JPH03180174A - バチルス・スフエリカスにおけるビオチンの発現の改良方法 - Google Patents
バチルス・スフエリカスにおけるビオチンの発現の改良方法Info
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- JPH03180174A JPH03180174A JP2010435A JP1043590A JPH03180174A JP H03180174 A JPH03180174 A JP H03180174A JP 2010435 A JP2010435 A JP 2010435A JP 1043590 A JP1043590 A JP 1043590A JP H03180174 A JPH03180174 A JP H03180174A
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- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/185—Heterocyclic compounds containing sulfur atoms as ring hetero atoms in the condensed system
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は特にバチルス・スフエリカス（Ｂａｃｉ−１１
ｕｓ ５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ ）におけるビオチンノ発
現ノ改良方法に関する。
ｕｓ ５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ ）におけるビオチンノ発
現ノ改良方法に関する。
ビオチン即ちビタミンＨは酵母における成長因子の複合
体である「ｂｉｏｓＪの成分の一つである。細胞内にお
いて、ビオチンは遊離状態にあるか或いは強くタンパク
質類に結合された状態にあり得、しばしばある種の酵素
のりジン残基に共有結合されている。それは、二酸化炭
素転移過程において多くのカルボキシラーゼ類（ピルビ
ン酸カルボキシラーゼ類、アセチル−ＣｏＡカルボキシ
ラーゼ類）或いは脱カルボキシラーゼ類（メチルマロニ
ル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ）の補欠分子団として含
まれている（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｒ ｖｉｔａｍｉｎ
ｓ。
体である「ｂｉｏｓＪの成分の一つである。細胞内にお
いて、ビオチンは遊離状態にあるか或いは強くタンパク
質類に結合された状態にあり得、しばしばある種の酵素
のりジン残基に共有結合されている。それは、二酸化炭
素転移過程において多くのカルボキシラーゼ類（ピルビ
ン酸カルボキシラーゼ類、アセチル−ＣｏＡカルボキシ
ラーゼ類）或いは脱カルボキシラーゼ類（メチルマロニ
ル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ）の補欠分子団として含
まれている（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｒ ｖｉｔａｍｉｎ
ｓ。
４０３ （１９８４年））。
ビオチンは細菌によるグルタミン酸の工業的発酵のため
の決定的な因子として説明されている（ａｍｉｎｏ ａ
ｃｌｄ−ｎｕｃｌｅｌｅ ａｃｉｄ、 １２０ （１９
６８年））。
の決定的な因子として説明されている（ａｍｉｎｏ ａ
ｃｌｄ−ｎｕｃｌｅｌｅ ａｃｉｄ、 １２０ （１９
６８年））。
その培養培地中における濃度と細胞膜の組成、すなわち
生ずる細胞透過性との間には相関関係がある。
生ずる細胞透過性との間には相関関係がある。
このビオチンは多くの微生物によって合成される。にも
拘らず、生成量は用いる種に応じて大きく異る。細菌内
では、バチルス・スフエリカスにおいてビオチンに至る
各種の中間体（以後「ビタマー（ｖｉｔａｍｅｒｓ）
Ｊと称する）の相当な蓄積が培養培地中に見られるので
（Ｂｕｌｌ、 １ｎｓｔ、 Ｃｈｅｗ。
拘らず、生成量は用いる種に応じて大きく異る。細菌内
では、バチルス・スフエリカスにおいてビオチンに至る
各種の中間体（以後「ビタマー（ｖｉｔａｍｅｒｓ）
Ｊと称する）の相当な蓄積が培養培地中に見られるので
（Ｂｕｌｌ、 １ｎｓｔ、 Ｃｈｅｗ。
Ｒｅｓ、５Ｂ （１９８０年））ピメリン酸ビオチン生
合成の前駆体からのビオチンの製造のための良好な潜在
的候補である。第１図は、ビオチン生合成の経路を図示
するものである。
合成の前駆体からのビオチンの製造のための良好な潜在
的候補である。第１図は、ビオチン生合成の経路を図示
するものである。
ビオチン生産は、しかしながら尚工業的要請に達してい
ない（Ａｒｇ、 Ｂｌｏｌ、 Ｃｈｅｗ、 ２９ Ｎｏ
、１０（１９６５年））。これは一方においては生産さ
れるビオチンが自身の合成酵素をコードする遺伝子を抑
制するためであると説明され、他方ＤＴＢ （デスチオ
ビオチン）のビオチンへの転換収率が低いためであると
説明されている。
ない（Ａｒｇ、 Ｂｌｏｌ、 Ｃｈｅｗ、 ２９ Ｎｏ
、１０（１９６５年））。これは一方においては生産さ
れるビオチンが自身の合成酵素をコードする遺伝子を抑
制するためであると説明され、他方ＤＴＢ （デスチオ
ビオチン）のビオチンへの転換収率が低いためであると
説明されている。
この低い生転換収率は特開昭６３−４４．８８９号に記
載されているようにＢ．スフェリカスの多コピープラス
ミド上のビオチンシンセターゼをコードするｂｉｏＢ遺
伝子を増幅することにより改良された。ｂｉｏＢ遺伝子
の発現がビオチンによって及ぼされる抑制を排除するた
めにビオチンシンセターゼをコードする配列がＢ、リケ
ニホルミス（Ｂ、 １１ｃｈｅｎＩｆ’ｏｒＩｌｌｓ）
のα−アミラーゼ プロモーターに融合された。適当な
培養方法は米国特許第４．５６３，４２６号明細書に記
載されている。この方法において、ピメリン酸がバイオ
マスの製造期中のビオチン産生に関連した抑制機構を最
少にするように指数増殖期の終りに添加される。しかし
ながら、この方法は単に抑制現象を最少にするにすぎな
い。本発明はＢ．スフェリカスの抑制解除株の造築に関
する。
載されているようにＢ．スフェリカスの多コピープラス
ミド上のビオチンシンセターゼをコードするｂｉｏＢ遺
伝子を増幅することにより改良された。ｂｉｏＢ遺伝子
の発現がビオチンによって及ぼされる抑制を排除するた
めにビオチンシンセターゼをコードする配列がＢ、リケ
ニホルミス（Ｂ、 １１ｃｈｅｎＩｆ’ｏｒＩｌｌｓ）
のα−アミラーゼ プロモーターに融合された。適当な
培養方法は米国特許第４．５６３，４２６号明細書に記
載されている。この方法において、ピメリン酸がバイオ
マスの製造期中のビオチン産生に関連した抑制機構を最
少にするように指数増殖期の終りに添加される。しかし
ながら、この方法は単に抑制現象を最少にするにすぎな
い。本発明はＢ．スフェリカスの抑制解除株の造築に関
する。
抑制解除突然変異体の使用はビオチン生合成のための全
ての遺伝子の発現のレベルを最適化することを可能にす
る。事実、非−抑制解除株については、培養培地中にビ
オチンがない場合においてさえ、内生的ビオチン合成が
その細胞内濃度を相当に増大させ、よって、生合成遺伝
子の発現の抑制をもたらすのに十分である。
ての遺伝子の発現のレベルを最適化することを可能にす
る。事実、非−抑制解除株については、培養培地中にビ
オチンがない場合においてさえ、内生的ビオチン合成が
その細胞内濃度を相当に増大させ、よって、生合成遺伝
子の発現の抑制をもたらすのに十分である。
これに対して、本発明に従う抑制解除突然変異体におい
ては、ピメリン酸とビオチン間の全ての代謝の流れを増
大させることができ、ビオチン産生が高められる。加え
て、本発明に従う抑制解除突然変異体の使用は培養の開
始時にピメリンを添加し、代謝の流れの最適条件下で細
胞が指数増殖期にビオチンを合成することを可能にする
新しい発酵方法の開発を可能にする。
ては、ピメリン酸とビオチン間の全ての代謝の流れを増
大させることができ、ビオチン産生が高められる。加え
て、本発明に従う抑制解除突然変異体の使用は培養の開
始時にピメリンを添加し、代謝の流れの最適条件下で細
胞が指数増殖期にビオチンを合成することを可能にする
新しい発酵方法の開発を可能にする。
突然変異株を用いてＢ６ スフエリカスにより産生され
るビオチン及びビタマーの量を増大させるための数多く
の方法が記載されている（Ａｒｇ。
るビオチン及びビタマーの量を増大させるための数多く
の方法が記載されている（Ａｒｇ。
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ、 ４７．１０１１ （１９８３
年） ） 、 Ｙ、ヤマダはビオチンの構造類似体５−
（２−チエニル）枯草酸及びアクチチアジン酸に耐性の
突然変異体のコレクションを１１１離した。最も重要な
突然変異体については、ビオチン産生は１２倍まで高め
られ、全ビグマーのそれは３５０μｇ ／ ｍｌに達す
る（Ａｒｇ。
年） ） 、 Ｙ、ヤマダはビオチンの構造類似体５−
（２−チエニル）枯草酸及びアクチチアジン酸に耐性の
突然変異体のコレクションを１１１離した。最も重要な
突然変異体については、ビオチン産生は１２倍まで高め
られ、全ビグマーのそれは３５０μｇ ／ ｍｌに達す
る（Ａｒｇ。
Ｂｉｏｌ、 ＣｈｅＩＩ＋、 ３７．１０７９ （１９
７３年））。にもかかわらず、これらの突然変異体の正
確な性質は未だ未知の状態にあり、調節解除突然変異に
好ましい何等の実験的データもない（Ａｒｇ、 Ｂｉｏ
ｌ、 Ｃｈｅａｐ、 ４７．１０１１ （１９８３年）
）。もう一つのビオチン類似体であるアルファーＤＨＢ
（アルファーデヒドロビオチン）がビオチン合成の抑
制解除された突然変異体を大腸菌から単離されることを
可能にした（Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｃｎｃｔ、１３４
．３４５ （１９７４年））が、Ｂ．スフェリカスの
安定な抑制解除突然変異体の製造を記載する何等のデー
タも刊行されていない。
７３年））。にもかかわらず、これらの突然変異体の正
確な性質は未だ未知の状態にあり、調節解除突然変異に
好ましい何等の実験的データもない（Ａｒｇ、 Ｂｉｏ
ｌ、 Ｃｈｅａｐ、 ４７．１０１１ （１９８３年）
）。もう一つのビオチン類似体であるアルファーＤＨＢ
（アルファーデヒドロビオチン）がビオチン合成の抑
制解除された突然変異体を大腸菌から単離されることを
可能にした（Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｃｎｃｔ、１３４
．３４５ （１９７４年））が、Ｂ．スフェリカスの
安定な抑制解除突然変異体の製造を記載する何等のデー
タも刊行されていない。
抑制解除突然変異体を選択するために、例えばアルギニ
ンの生合成のためのカナバニン（Ｑｕａｎｔ。
ンの生合成のためのカナバニン（Ｑｕａｎｔ。
１３１ｏ１．２Ｇ、１１ （１９８１年））、トリプト
ファンの生合成のための５−メチルトリプトファン（Ｊ
、 Ｂｌｏｔ。
ファンの生合成のための５−メチルトリプトファン（Ｊ
、 Ｂｌｏｔ。
Ｃｈｅｎ、 ２３５．１０９８ （１９６０年））、チ
アミンの生合成のためのビリチアミン（Ｊ、 １３１ｏ
ｃｈｃｆｆ１． Ｇ５、Ｎｏ、３（１９８９年））及び
ニコチン酸の生合成のための３−アセチルピリミジン（
Ｎａｔｕｒｅ、 ２０２．８２Ｂ （１９（ｉ４年））
などの代謝産物の桔抗剤の使用がしばしばなされている
。
アミンの生合成のためのビリチアミン（Ｊ、 １３１ｏ
ｃｈｃｆｆ１． Ｇ５、Ｎｏ、３（１９８９年））及び
ニコチン酸の生合成のための３−アセチルピリミジン（
Ｎａｔｕｒｅ、 ２０２．８２Ｂ （１９（ｉ４年））
などの代謝産物の桔抗剤の使用がしばしばなされている
。
本発明は抑制解除突然変異体を選択するための新しい手
法に基づくものである。それは、一次或いは二次代謝産
物の発現が抑制解除された生物の選択方法であって、こ
の正常に発現が抑制された株を親株として用いる方法に
おいてニ ー該親株が該代謝産物の発現を調節するＤＮＡ配列の制
御下にマーカー遺伝子を保有するプラスミドで形質転換
され、 −このようにして形質転換された株を突然変異処理に付
し、及び 形質転換親株中において該マーカーの発現を全く抑制す
る濃度の該代謝産物の存在下において該マーカーを発現
する陽性株を選択し、一これらの陽性株の中から任意に
それらのプラスミドを除去した後に代謝産物の過剰生産
性株を選択する、 ことを特徴とする方法よりなるものである。
法に基づくものである。それは、一次或いは二次代謝産
物の発現が抑制解除された生物の選択方法であって、こ
の正常に発現が抑制された株を親株として用いる方法に
おいてニ ー該親株が該代謝産物の発現を調節するＤＮＡ配列の制
御下にマーカー遺伝子を保有するプラスミドで形質転換
され、 −このようにして形質転換された株を突然変異処理に付
し、及び 形質転換親株中において該マーカーの発現を全く抑制す
る濃度の該代謝産物の存在下において該マーカーを発現
する陽性株を選択し、一これらの陽性株の中から任意に
それらのプラスミドを除去した後に代謝産物の過剰生産
性株を選択する、 ことを特徴とする方法よりなるものである。
本発明の文脈において、マーカーは好ましくは比色試験
において既述の（ＰＮＡＳ、 ８０．１１０１ （１９
８３年））のｘｙ１Ｅ遺伝子であり、選択される生物は
好ましくは細菌、特に好ましくはバチルス・スフエリカ
スであり、好ましい代謝産物は重要性を先に説明したビ
オチンである。
において既述の（ＰＮＡＳ、 ８０．１１０１ （１９
８３年））のｘｙ１Ｅ遺伝子であり、選択される生物は
好ましくは細菌、特に好ましくはバチルス・スフエリカ
スであり、好ましい代謝産物は重要性を先に説明したビ
オチンである。
「抑制解除」とは、抑制された親株と比較して、あらゆ
る場合において、一次或いは二次代謝産物の濃度が該代
謝産物の産生に殆んどまたは全く影響を及ぼさない株の
性質をいうものとされている。
る場合において、一次或いは二次代謝産物の濃度が該代
謝産物の産生に殆んどまたは全く影響を及ぼさない株の
性質をいうものとされている。
この方法を実施することを可能にする技術は、当業者に
公知であり、その幾つかはより詳細に具体例において説
明する。
公知であり、その幾つかはより詳細に具体例において説
明する。
この方法は特にビオチン産生のためにＢ．スフェリカス
に適用された場合に多くの抑制解除株を得ることを可能
にし、最大量のビオチンを産生ずるものが好ましく選ば
れるが、この基準は必らずしも決定的なものではない。
に適用された場合に多くの抑制解除株を得ることを可能
にし、最大量のビオチンを産生ずるものが好ましく選ば
れるが、この基準は必らずしも決定的なものではない。
特に、選択プラスミドは、リプレッサートラップとして
の役割を果し、除去せずにビオチン生産量によって選択
した場合、目的を達成しない場合があることがあり得る
ので、これが除去された場合に多量のビオチンの産山が
保存されることが重要である。
の役割を果し、除去せずにビオチン生産量によって選択
した場合、目的を達成しない場合があることがあり得る
ので、これが除去された場合に多量のビオチンの産山が
保存されることが重要である。
本発明は又、それにより得られる株そのものの或いはプ
ラスミド形質転換のための宿主株としての株、並びにこ
の方法を実施することにより得られビオチンの過剰生産
性のＢ．スフェリカスの株にも関する。
ラスミド形質転換のための宿主株としての株、並びにこ
の方法を実施することにより得られビオチンの過剰生産
性のＢ．スフェリカスの株にも関する。
本発明は又、該ビオチンを産生ずるＢ．スフェリカスの
株を培養培地中において培養することによりビオチンを
製造する方法においてｂｉｏＢ遺伝子を発現する少なく
とも１種のプラスミドで形質転換された本発明に従う株
を培養し、且つピメリン酸或いはその誘導体の一つが培
養培地に添加されることを特徴とする方法にも関する。
株を培養培地中において培養することによりビオチンを
製造する方法においてｂｉｏＢ遺伝子を発現する少なく
とも１種のプラスミドで形質転換された本発明に従う株
を培養し、且つピメリン酸或いはその誘導体の一つが培
養培地に添加されることを特徴とする方法にも関する。
ｂｉｏＢ遺伝子はその生成物がビオチン生合成の最終段
階を制御する主たる遺伝子の一つであるが、しかし、同
一プラスミド或いはその他の補助プラスミド上に特許公
報ＥＰ−Ａ− ０，２６６，２４０号明細書に記載されるように、調節
配列の制御下にビオチン生合成経路のその他の遺伝子を
得ることが可能である。発酵条件は当業者には公知であ
り、本件の場合においてピメリン酸或いはその誘導体が
培養の開始時、指数増殖期の前或いはその間に添加され
た際にビオチン産生の増大を示すことが可能であった。
階を制御する主たる遺伝子の一つであるが、しかし、同
一プラスミド或いはその他の補助プラスミド上に特許公
報ＥＰ−Ａ− ０，２６６，２４０号明細書に記載されるように、調節
配列の制御下にビオチン生合成経路のその他の遺伝子を
得ることが可能である。発酵条件は当業者には公知であ
り、本件の場合においてピメリン酸或いはその誘導体が
培養の開始時、指数増殖期の前或いはその間に添加され
た際にビオチン産生の増大を示すことが可能であった。
本発明のその他の特徴及び利点は以下の詳細な説明に際
して明らかとなるであろう。具体例を添付の図面を参照
して説明する。
して明らかとなるであろう。具体例を添付の図面を参照
して説明する。
例１ プラスミドｐＴＧ２４１４及びｐＴＧ２４１６の
増築：抑制解除突然変異体の単離のための選択ベクター ａ）プラスミドｐＴＧ２４１４の説明 このグラム−陽性ベクターはその内容が本発明において
準用されるヨーロッパ特許公報ＥＰ−Ａ−２６６，２４
０号明細書に従ってｘｙ１Ｅ遺伝子及びｂ ｉ ｏＤＡ
ＹＢオペロンの調節領域の融合体を含有する。ｂ ｉ
ｏＤＡＹＢオペロンのプロモーター領域を含有する７９
９−ｂｐ Ｎ５ｉＩ断片はプラスミドｐＴＧ１４００
から単離され、ファージＭ １３ Ｔ Ｇ １３１ （
Ｇｅｎｅ、 ２Ｂ （１９８３年））のＰｓｔ１部位に
挿入される。
増築：抑制解除突然変異体の単離のための選択ベクター ａ）プラスミドｐＴＧ２４１４の説明 このグラム−陽性ベクターはその内容が本発明において
準用されるヨーロッパ特許公報ＥＰ−Ａ−２６６，２４
０号明細書に従ってｘｙ１Ｅ遺伝子及びｂ ｉ ｏＤＡ
ＹＢオペロンの調節領域の融合体を含有する。ｂ ｉ
ｏＤＡＹＢオペロンのプロモーター領域を含有する７９
９−ｂｐ Ｎ５ｉＩ断片はプラスミドｐＴＧ１４００
から単離され、ファージＭ １３ Ｔ Ｇ １３１ （
Ｇｅｎｅ、 ２Ｂ （１９８３年））のＰｓｔ１部位に
挿入される。
組換えファージはＭ１３７０４３１と称される。
このベクターｐ Ｔ Ｇ ４４５ （Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
ａｎｄＢｌｏｔｃｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂａｃｉ
１目３０９ （１９８４年））からｘｙ１Ｅ遺伝子を含
有するＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片を切出し、ファージ
Ｍ１３ＴＧ４３１のｂ ｉ ｏＤＡＹＢプロモーターの
下流になるように、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ切断部位
に挿入する（第２図）。この組換えファージをＭ１３７
Ｇ４３３と称する。合成オリゴヌクレオチド類を用いて
、ＸＹＩＥ遺伝子を次いで第３図に示すようにｂｉｏＤ
遺伝子の潜在的リポソーム結合部位に融合する。
ａｎｄＢｌｏｔｃｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂａｃｉ
１目３０９ （１９８４年））からｘｙ１Ｅ遺伝子を含
有するＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片を切出し、ファージ
Ｍ１３ＴＧ４３１のｂ ｉ ｏＤＡＹＢプロモーターの
下流になるように、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ切断部位
に挿入する（第２図）。この組換えファージをＭ１３７
Ｇ４３３と称する。合成オリゴヌクレオチド類を用いて
、ＸＹＩＥ遺伝子を次いで第３図に示すようにｂｉｏＤ
遺伝子の潜在的リポソーム結合部位に融合する。
この融合体を含むＢｇｌｎ−ＥｃｏＲＩ断片をレプリコ
ンｐ Ｕ Ｂ １１０ （Ｊ−、Ｂａｃｔ、 １３４．
３１８（１９７８年））に連結し、酵素ＢａｍＨＩ及び
ＥｃｏＲＩにより予備消化する。この混合物を次いでチ
ャン（Ｃｈａｎｇ）及びコーエン（Ｃｏｈｅｎ） （Ｍ
ｏｌ。
ンｐ Ｕ Ｂ １１０ （Ｊ−、Ｂａｃｔ、 １３４．
３１８（１９７８年））に連結し、酵素ＢａｍＨＩ及び
ＥｃｏＲＩにより予備消化する。この混合物を次いでチ
ャン（Ｃｈａｎｇ）及びコーエン（Ｃｏｈｅｎ） （Ｍ
ｏｌ。
Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔｉｃ、 １６ｇ 、１９７９年）
により説明される実験方法に従ってＢ、ズブチリス（Ｂ
、 ５ｕｂｔｉｌｌｓ）株ＢＧＳＣＩＡ９２ ａｒｇ
Ａ２ ａｒｏＧ９３２ ｂｉｏＢ１４１ ５ａｃＡ
３２１の存在下においてインキュベートする。これらの
形質転換体を次いで１００μｒ／ｍｌのカナマイシンを
添加したＤＭ３培地上で選択し、妻揚子を用いて５μＮ
／ｍｌのカナマイシンを含有するＴＢＡＢ（トリプトー
ス血液寒天ベース）上に移す。皿に０．５Ｍカテコール
溶液をスプレーした後、黄色に染色したコロ：−のプラ
スミドを迅速アルカリ抽出法を用いて分析する（Ｎｕｃ
ｌ、 Ａｃ、 Ｒｅｓ、、７．１５１３．１９７９年）
。コルブリ：ｒンｐＵＢ１１０上にＤＡＹＢプロモータ
ー／ｘｙ１Ｅ遺伝子融合体を含有する組換えプラスミド
をｐＴＧ２４１４と称する。
により説明される実験方法に従ってＢ、ズブチリス（Ｂ
、 ５ｕｂｔｉｌｌｓ）株ＢＧＳＣＩＡ９２ ａｒｇ
Ａ２ ａｒｏＧ９３２ ｂｉｏＢ１４１ ５ａｃＡ
３２１の存在下においてインキュベートする。これらの
形質転換体を次いで１００μｒ／ｍｌのカナマイシンを
添加したＤＭ３培地上で選択し、妻揚子を用いて５μＮ
／ｍｌのカナマイシンを含有するＴＢＡＢ（トリプトー
ス血液寒天ベース）上に移す。皿に０．５Ｍカテコール
溶液をスプレーした後、黄色に染色したコロ：−のプラ
スミドを迅速アルカリ抽出法を用いて分析する（Ｎｕｃ
ｌ、 Ａｃ、 Ｒｅｓ、、７．１５１３．１９７９年）
。コルブリ：ｒンｐＵＢ１１０上にＤＡＹＢプロモータ
ー／ｘｙ１Ｅ遺伝子融合体を含有する組換えプラスミド
をｐＴＧ２４１４と称する。
ｂ）ベクターｐＴＧ２４１６の造築
プラスミドｐＴＧ１４１８を同時に酵素Ｈｉｎｄｍ及び
Ｘｍｎ１により消化する。ｂｉ。
Ｘｍｎ１により消化する。ｂｉ。
ＸＷＦオペロンの調節領域を含有する１ ５５３−ｂｐ
断片をＭ１３ＴＧ１３１のＨｉｎｄＩ［Ｉ−ＥｃｏＲＶ
部位に挿入する。この組換えファージＭ１３７０４３２
を次いで酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｍａ Ｔで消化し、ｐＴ
Ｇ４４５のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片に連結する。
断片をＭ１３ＴＧ１３１のＨｉｎｄＩ［Ｉ−ＥｃｏＲＶ
部位に挿入する。この組換えファージＭ１３７０４３２
を次いで酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｍａ Ｔで消化し、ｐＴ
Ｇ４４５のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片に連結する。
１５℃で１８時間インキュベーション後、ＤＮＡをイソ
プロパツール（５０： ５０）で沈殿させ、次いで製造
者によって説明される標準的条件下でフレノウポリメラ
ーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｃｒ製）の存在下においてイン
キュベートする。このＤＮＡを次いで上記と同一条件下
に沈殿させ、１５℃で１８時量子４リガーゼを用いてイ
ンキュベートする。この組換えファージをＭｌ ３ＴＧ
４４１と称する（第４図）。合成オリゴヌクレオチドを
用いてＸＷＦプロモーターを含有する断片を第５図に示
すようにＸＶＩＥ構造遺伝子に融合させる。このファー
ジＭ１３ＴＧ４４２のＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片に担
持された融合体をｐＵＢｌｌｏのＥｃｏＲＩ及びＢａｍ
Ｈ１部位に挿入してベクターｐＴＧ２４１６を得た。
プロパツール（５０： ５０）で沈殿させ、次いで製造
者によって説明される標準的条件下でフレノウポリメラ
ーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｃｒ製）の存在下においてイン
キュベートする。このＤＮＡを次いで上記と同一条件下
に沈殿させ、１５℃で１８時量子４リガーゼを用いてイ
ンキュベートする。この組換えファージをＭｌ ３ＴＧ
４４１と称する（第４図）。合成オリゴヌクレオチドを
用いてＸＷＦプロモーターを含有する断片を第５図に示
すようにＸＶＩＥ構造遺伝子に融合させる。このファー
ジＭ１３ＴＧ４４２のＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片に担
持された融合体をｐＵＢｌｌｏのＥｃｏＲＩ及びＢａｍ
Ｈ１部位に挿入してベクターｐＴＧ２４１６を得た。
例２Ｂ．スフェリカスの形質転換
Ｂ．スフェリカス株ＩＦＯ３５２５をプラスミドｐＴＧ
２４１４及びｐＴＧ２４１６の受容体株として選択した
。オルゼック（Ｏｒｚｃｃｈ）により説明される形質転
換実験方法（Ｊ、 Ｇｃｎ、 Ｍｌｃｒｏｂ。
２４１４及びｐＴＧ２４１６の受容体株として選択した
。オルゼック（Ｏｒｚｃｃｈ）により説明される形質転
換実験方法（Ｊ、 Ｇｃｎ、 Ｍｌｃｒｏｂ。
１３０．２０３．１９８４年）を僅かに修正した。平文
、プロトプラストの調製において、リゾチームに代えて
Ｎ−アセチルムラミダーゼＳＧを用いた。これらの形質
転換体を次いで１５０μｇ ／ ｍｌのカナマイシンを
含有するＤＭ４再生再生上地上択した。
、プロトプラストの調製において、リゾチームに代えて
Ｎ−アセチルムラミダーゼＳＧを用いた。これらの形質
転換体を次いで１５０μｇ ／ ｍｌのカナマイシンを
含有するＤＭ４再生再生上地上択した。
ＤＭ４は僅かに修正されたＤＭ３ （Ｍｏ１． Ｇｅｎ
。
。
Ｇｅｎｅｔｉｃ、 １６８、ｉｌｌ 、 １９７９年）
に対応し、コハク酸−ナトリウム塩及びグルコースの代
りにそれぞれ０．６６Ｍコハク酸二ナトリウム塩及びグ
リセロールを含有する。最後に、それにより選択された
形質転換体をカナマイシン（５μｇ ／ ｍｌ ）を添
加したＣＰ培地（Ｄ当り、グリセロール２０ｇ；プロテ
オースベプトン３０ｇ；ビタミン無しのカザミノ酸５ｆ
ｒ：に２ＨＰＯ４、Ｉｇ；ＫＣＩ。
に対応し、コハク酸−ナトリウム塩及びグルコースの代
りにそれぞれ０．６６Ｍコハク酸二ナトリウム塩及びグ
リセロールを含有する。最後に、それにより選択された
形質転換体をカナマイシン（５μｇ ／ ｍｌ ）を添
加したＣＰ培地（Ｄ当り、グリセロール２０ｇ；プロテ
オースベプトン３０ｇ；ビタミン無しのカザミノ酸５ｆ
ｒ：に２ＨＰＯ４、Ｉｇ；ＫＣＩ。
０．５ｇ、Ｍｇ５０ ・７Ｈ２０Ｓ０．５ｇ ；Ｆｅ
５０ ・７Ｈ２０Ｓ０．０１ｇ；ＭｎＳＯ４・４Ｈ２０
，０，００１ｇ；ｐＨ６，８〜７；チアミン−ＨＣｌ、
２０μｇ）に移した。
５０ ・７Ｈ２０Ｓ０．０１ｇ；ＭｎＳＯ４・４Ｈ２０
，０，００１ｇ；ｐＨ６，８〜７；チアミン−ＨＣｌ、
２０μｇ）に移した。
例３ 培地中のビオチンの濃度によるｘｙ１Ｅ遺伝子の
発現に関連した表現形の分析 ｘｙ１Ｅ遺伝子を発現するクローンは０．５Ｍカテコー
ル溶液でスプレーされた後黄色になる。
発現に関連した表現形の分析 ｘｙ１Ｅ遺伝子を発現するクローンは０．５Ｍカテコー
ル溶液でスプレーされた後黄色になる。
この染色は基質の黄色生成物：２−ヒドロキシ−ムコン
酸セミアルデヒドの細胞内転換に帰せられる。この生成
物の出現の酵素反応速度論は細胞内のｘｙ１Ｅ遺伝子の
種類及び発現レベルの両者に応じて異る。この遺伝子に
よりコード化される酵素カテコール２，３−オキシゲナ
ーゼ（Ｃ２，３０）の比活性は細胞を摩砕後分光測光法
アッセイにより容易に測定される。
酸セミアルデヒドの細胞内転換に帰せられる。この生成
物の出現の酵素反応速度論は細胞内のｘｙ１Ｅ遺伝子の
種類及び発現レベルの両者に応じて異る。この遺伝子に
よりコード化される酵素カテコール２，３−オキシゲナ
ーゼ（Ｃ２，３０）の比活性は細胞を摩砕後分光測光法
アッセイにより容易に測定される。
株ＩＦＯ３５２５の形質転換体を表１ａの異った濃度の
ビオチンを含有する固体ＧＰ培地上で３７℃においてイ
ンキュベートした。５０ｎｇ／ｍｌを越える濃度ではｘ
ｙ１Ｅ遺伝子の発現が厳しく抑制された。表１ｂに示す
液体培地中での０２．３０の比活性の測定結果はこの結
果を確認する。
ビオチンを含有する固体ＧＰ培地上で３７℃においてイ
ンキュベートした。５０ｎｇ／ｍｌを越える濃度ではｘ
ｙ１Ｅ遺伝子の発現が厳しく抑制された。表１ｂに示す
液体培地中での０２．３０の比活性の測定結果はこの結
果を確認する。
表１＝ビオチンの存在下におけるｘｙ１Ｅ遺伝子の発現
ａ、カナマイシン５μｚ ／ ｍｌ含有ＣＰ固体培地ｘ
ｙ１Ｅ表現型：コロ：−はカテコールスプレー後黄色に
なる。
ｙ１Ｅ表現型：コロ：−はカテコールスプレー後黄色に
なる。
ｂ。
カナマイシン５μｚ ／ ｍｌ含有ＧＰ液体培地各濃度
のビオチンの存在下において培養された破壊細胞のｘｙ
１Ｅ遺伝子生成物 （Ｃ２，３０）の活性の測定 餞ユ 抑制解除株の単離 抑制解除株を単離するためには、 ｐＴＧ２４１４或いはｐＴＧ２４１６のいずれかを含有
するＩＦＯ３５２５形質転換体から出発してｘｙ１Ｅ遺
伝子を構成的に発現することのできる突然変異体のコレ
クションを得ることが必要である。
のビオチンの存在下において培養された破壊細胞のｘｙ
１Ｅ遺伝子生成物 （Ｃ２，３０）の活性の測定 餞ユ 抑制解除株の単離 抑制解除株を単離するためには、 ｐＴＧ２４１４或いはｐＴＧ２４１６のいずれかを含有
するＩＦＯ３５２５形質転換体から出発してｘｙ１Ｅ遺
伝子を構成的に発現することのできる突然変異体のコレ
クションを得ることが必要である。
即ち、ｐＴＧ２４１４を含有する形質転換体を液体ＧＰ
培地中で４〜５時間培養し、集められた細胞を０．０１
Ｍリン酸緩衝液中に懸濁した。それらを次いで１００μ
ｇ ／ ｍｌのニトロソグアニジンにより３７℃で５〜
１ｏ分間処理した。
培地中で４〜５時間培養し、集められた細胞を０．０１
Ｍリン酸緩衝液中に懸濁した。それらを次いで１００μ
ｇ ／ ｍｌのニトロソグアニジンにより３７℃で５〜
１ｏ分間処理した。
この突然変異誘発処理の後、細胞をリン酸緩衝液中で洗
浄し、採集し、１０μｇ ／ ｍｌのビオチンを含有す
るＧＰ屹地上にブレーティングし、３７℃で１８時間培
養した。これらの皿を次いで０．５Ｍカテコール溶液で
スプレーし、黄色になる細胞が潜在的調節抑制突然変異
体である可能性を示した。
浄し、採集し、１０μｇ ／ ｍｌのビオチンを含有す
るＧＰ屹地上にブレーティングし、３７℃で１８時間培
養した。これらの皿を次いで０．５Ｍカテコール溶液で
スプレーし、黄色になる細胞が潜在的調節抑制突然変異
体である可能性を示した。
黄色に染色されたコロ：−を単離し、各コロ：−を１■
／ｍｌのピメリン酸を含有するＣＰ培地中において３７
℃で２日間培養した。６株について蓄積されたビオチン
の量を表２に示す。
／ｍｌのピメリン酸を含有するＣＰ培地中において３７
℃で２日間培養した。６株について蓄積されたビオチン
の量を表２に示す。
表 ２＝抑制解除株によるビオチンの産生野性種株ＩＦ
Ｏ３５２５よりも多くのビオチンを産生ずる突然変異体
株であるＴＫ５０２−２からプラスミドを除去するため
に以下の実験を行なった。ＬＢ培地中で３７℃で１８時
間インキュベーション後、培養液の１／１００容を新た
に調製されたノボビオシンＯ〜１０μｔｒ ／ ｍｌ添
加ＬＢ培地中に接種し、１８時間インキュベートした。
Ｏ３５２５よりも多くのビオチンを産生ずる突然変異体
株であるＴＫ５０２−２からプラスミドを除去するため
に以下の実験を行なった。ＬＢ培地中で３７℃で１８時
間インキュベーション後、培養液の１／１００容を新た
に調製されたノボビオシンＯ〜１０μｔｒ ／ ｍｌ添
加ＬＢ培地中に接種し、１８時間インキュベートした。
ノボビオシンを有しないものに比べて僅かに遅れた成長
を示すこれらの培養液を固体ＣＰ培地上にブレーティン
グし、３７℃で１８時間インキュベートした。０．５Ｍ
カテコールによる処理後、黄色に染色しなかったコロ：
−を次いで選択し、６株から抽出したＤＮＡを電気泳動
によって分析した。ｐＴＧ２４１４を失った株について
、それらのビオチンを蓄積する能力を試験し、株ＴＫ５
０２−２−Ｃ５を採用した。
を示すこれらの培養液を固体ＣＰ培地上にブレーティン
グし、３７℃で１８時間インキュベートした。０．５Ｍ
カテコールによる処理後、黄色に染色しなかったコロ：
−を次いで選択し、６株から抽出したＤＮＡを電気泳動
によって分析した。ｐＴＧ２４１４を失った株について
、それらのビオチンを蓄積する能力を試験し、株ＴＫ５
０２−２−Ｃ５を採用した。
餞ニ 調節解除株の分析
我々の研究は培養の開始時点からの前駆体の存在下、及
びプラスミドｐＴＧ２４１４ （リプレッサートラップ
として作用しうる）の不存７Ｅ下において培養後ビオチ
ンを産生ずるその能力によって株ＴＫ５０２−２−Ｃ５
に限定した。ｐＴＧ２４１４及びｐＴＧ２４１６が再導
入されたこの株は尚ＧＰ培地上で形質転換されたコロ：
−のカテコールの存在下における黄色化により確認され
るようにビオチンの存在下においてｘｙ１Ｅ遺伝子を構
成的に発現する。この実験は明らかに野性種株の変異が
行われ、突然変異が染色体レベルに局在化され、及び調
節解除がｂ ｉ ｏＤＡＹＢ及びｂｉｏＸＷＦオペロン
に影響を及ぼすことを明確に示す。このような株の抑制
解除のレベルを定量するために、我々はＧＰ培地上のビ
オチンの存在下或いは不存在下において培養された細胞
からのＣ２，ａｏの比活性を測定した。二つの結論が表
３から引出されるニ ーＣ，３Ｏの比活性は野性種株と比較してＴＫ５０２−
２−Ｃ５中のビオチンの存在により僅かに影響されるに
すぎない。
びプラスミドｐＴＧ２４１４ （リプレッサートラップ
として作用しうる）の不存７Ｅ下において培養後ビオチ
ンを産生ずるその能力によって株ＴＫ５０２−２−Ｃ５
に限定した。ｐＴＧ２４１４及びｐＴＧ２４１６が再導
入されたこの株は尚ＧＰ培地上で形質転換されたコロ：
−のカテコールの存在下における黄色化により確認され
るようにビオチンの存在下においてｘｙ１Ｅ遺伝子を構
成的に発現する。この実験は明らかに野性種株の変異が
行われ、突然変異が染色体レベルに局在化され、及び調
節解除がｂ ｉ ｏＤＡＹＢ及びｂｉｏＸＷＦオペロン
に影響を及ぼすことを明確に示す。このような株の抑制
解除のレベルを定量するために、我々はＧＰ培地上のビ
オチンの存在下或いは不存在下において培養された細胞
からのＣ２，ａｏの比活性を測定した。二つの結論が表
３から引出されるニ ーＣ，３Ｏの比活性は野性種株と比較してＴＫ５０２−
２−Ｃ５中のビオチンの存在により僅かに影響されるに
すぎない。
−Ｃ，３Ｏの比活性はビオチンの不存在下においても増
幅される。
幅される。
表 ３二Ｂ．スフェリカス株Ｔ Ｋ ５０２２−Ｃ５の
Ｃ２，３０ これらの結果は、各ビオチン酵素の比活性がこの突然受
具体において増大したことを示唆する。
Ｃ２，３０ これらの結果は、各ビオチン酵素の比活性がこの突然受
具体において増大したことを示唆する。
例６ Ｂ．スフェリカスの調節解除味におけるｂｉｏ
Ｂ遺伝子の増幅 ｂ ｉｏＢ、ｐＢＨＢ５０２２及びｐＴＧ４９８の発現
ベクターを第６図及び第７図に記載したように造築した
。ＴＫ５０２−２−Ｃ５をこれらのベクターを用いて形
質転換し、これらの形質転換体により産生されたビオチ
ンの量を表４に示す。
Ｂ遺伝子の増幅 ｂ ｉｏＢ、ｐＢＨＢ５０２２及びｐＴＧ４９８の発現
ベクターを第６図及び第７図に記載したように造築した
。ＴＫ５０２−２−Ｃ５をこれらのベクターを用いて形
質転換し、これらの形質転換体により産生されたビオチ
ンの量を表４に示す。
二つの主な結論が引出せるニ
ーｂｉｏＢ遺伝子の増幅は調節解除株中のビオチンの収
率を増大させるための良好な因子である。
率を増大させるための良好な因子である。
−指数増殖期におけるＤＴＢのビオチンへの転換は、重
要であり、ピメリン酸を培養の開始から添加することが
より容易である。
要であり、ピメリン酸を培養の開始から添加することが
より容易である。
表 ４：Ｂ．スフェリカスの抑制解除様ＴＫ５０２−２
−Ｃ５によるビオチンの産生 接種後培養物をＣＰ培地中において３０℃で１日増殖し
、次いで３７℃で２０間増殖させた。上澄液中のビオチ
ン産生はり、ブラタルム（Ｌ、 ｐｌａｎｔａｒｕｍ）
Ａ Ｔ ＣＣ８０１４の微生物アッセイにより評価す
る。抑制解除様の場合においては培養物を実験の開始か
ら３７℃に維持した。ピメリン酸０．５■／ｍｌ、ｎｄ
−測定せず。
−Ｃ５によるビオチンの産生 接種後培養物をＣＰ培地中において３０℃で１日増殖し
、次いで３７℃で２０間増殖させた。上澄液中のビオチ
ン産生はり、ブラタルム（Ｌ、 ｐｌａｎｔａｒｕｍ）
Ａ Ｔ ＣＣ８０１４の微生物アッセイにより評価す
る。抑制解除様の場合においては培養物を実験の開始か
ら３７℃に維持した。ピメリン酸０．５■／ｍｌ、ｎｄ
−測定せず。
ｂｉｏＢの発現のポリアクリルアミドゲル上での分析
Ｂ．スフェリカス Ｔ Ｋ ５０２−２− Ｃ５（ｐＴ
Ｇ４９８）細胞を１０Ｂｇ／ｍｌのカナマイシンを含有
するＧＰ培地中において３７℃で１８時間インキュベー
トした。１００μｇの培養液をエツペンドルフチューブ
内で遠心分離し、洗浄後のペレットをＰｅ５ｃｈｋｅ
（Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｌｏｌ、 １８Ｂ、１９８５年
）により説明される実験方法に従って処理した。５μｇ
を１３％ポリアクリルアミドゲル上で試験した。２０ｍ
Ａにおける５時間の展開後、ゲルを７．５％酢酸１５％
メタノール１０． ２５％クマジーブルーを含有する溶
液中において固定し、７．５％酢酸７５％メタノール溶
戚中で可視化した。第８図は、増幅ｂｉｏＢ遺伝子を含
有する抽出液から得られた３７ｋＤの見掛は分子量を有
する新しいバンドが認められたことを示す。これらの結
果は、ビオチン産生の増大とビオチンシンセターゼの発
現の間の良好な相関関係を示す。
Ｇ４９８）細胞を１０Ｂｇ／ｍｌのカナマイシンを含有
するＧＰ培地中において３７℃で１８時間インキュベー
トした。１００μｇの培養液をエツペンドルフチューブ
内で遠心分離し、洗浄後のペレットをＰｅ５ｃｈｋｅ
（Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｌｏｌ、 １８Ｂ、１９８５年
）により説明される実験方法に従って処理した。５μｇ
を１３％ポリアクリルアミドゲル上で試験した。２０ｍ
Ａにおける５時間の展開後、ゲルを７．５％酢酸１５％
メタノール１０． ２５％クマジーブルーを含有する溶
液中において固定し、７．５％酢酸７５％メタノール溶
戚中で可視化した。第８図は、増幅ｂｉｏＢ遺伝子を含
有する抽出液から得られた３７ｋＤの見掛は分子量を有
する新しいバンドが認められたことを示す。これらの結
果は、ビオチン産生の増大とビオチンシンセターゼの発
現の間の良好な相関関係を示す。
Ｂ．スフェリカス株ＴＫ５０２−２−Ｃ５は、パスツー
ル研究所のＣｏ１１ｅｃｔｌｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ
ｄａＣｕｌｔｕｒｅ ｄａ ＭｉｅｒＯＯＶｇａｎｉ
ＳＩＯ８（Ｎａｔｉａｎａｌ Ｃｏ１１ｃｃ−ｔｌｏｎ
ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｖｇａｎｌｓｍ Ｃｕ１ｔｕｒｅ
ｓ） ２８Ｒｕｅ ｄｅＤｏｃｔｃｕｒ Ｒｏｕｘ、
７５７２４ Ｐａｒｌｓ Ｃｃｄｅｘに１９８８年１１
月８日！−８０８として寄託された。
ル研究所のＣｏ１１ｅｃｔｌｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ
ｄａＣｕｌｔｕｒｅ ｄａ ＭｉｅｒＯＯＶｇａｎｉ
ＳＩＯ８（Ｎａｔｉａｎａｌ Ｃｏ１１ｃｃ−ｔｌｏｎ
ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｖｇａｎｌｓｍ Ｃｕ１ｔｕｒｅ
ｓ） ２８Ｒｕｅ ｄｅＤｏｃｔｃｕｒ Ｒｏｕｘ、
７５７２４ Ｐａｒｌｓ Ｃｃｄｅｘに１９８８年１１
月８日！−８０８として寄託された。
第１図はビオチン生合成の経路を示す。
第２図はｐＴＧ２４１４の造築を示す。
第３図はｐＴＧ２４１４を図示する。
第４図はｐＴＧ２４１６の造築を示す。
第５図はｐＴＧ２４１６を図示する。
第６図ＡとＢはｐＢＨＢ５０２２の造築を示す。
第７図はｐＴ０４９８の造築を示す。
第８図はポリアクリルアミドゲル上のｂｉｏＢの発現を
示す。 エ エ 工 Ｉ ＦＩＧ−７ ＦＩＧ、８
示す。 エ エ 工 Ｉ ＦＩＧ−７ ＦＩＧ、８
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、一次或いは二次代謝産物の発現が抑制解除された生
物の選択方法であって、この正常に発現が抑制された株
を親株として用いる方法において： −該親株が該代謝産物の発現を調節するＤＮＡ配列の制
御下にマーカー遺伝子を保有するプラスミドで形質転換
され、 −このようにして形質転換された株を突然変異処理に付
し、及び −該形質転換親株中において該マーカーの発現を全く抑
制する濃度の該代謝産物の存在下において該マーカーを
発現する陽性株を選択し、 一これらの陽性株の中から任意にそれらのプラスミドを
除去した後に代謝産物の過剰生産性株を選択する、こと
を特徴とする方法。 ２、代謝産物がビオチンであり、マーカー遺伝子がｘｙ
１Ｅ遺伝子であり、株がバチルス・スフェリカス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）に属するもので
ある請求項１記載の方法。 ３、請求項１及び２のいずれかに記載の方法を行うこと
により得られた抑制解除生物株。 ４、請求項２記載の方法を行うことにより得ることので
きるビオチンの発現が抑制解除されたＢ．スフェリカス
株。 ５、培養培地中においてビオチンを産生するＢ．スフェ
リカスの株を培養することによるビオチンの製造方法に
おいて、ｂｉｏＢ遺伝子を発現する少なくとも１種のプ
ラスミドで形質転換された請求項４記載の株を培養し、
且つピメリン酸或いはその誘導体の一つを培養培地に添
加することを特徴とする方法。 ６、該株がビオチン生合成経路のその他の遺伝子を発現
するプラスミドにより形質転換された請求項５記載のビ
オチン製造方法。 ７、ピメリン酸或いはその誘導体が培養開始時、指数増
殖期前或いはその間に添加される請求項５及び６のいず
れかに記載の方法。 ８、株がＢ．スフェリカス株Ｎｏ． I −８０８である
請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8900597 | 1989-01-19 | ||
| FR8900597A FR2642768B1 (fr) | 1989-01-19 | 1989-01-19 | Procede perfectionne pour l'expression de la biotine dans bacillus sphaericus |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03180174A true JPH03180174A (ja) | 1991-08-06 |
Family
ID=9377861
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2010435A Pending JPH03180174A (ja) | 1989-01-19 | 1990-01-19 | バチルス・スフエリカスにおけるビオチンの発現の改良方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0379428B1 (ja) |
| JP (1) | JPH03180174A (ja) |
| DE (1) | DE69003693T2 (ja) |
| FR (1) | FR2642768B1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6361978B1 (en) | 1996-05-06 | 2002-03-26 | Roche Vitamins, Inc. | Production of biotin |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6277609B1 (en) | 1993-01-06 | 2001-08-21 | Basf Aktiengesellschaft | Method to produce biotin |
| EP0635572A3 (en) | 1993-06-25 | 1995-03-08 | Hoffmann La Roche | Biotin biosynthesis in Bacillus subtilis. |
| US5882883A (en) * | 1994-09-28 | 1999-03-16 | Novo Nordisk A/S | Process for the production of secondary metabolites |
-
1989
- 1989-01-19 FR FR8900597A patent/FR2642768B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-01-17 DE DE1990603693 patent/DE69003693T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-01-17 EP EP19900400129 patent/EP0379428B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-19 JP JP2010435A patent/JPH03180174A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6361978B1 (en) | 1996-05-06 | 2002-03-26 | Roche Vitamins, Inc. | Production of biotin |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0379428A1 (en) | 1990-07-25 |
| FR2642768B1 (fr) | 1991-05-17 |
| FR2642768A1 (fr) | 1990-08-10 |
| EP0379428B1 (en) | 1993-10-06 |
| DE69003693D1 (de) | 1993-11-11 |
| DE69003693T2 (de) | 1994-02-24 |
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