JPH0317807B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は、鳥類特に鶏の伝染病予防薬、さらに
詳しくは培養細胞を用いた鶏伝染性喉頭気管炎生
ワクチン、およびこれを用いた鶏伝染性喉頭気管
炎・マレツク病混合生ワクチンに関する。 技術的背景と従来技術 鶏伝染性喉頭気管炎およびマレツク病は、ウイ
ルスによつて起こる鶏伝染病で、その発生は日本
のみならず、アメリカ、ヨーロツパ、オーストラ
リアなど鶏の多数羽飼育の進んでいる国で発生
し、養鶏産業の生産性を大きく低下させる要因と
して重要視されている。 鶏伝染性喉頭気管炎は鶏の呼吸器病であり、鶏
が鶏伝染性喉頭気管炎ウイルスに感染すると、感
染後２ないし３日で発症し、２日から２週間症状
が続く。死亡率は、ウイルスの病原性、鶏の飼育
環境等の条件で異なり、10％から70％とかなりの
差が認められるが、通常は20％程度とされてい
る。また鶏は系統、性別、日齢に関係なくこのウ
イルスに対し感受性を有しており、特に日齢の若
い雛ほど発生率、死亡率ともに高い傾向を示す。 この病気に罹患すると、気管に炎症を起こし
て、くしやみ、咳などの症状を示し、重症の場合
には、気管滲出物が気管をふさいであえぎ呼吸を
したり窒息死を起こしたりする。その結果、飼育
鶏の死亡率の増加、飼育効率の低下、体重増加率
の低下、産卵率の低下をまねく。鶏の多数羽飼育
の進んでいるわが国においては、ひとたび鶏伝染
性喉頭気管炎が飼育鶏の中において発生すると前
に述べたような症状が生じ、養鶏業者にとつて多
大な損害を被ることから、鶏伝染性喉頭気管炎
は、養鶏産業の生産性低下の原因として重要視さ
れ届出伝染病として指定されている。 一方、鶏のマレツク病はリンパ様細胞が増殖す
る腫瘍性の病気で、神経、生殖器、各種の内臓、
眼および皮膚等に広く病変が出現する伝染病であ
る。このマレツク病に対しても鶏は系統、性別を
問わず高い感受性を示すが、日齢の若いものほど
感受性が高く、その影響も大きいことがわかつて
いる。マレツク病の臨床症状は、神経が冒された
場合には神経麻ひによる運動障害、内臓が冒され
た場合には腫瘍の出現による内臓の機能障害およ
び慢性消耗性の栄養不良が起こり、ほとんどの場
合に回復できずに死亡することが多い。 鶏伝染性喉頭気管炎や、マレツク病発生時の処置
としては、効果的な治療薬剤がなく、発症鶏を抜
き出して鶏の数を減らすとか換気をよくすること
が考えられる対策であるが、実質的にはほとんど
効果がないというのが現状である。未然にウイル
ス感染を防御する効果的なワクチンのみが、唯一
考えられる現実の対策である。 すでにこれら２つの伝染病に対するワクチンが
開発され養鶏業界で使用されている。しかしなが
ら、現在のところこれらの混合ワクチンは開発さ
れておらず、それぞれ単独で、２度にわたり接種
を行つているのが現状であり、また鶏伝染性喉頭
気管炎ワクチンも安全性、有効性および接種方法
の点でいまだ問題を残している。 まず現在使用されている鶏伝染性喉頭気管炎ワ
クチンは、弱毒鶏伝染性喉頭気管炎ウイルスを培
養細胞で培養して得た培養上清、すなわち感染培
養細胞を除いたウイルス液のみ、または鶏伝染性
喉頭気管炎ウイルスを鶏卵のしよう尿腔液で培養
したウイルス液を主成分とする弱毒化生ワクチン
であり、ウイルスの自然感染部位のひとつである
眼に接種し、鶏に免疫を与えるものである。しか
し、この鶏伝染性喉頭気管炎ワクチンには、鶏伝
染性喉頭気管炎に対する十分な免疫効果という点
と、接種時期の２つの点でまだ問題が残されてい
る。 すなわち、現行の鶏伝染性喉頭気管炎ワクチン
接種では、14日齢以前の鶏にワクチン接種したも
のには免疫効果が現れないことが確認されてお
り、14日齢以降の鶏にしか十分な効果を得ること
ができない。そのため、鶏が14日齢以前に鶏伝染
性喉頭気管炎ウイルスの感染を受けた場合にはこ
れを防ぐことができないという大きな問題が残つ
ている。また鶏は、14日齢となると体も大きくな
り、動作も俊敏となるために、この時期に鶏を捕
まえ、一羽一羽にワクチンを接種することは、鶏
によけいなストレスを与える原因となつていると
ともに、多数羽飼育が進んでいる日本の養鶏業者
にとつて、経済的にも、労働力の面からも非常に
大きな負担となつている。また、、点眼用ワクチ
ンは弱毒化されてはいるとはいえ、接種反応の恐
れは依然として残されている。 一方、現在使用されているマレツク病ワクチン
は、弱毒マレツク病ウイルスまたは弱毒七面鳥ヘ
ルペスウイルスを培養細胞で培養した感染細胞を
有効成分とするワクチンであり通常０日齢の鶏に
接種されている。マレツク病ワクチンで感染細胞
を有効成分として用いる理由はマレツク病ウイル
スが非常に不安定なウイルスであり、培養細胞を
用いて培養する場合でも、細胞外にウイルスが出
るとすぐにウイルスに変化が生じ、ワクチンとし
ての抗原性が失われてしまうという性質を持つて
いるためである。上述した理由で、現在のところ
鶏伝染性喉頭気管炎とマレツク病ワクチンの混合
ワクチンは開発されておらず、また鶏伝染性喉頭
気管炎ワクチン自体もいまだ満足できるものは開
発されていない。 発明の目的 本発明の目的は、０日齢の鶏にも接種できる改
良された鶏伝染性喉頭気管炎ワクチンを提供する
ことである。本発明のさらに別の目的はマレツク
病ワクチンと同様に皮下接種可能な鶏伝染性喉頭
気管炎ワクチンを提供し、それによつて鶏伝染性
喉頭気管炎、マレツク混合ワクチンを提供するこ
とである。 本発明のこれら、および他の目的は、弱毒鶏伝
染性喉頭気管炎ウイルスを培養細胞で培養して得
た感染細胞を有効成分とする鶏伝染性喉頭気管炎
生ウイルスワクチンを提供することによつて達成
される。即ち、上述のマレツクウイルス以外の一
般的な特別の事情をもたないウイルスを用いるワ
クチンでは、通常ワクチンとして必要な成分であ
るウイルスのみを精製し、これ以外の培養細胞
等、不要と考えられる成分は取り除いてワクチン
精製品にするのが通常の概念であるが、本発明者
らは、鶏伝染性喉頭気管炎ウイルス感染細胞を主
成分とするものを鶏に接種したところ意外にもこ
れが有効であり、かつ皮下接種できることを見い
出した。 本発明はこの知見に基ずくものであり、さらに
検討を進めた結果、この感染細胞からなるワクチ
ンは鶏に対して極めて安全であることを確認し
た。 すなわち、この感染細胞を成分とする新しいワ
クチンを、これまでのワクチンの接種において行
つていた14日齢以降の鶏への点眼法ではなく、養
鶏業者にとつても接種が容易な、初生時の鶏の皮
下または筋肉内に接種することにより鶏伝染性喉
頭気管炎ウイルスに対して十分な免疫効果が14日
齢以前でも得られ、かつ接種による鶏への副作用
も生じないことを見い出し本発明を完成するに至
つたのである。 本発明によれば、初生時の鶏に対する１回の皮
下または筋肉内接種により、永続的な免疫効果を
得ることが可能な弱毒鶏伝染性喉頭気管炎生ワク
チンが提供される。さらには、この弱毒鶏伝染性
喉頭気管炎ウイルス感染培養細胞と、弱毒マレツ
ク病ウイルスまたは七面鳥ヘルペスウイルスの感
染細胞を混合したワクチンにより、初生時の鶏に
対する１回の接種によつて永続的な免疫効果を得
ることが可能な弱毒鶏伝染性喉頭気管炎・マレツ
ク病混合生ワクチンをも提供できる。 発明の構成およびその効果 本発明で鶏伝染性喉頭気管炎またはマレツク病
ウイルスの培養に使用する細胞としては、通常本
目的に使用される培養細胞、例えば鶏腎由来培養
細胞、鶏胚由来培養細胞、アヒル腎由来培養細胞
およびアヒル胚由来培養細胞などをあげることが
できる。 培養するウイルスとしては、鶏伝染性喉頭気管
炎ワクチン用には、弱毒化した鶏伝染性喉頭気管
炎ウイルスたとえば鶏伝染性喉頭気管炎ウイルス
CE株等を用い、マレツク病ワクチン用には、弱
毒化したマレツク病ウイルスまたは七面鳥ヘルペ
スウイルスを用い得る。 培養方法は、上記培養細胞に適当量の弱毒ウイ
ルスを感染させ、その細胞浮遊液を培養びんまた
はタンクを用いて通常の培養条件下で、例えば37
℃で４〜５日間培養する。細胞中でウイルスが増
殖極期に達したところで、細胞をトリプシン等で
浮遊させ遠心操作により感染細胞を採取し、適当
な濃度に牛血清等を用い浮遊させワクチン原液を
得る。ワクチン原液は、無菌試験、マイコプラズ
マ否定試験等のワクチンの安全性確認のため必要
な試験を行つたあと分注し保存する。また、ワク
チンの剤型としては、感染培養細胞をジメチルス
ルホキシドやグリセリンなどの凍結保護剤で懸濁
し、液体窒素中で凍結保存する凍結ワクチンおよ
び、適当な凍結保護剤に感染培養細胞を懸濁させ
たあと、凍結乾燥をおこなう凍結乾燥ワクチンの
いずれであつてもよい。 本発明の鶏伝染性喉頭気管炎ワクチンの有効投
与量はウイルス量にしてTCID50で10³〜10⁵程度
である。 鶏伝染性喉頭気管炎ワクチンとマレツク病ワク
チンの混ワクチンを製造する場合には、それぞれ
の弱毒ウイルスを培養細胞を用いて別々に培養
し、それぞれの有効量を適当に混合してワクチン
原液を得る。またウイルス培養時において両者の
ウイルスを混合し、同じ培養細胞で同時に培養さ
せることも可能である。このような混合ワクチン
の場合、ワクチンとしての有効性が他方の有効成
分によつて損なわれる干渉作用が認められる場合
が多々あるが、本発明において後述の実施例で示
すごとく、そのような干渉作用は認められず、有
効な混合ワクチンを得ることが出来る。 本発明の最も大きな効果は、従来の鶏伝染性喉
頭気管炎ワクチンでは達せられなかつた初生鶏に
対し皮下または筋肉内接種が可能となることであ
る。すなわち、これまでの鶏伝染性喉頭気管炎ワ
クチンでは14日齢以降の鶏を接種の対象とし、通
常は十分な有効性という観点から、更に成長した
21日齢程度の鶏に接種していたため、それ以前の
感染については予防法が全くないのが現状であつ
た。これに対して、本発明のワクチンを使用すれ
ば、初生時の鶏にワクチンの接種が可能となり、
またその有効性、安全性も十分に達せられること
から、飼育鶏の鶏伝染性喉頭気管炎をほぼ完全に
予防することができるという大きな利点を得るこ
とが出来る。 また、このような生まれて間もない雛にワクチ
ン接種する場合、雛に母体から授かつた移行抗体
が存在していることで、十分なワクチンの効果が
得られない場合があると言われている。しかしな
がら、本発明のワクチンでは、雛の体内に鶏伝染
性喉頭気管炎ウイルスに対する移行抗体が存在す
る場合でも、ワクチンとしての十分な有効性があ
ることが確認された。これは、ワクチンとして接
種する鶏伝染性喉頭気管炎ウイルスが裸の状態で
はなく、培養細胞の細胞膜で覆われているために
移行抗体からの影響を免れるのではないかと考え
られる。 しかも、以上のような有効性の面での大きな効
果に加えて、本発明のワクチンは、比較的おとな
しい初生時の鶏に接種できるため、14日齢以降の
鶏に接種するこれまでのワクチンのように、接種
する作業者にとつて多大な労力を費やすことなく
鶏に接種することができる。一般にこの業界にお
いては、授精鶏卵をふ化業者がふ化させた後、そ
の雛が養鶏業者に渡されるというシステムが通常
であるため、本ワクチンでは、ふ化業者によつて
鶏に接種することが可能となる。このことは養鶏
業者の労働力の省力化の面においても大きな効果
をもたらす。通常、マレツク病のワクチンなどは
現在この時期に鶏に接種されていることからし
て、本発明のひとつの実施態様である混合ワクチ
ンの形として使用できることは孵化業者にも何ら
余計な手間を生じさせないものである。 次に、本発明を実施例に沿つて、更に詳細に説
明する。 実施例 １ ９〜11日齢のSPF鶏由来胚細胞を無菌的に採取
し、0.25％トリプシン溶液で消化し、細胞浮遊液
（２×10⁶個／ml）を得た。細胞浮遊液100mlにつ
き10³・⁰TCID50の割合で、弱毒鶏伝染性喉頭気
管炎ウイルスCE株を加え、培養びん（ルーびん
または回転培養びん）に100ml〜150mlずつ分注
し、37℃で４〜５日間培養した。CPEが80％以
上に出現したことを確かめ、トリプシンで消化
し、遠心分離（1500rpm，５分）して感染細胞を
採取した。採取した感染細胞を混合して、細胞数
が10⁷・⁰個になるように牛胎児血清を含むMEM
培地に浮遊させワクチン原液とした。ワクチン原
液については、無菌試験、マイコプラズマ否定試
験を行い、安全性を確認した。ワクチン原液にジ
メチルスルホキシド10v／ｖ％、ベンジルペニシ
リンカリウム100単位／mlおよび硫酸ストレプト
マイシン100μg／mlを加え、アンプルに分注し
た。熔封したアンプルは液体窒素を用いて−100
℃以下に凍結保存した。カゼイン水解物4.0ｇ、
塩化ナトリウム7.965ｇ、リン酸一ナトリウム
0.18ｇ、リン酸二ナトリウム1.53ｇおよびフエノ
ールレツド0.025ｇを蒸留水990mlに溶解したもの
を用意し、これを滅菌した後、ワクチンの溶解用
液として用いた。 このワクチンの安全性を調べるために、正常の
鶏を用い、０日齢と、21日齢の鶏の頚部皮下およ
び筋肉内にそれぞれ接種した。その結果を第１表
と第２表に示した。

【表】
.
０ 10 皮下 0.2 1
0^{４ ５} 異常なし 163 771

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 弱毒鶏伝染性喉頭気管炎ウイルスを培養細胞
   で培養して得た感染細胞を有効成分とする鶏伝染
   性喉頭気管炎生ウイルスワクチン。 ２ 弱毒鶏伝染性喉頭気管炎ウイルスを培養細胞
   で培養して得た感染細胞と、弱毒マレツク病ウイ
   ルスまたは七面鳥ヘルペスウイルスを培養細胞で
   培養して得た感染細胞とを混合した鶏伝染性喉頭
   気管炎・マレツク病混合生ワクチン。 ３ ワクチンが皮下または筋肉内接種用である前
   記第１項または第２項記載のワクチン。