＢａｍＨ
Ｉ中に結合し、それぞれ、プラスミド！）１＋ＩＱＳａ
ｕおよびｐ１５＋ＩＱｓａｕをつくる。

プラスミドｐｌ＋ｒＱｓａｕを収容するＥ．ｃｏ１１菌
株ＭＣｌ０６１は、アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション（ｔｈｅ　　Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐ
ｅ　　Ｃｕｌｔｕｒｅ　　Ｃｏｉｌｓｃｔｉｏｎ）に受
託され、そしてＡＴＣＣ受託番号６８．３５２を割り当
てられた。

比較の目的で、ｐ　ＺＭ−Ｂ　ｓ　ｓＳｐ　ＺＭ−Ｃ　
ｌａＡ，およびｐＺＭ−Ｅｃｏのβ−ガラクトシダーゼ
／切断カセット領域を、また、ｐｌ＋ＩＱ中にサブクロ
ーニングした。ｐＺＭ−Ｃ１ａＢを対照として使用した
。ｐＺＭ−ＤｒａおよびｐＺＭ−Ｓｓｔは非機能的β−
ガラクトシダーゼを産生ずるので、これらはそれ以上考
慮しない。

これらの生ずるプラスミドｐｌ＋ＩＱＳａｕおよびｐｌ
５＋ＩＱｓａｕを収容する細胞からの合計のタンパク質
をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、そしてβ−ガラクトシダー
ゼの切断をウエスタン分析により監視される（第８図）
。このβ−ガラクトシダーゼ／切断カセットを野生型Ｈ
ＩＶブロテアーゼにより生体内で切断される（パネルＡ
１レーンｌ１およびバネルＢ１レーン２）が、突然変異
のプロテアーゼにより切断されず（バネルＢ、レーン３
）、生体外で観測されるのと同一の切断産生物を発生す
る（第６図Ｂ５レーン８および１１）。β−ガラクトシ
ダーゼ／切断カセットタンパク質のほぼ５０〜７５％が
切断されることが推定される。これらの切断アツセイを
液体培養において実施する。コロニー中で起こる切断の
量は直接定量されず、ｐｌ＋ＩＱｓａｕを収容するＥ．
ｃｏ１ｉ　　ＭＣ１０６１はＸ−ｇａｌ上で白色であり
、これに対してｐｌｓ＋ＩＱｓａｕは青色を与える。

これらのデータは、野生型ＨＩＶプロテアーゼによるβ
−ガラクトシダーゼ／切断カセットの切断と一致するが
、突然変異ＨＩＶゾロテアーゼによるそれと一致しない
。

ＨＩＶプロテアーゼは、生体外のプロテアーゼ抵抗性で
ある、生体内のこれらの他のβ−ガラクトシダーゼ／切
断カセットタンパク質のいずれによっても切断しない（
第８図Ａ１レーン２〜５、および表Ｖ）．期待するよう
に、ｐｌ＋ＩＱＢｓｓＳ　ｐ　ｌ＋ＩＱｃａ　ＩＡＳ　
ｐ　ｌ＋ＩＱｃａ　ＩＢ，またはｐ１＋ＩＱＥｃｏを収
容する細胞は平板上で青色であり、ＨＩＶブロテアーゼ
による切断の欠如と一致する。

生体内の他のＬ｛ＩＶプロテアーゼ切断アッセイの結果
は、第９図の写真に示されている。種々のプラスミドを
収容するＥ．ｃｏｌｉ菌株の試料を、色指示体のＸ−ｇ
ａ＋を含有する平板上にスポツティングする。プラスミ
ドはｐＺＭ−１（β−ガラクトシダーゼ活性について陽
性の対照）、ｐＺＭ−２（β−ガラクトシダーゼ活性に
ついて陰性の対照）、ｐ２Ｍ−Ｓａｕ，ｐｌ＋ＩＱｓａ
ｕ　（標識したｌ＋ＩＱＢ−Ｓａｕ）およびｐｌ５＋Ｉ
ＱＳａｕ　（標識しｆｏｐ　ｌ　５＋ＩＱＢ−Ｓａｕ）
．野生型ＨＩＶプロテアーゼを使用して切断アツセイに
おいて、β−ガラクトシダーゼを切断する構成体は白色
を生戊し、これに対してβ−ガラクトシダーゼを切断し
ない構成体は青色を生成する。プラスミドｐＺＭ−２は
突然変異の不活性のβ−ガラクトンダーゼをエンコード
し、それゆえ白色のコロニーを産生ずる。プラスミドｐ
ＺＭ−２は、プラスミドｐＺＭ−　１をＥｃｏＲＩおよ
びＢａｍＨｌで消化して、β−ガラクトシダーゼのカル
ボキシ末端における１８アミノ酸の遺伝情報を指定する
ＤＮＡ配列を欠失することによって構成する。

期待するように、ｐＺＭ−　１は青色を生威し、同様に
ｐＺＭＳａｕおよびｐ１５＋ＩＱｓａｕも青色を生成す
る。プラスミドｐＺＭ−２は、陰性の対照として、白色
を生成する；ｐｌ＋ＩＱｓａｕにより産土されるβ−ガ
ラクトシダーゼはプロテアーゼにより切断され、そして
白色を生戒する。

ウィルスのプロテアーゼ切断カセットの挿入により修飾
されたβ−ガラクトシダーゼタンノくク質は、そのプロ
テアーゼの阻害因子を同定するだめのスクリーンにおい
て使用することができるか、あるいは切断配列が知られ
ておりかつβ−ガラクトシダーゼのＳａｕ　Ｉ部位中に
導入することができる、他のプロテアーゼの阻害因子を
同定するだめのスクリーンにおいて使用することができ
る。

適当なＥ．ｃｏｌｉ菌株、例えば、ＢＡＳ８４９（４１
）（他の膜中に突然変異を有し、これにより種々の化合
物に対するより透過性である）中のプラスミドｐ１＋Ｉ
ＱＳａｕは、寒天平板上に菌叢として平板培養した。あ
るいは、液体培養物は戊熟培地として使用することがで
きる。平板は十分なＩ　ＰＴＧを含有してＨＩＶプロテ
アーゼの合成を誘発し、β−ガラクトシダーゼを切断し
、モしてβ−ガラクトシダーゼの色指示体、例えば、Ｘ
−ｇａ　＋　　（４０）　、ファースト・プルーＲＲ　
（４２）などを使用してアッセイするとき、菌叢を無色
とすべきである。プロテアーゼの可能な阻害因子を菌叢
上にスポッティングし、次いでこの上に指示体を配置す
る。

プロテアーゼ阻害因子はプロテアーゼを不活性化し、β
−ガラクトシダーゼの切断を防止する。

次いで、β−ガラクトシダーゼを指示体と反応させ、こ
のスポットを着色させる（Ｘ−ｇａｌの場合において青
色、７アースト・プルーＲＲの場合において赤色）。こ
うして、プロテアーゼ阻害因子を同定する。

同様なスクリーニング方法を使用することができ、ここ
で色の変化よりむしろ光を放射する反応を監視する。切
断カセットをβ−ガラクトシダーゼよりむしろタンパク
質、例えば、ルシフエラーゼ（クロンテク・ラボラトリ
ーズ・インコーポレーテッド、カリフォルニア州パロア
ルト）中に挿入する。プロテアーゼ酵素の不存在下に、
ルシフエラーゼ／切断カセットタンパク質は光を放射す
る化学反応を触媒する。ルシ７エラーゼおよびＡＴＰの
存在下に、酵素結合したルシ７エリルーアデニレート複
合体を形戊し、次いで酸化的脱力ルポキシル化する。反
応生成物はＣＯ，、オキシルシ７エリンおよびＡＭＰで
あり、光の放射を伴う。

光の放射は肉眼で観察し、分光光度計で測定するか、あ
るいはＸ線フイルムに記録する。

プロテアーゼ酵素が存在するとき、それはプロテアーゼ
酵素の切断部位で切断し、これによりルシ７エラーゼに
より触媒される反応を遮断し、こうして光は放射されな
い。プロテアーゼ阻害因子についてスクリーニングする
とき、試験化合物をアッセイ系中に含める。化合物がプ
ロテアーゼによる切断を防止する場合、反応は進行し、
これにより化合物はプロテアーゼ阻害因子として同定さ
れる。

前述したように、色指示体および光を放射する化学反応
の生体内アッセイの両者において、発現系はβ−ガラク
トシダーゼ／切断カセットタンパク質およびＨＩＶプロ
テアーゼの遺伝情報を指定する遺伝子を含有する。発現
系はアッセイ系において使用する両者のタンパク質を発
現する。

β−ガラクトシダーゼ／切断カセットタンパク質は、ま
ｔ；、試験管中で直接アッセイすることができる。この
生体外アッセイにおいて、発現系はβ−ガラクトシダー
ゼ／切断カセットタンパク質の遺伝情報を指定する遺伝
子のみを含有する。ＨＩＶプロテアーゼは別々に発生し
、そしてアッセイの時間まで融合タンパク質から離れて
保持される。その時において、精製したβ−ガラクトシ
ダーゼ／切断カセットタンパク質をＨＩＶプロテアーゼ
および潜在的プロテアーゼ阻害因子と溶液中で混合する
。β−ガラクトシダーゼ活性をＯＮＰＧの加水分解によ
り分光光度計を使用して監視する。プロテアーゼ阻害因
子は、融合タンパク質およびＨＩＶプロテアーゼのみを
使用する対照実験において観測されるものを越えてβ−
ガラクトシダーゼ活性を増加させるであろう。

本発明の第２実施態様の上のスクリーニング方法は、ま
た、他のプロテアーゼ、例えば、ポリオ３Ｃプロテアー
ゼのイン７レームについてスクリニングするために使用
できる。第１に、β−ガラクトシダーゼ／切断カセット
タンパク質を構成する。例えば、ポリオ３Ｃプロテアー
ゼ切断部位をエンコードするオリゴヌクレオチドＭｅｔ
−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−
Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ（４
３）を、インフレームで、β−ガラクトシダーゼのＳａ
ｕ　１部位中に挿入し、ｐ　Ｚ　Ｍ　３　ＣＳａｕをつ
くる。このプラスミドを収容するプラスミドは青色であ
り、ＨＩＶプロテアーゼ切断カセットを含有するｐＺＭ
−Ｓａｕについての結果と一致する（表Ｖ）。こ、れら
のデータがさらに示すように、Ｓａｕ　Ｉ部位は、β−
ガラクトシダーゼ活性を破壊しないで異種タンパク質配
列の挿入のだめの適当な部位である。

第１０図に示すように、この融合タンパク質は、期待す
るように、ニツクリン（Ｎｉｃｋｌｉｎ）ら（４４）と
同様な融合においてＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳにお
いて発現される、ポリオ３Ｃプロテアーゼ（レーン５）
により切断されるが、ＨＩＶプロテアーゼ（レーン６）
により切断されない。次いで、この構成体を使用して、
前述の方法により、ポリオ３Ｃプロテアーゼの阻害因子
についてスクリーニングする二とができる。

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Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．
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０−　　Ｊ．Ｍｉｌｌｅｒ，”Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
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　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　　Ｎ．Ｙ
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，　Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．．　６２．　４５８６−４５９３
（１９８８）． 本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。

ｌ１工程： （ａ）Ｔ７プロモーターの制御下にブロテアーゼをエン
コードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを構成し、 （ｂ）バクテリアの発現菌株に対する前記プロテアーゼ
の毒性のために、前記プラスミドにより形質転換されな
い、前記バクテリアの発現菌株を選択し、そして （ｃ）スクリーニングすべき化合物を前記プラスミドと
一緒に前記バクテリアの菌株に添加し、こうして前記バ
クテリアの菌株が殺されず、そして形質転換体を産生ず
る場合、前記化合物がプロテアーゼの阻害因子として同
定されるようにする、からなる、プロテアーゼ酵素を阻
害する化合物についてスクリーニングする方法。

２、前記バクテリアの菌株はＥ．ｃｏｌｉ　　ＢＬ２１
（ＤＥ３）であり、そして前記プラスミドはヒトの免疫
欠損ウィルスのプロテアーゼをエンコードするＤＮＡ配
列を有する、上記第１項記載の方法。

３、前記プラスミドはｐＰｏｌｉｏプロテアーゼ３Ｃで
あり、そして前記プラスミドはポリオプロテアーゼ３Ｃ
を工冫コードするＤＮＡ配列を有する、上記第１項記載
の方法。

４、工程： （ａ）Ｔ７プロモーターの制御下にヒトの免疫欠損ウィ
ルスのプロテアーゼをエンコードするＤＮＡ配列を有す
るプラスミドを構成し、（ｂ）前記プラスミドにより形
質転換されたバクテリアの菌株を選択し、前記菌株は誘
発因子のイソプロピルーβ一〇一チオガラクトプラノシ
ドによるプロテアーゼの合成の誘発により殺され、そし
て （ｃ）スクリーニングすぺき化合物を前記イソプロピル
−β一Ｄ−チオガラクトプラノシドと一緒に前記形質転
換されたバクテリアの菌株に添加し、こうして誘発され
た細胞が殺されない場合、前記化合物はヒトの免疫欠損
ウィルスのプロテアーゼの阻害因子として同定される、 からなる、ヒトの免疫欠損ウィルスのプロテアーゼを阻
害する化合物についてスクリーニングする方法。

５、前記バクテリアの菌株はＥ．ｃｏｌｉ　　ＢＬ２１
　（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳである、上記第４項記載の方法
。

６、（ａ）酵素的に活性な１０ｋｄのヒトの免疫欠損ウ
ィルスのプロテアーゼの１８ｋｄのプロテアーゼ前駆体
をエンフードするＤＮＡ配列中に突然変異を導入し、こ
れによりそうでなければ戊熟した、酵素的に活性な１０
ｋｄのプロテアーゼを遊離する前記前駆体の自己消化を
防止するか、あるいは（ｂ）前記１０ｋｄのプロテアー
ゼをエンコードするＤＮＡ配列中に突然変異を導入する
、からなる、前記１　０ｋｄのプロテアーゼの発現を防
止する方法。

７、１０ｋｄのヒトの免疫欠損ウィルスのプロテアーゼ
の１８ｋｄのプロテアーゼ前駆体をエンコードするＤＮ
Ａを修飾し、こうして成熟したｌＯｋｄのプロテアーゼ
のアミノ酸−１〜１に位置する切断可能なＰｈｅ−Ｐｒ
ｏ結合を崩壊させる、からなる、非機能的な１０ｋｄの
ヒトの免疫欠損ウィルスのプロテアーゼを産生ずる方法
。

８、工程： （１）（ａ）色指示化合物と反応して色の変化を生或す
ることによってアッセイすることができるリポータータ
ンパク質を選択し、 （ｂ）前記タンパク質の遺伝情報を指定する遺伝子中に
、プロテアーゼ酵素の切断部位を含むペプチドの遺伝情
報を指定する異種ＤＮＡ配列を挿入し、 （ｃ）適当な発現系中に、工程（ｂ）の構成体と、工程
（ｂ）の異種ＤＮＡ配列により遺伝情報を指定された前
記ベブチドの前記プロテアーゼ酵素の切断部位を認識し
かつ切断するプロテアーゼ酵素の遺伝情報を指定する遺
伝子とを挿入し、（ｄ）（ｉ）工程（ｃ）の発現系、 （ｉｉ）色指示化合物、および （ｉ　ｉ　ｉ）栄養培地、 からなるアッセイ系を調製し、そして （ｅ）スクリーニングすべき化合物を前記アッセイ系に
添加し、こうして、前記化合物が前記プロテアーゼ酵素
を阻害する場合、前記発現系は工程（ｂ）の完全な構成
体を産生じ、前記リポータータンパク質はその活性を保
持し、そして色は前記ア７セイ系において維持されるが
、前記化合物が阻害因子でない場合、前記プロテアーゼ
は工程（ｂ）のペプチドのプロテアーゼ酵素の切断部位
を切断し、前記リポータータンパク質は不活性化され、
そして色は前記アッセイ系において観察されないか、あ
るいは （ＩＩ）（ａ）光を放射する化学反応を触媒することが
できるリポータータンパク質を選択し、（ｂ）前記リポ
ータータンパク質の遺伝情報を指定する遺伝子中に、プ
ロテアーゼ酵素の切断部位を含むペプチドの遺伝情報を
指定する異種ＤＮＡ配列を挿入し、 （ｃ）適当な発現系中に、工程（ｂ）の構成体と、工程
（ｂ）の異種ＤＮＡ配列により遺伝情報を指定された前
記ペブチドの前記プロテアーゼ酵素の切断部位を認識し
かつ切断するプロテアーゼ酵素の遺伝情報を指定する遺
伝子とを挿入し、（ｄ）（ｉ）工程（Ｃ）の発現系、お
よび（ｉｉ）工程（ａ）のリポータータンパク質により
触媒される光を放射する化学反応を行う化合物、からな
るアッセイ系を調製し、そして（ｅ）スクリーニングす
べき化合物を前記アッセイ系に添加し、こうして、前記
化合物が前記プロテアーゼ酵素を阻害する場合、前記発
現系は工程（ｂ）の完全な構成体を産生じ、前記リポー
タータンパク質はその活性を保持し、そして光を放射す
る化学反応は起こるが、前記化合物が阻害因子でない場
合、前記プロテアーゼは工程（ｂ）のペプチドのプロテ
アーゼ酵素の切断部位を切断し、前記リポータータンパ
ク質は不活性化され、そして前記光を放射する化学反応
は起こらない、からなる、プロテアーゼ酵素を阻害する
化合物についてスクリーニングする方法。

９、（１）において、工程（ａ）のリポータータンパク
質はβ−ガラクトシダーゼであり、（ＩＩ）において、
工程（ａ）のリポータータンパク賞はルシ７エラーゼで
あり、そしてＣＩ）または（Ｉ　Ｉ）において、工程（
ｂ）のプロテアーゼ切断部位はヒトの免疫欠損ウィルス
のプロテアーゼのｐ６／ＰＲｇａｇ／ｐｏ　ｌポリタン
パク質切断部位であり、工程（ｃ）の発現系はＥ．ｃｏ
ｌｉ宿主菌株を含み、そして工程（ｄ）（ｉ）のプロテ
アーゼ酵素はヒトの免疫欠損ウィルスのプロテアーゼで
ある、上記第８項記載の方法。

１０、（Ｔ）または（Ｉ　Ｉ）において、工程（ｂ）の
プロテアーゼ切断部位はボリオ３Ｃプロテアーゼ切断部
位であり、そして工程（ｄ）（ｉ）のプロテアーゼ酵素
はポリオ３Ｃプロテアーゼである、上記第８項記載の方
法。

ＩＬ工程： （ａ）基質との反応により監視することができる活性を
有するリポータータンパク質を選択し、（ｂ）前記リポ
ータータンパク質の遺伝情報を指定する遺伝子を、プロ
テアーゼ酵素の切断部位を含むベプチドの遺伝情報を指
定する異種ＤＮＡ配列を挿入し、 （Ｃ）適当な発現系中に、工程（ｂ）の構成体を挿入し
、 （ｄ）（ｉ）工程（ｂ）の異種ＤＮＡ配列により遺伝情
報を指定されるベプチドのプロテアーゼ酵素の切断部位
を認識しかつ切断するプロテアーゼ酵素、 （ｉ　ｉ）工程（ｂ）の構成体を収容する工程（ｃ）の
発現系、および （ｉｉｉ）工程（ａ）のリポータータンパク質を反応す
る基質、 からなるアッセイ系を調製し、そして （ｅ）スクリーニングすべき化合物を前記アッセイ系に
添加し、こうして、前記化合物が前記プロテアーゼ酵素
を阻害する場合、前記発現系は工程（ｂ）の完全な構成
体を産生し、前記リポータータンパク質はその活性を保
持し、そして前記リポータータンパク質は前記基質との
反応により監視されるその活性を保持するが、前記化合
物が阻害因子でない場合、前記プロテアーゼは工程（ｂ
）のペプチドのプロテアーゼ酵素の切断部位を切断し、
そして前記リポータータンパク質は不活性化される、 からなる、プロテアーゼ酵素を阻害する化合物について
スクリーニングする方法。

１２、工程（ａ）のタンパク質はβ−ガラクトシダーゼ
であり、工程（ｂ）のプロテアーゼ切断部位はヒトの免
疫欠損ウィルスのプロテアーゼのｐ６／ＰＲｇａｇ／ｐ
ｏ　１ポリタンパク質切断部位であり、工程（ｃ）の発
現系はＥ．ｃｏｌｉ宿主菌株を含み、そして工程（ｄ）
（ｉ）のプロテアーゼ酵素はヒトの免疫欠損ウィルスの
プロテアーゼであり、そして工程（ｄ）（ｉｉｉ）の基
質は０−ニトロフェニルーβ一Ｄ−ガラルトシターゼで
ある、上記第１１項記載の方法。

ｌ．３、工程（ｂ）のプロテアーゼ切断部位はポリオ３
Ｃプロテアーゼ切断部位であり、そして工程（ｄ）（ｉ
）のプロテアーゼ酵素はポリオ３ｃプロテアーゼである
、上記第１１項記載の方法。

１４、ｐＰＤＢ１６、ｐ　Ｍ　ａ　ｅ　２、ｐｌ＋ＩＱ
Ｓａｕおよびｐ　Ｚ　Ｍ　３　Ｃ　Ｓ　ａ　ｕと表示す
るプラスミドから或る群より選択されるプラスミド。

１５、プラスミドｐＰＤＢｌ６を収容するＥ．ｃｏｌｉ
菌株ＤＨ５α（ＡＴＣＣ　　６８００５）、プラスミド
ｐＰ４８を収容するＥ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１　（ＤＥ
３）（ＡＴＣＣ　　６８００４）およびグラスミドｐ　
ｌ　＋Ｉ　Ｑ　Ｓ　ａ　ｕを収容するＥ．ｃｏｌｉ菌株
ＭＣｌ０６１　（ＡＴＣＣ　　６８．３５２）から成る
群より選択されるプラスミドを収容するバクテリアの菌
株。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＨＩＶプロテアーゼ構成体ｐＰＤＢｌ６およ
びｐＭａｅ２を描写する。構成体ｐＰＤＢ１６はＴ７プ
ロモーターの制御下に１８ｋｄのプロテアーゼ前駆体を
エンコードする。ＨＩＶｐｏ１遺伝子のヌクレオチド１
４１８−１８９９に相当する、λＢＨ５からのＢｇｌｌ
ｌ−Ｄｒａｌ断片（４）を、合或オリゴヌクレオチドを
使用して、前述の発現ベクター（ｌ９）のＮｄｅｌ−Ｂ
ａｍＨ１部位中にサブクローニングする。上流のオリゴ
ヌクレオチドはＮｄｅｌ制限部位で開始し、インフレー
ムの翻訳開始コドンを提供し、そしてヌクレオチド１４
０６−１４１７を再生する。下流のオリゴヌクレオチド
はヌクレオチド１９００一１９０６、次いで２つのイン
フレームの停止コドンおよびＢａｍＨＩ制限部位を再生
する。明瞭のため、開始コドンの塩基Ａはヌクレオチド
（ｎｔ）ｌとして定義する。アミノ酸十〜＋９９は、示
したＰｈｅ−Ｐｒｏ結合における自己消化により遊離さ
れた或熟１０ｋｄのプロテアーゼを表す。 ｐＭａｅ２は或熟１　０ｋｄのプロテアーゼをエンコー
ドする。その構成はｐＰＤＢｌ６に類似するが、ただし
上流のオリゴヌクレオチドはヌクレオチド１６１０から
ＭａｅＩＩＩ制限部位までを再生する。 第２図は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のＨＩＶブロテアーゼの発現
を描写する。パネルＡ：ｐＰＤＢ１６を収容するＢＬ２
１　（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中のプロテアーゼの合成。タ
ンパク質は記載されているように３ＳＳメチオニンで標
識し（ｌ９）、次いで電気泳動およびオートラジオグラ
７イーを行う。レーンｌ，イソプロピルーβ一〇一チオ
ガラクトプラノシド（ｒｌＰＴＧＪ）なし。レーン２、
１ミリモルのｒＰＴＧ，矢印は戒熟１０ｋｄのプロテア
ーゼを示す。パネルＢ：突然変異したｐ　ＰＤＢｌ６を
収容するＢＬ２１　（ＤＥ３）中のプロテアーゼの合或
。各レーンより上の数は、表ＩＩおよびＩＩＩにおける
クローンの表示に相当する。分子量マーカーは左に示さ
れている（６　８　ｋ　ｄ−ウシ血清アノレブミン；４
３ｋｄ−オバノレブミン；２９ｋｄ−炭酸アンヒドラー
ゼ；ｌ８ｋｄ−ベーターラクトグロブリン：１４ｋｄ−
リゾチーム）．第３図は、Ｉ　ＰＴＧを使用する｝｛Ｉ
Ｖプロテアーゼ合成の誘発のときのＢＬ２　１　（ＤＥ
３）ｐＬｙｓＳの殺しを描写する。野生型（ｐＰＤＢｌ
６）または突然変異（ｐＰ４８）プロテアーゼ前駆体を
収容する細胞を０．５吸収単位（６００ｎｍ）に戊長さ
せ、そしてＩＰＴＧを示した濃度に添加する。示した加
熱において、培養物のアリコートを取り出し、そして希
釈物をカナマイシンおよびクロラン７エニコールを含有
するＬＢ平板上で平板培養する。一夜インキユベーショ
ンした後、コロニー形戊単位（　ｒｃＦｔｒＪ　）　／
　１００，１２　（７）培養物を決定する。 第４図は、野生型の量および突然変異プロテアーゼの産
生の比較を描写する。示したプラスミドを収容するＢＬ
２１　（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞を１ミリモルのＩ　Ｐ
ＴＧで誘発し、そしてタンパク質を記載されているよう
に３′Ｓメチオニンで標識する（１９）。細胞抽出物（
レーンｌ−５）、および戊熟プロテアーゼのアミノ酸３
４−４６に対してレイズした抗血清からの免疫沈澱物（
６−ｌＯ）を、電気泳動およびオートラジオグラフィー
にかける。レーンｌおよび５、ｐＰＤＢｌ６。レーン２
および７、ｐＰ４８。レーン３および８、ｐ　Ｍ　ａ　
ｅ　’ｌ。レーン４および９、ＩＩ）　Ｐ　４　８　Ｍ
　ａ　ｅ６。レーン５およびｌＯ、ｐＰｏｌ，ポリオポ
リメラーゼをエンコードする（ｌ９）。レーンＭ１分子
量マーカー（６　８　ｋ　ｄ−ウシ血清アルブミン；４
３ｋｄ−オバルブミン；２９ｋｄ−炭酸アンヒドラーゼ
；１８ｋｄ−ベーターラクトグロブリン；１４ｋｄ−リ
ゾチーム；６ｋｄ−ウシトリプシン阻害因子）。 第５図は、バネルＡは、ｔａｃプロモーターの制御下に
、それぞれ、野生型および突然変異Ｈ１■プロテアーゼ
をエンコードする、ＨＩ■プロテアーゼのプラスミドｐ
ｌ−ＩＩＱｓａｕおよびｐｌ５−ＩＱを描写する。これ
らのプラスミドを収容するＥ．ｃｏｌｉ菌株ＭＣｌ０８
１をβ−ガラクトシダーゼの生体外切断のためにＨＩＶ
プロテアーゼ源として使用する。生体内の切断を監視す
るために、β−ガラクトシダーゼ／切断カセット遺伝子
をｐＺＭグラスミドからＳｔｕＩおよびＢａｍＨＩで切
除し、モしてＢａｍＨＩリンカーを使用してｐｌ＋ＩＱ
またはｐｌ５−ＩＱ中に結合し、こうしてＨＩＶプロテ
アーゼおよびβ−ガラクトシダーゼを同一Ｅ．ｃｏｌｉ
中で同時発現させる。 パネルＢはβ−ガラクトシダーゼ中のＨＩＶプロテアー
ゼ切断部位の挿入を描写する。ＨＩＶプロテアーゼ切断
部位をエンコードするオリゴヌクレオチドは、β−ガラ
クトシダーゼ遺伝子の示した制限部位中に挿入する。β
−ガラクトシダーゼをもつヌクレオチド（ｎｔ）および
アミノ酸（ａ　ａ）の位置を示す。 第６図、パネルＡは｝ＩＩＶプロテアーゼによるｇａｇ
ポリタンパク質の生体外切断を描写する。 ｇａｇポリタンパク質を緩衝液（レーンｌ）とともに、
あるいは野生型（レーン２）または突然変異（レーン３
）のＨＩＶプロテアーゼとともにインキユベーションし
、次いで電気泳動およびオートラジオグラフィーを行う
。分子量のマーカーを左に示す（６７ｋｄ−ウシ血清ア
ルブミン：４２ｋｄ−オバルブミン；　２８ｋｄ一炭酸
アンヒドラーゼｉ　ｌ　８ｋｄ−ベーターラクトグロプ
リン）。 パ不ルＢはＨＩＶプロテアーゼによるβ−ガラクトシダ
ーゼ／切断カセットタンパク質の生体外切断を描写する
。ＨＩＶブロテアーゼを収容するＭＣ１０６１細胞の抽
出物を、β−ガラクトシダーゼを収容する抽出物ととも
にインキユベーションし、次いで抗β−ガラクトシダー
ゼとともにウェスタン・ブロッティングする。レーンＬ
ＭＣＩ０６ｌ（プラスミドなし）。レーン２、野生型Ｈ
ＩＶブロテアーゼ抽出物。レーン３、突然変異ＨＩＶブ
ロテアーゼ抽出物。ＭＣ１０６１／ｐＺＭｌ（レーン４
）を、野生型（レーン５）または突然変異（レーン６）
ＨＩＶプロテアーゼとともにインキユベーシコンする。 ２つの独立のクローン（レーン７および１０）からのＭ
Ｃｌ０６１／ｐＺＭ−Ｓａｕ抽出物を、野生型（レーン
８および１１）または突然変異（レーン９および１２）
ｈｐとともにインキユベーションする。右の上の矢印は
β−ガラクトシダーゼを示す；右の下の矢印はｐＺＭ−
Ｓａｕからの切断産生物を示す。分子量マーカーは左に
示す（ｌＯＳｋｄ−ホスホリラーゼｂ　；　６７ｋｄ−
ウシ血清アルブミン：４２ｋｄ−オバルブミンｉ２８ｋ
ｄ＝炭酸アンヒドラーゼ）。 第７図は、ペプスタチンＡによるβ−ガラクトシダーゼ
の切断の阻害を描写する。ｐＺＭ−ＳＡＵを収容するＭ
Ｃｌ０６１細胞からのβ−ガラクトシダーゼ／切断カセ
ットタンパク賞を、ベプスタチンＡの存在下または不存
在下にＨＩＶプロテアーゼとインキユベーションし、次
いで抗β−ガラクトシダーゼを使用してウェスタン・ブ
ロッティングする。レーンｌ、プロテアーゼなし。レー
ン２、プロテアーゼを添加した。ジメチルスルホキシド
中に溶解したべプスタチンＡを、０、０．２、１、５、
２５および５０μｇ／ｒｒｌのｃｒｔにおけるインキュ
ベーションに添加する（レーン３〜８）。右の上の矢印
はβ−ガラクトシダーゼを示す；右の下の矢印はｐＺＭ
−ＳＡｕからの切断産生物を示す。左の分子量マーカー
は第６図、パネルＢにおけるそれらと同一である。 第８図は、ＨＩＶプロテアーゼによるβ−ガラクトシダ
ーゼ／切断カセットタンパク質の生体内切断を描写する
。バネルＡ：ｐｌ＋ＩＱＳａｕ　（レーンｌ）、ｐｌ＋
ＩＱ−ＣＩａＡ（レーン２）、ｐｌ＋ＩＱ−ＣｌａＢ　
（レーン３）、ｐｌ＋ＩＱ−Ｂｓｓ（レーン４）、ｐｌ
＋ＩＱ−Ｅｃｏ　（レーン５）、ｐｌ＋ＩＱ（レーン６
）を収容するか、あるいはプラスミドをもたないＭＣｌ
０６１細胞を対数中期（ｍ−ｉｄ−１０ｇ　　ｐｈａｓ
ｅ）に増殖させ、そしてＩ　ＰＴＧを１ミリモルに添加
する。 ３０分後、細胞を沈澱させ、そして試料緩衝液中に懸濁
させ、次いで電気泳動および抗β−ガラクトシダーゼを
使用するウェスタン・プロッティングにかける。パネル
Ａ：グラスミドを含まない（レーン１）またはｐｌ＋Ｉ
Ｑｓａｕを収容する（レーン２）またはｐｌ５＋ＩＱｓ
ａｕ　（レーン３）を収容する（レーン３）ＭＣＩ０６
１細胞をパネルＡにおけるように処理する。各パネルに
おいて、右の上の矢印はβ−ガラクトシダーゼを示す；
右の下の矢印はｐｌ＋ＩＱｓａｕからの切断産生物を示
す。各パネルにおいて、分子量マーカーは第６図、バネ
ルＢにおけるものと同一である。 第９図は、生体内切断アッセイの結果を描写する写真で
ある。種々のグラスミドを収容するＥ．ｃｏ１ｉ１ｉ株
ＭＣｌ０６１の試料を、色指示体Ｘ−ｇａ　ｌを含有す
る平板上にスポッティングする。 プラスミドはｐＺＭ−１（β−ガラクトシダーゼ活性に
ついての陽性の対照）、ｐＺＭ−２（βーガラクトシダ
ーゼ活性についての陰性の対照）、ｐＺＭ−ＳＡｕ，ｐ
　１＋ＩＱＳａｕ　（標識した１＋（ＱＳａｕ）および
ｐｌ５＋ＩＱｓａｕ　（標識したｐ１５＋ＩＱ−Ｓａｕ
）である。水ＨＩＶプロテアーゼを使用する切断アッセ
イにおいて、β一ガラクトシダーゼを切断する構成体は
白色を生戊するが、β−ガラクトシダーゼを切断しない
構成体は青色を生戊する。プラスミドｐＺＭ−１は後述
するように構成する。プラスミドｐＺＭ−２は突然変異
の不活性なβ−ガラクトシダーゼをエンコードし、それ
ゆえ白色のコロニーを産生ずる。 プラスミドｐ　Ｚ　Ｍ　−　２　ハ、ｐ　ＺＭ−　１を
ＥｃｏＲ！およびＢａｍＨＩで消化して、β−ガラクト
シダーゼのカルボキシ末端における１８アミノ酸の遺伝
情報を指定するＤＮＡ配列を欠失することによって構成
する。期待するように、ｐＺＭ−１は青色を産土し、同
様にｐ　Ｚ　Ｍ　Ｓ　Ａ　ｕおよびｐｌ５＋Ｉ　Ｑ　Ｓ
　ａ　ｕも青色を産生ずる。プラスミドｐｚＭ−２は、
陰性の対照として、白色を産生ずる；ｐｌ＋ＩＱｓａｕ
からのβ−ガラクトシダーゼはＨＩＶプロテアーゼによ
り切断され、そして白色を産生する。 第１０図は、ポリオプロテアーゼによる生体内のポリオ
プロテアーゼ切断カセットの切断を描写する。ポリオプ
ロテアーゼ切断部位（ＭＣ　ｌ　０　６１　／　ｐ　Ｚ
　Ｍ　３　Ｃ　Ｓ　ａ　ｕ中の）またはＨｒＶプσテア
ーゼ切断部位ＣＭＣｌ０６　１／ｐＺＭ−ＳＡｕ中の）
を含有するβ−ガラクトシダーゼの抽出物をポリオプロ
テアーゼまたはＨＩＶプロテ、アーゼとともにインキュ
ペーシ３ンし、次いで抗β−ガラクトシダーゼを使用す
るウエスタン・ブロツテ，ングにかける。レーンｌ１プ
ラスミドを含まないＭＣｌ０６１．レーン２、ボリオ３
Ｃプロテアーゼ。レーン３、ＨＩｖプロテアーゼ。レー
ン４、インキュベーシａンしないＭＣ１０６１／ｐＺＭ
３ＣＳａｕ．レーン５、ポリオ３０プロテアーゼトイン
キュヘ−シｙ　ンシタＭＣ　Ｉ　Ｏ　６　１／　ｐ　Ｚ
Ｍ３ＣＳａｕ，レーン６、ＨＩＶプロテアーゼとインキ
ュベーションしｔ二ＭＣｌ０６１／ｐＺＭ３ＣＳａｕａ
レーン７、インキユベーシジンしないＭＣ　１　０　６
　１　／　ｐ　Ｚ　Ｍ　−　Ｓ　Ａ　ｕ　，　レーン８
、ｐＰｏ１ｉｏプロテアーゼ３Ｃとインキユベーション
したＭＣｌ０６１／ｐＺＭ−ＳＡｕ，レーン９、ＨＩＶ
ブロテアーゼとインキユベーションしたＭＣ１　０　６
　１／　ｐ　ＺＭ−ＳＡｕ，レーン１０、インキユベー
シゴンしないＭＣｌ０６１／ｐＺＭｌ．レーン１１，ｐ
Ｐｏｌｉｏプロテアーゼ３Ｃとインキユベーションした
ＭＣｌ０６１／ｐＺＭ１。レーン１２、ＨＩＶプロテア
ーゼとインキユベーションしたＭＣ１０６１／ｐＺＭ１
．右の上の矢印はβ−ガラクトシダーゼを示す：右の下
の矢印はＳａＵ構成体からの切断産生物を示す。分子量
のマーカーは左に示す（ｌＯ３ｋｄ−ホスホリラーゼｂ
；６７ｋｄ−ウシ血清アルブミンｉ４２ｋｄ−才バルブ
・ミン。 Ｍ２ Ｍ３ Ｍ４ Ｍ５ Ｍ６ Ｍ７ ＦＩＧ．　４ Ｍ 一一 瑠　霞　雲 ▼▼ ＋１ ５　　霧 ▼▼

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、工程： （ａ）Ｔ７プロモーターの制御下にプロテアーゼをエン
   コードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを構成し、 （ｂ）バクテリアの発現菌株に対する前記プロテアーゼ
   の毒性のために、前記プラスミドにより形質転換されな
   い、前記バクテリアの発現菌株を選択し、そして （ｃ）スクリーニングすべき化合物を前記プラスミドと
   一緒に前記バクテリアの菌株に添加し、こうして前記バ
   クテリアの菌株が殺されず、そして形質転換体を産生す
   る場合、前記化合物がプロテアーゼの阻害因子として同
   定されるようにする、からなる、プロテアーゼ酵素を阻
   害する化合物についてスクリーニングする方法。 ２、工程： （ａ）Ｔ７プロモーターの制御下にヒトの免疫欠損ウィ
   ルスのプロテアーゼをエンコードするＤＮＡ配列を有す
   るプラスミドを構成し、 （ｂ）前記プラスミドにより形質転換されたバクテリア
   の菌株を選択し、前記菌株は誘発因子のイソプロピル−
   β−Ｄ−チオガラクトプラノシドによるプロテアーゼの
   合成の誘発により殺され、そして （ｃ）スクリーニングすべき化合物を前記イソプロピル
   −β−Ｄ−チオガラクトプラノシドと一緒に前記形質転
   換されたバクテリアの菌株に添加し、こうして誘発され
   た細胞が殺されない場合、前記化合物はヒトの免疫欠損
   ウィルスのプロテアーゼの阻害因子として同定される、 からなる、ヒトの免疫欠損ウィルスのプロテアーゼを阻
   害する化合物についてスクリーニングする方法。 ３、（ａ）酵素的に活性な１０ｋｄのヒトの免疫欠損ウ
   ィルスのプロテアーゼの１８ｋｄのプロテアーゼ前駆体
   をエンコードするＤＮＡ配列中に突然変異を導入し、こ
   れによりそうでなければ成熟した、酵素的に活性な１０
   ｋｄのプロテアーゼを遊離する前記前駆体の自己消化を
   防止するか、あるいは （ｂ）前記１０ｋｄのプロテアーゼをエンコードするＤ
   ＮＡ配列中に突然変異を導入する、からなる、前記１０
   ｋｄのプロテアーゼの発現を防止する方法。 ４、１０ｋｄのヒトの免疫欠損ウィルスのプロテアーゼ
   の１８ｋｄのプロテアーゼ前駆体をエンコードするＤＮ
   Ａを修飾し、こうして成熟した１０ｋｄのプロテアーゼ
   のアミノ酸−１〜１に位置する切断可能なＰｈｅ−Ｐｒ
   ｏ結合を崩壊させる、からなる、非機能的な１０ｋｄの
   ヒトの免疫欠損ウィルスのプロテアーゼを産生する方法
   。 ５、工程： （ I ）（ａ）色指示化合物と反応して色の変化を生成
   することによってアッセイすることができるリポーター
   タンパク質を選択し、 （ｂ）前記タンパク質の遺伝情報を指定する遺伝子中に
   、プロテアーゼ酵素の切断部位を含むペプチドの遺伝情
   報を指定する異種ＤＮＡ配列を挿入し、 （ｃ）適当な発現系中に、工程（ｂ）の構成体と、工程
   （ｂ）の異種ＤＮＡ配列により遺伝情報を指定された前
   記ペプチドの前記プロテアーゼ酵素の切断部位を認識し
   かつ切断するプロテアーゼ酵素の遺伝情報を指定する遺
   伝子とを挿入し、（ｄ）（ｉ）工程（ｃ）の発現系、 （ｉｉ）色指示化合物、および （ｉｉｉ）栄養培地、 からなるアッセイ系を調製し、そして （ｅ）スクリーニングすべき化合物を前記アッセイ系に
   添加し、こうして、前記化合物が前記プロテアーゼ酵素
   を阻害する場合、前記発現系は工程（ｂ）の完全な構成
   体を産生し、前記リポータータンパク質はその活性を保
   持し、そして色は前記アッセイ系において維持されるが
   、前記化合物が阻害因子でない場合、前記プロテアーゼ
   は工程（ｂ）のペプチドのプロテアーゼ酵素の切断部位
   を切断し、前記リポータータンパク質は不活性化され、
   そして色は前記アッセイ系において観察されないか、あ
   るいは （II）（ａ）光を放射する化学反応を触媒することがで
   きるリポータータンパク質を選択し、（ｂ）前記リポー
   タータンパク質の遺伝情報を指定する遺伝子中に、プロ
   テアーゼ酵素の切断部位を含むペプチドの遺伝情報を指
   定する異種ＤＮＡ配列を挿入し、 （ｃ）適当な発現系中に、工程（ｂ）の構成体と、工程
   （ｂ）の異種ＤＮＡ配列により遺伝情報を指定された前
   記ペプチドの前記プロテアーゼ酵素の切断部位を認識し
   かつ切断するプロテアーゼ酵素の遺伝情報を指定する遺
   伝子とを挿入し、（ｄ）（ｉ）工程（ｃ）の発現系、お
   よび （ｉｉ）工程（ａ）のリポータータンパ ク質により触媒される光を放射する化学反応を行う化合
   物、からなるアッセイ系を調製し、そして（ｅ）スクリ
   ーニングすべき化合物を前記アッセイ系に添加し、こう
   して、前記化合物が前記プロテアーゼ酵素を阻害する場
   合、前記発現系は工程（ｂ）の完全な構成体を産生し、
   前記リポータータンパク質はその活性を保持し、そして
   光を放射する化学反応は起こるが、前記化合物が阻害因
   子でない場合、前記プロテアーゼは工程（ｂ）のペプチ
   ドのプロテアーゼ酵素の切断部位を切断し、前記リポー
   タータンパク質は不活性化され、そして前記光を放射す
   る化学反応は起こらない、からなる、プロテアーゼ酵素
   を阻害する化合物についてスクリーニングする方法。 ６、工程： （ａ）基質との反応により監視することができる活性を
   有するリポータータンパク質を選択し、（ｂ）前記リポ
   ータータンパク質の遺伝情報を指定する遺伝子を、プロ
   テアーゼ酵素の切断部位を含むペプチドの遺伝情報を指
   定する異種ＤＮＡ配列を挿入し、 （ｃ）適当な発現系中に、工程（ｂ）の構成体を挿入し
   、 （ｄ）（ｉ）工程（ｂ）の異種ＤＮＡ配列により遺伝情
   報を指定されるペプチドのプロテアーゼ酵素の切断部位
   を認識しかつ切断するプロテアーゼ酵素、 （ｉｉ）工程（ｂ）の構成体を収容する工程（ｃ）の発
   現系、および （ｉｉｉ）工程（ａ）のリポータータンパク質を反応す
   る基質、 からなるアッセイ系を調製し、そして （ｅ）スクリーニングすべき化合物を前記アッセイ系に
   添加し、こうして、前記化合物が前記プロテアーゼ酵素
   を阻害する場合、前記発現系は工程（ｂ）の完全な構成
   体を産金し、前記リポータータンパク質はその活性を保
   持し、そして前記リポータータンパク質は前記基質との
   反応により監視されるその活性を保持するが、前記化合
   物が阻害因子でない場合、前記プロテアーゼは工程（ｂ
   ）のペプチドのプロテアーゼ酵素の切断部位を切断し、
   そして前記リポータータンパク質は不活性化される、 からなる、プロテアーゼ酵素を阻害する化合物について
   スクリーニングする方法。 ７、ｐＰＤＢ１６、ｐＭａｅ２、ｐｌ＋ＩＱＳａｕおよ
   びｐＺＭ３ＣＳａｕと表示するプラスミドから成る群よ
   り選択されるプラスミド。 ８、プラスミドｐＰＤＢ１６を収容するＥ．ｃｏｌｉ菌
   株ＤＨ５α（ＡＴＣＣ　６８００５）、プラスミドｐＰ
   ４８を収容するＥ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（
   ＡＴＣＣ　６８００４）およびプラスミドｐｌ＋ＩＱＳ
   ａｕを収容するＥ．ｃｏｌｉ菌株ＭＣ１０６１（ＡＴＣ
   Ｃ　６８、３５２）から成る群より選択されるプラスミ
   ドを収容するバクテリアの菌株。