JPH03178995A - 蛋白質およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、易熱性エンテロトキシンＢサブユニット（Ｌ
ＴＢ）と易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）とは異種の蛋
白質との融合蛋白遺伝子を組換えＤＮＡ技術を用いて真
核生物あるいは原核生物で発現させることによって、治
療ワクチンや予防ワクチンの免疫原として有用な融合抗
原、および各種３− 疾病の治療に有用な生理活性融合蛋白を製造する技術に
関する。

述朱乃丑１− 外来物質または生理活性物質（蛋白）に界面活性剤を添
加して鼻粘膜組織からの吸収を高めたり、外来抗原にコ
レラトキシンを添加して鼻粘膜組織から免疫する試みが
検討されている。

充−を−珍）邂匙ぐ〔δＬ□課應 外来物質または生理活性融合物質の鼻粘膜組織からの吸
収を促進させ、また鼻粘膜組織から免疫するために適し
た蛋白の作製が望まれている。

黒蒐」」連作を支−な−森鬼毛没 本発明者らは、局所への外来蛋白のターゲラティグによ
・って、鼻粘膜組織からの該蛋白の吸収や免疫に適した
抗原を作製することを目標に研究を進めた結果、Ｌ　Ｔ
　ＢとＬＴとは異種の蛋白質とを遺伝子工学的に結合さ
せた融合蛋白が、この目的を達成し得ることを見出し、
本発明を完成した。

すなわち、本発明は、（１）ＬＴＢとＬ　Ｔとは異種の
蛋白質とを遺伝子工学的に結合させた融合蛋白、　（２
）上記（１）記載の融合蛋白をコードする塩基配列を含
有する組換えＤＮＡ、（３）上記（２）記載の組換えＤ
ＮＡを保持する形質転換体、（４）上記（３）記載の形
質転換体を培養し、培養物中に上記（１）記載の融合蛋
白を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする
該融合蛋白の製造法に関するものである。

異種の蛋白質としては、例えば、ワクチン用の抗原（蛋
白またはポリペプチド）や生理活性蛋白質（蛋白または
ポリペプチド）があげられる。

ワクチン用の抗原としては、例えば、単純ヘルペスウィ
ルス（Ｈ８Ｖ）、水痘帯状はう疹ウィルス（ＶＺＶ）、
サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）をはじめとするヘルペ
スウィルスの抗原、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、
成人Ｔ細胞白血病ウィルス（ＨＴＬＶ−１）をはじめと
するレトロウィルスの抗原、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ
）をはじめとするヘパドナウィルスの抗原、非Ａ非Ｂ型
肝炎ウィルス（ＨＣＶ、ＲＥＶ）、日本脳炎ウィルスを
はじめとするトガウィルスの抗原、Ａ型肝炎ウィルス（
ＨＡＶ）をはじめとするピコルナウィルスの抗原、イン
フルエンザウィルスをはじめとするオルソミキソウイル
スの抗原、パルボウイルスの抗原、パボバウイルスの抗
原、アデノウィルスの抗原、ポックスウィルスの抗原、
レオウィルスの抗原、パラミキソウイルスの抗原、ラブ
ドウィルスの抗原、アレナウイルスの抗原、コロナウィ
ルスの抗原などの動物を宿主とするウィルスの抗原、マ
ラリア抗原などの病原性原虫の抗原、百日咳菌抗原など
の病原性細菌の抗原などが挙げられる。

生理活性蛋白質としては、外来、あるいはヒｌ〜由来の
生理活性ペプチドや蛋白質（例、ホルモン（インスリン
、ヒト成長ホルモン、ゴナドトロピン、インヒビタ、プ
ロラクチンなど）、酵素（セラチオペプチターゼなど）
、サイトメガロ（インターフェロン（ＩＦＮ）−α、Ｉ
ＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、インターロイキン（ＩＬ）−１
、Ｉ　Ｌ２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、Ｉ　Ｌ−５、Ｉ　Ｌ
　−６、ＩＬ−７、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マ
クロファージコロニー刺ｆｆｉ　因子、マクロファージ
コロニー刺激因子、エリスロボエチンなど）〕、成長因
子（塩基性繊維芽細胞増殖因子、上皮細胞増殖因子など
）が挙げられる。

蛍白質、例えばワクチン用の抗原とＬＴＢとはリンカ−
を介して融合していてもよい。リンカ−はＧ、Ａ、Ｖ、
Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｃ，Ｍ、Ｅ、Ｄ。

Ｋ、Ｒ，Ｈ，Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｐ、Ｎ、Ｑから選ばれる１個
のアミノ酸残基または２〜３０個程度のアミノ酸残基か
らなるペプチド（好ましくは、１個のアミノ酸残基また
は２〜１０個程度のアミノ酸残基からなるペプチド）で
構成される。

具体的な例として、以下にＨＳ　Ｖ抗原であるＩ（Ｓｖ
表面蛋白とＬＴＢとの融合蛋白を説明する。

ＨＳ　Ｖ表面蛋白としては、＋ヘランスメンブレンドメ
インの除去された糖蛋白ｇＤおよびｇＢが有利に用いら
れる。

本発明では特に、（１）トランスメンブレンドメインの
除去されたｇＤとＬＴＢとの融合蛋白（Ｉ）、またはト
ランスメンブレンドメインの除去されたｇＢとＬＴＢと
の融合蛋白（ＴＩ）；　　（２）融合蛋白（Ｉ）あるい
は（ＩＩ）をコードする塩基配列を含有する組換えＩ）
ＮＡ（それぞれ■および■）；　　（３）組換えＤＮＡ
　（ＩＩＩ）または（ＴＶ）を保持する形質転換体；お
よび（４）組換えＤＮＡ（ＩＩＩ）または（ＩＶ）を保
持する形質転換体を培養し、培養物中に融合蛋白Ｎ）ま
たは（ＩＩ）を生成蓄積せしめ、これを採取することを
特徴とする該融合蛋白（Ｉ）または（ＩＩ）の製造法を
提供するものである。

ＨＳ　Ｖの表面蛋白遺伝子としては、例えばＨ５Ｖ−１
−型深山株等、Ｈ８Ｖ−１型や２型の各種の株のｇＤ遺
伝子やｇＢ遺伝子を用いることができる。ｇＤとしては
第↓図のようなアミノ酸配列のもの（Ｈ８Ｖ−１型深山
株の表面蛋白ｇＤ、特開平２−王８２王９６号）が例と
して挙げられるが、この中の必須の部分はＮｏ、２６の
ＬｙｓからＮｏ、３０２のＡｌａである。このｇＤをコ
ードする塩基配列を含有するＤＮＡとしては第２図に示
すものが一例として挙げられる。そのＮｏ、１．８６８ からＮｏ、１０１６までがその必須部分に相当する。

またｇＢとしては第３図（）ＴＳＶ−１型深山株の表面
蛋白ｇＢ、平成１年６月２２日出願の特願平１−１５８
２３８号および平底１年１１月３０日出願の特願平１−
−３０８９４１号）のアミノ酸配列のポリペプチドがそ
の一例として挙げられるが、この中必須の部分はＮｏ、
１のＡ　］、　ａからＮｏ。

２９３のＡｓｐまでである。このｇＢをコードする塩基
配列を含有するＤＮＡとしては第４図に示すものが一例
として挙げられる。そのＮｏ、３４１からＮｏ、１２１
９までがその必須部分に相当する。

更にｇＢ遺伝子の例として、第５図［ＨＳ　Ｖ　−１型
ＫＯ８株の表面蛋白ｇ　Ｂ　、Ｄ、Ｊ、Ｂｚｊｋら、ウ
ィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　１３３．３０１（１
９８４））　、第６図（Ｈ８Ｖ−１型Ｆ株の表面蛋白ｇ
　Ｂ　、　Ｐ、Ｅ、Ｐｅ１ｌｅｔら、ジャーナル・オブ
・ウィロロジー（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、　５３、２４３（
１９８５））のような塩基配列、それから推定されるア
ミノ酸配列のものが例として挙げられる。

これらの遺伝子、より好ましくはトランスメンブレンド
メインのコード領域を除去したトランケイテッドｇＤや
ｇＢ遺伝子に、ＬＴＢ遺伝子を結合させることによって
融合蛋白遺伝子を構築することができる。

Ｌ　Ｔ　Ｂ遺伝子としては、ＬＴＢ活性物質をコードす
るものであればいずれのものも用いることができる。、
ＬＴＢ活性物質としては、Ｔ、　Ｔ　Ｂ活性、すなわち
アジュバント作用を有する物質であればいずれでもよい
。例えばヒトやブタから分離される毒素原性大腸菌で産
生される天然のＬＴＢや遺伝子組換え技術で生産させる
組換え型ＬＴＢやこれらの関連物質が挙げられるが、な
かでもヒトから分離された毒素原性大腸菌の産生ずるＬ
Ｔ（ＬＴｈと略称）のＢサブユニット（ＬＴｈＢと略称
）が好ましい。上記ＬＴＢやこれらの関連物質は、蛋白
質である場合、糖鎖を有していてもよく、また有さなく
てもよい。

本発明に用いるＬＴＢをコードするＤＮＡとしては、毒
素原性大腸菌の産生ずるＬＴＢをコードするＤＮＡであ
ればいずれでもよく、当該ＤＮＡは天然由来のものある
いは化学合成したもののいずれでもよく、またＬＴＢ遺
伝子またはその＝一部であってもよい。

本発明に用いるＬＴＢをコードするＤＮＡは、具体的に
は、例えばＬ　Ｔ　ｈ遺伝子がクローン化されたプラス
ミドｐ　Ｊ　Ｙ　Ｌ　２２９９（Ｙａｍａｍｏｔｏ、　
Ｔ、およびＹｏｋｏｔａ、　Ｔ、、ジャーナル・オブ・
バクテリオロジ−（，１１，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１
４３．６５２（１９８０））がら適当な制限酵素を用い
ることによって調製することができ、該ＤＮＡがサブク
ローン化されたプラスミドを大腸菌内で増幅することに
より、大量にＬ　Ｔ　ｈ　ＢをコートするＤＮＡを調製
することができる。

本発明における融合蛋白（Ｉ）または（ＩＩ）をコード
する塩基配列を含有する組換えＤＮＡ　（発現用プラス
ミド）は例えば（イ）Ｈ８Ｖ−１型深山株のｇＤまたは
ｇＢ遺伝子がクローン化されたプラスミドから、目的と
するトランケイテッド遺伝子を切り出し、（ロ）必要に
より適当なリンカ−を付加させた後、該ＤＮＡの３′末
端側にＬＴＢ遺伝子を結合した融合遺伝子を構築し、（
ハ）該融合蛋白遺伝子を発現ベクター中のプロモーター
の下１１− 流に連結することにより、融合蛋白をコードするＤＮＡ
を作製することができる。

本発明に用いるベクター（例、プラスミド）としては、
宿主である真核細胞に対応して複製可能なものであれば
何でもよい。宿主が酵母の場合には、例えばｐ　Ｓ　Ｒ
１９（Ｉｌａｒａｓｉｍａ、Ｓ、ら、モレキュラー・セ
ルラー・オブ・バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉ
ｏｌ、）、４゜７７１、（１９８４））、ｐ　Ｓ　Ｈ１
，９−１，（ヨーロッパ特許出願公開ＥＰ−Ａ−０２３
５４３０）などが挙げられ、これらにプロモーターを挿
入することによって外来遺伝子発現用ビーグルが得られ
る。宿主が動物細胞の場合には、例えばｐ　Ｂ　Ｒ３２
２にＳＶ４０由来のプロモーター、し１−ロウィルスの
プロモーターなどを挿入することによって外来遺伝子発
現用ビークルが得られる。

本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発
現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば
いかなるものでもよい。宿主が酵母である場合は、ＧＬ
Ｄ（ＧＡＰＨ）プロモーターＰＨ０５プロモーター、Ｐ
ＧＫプロモーター、Ａ２− ＤＨプロモーター、ＰＨ０８１プロモーターなどが好ま
しく用いられる。宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ
４０由来のプロモーター、し１−ロウィルスのプロモー
ターなどが挙げられる。

プロモーターは対応する遺伝子より酵素的に調製するこ
とができる。また、化学合成することもできる。

このようにして構築された組換えＤＮＡを含有するベク
ターを用いて、真核細胞を形質転換する。

宿主としては、酵母、動物細胞などが挙げられる。酵母
としては、たとえばサツカロマイセスセレビシェ（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　Ａ
　Ｈ２２Ｒ、ＮＡ３７−１１Ａ、ＤＫＤ−５Ｄやシブサ
ツカロマイセス１ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）　ＡＴＣＣ３８３９９（ｈ−
１ｅｕｌ−３２）　、Ｔｌ−１１６８（ｈ”　ａｄｅ６
−Ｒ２１０ｕｒａｌ　１ｅｕｌ　）（Ｍ、　Ｋ１５ｈｉ
ｄａａｎｄ　Ｃ，Ｓｈｉｍａｄａ、カレン１へ・ジェネ
ティックス（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　、
１０，４４３　（１９８６）　３などが挙げられる。

動物細胞としては、たとえば付着細胞であるサルＣ０８
−７細胞、サルＶｅｒｏ細胞、チャイニーズハムスター
（ＣＨ○）細胞、マウスＬ細胞。

ヒトＦＬ細胞、および浮遊細胞であるマウスミエローマ
細胞（ＳＰ２１０なと）、マウスＹＡＣ１細胞、マウス
Ｍ　ｅ　ｔ　ｈ　Ａ細胞、マウスＰ３８８細胞、マウス
ＥＬ−４細胞などが挙げられる。

酵母を形質転換するには、たとえばプロシージンゲス・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス
（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、
７５．１９２９（１，９７８）：ｌに記載の方法に従っ
て行われる。動物細胞を形質転換するには、たとえばヴ
イロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、　５２，４５６（１
９７３）に記載の方法に従って行われる。

このようにして得られた形質転換体 をそれ自体公知の方法で培養する。

宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地として
は、たとえばパークホールダー（３１ｒｋｈｏｌｄｅｒ
）最小培地［Ｂｏｓｔａｉｎ、　Ｋ、Ｌ、ら「プロシー
ジンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・
サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、ＵＳＡ）　、　７７．４５０５（組換え体） （１９８０）Ｊが挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に
調整するのが奸ましい。培養は通常約２０℃〜３５°Ｃ
で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加
える。

宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地と
しては、たとえば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥ
Ｍ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、　１２２．５
０１（１９５２）：ｌ、　ＤＭＥＭ培地〔ヴイロロジー
（Ｖｊｒｏ−１ｏｇｙ）、８，３９６（１９５９）］、
　ＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０培地（ジャーナル・オブ・ザ
・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｔｈｅ
　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　
Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ）、　　１９
９，５１９（１９６７））。

］−９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエテ
ィ・フォー・ザ・バイオロジカル・メティスン（Ｐｒｏ
−ｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｏｃｊｅｔｙ　ｆ
ｏｒ　ｔｈｅ　ＢｉｏｌｏＨｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎ
ｅ）、　７３．１　（１９５０）３などが挙げられる。

。 ｐ　Ｉ（は約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約
３０℃〜４０’Ｃで約１５〜６０時間行い、必要に応じ
て通気や攪拌を加える。

本発明によれば、Ｈ８Ｖ表面抗原性とＬ　Ｔ　Ｂの５− 両活性をもつ融合蛋白は、自体公知の分離・精製法を適
切に組み合わせて行うことができる。これらの公知の分
離・精製法としては、塩析や溶媒沈殿法などの溶解度を
利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法および
５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主と
して分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグ
ラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティ
クロマトグラフイーなどの特異的親和性を利用する方法
、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を
利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利
用する方法などが挙げられる。

Ｈ８Ｖ表面抗原性とＬＴＢの両活性を有する融合蛋白の
分離・精製には、イオン交換クロマトグラフィーとゲル
ろ過（ゲルパーミェーションクロマトグラフィー）の組
み合せが好ましい。イオン交換用充填剤としては、スル
ホ基を交換基とする陽イオン交換樹脂（例、５Ｐ−Ｔｏ
ｙｏｐｅａｒｌ　６５０Ｍ）が好ましい。カラムの平衡
化に用いられる溶媒としては２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ５，８）があげられ、６ 溶出溶媒としては、Ｏ〜１ＭＮａｃｌを含む２０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ５，８）があげられる。ゲルろ適用充
填剤としては、分子量ｌＸｌＯ４〜５Ｘ１０６程度の蛋
白質を分画可能な多孔質粒子（例、５ｅｐｈａｃｙｌ　
Ｓ−３００ｔ（Ｒ）が好ましい。ゲルろ適用溶媒として
は、０．５−１．５％　ＮａＣ］を含む５−２０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６，８〜７．２）が好ましい。

Ｈ８Ｖ表面抗原蛋白以外の異種蛋白とＬＴＢとの融合蛋
白は、ＨＳ　Ｖ表面抗原蛋白遺伝子の代わりにその異種
蛋白をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を用い、上記の方法
に従って製造することが出来る。

仕損」じυ１竪 本発明で得られる抗原蛋白−Ｌ　Ｔ　Ｂ融合蛋白あるい
は生理活性蛋白−Ｌ　Ｔ　Ｂ融合蛋白は、非融合型蛋白
と比べ、鼻粘膜組織へのターゲツティングの効果がはる
かに良い。ＬＴＢには粘膜上皮細胞膜上の糖脂質と特異
的に結合する作用が有るだけでなく、共存する蛋白の粘
膜組織からの吸収を増強する作用を有するが、ＬＴＢを
目的の蛋白と融合した場合にはさらにその作用は高い。

その結果、抗原蛋白の場合には鼻粘膜局所を通して、生
体の免疫反応を効率良く誘導することが出来る。また、
生理活性蛋白の場合には鼻粘膜組織より効率良く吸収さ
せることが出来る。

本発明で得られた抗原蛋白−ＬＴＢ融合蛋白は、ウィル
ス、病原性原虫、病原性細菌の感染予防や治療のための
ワクチンとして、筋肉内、皮下、皮肉に投与できる以外
に、経鼻的にも投与できる。

また、本発明で得られる生理活性蛋白−ＬＴＢ融合蛋白
は、経鼻投与によって粘膜組織から吸収させることが出
来る。Ｈ８Ｖ抗原−ＬＴＢ融合蛋白の場合には、経膣的
投与も有効である。

なお、本願明細書や図面において、塩基やアミノ酸など
を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　　Ｃｏｍ
ｍ１ｓｉｏｎ　　ｏｎ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　
Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野
における慣用略号に基づくものであり、その例を次に挙
げる。またアミノ酸に関して光学異性体があり得る場合
は、特に明示しなければＬ一体を示すものとする。

ＤＮＡ　　：デオキシリボ核酸 Ａ　　：アデニン Ｔ　　：チミン Ｇ　　ニゲアニン Ｃニジ１へシン ＳＤＳ　　ニドデシル硫酸す１〜リウムＧｌ：ｙ　　ニ
ゲリシン（Ｇ） Ａｌａ　　：アラニン（Ａ） Ｖａｌ：バリン（Ｖ） Ｌｅｕ：ロイシン（Ｌ　） １１ｅ　　：イソロイシン（Ｉ） Ｓｅｒ　　：セリン（Ｓ） Ｔｈｒ　　：スレオニン（Ｔ） Ｃｙｓ　　ニジスティン（Ｃ） １／２Ｃｙ　ｓ　　：ハーフシスチン Ｍｅｔ：メチオニン（Ｍ） Ｇｌｕ　　：グルタミン酸（Ｅ） Ａｓｐ：アスパラギン酸（Ｄ） Ｌｙｓ　　：リジン（Ｋ） Ａｒｇ　　：アルギニン（Ｒ） ＩＱ Ｈｉｓ　　：ヒスチジン（Ｈ） Ｐｈｅ　　：フエニールアラニン（Ｆ）Ｔｙｒ　　：チ
ロシン（Ｙ） Ｔｒｐニドリプ１〜ファン（Ｗ） Ｐｒｏ　　ニブロリン（Ｐ） Ａｓｎ　　：アスパラギン（Ｎ） Ｇｉｎ　　：グルタミン（Ｑ） Ａｐｌ″　：アンピシリン耐性遺伝子 Ｔｃ’　　：テトラサイクリン耐性遺伝子なお、本発明
のペプチドにおいては、そのアミノ酸配列の一部が修飾
（付加、除去、その他のアミノ酸への置換など）されて
いてもよい。

尖適−鮭 以下の参考例および実施例により本発明をより具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない
。

後述の実施例６で得られたプラスミドｐ　ＨＤ　Ｔｄｈ
ｆｒ２を保持する形質転換体ＣＨ○−ＨＤＴ−：２−３
５は、平成１年９月８日から通商産業省工業技術院微生
物工業技術研究所（ＦＲＩ）に受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ
−２５９０として寄託され、また該微生物は平成（年８
月２４日から財団法人発酵研究所（ＵＦＯ）に受託番号
ＩＦＯ５０２０９として寄託されている。

また、実施例８で得られたプラスミドｐ　ＨＤ　Ｔ・ｎ
ｅｏｌを保持する形質転換体５ｐ−ｎｅｏ−ＨＤＴ−１
３−７１は、平成２年８月８日からＦＲＩに受託番号Ｆ
ＥＲＭ　ＢＰ−３０７１として寄託され、また該微生物
は平成２年８月８日からＵＦＯに受託番号ＩＦＯ５０２
５４として寄託されている。

後述の参考例に記載のプラスミドｐ、Ｈ８ＤＢＪ−１を
保持する形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
Ｄ　Ｈ↓／　ｐ　ＨＳ　Ｉ）　Ｂ　、Ｊ　−１は、昭和
６３年３月９日からＦＲＩに受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１
−７８４として寄託され、また該微生物は昭和６３年２
月２３日からＵＦＯに受託番号ＩＦ○　１，４７３０と
して寄託されている。

参拷１Ｌえ　プラスミドｐ　ＨＳ　Ｇ　３９６　Ｓ　ｇ
　Ｄの作製（第７図） ｇＤのＮ末端２０アミノ酸残基をコードするＤＮＡ、す
なわち第７図に示す７３１）ｐ　ＤＮＡ断片を化学的に
合威し、これを制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉ　ｎ　ｄ　ｍ
で消化したベクターｐＵＣ８に挿入した。

得られたｐＵＣ８ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄｌｌＩ７３をＢ
　ａ　ｍ　ＨＩとＮｃｏＩで消化して得られた７３ｂｐ
断片と、Ｈ８ＶのｇＤコード領域を含む約１．４ｋｂの
ＨｉｎｄｌＩＩ−Ｎｒｕｌ断片〔プラスミドｐ、Ｈ８Ｄ
　ＢＪ−１，（ＵＦＯ１４７３０，Ｆ　Ｅ　ＲＭＢＰ−
１７８４由来〕のクローン化されたプラスミドｐＵｃ１
．８ｇＤから得られた約１．２８ｋｂのＮｏ　Ｏ■−８
ａ　ｃ　Ｉ　　ＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐ　Ｈ
Ｓ　Ｇ　３９６のＢａｍＨＩ−８ａｃＩ消化物と反応さ
せ、サブクローニングプラスミドｐＨ８Ｇ３９６ＳｇＤ
を作製した。

％　　ＨＳ　Ｖ　−１型のｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｇ　Ｄ
遺伝子の構築（第８図） Ｈ８Ｖ−↓型深山株ｇＤ遺伝子を有するプラスミドベク
ターｐ　ＨＳ　０３９６　Ｓ　ｇ　Ｄ　（参考例１）を
制限酵素Ｘ−ｈ　ｏ　ＩとＸｂａｌで消化して約］。

３５　ｋ　ｌ）のＤＮＡ断片を得、さらに制限酵素Ｈ１
ｎｆＩで消化して約０．９１ｋｂのＸ、ｈｏｌ−Ｈｊｎ
ｆＩ断片を得た。第８図に示すス１−ツブコドンを有す
る１２ｂｐ　　ＤＮＡ断片を化学的に合成し、これと上
記ＸｈｏＩ−ＨｉｎｆＩ断片をプラスミドベクターｐ、
　ＨＳ　Ｇ　３９７のＸ、　ｈ　ｏ　Ｉ　−Ｓ　ａｃ■
消化物と反応させ、サブクローニングプラスミドｐ　Ｈ
Ｓ　Ｇ　３９７　Ｓ　ｇ　ＤΔＨ：ｉ、　ｎ　ｆを作製
した。

失亀奥−１−ＨＳ　Ｖ　−１型のｔｒｕｎｃａｔｅｄ　
ｇ　Ｄ　（ｔｇＤ）の動物細胞発現用プラスミドの 構築（第９図） 参考例２に記載のプラスミドｐ　ＨＳ　Ｇ　３９７　Ｓ
ｇＤΔＨｉ　ｎ　ｆをＸｈｏｌ−８ａｃＩで消化した後
、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを作用させ、約０゜９ｋｂの
ｔ−ｇＤ遺伝子を含む両端が平滑な断片を得た。

次にプラスミドｐＴＢ３９９　［特開昭６１−６３２８
３− ２号公報；　５ａｓａｄａ、　Ｒら、セル・ストラフチ
ャー・アンド−ファンクション（Ｃｅｌｌ　５ｔｒｕｃ
ｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ）、　１２．２０
５（１９８７））を制限酵素Ｅｃｏ　　Ｒ１とＢ　ｇ　
］、　Ｉｆで消化後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを作用さ
せ、約３．９ｋｂの両端が平滑な断片を得た。この断片
と上記のｔ−ｇＤを含む断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼで
反応させることにより、発現プラスミドｐＨ８Ｄ２０９
を得た。

次に、この遺伝子をＣＨＯ細胞で安定的に発現させて遺
伝子増幅も可能にするために、ｐ　Ｉ−Ｉ　Ｓ　Ｄ２０
９を制限酵素Ｃ１ａＩで消化して得られる約２．４ｋｂ
をプラスミドｐＴＢ３４８［特開昭６１−６３２８２号
公報参照〕のＣ］、　ａ　１部位に挿入することにより
、プラスミドＰＨ８ＤｄｈｆｒｌおよびｐＨ８Ｄｄｈｆ
ｒ２を得た。

％　　ＨＳ　Ｖ　−１型のｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｇ　Ｄ
の動物細胞における発現 実施例１において構築したプラスミドｐ　ＨＳ　Ｄｄｈ
ｆｒｌをリン酸カルシウム法（Ｇｏｒｍａｎ　Ｃ，Ｍ。

ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、　　２２１，５５
１−５５３（１９８３））２４ によりＣＨＯ細胞ＤＨＦＲ−株（Ｕｒｌａｕｂ　Ｇ　ａ
ｎｄ　Ｃｈａｓｉｍ、　Ｌ、Ａ、プロシージンゲス・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、７７．４２］６−４２２
０（１９８０））を形質転換し、Ｄ　ＨＦ　Ｒとなった
形質転換体を得た。

得られた形質転換体ＣＨ○−Ｈ８Ｄ−１−７を、１０％
牛脂児血清（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ　Ｍ、Ａ、　Ｂｉｏｐ
ｒｏｄｕｃｔｓ社製）を含むダルベツコ−ＭＥＭ培地Ｃ
ＧＩＢｃｏ社製〕でコンフルエントになるまで培養した
後、メチオニン不含の培地に交換し、２５μＣｊ／　ｍ
　Ｑの３″Ｓ−メチオニンを加えて一晩培養した。

この培養上清を回収後、上清１ｍｆｌにつき、５μＱの
ウサギ抗Ｈ８Ｖ−１血清（ＤＡＫＯＰＡＴＴ社製〕を加
え、４℃で２時間インキュベートした。次にプロティン
Ａ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を加えて
、さらに４℃で２時間インキュベートした後、遠心して
沈殿を回収した。この沈殿を０．０５％　ＮＰ−４０を
含むバッファーで洗浄後、Ｌａｅｍｍｌｉ　ｂｕｆｆｅ
ｒを加えて１００℃、５分間加熱した。冷却後、遠心し
て上清を回収し、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行った。泳動後、ゲルを乾燥し、オートラジオグ
ラフィーを行った結果、抗Ｈ８Ｖ−１抗体と反応する約
４３〜３０にダルトンの分子種の生成していることが分
かった。

失１各主　動物細胞において発現したＨ８Ｖ−１型のｔ
ｒｕｎｃａｔｅｄ　ｇ　Ｄ　（ｔ　−ｇ　Ｄ　）の精製 実施例２に記載の方法で培養したＣ　ＨＯ−Ｈ５Ｄ−１
−７細胞株の培養液１．８氾を２０ｍＭ　Ｔｒｊｓを含
む緩衝液（ｐＨ８，０）　３６．ＯＱに対して４℃、１
６時間透析した。この透析液２．０　Ｑに硫酸アンモニ
ウム３３６ｇを徐々に加え、４℃、２時間撹拌しつつ溶
解した。

上記の溶解液を１６８ｇ７１硫酸アンモニウム−２０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８，０）で平衡化したブチル
トヨパール６５０Ｍ　（東洋ソーダ社製）カラＡ（２，
６Ｘ　１８．８ｃｍ　、Ｌｏｏｍ　Ｑ　）に負荷し、同
緩衝液１．ＯＱで洗浄した後、１６８　ｇ　／　ｆｉ硫
酸アンモニウム−２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８，
０）から２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐ　Ｈ８、０）ま
でのリニアグラジェント（容量６００ｍＱ）により溶出
した。約１４０ｍｆｌの溶出液をセントリプレツブ１０
（アミコン社、米国）を用いて１４ｍＱにまで濃縮した
。

上記のブチル１〜ヨパール力ラムによって精製されたｔ
、−ｇ　Ｄ画分を蒸留水に対して透析した後、除菌ろ過
して、５３６／ｊ　ｇ　／　ｍ　ｆｌ濃度のｔ−ｇＤ精
製標品１４ｍＤ、を得た。

犬−施」−動物細胞から精製されたＩ−Ｉ　Ｓ　Ｖ　−
１型のｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｇ　Ｄ　（ｔ　−ｇ　Ｄ　
）の性質実施例３で得た精製ｔ−ｇＤ標品について以下
の性質を調べた。

ラエムリ〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２２７，６８
０（１９７０））の方法に準して５ＤＳ−ポリアクリル
アミドスラブ電気泳動を行った後に、銀染色を行った。

その結果、該ｔ−ｇＤ蛋白質は４３，０００ダル１〜ン
から３０゜ＯＯＯダルトンにかけての分子種から構成さ
れていた。

ｍ　　ＨＳ　Ｖ　−１型のｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｇ　Ｄ
　（ｔ　−ｇＤ）とＬＴｈＢとから成る融合蛋白 の遺伝子発現プラスミドの構築（第１０図） 参考例２に記載（７）　ｐ　ＨＳ　Ｇ　３９７　Ｓ　ｇ
　Ｄ　ΔＨｊｎｆをＨｉ、　ｎ　ｆ　Ｉで消化し、約０
．９５ｋｂのＤＮＡ断片を分離した。この断片をＫｌｅ
ｎｏωフラグメントで平滑末端と１ハＮ　ｈ　ｅ　Ｔリ
ンカ−を結合させた後、Ｎ　ｋ＋　ｅ　Ｉで消化した。

この断片をさらにＥｃｏＲＩで消化シ、ｔ；−ｇＤをコ
ートする約０．９ｋｂ１７）ＥｃｏＲＩ−Ｎｈｅｌ断片
を分離した。

次にＥ　、　ｃｏｌｉ　ｈｅａｔ−１ａｂｉｌｅ　ｔｏ
ｘｊｎの遺伝子を含むプラスミドｐ　Ｊ　Ｙ　Ｌ　２２
９９〔Ｔ、　Ｙａｍａｍｏｔｏら、ジャーナルオブバク
テリオロジー（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

）、上／１８．９８３（１９８１））を制限酵素Ｈｉ、
　ｎ　ｄ　ＩＩＴで消化してＢサブユニットを含む０．
７７ｋｂの断片を回収し、ｐ　Ｂ　Ｒ３２２のＨｉ　ｎ
　ｄ　ＩＩＩ消化物と反応させることにより、サブクロ
ーニングプラスミドｐＢＲＬＴｈ　Ｂを得た。さらに、
このプラスミドを制限酵素５ａｃＴで消化しＴ４ＤＮＡ
ポリメラーゼを作用させた後、Ｎ　ｈ　ｅ　ｌリンカ−
（ｐＣＧＣＴＡＧＣＧ）〔ファルマシア社製〕をＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて付加し、プラスミドｐ　Ｂ　ＲＬ
　Ｔ　ｈ　Ｂ　−Ｎ７− を得た。このプラスミドを制限酵素Ｄｒａ　ＩとＨｊｎ
ｄｌＴＩで消化して得られる約０．５９ｋｂのＤＮＡ断
片に８ｇｌｌｌリンカ−（ｐＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣ）（
ＮＥＢ社製）をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて付加後、Ｎ
ｈｅＩとＢ　ｇ　］、　ＴＩで消化し、Ｌ　Ｔ　ｈ　Ｂ
コード領域を含む０．３２ｋｂ　Ｎｈ　ｅ　Ｉ　−Ｂ　
ｇ　ｌ　ｍ断片を得た。

上記の０．９ｋｂおよび（１，３２ｋｂ　ＤＮＡの断片
と、ｐＴＢ３９９（特開昭６１．−６３２８２号公報；
　５ａｓａｄａ、　Ｒら、セル・ストラフチャー・アン
ド・ファンクション（Ｃｅ１１５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａ
ｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）、１２，２０５（１９８７）
］をＥｃｏＲＴ−Ｂｇｌｌｌ消化して得られた約３．９
ｋｂの断片とを反応させることにより、ｔ−ｇＤとＬＴ
ｈＢとから成る融合蛋白（ｔ−ｇＤ−Ｔ、、ＴｈＢ）の
遺伝子発現プラスミドｐＨＤＴ２０１を得た。

さらに、この融合蛋白遺伝子をＣＨＯ細胞で発現させて
遺伝子増幅を可能にするために、ｐＩ（ＤＴ２０１をＳ
　ａ　Ｊ、　ＩとＦＩｉ　ｎ　ｄ　ｍで消化して得たｔ
−ｇＤ−ＬＴｈＢ融合蛋白の遺伝子を含む約２．８ｋｂ
ＤＮＡ断片を、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）８ 遺伝子発現プラスミドｐＴＢ３４８（特開昭６１．−６
３２８２号公報参照）を５ａｉｌとＨｉｎｄｍで消化し
て得られた約４．５ｋｂの断片とを反応させることによ
り、プラスミドＰＨＤＴｄｈｆｒ２を得た（第１０図）
。

また、得られた融合蛋白遺伝子の塩基配列を第１１図に
、推定されるアミノ酸配列を第１２図に示す。

ＭＩ　　ＨＳ　Ｖ　−１型のｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｇ　
ＤとＬＴｈＢとから成る融合蛋白遺伝子の動物 細胞における発現 実施例５において構築したプラスミドｐＩ（ＤＴｄｈｆ
ｒ２を実施例２と同様にリン酸カルシウム法を用いてＣ
ＨＯ細胞Ｄ　ＨＦ　Ｒ−株に導入し、ＤＨＦ　Ｒ＋どな
った形質転換体を得た。

得られた形質転換体ＣＩ−Ｉ〇−ＨＤＴ−２−３５（Ｉ
Ｆ○　５０２０９．ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２５９０）を、
実施例２と同じ方法で培養し、３５Ｓ−メチオニンでア
イソトープラベルした後、ウサギ抗Ｈ３Ｖ−１抗体とヤ
ギ抗コレラトキシン抗体（１４■ＳＴ　ＢＩＯＬＯＧＩ
ＣＡＬ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を用いて、遺
伝子産物を免疫沈降させた。

Ｘ遮９＋１−７　　Ｈ８Ｖ−１型のｔｒｕｎｃａｔｅｄ
　ｇ　Ｄ　（ｔ　−ｇＤ）ど■、ＴｈＢとから成る融合
蛋白遺伝子のミエローマ細胞用発現プラスミ ドの構築 実施例５において構築したプラスミドｐ　ＨＤ　Ｔ２Ｏ
１を制限酵素５ａｌｌとＥｃｏＲＩで消化することによ
りｔ−ｇＤとＬ　Ｔ　ｈ　Ｂの融合蛋白遺伝子を含む約
３．９ｋｂの断片を得た。また、ネオマイシン耐性遺伝
子を持ったｔ；　−ｇ　Ｄ発現用プラスミドル　ＨＳ　
Ｄ−ｎ　ｅ　ｏ　１　（平成２年特許願第１７７２５８
）をＳａｌ、ＩとＥｃｏＲＩで消化し、ネオマイシン耐
性遺伝子を含む約４，４ｋｂの断片を得た。これら２つ
の断片を反応させることにより、ネオマイシン耐性遺伝
子を持つ、ｔ−ｇＤ−ＬＴｈＢ融合蛋白遺伝子の発現プ
ラスミドｐ）（ＤＴ−ｎｅｏｌを得た（第１３図）。

ｆｄｆｆ５＠　８　　ＨＳ　Ｖ−１型ｔｒｕｎｃａ上ｅ
ｄ　ｇＤ（ｔ−ｇＤ）とＴ、　Ｔ　ｈ　Ｂとから成る融
合蛋白遺伝子のミエローマ細胞での発現 実施例７において構築したプラスミドｐ　ＨＤ　Ｔ・ｎ
ｅｏｌをシーンパルサー［ＢＩＯ−ＲＡＤ社製〕を用い
てエレク１−ロポレーションを行い、マウスミエローマ
細胞Ｓ　ｐ　２１０−Ａｇ１４　（大日本製薬社〕を形
質転換後、２００μｇ／ｍＱのＧ４１８　（ＧＩＢＣＯ
社製〕および１０％牛脂児血清を含むＲＰＭ１１６４０
培地［ＧＩＢＣＯ社製］で培養することによりＧ４１８
耐性となった形質転換体を得た。これら形質転換体の培
養上清を、ウサギ抗Ｈ８Ｖ−１血清［ＤＡＫＯＰＡＴＴ
社製］をコートしたマイクロプレート〔ヌンク社製〕と
ビオチン化つサギ抗ＨＳ　Ｖ　−１および一２抗体〔ケ
ミコン社製〕を用いたサンドインチ法によるエンザイム
イムノアッセイでスクリーニングし、ｔ−ｇＤを発現し
ているクローンを得た。

得られたクローンのうち発現量の比較的多い５ｐ−ｎ　
ｅ　ｏ−ＨＤＴ−１３−７１を無血清培地ＡｓＦ１０４
［味の素社製］で培養し、その−ヒ清１ｍＤ。

をモルカット〔ミリポア社製〕で濃縮し、Ｌａｅｍｍｌ
ｉ　Ｂｕｆｆｅｒを加えて５０μ氾とし、１００℃、５
分間加熱した。冷却後、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
＝５１ 電気泳動を行い、さらにウサギ抗ＨＳ　Ｖ　−１血清Ｃ
ＤＡＫＯＰＡＴＴ社製〕およびヤギ抗コレラトキシン血
清を用いてウェスタンブロッティングを行ったところ、
いずれの抗体によっても認識されるバンドが特異的に検
出された。

７　　ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｇ　ＤとＬＴｈＢとから成
る融合蛋白（ｔ−ｇ　Ｄ−Ｔ、　Ｔ　ｈＢ　）の精製実
施例８で得られた形質転換体５ｐ−ｎｅｏ−ＨＤＴ−１
，３−７１を無血清培地ＡＳＦ１０４［：味の素社製〕
に浮遊し、３７℃、５％ＣＯ２で４から７日間培養した
。培養液を目立社製ＣＲ２６Ｈ型遠心分離機にて３０型
ローターを用いて、　４，０ＯＯｒ　ｐｍ、２０分間遠
心分離することにより培養上清５．５αを得た。培養上
清は２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５，８）に対して透析
した後、Ｎｏ、２ろ紙（アトパンチツク東洋製）でろ過
し、得られたろ液を同緩衝液で平衡化したＳＰ−Ｔｏｙ
ｏｐｅａｒ１６５ＧＭ　（東ソー社製）カラム（ベツド
容量５４０ｍ　Ｑ　。

φ４．ＩＸ４］ｃｍ）にかけた。カラムを同緩衝液で洗
浄した後、ＮａＣ１濃度がＯから］Ｍのグラジー、３ｚ エンド（計４氾）によってｔ−ｇＤ−ＬＴｈＢを溶出し
た。約０．２から０．３５ＭのＮａＣ］濃度で溶出され
たｔ、　−ｇ　Ｄ　−Ｌ　Ｔ　ｈ　Ｂ溶出画分（４ｚ７
ｍ　Ｑ　）を限外ろ過（アミコン、ＹＭＩＯ）で８．３
ｍ　Ｑに濃縮し、これをＰＢＳで平衡化した５ｅｐｈａ
ｃｒｙｌ　５３００ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）カ
ラム（ベツド容量１９８ｍＱ、φ１．６Ｘ９８．５ｃ　
ｍ）にかけ、ｔ−ｇＤ−ＬＴｈＢ画分を限外ろ過（アミ
コン、ＹＭＩＯ）で濃縮して精製標品（１，７２５ｍ　
ｇ　／　０．８４５ｍ　Ｑ、　）とした。

１１！Ｉｌｌ　　Ｈ８Ｖ−１型のｔｒｕｎｃａｔｅｄ　
ｇ　Ｄと丁・ＴｈＢとから成る融合蛋白（ｔ−ｇ Ｄ−ＬＴｈＢ）の免疫原性 Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス（メス、８週齢、チャー
ルズ・リバー社産）の鼻腔内に、実施例１０で取得した
ｔ−ｇＤ−ＬＴｈＢを投与した（１６μＱ／マウス）。

５週後に採血し、サンプル血清を調製した。また、ａｍ
内をＰＢＳで数回洗浄することにより洗浄液を得た。こ
れらの検体中の抗ＨＳ　Ｖ抗体は以下の方法で測定した
。

ヒト抗ＨＳ　Ｖ抗体測定キラ１〜（ヘルペススタッ１−
　、　Ｗｈｊ、ｔｔａｋｅｒ　Ｂｊ、ｏｐｒｏｄｕｃｔ
ｓ社製、ロット番号００２７０６）の不活性化Ｈ８Ｖコ
ーＩ〜マイクロプレー１〜を２０％ＦＣＳ含有ＰＢＳで
ブロッキング（室温。

２時間）した後、０．０５％Ｔ１１ｅｅｎ　２０含有Ｐ
ＢＳ（Ｐ　Ｂ　Ｓ−Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄した。この
プレー１〜に２０％ＦＣ８／４０ｍＭ　Ｔｒｉ　５−Ｉ
ＪＣＱ　（ｐＨ７，５）１５％　Ｎ　ａ　ＣＱ　１０．
０５％Ｔｕｅｅｎ　２０で希釈したサンプル血清をウェ
ルあたり１００μ文加え、室温で１時間インキュベーシ
ョンした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで６回洗浄し
た後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体あるい
は抗マウス■ｇＡ　（Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｊｅｓ社製）を１００から１０００倍に希釈した液をウ
ェル当り１００μα加え、室温で３０分間インキュベー
ションした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで６回洗浄
した後、基質液〔２ｍｇ／ｍｆｌｏ−フェニレンジアミ
ン１０．０２％　Ｉ（２０２１０，１Ｍクエン酸緩衝液
（ｐＨ４，５）］をウェル当り１００μΩ加え、］−０
９分間反させた。２Ｎの硫酸をウェル当り２００μα加
えて発色を停止さ３５− せた後、４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果、ｔ
−ｇ　Ｉ）−ＬＴ　ｈ　Ｂを鼻腔内に投与することによ
り、効率よ＜　Ｈｓｖに対するＩｇＧおよびＩｇＡ抗体
を血中ならびに鼻腔内局所に誘導できることが分った。

【図面の簡単な説明】

第１図はＨＳ　Ｖ　−，１型深山株の表面蛋白ｇＤ遺伝
子のアミノ酸配列の−・例を示す図であり、第２図は第
］−図のアミノ酸配列に対応する塩基配列の一例である
。 第３図はＨ８Ｖ−１型深山株の表面蛋白ｇＢ遺伝子のア
ミノ酸配列の一例を示す図であり、第４図は第３図のア
ミノ酸配列に対応する塩基配列の一例である。 第５図はＩ（Ｓ　Ｖ　−］型ＫＯ８株の表面蛋白ｇＢの
塩基配列の一例、それから推定されるアミノ酸配列を示
す図であり、第６図はＩ−Ｉ　Ｓ　Ｖ　−１型Ｆ株の表
面蛋白の塩基配列の一例、それから推定されるアミノ酸
配列を示す図である。 第７図はプラスミドｐＨ８Ｇ３９６ｓｇＤの構築図であ
り、第８図はＨＳ　Ｖ　−１型のｔｒｕｎｃａｔｅｄｇ
Ｄ遺伝子の構築図である。 第９図はＨ８Ｖ−１型のｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｇ　Ｄの
動物細胞発現用プラスミドの構築図である。 第１０図は本発明の融合蛋白遺伝子発現プラスミドの構
築図であり、第１１図は本発明で得られた融合蛋白遺伝
子の塩基配列を示す図であり、第１２図は第１１図の塩
基配列から推定されるアミノ酸配列を示す図である。 第１３図は本発明の融合蛋白遺伝子発現プラスミドの構
築図である。

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. （１）易熱性エンテロトキシンＢサブユニットと易熱性
   エンテロトキシンとは異種の蛋白質との融合蛋白質。
2. （２）易熱性エンテロトキシンＢサブユニットと易熱性
   エンテロトキシンとは異種の蛋白質とをリンカーを介し
   て融合させた請求項１記載の蛋白質。
3. （３）蛋白質がワクチン用の抗原である請求項１記載の
   蛋白質。
4. （４）ワクチン用の抗原がウィルス抗原、病原性原虫抗
   原または病原性細菌抗原である請求項３記載の蛋白質。
5. （５）蛋白質が生理活性物質である請求項１記載の融合
   蛋白質。
6. （６）単純ヘルペスウィルス表面抗原と易熱性エンテロ
   トキシンＢサブユニットとの融合蛋白である請求項１記
   載の融合蛋白質。
7. （７）単純ヘルペスウィルス表面抗原が単純ヘルペスウ
   ィルス１型または２型のｇＤあるいはｇＢである請求項
   ６記載の融合蛋白。
8. （８）易熱性エンテロトキシンＢサブユニットがヒトか
   ら分離される毒素原性大腸菌の産生する易熱性エンテロ
   トキシンＢサブユニットである請求項６記載の融合蛋白
   。
9. （９）ｇＤあるいはｇＢがトランスメンブレン領域の除
   外されたｇＤあるいはｇＢである請求項７記載の融合蛋
   白。
10. （１０）単純ヘルペスウィルス表面抗原をアミノ末端側
    に、易熱性エンテロトキシンＢサブユニットをカルボキ
    シル末端側に配置した請求項６記載の融合蛋白。
11. （１１）請求項１記載の融合蛋白をコードする塩基配列
    を含有する組換えＤＮＡ。
12. （１２）請求項６記載の融合蛋白をコードする塩基配列
    を含有する組換えＤＮＡ。
13. （１３）請求項１１または１２記載の組換えＤＮＡを保
    持する形質転換体。
14. （１４）請求項１３記載の形質転換体を培養し、培養物
    中に請求項１記載の融合蛋白を生成蓄積せしめ、これを
    採取することを特徴とする該融合蛋白の製造法。
15. （１５）単純ヘルペスウィルス表面抗原と易熱性エンテ
    ロトキシンＢサブユニットとの融合蛋白をコードする塩
    基配列を含有する組換えＤＮＡを保持する形質転換体を
    培養し、培養物中に該融合蛋白を生成蓄積せしめ、該融
    合蛋白を採取し、採取された融合蛋白を陽イオン交換ク
    ロマトグラフィーとゲルろ過を含む精製工程に付すこと
    を特徴とする該融合蛋白の精製法。