JPH03180176A - 細胞培養のための基礎栄養培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、一般に、哺乳動物細胞の生体外培養（ｉｎ　
ｖｉｔｒｏ　ｃｕｌｔｕｒｅ）のための培地に関する。

さらに詳しくは、本発明は、血清不含培養のための、あ
るいは低いレベルの血清を補充したときの培養のための
、規定された基礎栄養培地（ｄｅｆｉｎｅｄ　ｂａｓａ
ｌ　ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ｍｅｄｉｕｍ）である。血清不
含培養のため、無機鉄源および／または規定された蛋白
質を基礎栄養培地に添加する。この培地は、広範な種類
の細胞系および細胞のタイプの高いまたは低い密度の培
養において使用するとき、非常に有効である。

生体外培養のため、培地は、もちろん、細胞にすべての
必須栄養を供給しなくてはならない：ビタミン、アミノ
酸、脂質、核酸前駆体、炭水化物、微量元素、およびバ
ルクイオン（ｂｕｌｋ　　１ｏｎ）。

歴史的には、基礎栄養培地は、生物学的流体または抽出
物、例えば、血清または他の血液産生物（例えば、血漿
、血漿タンパク質、ヘモグロビン）、脂質、酵母エキス
または胚抽出物を補充した後はじめて、細胞の生長を支
持するように案出された。

血清は、とくに、有効な補充物質であることが証明され
た。なぜなら、多分、それは生理学的に許容されうる濃
度で必要な生長促進因子および増殖促進因子を含有する
からである。このタイプの基礎栄養培地の例は、次の通
りである：イーグルの基礎培地（ＢＭＥ）　、その組成
は米国特許第３゜４５０．５９８号［ウェルシュ（Ｗｅ
ｌｓｈ）ら］に記載されている、およびダルベツコの変
性イーグル（ＤＭＥ）培地、その組成はハム（Ｈａｍ）
ら、「培地および生長の要件（Ｍｅｄｉａ　　ａｎｄ　
　ＧｒｏｗｔｈＲｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ）　Ｊ　、酵
素学における方法（狗ｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅ　ｎｚ
ｙｍｏｌ、）、（１９７８）、の表ＩＩに記載されてい
る。ＤＭＥ倍地は、比較的高い濃度の必須アミノ酸およ
び糖を含有し、血清を補充した細胞の大量培養のために
配合された、商業的入手可能な培地の代表である。

細胞培養技術中の生長のソフィスティケーションを用い
ると、血清または他の生物学的抽出中に存在する因子が
同定された。細胞の生長および増殖のために必要な規定
された蛋白質を基礎栄養培地に補充することによって、
血清不含環境において哺乳動物の細胞を生長させること
が、現在、可能である。例えば、ハムのＦ１２倍地はク
ローナル蛋白質不含生長のために配合された。Ｆ１２の
組成はハム（Ｈａｍ）ら上の参考文献の表ＩＩに記載さ
れており、このＦ１２は低濃度の必須アミノ酸および糖
を含有するが、脂質、核酸誘導体、ビタミンおよび非必
須アミノ酸を含有する。

低い血、清濃度における細胞の大量培養のための、容易
に得られかつ十分に複雑な基礎栄養培地は、ＤＭＥおよ
びＦ１２を混合することによって調製できることは、現
在一般に受入れられている。このような混合物は、また
、多くの細胞のタイプの血清不含生長を支持することが
できる。バーネス（Ｂ　ｅｒｎｓｅ）ら、「血清不含培
地において培養した細胞の生長の生長の方法（Ｍ　ｅｔ
ｈｏｄｓ　　ｆｏｒ　　Ｇ　ｒｏｗｔｈ　　ｏｆ　　Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅｄ　　Ｃｅ１ｌｓ　　ｉｎ　　Ｓｅｒｕｍ
−Ｆｒ２．２５５−７０ページ（１９８０）、は両者の
アプローチの例を記載している。

いくつかの商業的に入手可能な栄養培地は、ＤＭＥ、Ｆ
１２および／または他の培地、例えば、ハム（Ｈａｍ）
ら上の参考文献の表ＩＩに記載されている混合物に基づ
く。しかしながら、現存する商用培地の簡単な混合物は
すべての細胞系を培養するためにはまったく最適ではな
く、それゆえ培地の調製は大抵特定の細胞系または細胞
のタイプを目標としてきている。ウォルフェ（Ｗｏｌｆ
ｅ）ら、「血清不含培地中のラットＣ６膠腫の連続的培
養（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｓ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　ｏｆ　
　Ｒａｔ　　Ｃ６Ｇｌｉｏｍａ　　ｉｎ　　Ｓｅｒｍ−
Ｆｒｅｅ　　Ｍｅｄｉｕｍ）　Ｊ　、ジャーナル・オブ
・セル・バイオロジー（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　　Ｂｉｏｌ、
）　、Ｖｏｌ、　８７．４３４−４２ページ（１９８０
）は、微量元素が補充されおよびさらに次の規定された
蛋白質を補充された、３：ｌのＤＭＥ対Ｆ１２混合物の
使用を教示している：インスリン、トランスフェリ、線
維芽細胞の生長因子、脂肪酸不含ウシ血清アルブミンに
対して錯化したリノール酸、および血清拡張因子（３ｅ
ｒＨ−５ｐｒｅａｄ　ｉｎｇ　　ｆａｃｔｏｒ）　　（
ビトロネクチン）。

生物学的物質（例えば、モノクローナル抗体および遺伝
子操作された蛋白質）を生産するために、培養した哺乳
動物細胞を使用することが増加し、化学的に規定された
血清不含培地の要求が増加している。所望の細胞産生物
の精製は、少なくとも数１００の異なる蛋白質を含有し
つる血清の存在によって、大きく複雑である。したがっ
て、培地の蛋白質含量をわずかの規定された化合物に減
少し、これらからモノクローナル抗体または他の細胞産
生物をいっそう容易に分離できるようにすることが望ま
しい。規定されたタンパク質は、任意の特定の、同定可
能な、精製されたタンパク質を包含する。規定されたタ
ンパク質は、次のものを包含するが、これらに限定され
ない：アルブミン、トランスフェリン、インスリン、ビ
トロネクチン、線維芽増殖因子、インスリン様増殖因子
、ラミニン、フィブロネクチンおよびその誘導体、およ
び他のホルモン、増殖因子および緩衝液因子。

必要な栄養および蛋白質の因子に加えて、培地はｐＨレ
ベルを調節するための手段をもたなくてはならない。よ
り典型的には、ｐＨの調節は重炭酸塩／二酸化炭素の系
に頼り、これは二酸化炭素の調整剤ならびに培養物に一
定レベルの二酸化炭素を供給するためのインキュベータ
ーを必要とする。この系の緩衝化容量は、生物適合性有
機緩衝化剤、例えば、α−グリセロールホスフェートま
たはＨＥＰＥＳ　（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジ
ン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸）または他の両性イオ
ンを含めることによって拡張できる。

扱いにくい重炭酸塩／二酸化炭素の系の代わりのものが
提案されてきたが、この分野において有意に受入れなか
った。参照、例えば、レイボビッツ（Ｌ　ｅｉｂｏｖｉ
ｔｔｚ）、「大気との遊離ガス交換における組繊細胞の
培養物の生長および維持（ＴｈｅＧｒｏｗｔｈ　　ａｎ
ｄ　　Ｍａｉｔｅｎａｎｃｅ　　ｏｆ　　Ｔｉ５ｓｕｒ
ｅ−Ｃｅ１１　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　ｉｎ　　Ｇａｓ　
　Ｅｘｃｈａｎｇｅ　　ｗｉｔｈ　　ｔｈｅＡｔ＋＋ｏ
ｓｐｈｅｒｅ）　、Ａｍ、Ｊ、　　Ｈｙｇｉｅｎｅ、　
Ｖｏｌ。

７８．１７３−８０ページ（１９６３）、これは遊離の
基本アミノ酸を使用し、そしてグルコースの代わりにＤ
（＋）ガラクトース、ピルビン酸ナトリウムおよびＤＬ
−α−アラニンを使用する培地（Ｌ−１５）を開示して
いる。Ｌ−１５倍地は大気との遊離ガスの交換において
使用できると考えられる。フェルグソン（Ｆｅｒｇｕｓ
ｏｎ）ら、［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａ
ｎａｌｙｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）（１９８０）１０４：
３（）Ｏ−３１０１は、哺乳動物の組織培養における両
性イオンの使用を記載している。しかしながら、各場合
において、培地は、また、１０％の血清が補充されてお
り、５％のＣＯ２を含有する空気中でインキュベーショ
ンし、そして細胞を低い密度においてのみ支持した。バ
タッチャリャ（Ｂｈａｔ　ｔａｃｈａｒｙｙａ）ら［ゲ
イメチ・リサーチ（Ｇａｍｅｔｅ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
）（１９８８）１９　：１２３−１２９１は、培地中で
合成有機緩衝剤を重炭酸塩／二酸化炭素の代わりに使用
した。彼らの研究は、重炭酸塩／二酸化炭素が合成有機
緩衝剤のいずれよりも生体外の受精における胚の産生お
よび増殖の支持においていっそう優れていることを示し
た。今日まで、血清および二酸化炭素のインキュベーシ
ョンの不存在下に高いおよび低い細胞密度において増殖
を支持するために特別に培地は配合されてきていない。

本発明の基礎栄養培地は、規定される蛋白質因子、無機
鉄の補充物質または非常に低いレベルの血清を補充する
ときにおける、高いまたは低い密度の哺乳動物細胞の培
養のために案出された。この培地は空気の平衡化を利用
する緩衝系を含有する。

本発明の主目的は、哺乳動物細胞の高い密度の培養に遊
離でありかつ血清の不存在下にあるいは低い濃度の血清
の存在下に、このような培養を支持する、化学的に規定
された培地を提供することである。１つの重要な意図す
る利益は、血清中に存在する生長阻害剤の濃度の減少で
ある。さらに、培地に低いレベルの外因性蛋白質を供給
することによって、所望細胞産生物の回収および精製が
促進されることである。

本発明の１つの実施態様は、規定されたタンパク質を、
鉄補充物質、例えば、硫酸第二鉄、クエン酸第二鉄、フ
マル酸第一鉄または硫酸アンモニウム第一鉄で鉄飽和さ
れたトランスフェリンで置換する。これはことに有利で
ある。なぜなら、無機の鉄補充物質はトランスフェリン
より安価であり、そしてまた精製は余分のタンパク質の
量が低いからである。

より特定の目的は、ハイブリドーマ細胞による免疫グロ
ブリンの高い生成と適合するナトリウム／カリウム比お
よび合計のモル浸透圧濃度（ｏｓｍ。

１ａｒｉｔｙ）を有する培地を案出することである。ま
た、培地が免疫グロブリンと同時精製するポリペプチド
を含まないことを意図する。本発明の目標は、培養物か
ら回収される細胞産生物の純度を顕著に改良することで
ある。

追加の目標は、中空繊維のバイオリアクター（ｂｉｏｒ
ｅａｃｔｏｒ）中の使用にとくによく適した細胞培地を
提供することである。この目標を達成するため、培地の
処方は培養した細胞へ悪影響を与えるために十分なモル
浸透圧濃度の変化を回避または減少することを意図する
。

他の目的は、高い細胞密度に適するが、低い密度の培養
を阻害しないレベルで栄養を有する培地を案出すること
である。低い密度から高い密度の培養条件に移行すると
き、培地の交換を排除し、ならびに血清補充培地から血
清不含培地細胞を「ウィーニング（ｗｅａｎｉｎｇ）　
Ｊすることの必要性を減少または排除することを意図す
る。

本発明のなお他の目的は、広範な種類の細胞のタイプま
たは源の培養に適する、基礎栄養培地を案出することで
ある。この培地はヒト細胞のクローナル生長に適合する
ことを意図する。

なお他の重要な目的は、空気と二酸化炭素との混合物で
はなく、空気との平衡化のために配合される緩衝系をも
つ培地を提供することである。

本発明の１つの実施態様は、炭水化物源とじてＤ−グル
コースを含有しない基礎栄養培地である。

この実施態様は、人工膵臓の研究分野または使用するグ
ルコースのレベルが特別に変化させることが必要な分野
における研究道具として使用することができる。これは
乳酸塩の産生を変更し、こうしてｐＨを安定化するため
に手段として使用することができる。この分野において
、変化するレベルのグルコースがインスリンの産生を誘
発する実験を妨害する、付近の外因性グルコースをもた
ないことが重要である。この実施態様は、また、炭水化
物源、例えば、フルクトース、マンノース、ラクトース
、スクロースなどを使用する独特の配合を可能とし、こ
れらは特定のタイプの発酵または細胞のタイプによりよ
く適することがある。この実施態様は、また、他のグル
コース含有培地またはグルコースを補充した培地と混合
して、独特の発酵または細胞のタイプの要件を満足する
ことができる。

ミニに記載する基礎栄養培地は、高い細胞密度および低
い細胞密度の両者の培養に適する、栄養物質および他の
成分の完全に新規な配合物である。

培地は、生体外哺乳動物細胞の培養のための万能栄養培
地として機能するために、適当なレベルの必須アミノ酸
および非必須アミノ酸およびアミノ酸誘導体、バルクイ
オンおよび微量元素、緩衝剤、ビタミン、補酵素、炭水
化物および誘導体、核酸誘導体および脂質からなる。基
礎培地は、規定された蛋白質で、無機鉄源あるいは低い
レベルの血清または他の生物学的抽出物で補充されるよ
うに案出されている。この培地の緩衝系は、空気平衡化
されたｐＨ調節を可能とするように特別に配合されてい
る。

栄養培地を、特定の用途のために、あるいは特定の細胞
系または細胞のタイプの生長のための個々に案出するの
は典型的である。高い細胞密度に有用な先行技術の配合
物は、低い細胞密度の培養に対して大きい障害である、
ある種の成分を高い濃度で含有することが頻繁に発見さ
れる。さらに、多くの先行の培地は１つの細胞系のため
に特別に配合されており、そしてその細胞系のみに最適
である濃度の成分を含有する。先行技術の培地または培
地の組み合わせは、ここに記載する培地の成分のすべて
を含有せず、また個々の成分は先行技術の培地と同一濃
度で使用されていない。

ここに記載する培地は万能基礎栄養培地である。

それは低い細胞密度および高い細胞密度の両者の培養を
効果的に支持することが立証された。それはネズミ、ヒ
トまたは他のハイブリドーマ、肝細胞系、例えば、Ｈｅ
ｐＧ２、ＵＭＲ１０８、線維芽、例えば、３Ｔ３および
３Ｔ１２、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞を包
含する種々の細胞系およびタイプが必要とする栄養成分
を供給することが立証された。この培地は、とくに、種
々の生産モード、例えば、中空繊維のバイオリアクター
、発酵器、スピンナーフラスコ（ｓｐｉｎｎｅｒ　　ｆ
ｌａｓｋ）およびローラーボトル（ｒｏｌｌｅｒ　　ｂ
ｏｔｌｅ）におけるモノクローナル抗体の生産によく適
する。

培地を規定された蛋白質（すなわち、ホルモンおよび生
長因子）、無機鉄源で、あるいは低いレベルの血清で補
充するとき、高い純度の細胞産生物、例えば、モノクロ
ーナル抗体および組み換えタンパク質を容易に回収でき
る。

細胞の生長に必須な主要栄養成分および他の因子の大分
部分は、既知であり、そして多くの組み合わせおよび配
合で従来使用されてきている。しかしながら、成分の濃
度は、本発明の栄養培地のための新しく配合された。成
分は、この分野において普通に実施されているように、
１つの特定の細胞系または生産条件の組に対して単に最
適化されていない。むしろ、成分は万能培地において生
長因子および増強剤（ｅｎｈａｎｃｅｒ）の相互の関係
をもった組として最適化されている。さらに、ｐＨ調節
系は先行技術の培地と劇的に異なる。

ここに記載かつ下表１に列挙する成分は、培地の生産の
分野において普通の物理的およびイオン化の状態で与え
られている。しかしながら、他の物理的状態および／ま
たはイオン化状態を、必要に応じて、使用できる５両性
イオンおよび水酸化ナトリウムを除外した、成分のいず
れの濃度も、モル浸透圧濃度、ｐＨおよびナトリウム対
カリウムの比がここに記載する範囲内にあるかぎり、下
表に記載するものから２桁程度に多く変化させることが
できる。両性イオンの濃度は約１０．０〜約５０．０ミ
リモルの範囲、好ましくは約２５゜０ミリモルであるこ
とができる。使用するＮａＯＨの量は選択するｐＨの関
数である。

Ｄ−グルコース　　　　１８０．１６ Ｎａビルベー）　　　　　１１０．０ バルクイオンおよび微量元素 ２Ｘ１０−” Ｘｌ０−３ ＣａＣＡ’ｚ・２１１ｚＯ ＣｕＳＯ４・５Ｂ２０ ＦｅＳＯ４４Ｈ２０ Ｆｅ（ＮＯｘ）ｓ・９ＨｚＯ Ｃｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ａＣ１ １４７、０２ ２４９、６８ ２７８、０２ ４０４、０２ ７４、５５ ２４６、３８ ５８、４４ Ｘｌ０−３ ３Ｘ　１０−’ ＩＸ　１０−’ ２×１０″″７ ４Ｘ１０−’ ８Ｘ　１０−’ １．０５Ｘ　１０−’ ３６０３、２ １１０．０ １４７、０２ ０、０００７４９ ０、２７８ ０、０８０８ ２９８、２ １９７、１ ６１３６、２ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ Ｎａ２ＳｅＯｓ”５１１２Ｏ Ｎａ２Ｓｉ０３・９１１ｔＯ （ＮＨ４）６Ｍｏｔ０２４・４１Ｔ２ＯＮＨ４ＶＯ８ ＮｉＳ０４・６■２０ ＺｎＳＯ４４Ｈ２０ アミノ酸 −Ａｒｇ Ｌ−Ｃｙｓ　ＨＣｊ７．Ｈ２Ｏ −Ｇｌｎ Ｌ−ｔｌｉｓ　ＨＣｌ、０２０ Ｌ−ヒドロキシ−Ｐｒ。

−１１ｅ −Ｌｅｕ ピリドキサールＨＣＩ ピリドキシンＨＣｌ リボフラビン チアミンＨＣｌ ２６８、１ １５６、０１ ２６３、０１ ２８４、２ １２３５、９ １１６．９９ ２６２、８０ ２８７、５４ ２１０、７ １？５．６ １４６、１ ２０９、７ １３１、１３ １３１、２ １３１、２ ２０３、６ ２０５、６ ３７６、４ ３３７、０ ３Ｘ　１０−’ ６Ｘ　１０−’ ３Ｘ１０−” ＩＸ　１０−２ ３Ｘ　１０−’ ５×１０″″１０ ３Ｘ　１Ｏ−１０ ８Ｘ　１０−’ ｇｘ　ｉ　ｏ−’ ３×１０″″４ ５Ｘ　１０−’ ２Ｘ　１０−’ １×１０″″４ ６×１０″″４ ６×１０″″４ １Ｘ　１０−’ ３Ｘ　１０−’ ８Ｘ　１０−７ ９×１０″″６ ８０、４３ ９３、６０６ ０、００７８９ ２、８４２ ０、００３７１ ０、００００５８５ ０、００００７８８ ０．２３ １６８、５６ ５２、６８ ７３０、５ ４１．９４ １３、１１３ ７８、７２ ７ｇ、　７２ ２、０３６ ０、０６２ ０．３０１ ３、０３６ ビタミンＢ１２　　　　　１３５５．４　　　　３ｘ　
１０−’　　　　０．４０７核酸誘導体 アゾ＝ン１３５．１３　　　　１Ｘ　１０−’　　　　
０．１３５ｆミ’）ンＨＣＩ　　　　　３３７．３　　
　　１Ｘ　１０−’　　　　３．３７３脂質および誘導
体 コリンクロライド　　１３９．６３　　　　１ＸＩＯ−
’　　　　１３．９６エタノールアミンＨＣＩ　９７．
５５　　　　　２Ｘ　１０″″’　　　　１．９５１ｉ
−イ／シ）−ル１８０．２　　　　１ＸＩＯ−’　　　
　１８．０２リノール酸　　　　　２８０．４　　　　
　１ＸＩＯ−’　　　　０．０２８リポ酸２０６．３　
　　　　２Ｘ１０−’　　　　０．０４１漿亜璽 双生イオン緩衝開本　　　　　　　　　２．５Ｘ１０−
”Ｎａ０Ｂ　　　　　　　　　４０．０１　　　　１．
２３Ｘ　１０−”　　４９２．１２ＮａＨＣ０１ｇ４．
０１　　　　３ｘ　１０−”　　　　２５２．０３ナト
リウム（合計）ミリモル　　　　　１２３．１カリウム
（合計）ミリモル　　　　　　４．０ナトリウム：カリ
ウム　　　　　　　３０．７合計のモル浸透圧濃度（Ｉ
ｏｓ■）　　　　　３０２．７本　双生イオン緩衝剤は
一種でも又は一種以上の適当な双生イオンＬ−Ｌｙｓ　
ＨＣＩ　　　　　　　１８２．７Ｌ−Ｍｅｔ　　　　　
　　　　　１４９．２Ｌ−Ｐｈｅ　　　　　　　　　　
１６５．２Ｌ−Ｔｈｒ　　　　　　　　　　１１９．　
ＩＬ−Ｔｒｐ　　　　　　　　　２０４．２Ｌ−Ｔｙｒ
（ジＮａつ２１１，０　　２６３．２Ｌ−Ｖａｌ　　　
　　　　　　　１１７．２Ｌ−＾１ａ　　　　　　　　
　　８９．０９Ｌ−Ａｓｎ　、　ＨＩ３　　　　　１５
０．　ＩＬ−Ａｓｐ　　　　　　　　　１３３．　ＩＬ
−Ｇｌｕ　　　　　　　　　　１４７．　ＩＧｕｙ　　
　　　　　　　　　７５．０７Ｌ−Ｐｒｏ　　　　　　
　　　　１１５．１Ｌ−８ｅｔ　　　　　　　　　　１
０５．１アミノ酸誘導体 グルタチオン　　　　３０７．３ プトレシン２ＨＣ１１６１，１ 水溶性ビタミンおよび補酵素 ８Ｘ　１０−’ ｌ×１０″″３ Ｘ１Ｏ−４ ６Ｘ１０−’ Ｘ１０− Ｘ１Ｏ−４ ６×１０″″４ ２Ｘ　１０−’ ３Ｘ　１０−’ Ｘ１Ｏ−１ ２Ｘ　１０−” ３Ｘ　１０−’ ２×１０″″４ ３×１０″″４ １Ｘ１０−・ ３Ｘ　１０−’ １４６、１６ １４９．２ ４９、５６ ７１、４６ １２、２５２ ７８、９５ ７０、３２ １、７ｇ２ ４５、０３ ２、６６２ ２、９４２ ２、２５２ ２３、０２ ３１、５３ ０、３０７ ０、０４８ ビオチン　　　　　　２４４．３ ３Ｘ　１０−” ０、００７ Ｄ−他バントテネート　２３８．３　　　　２Ｘ　１０
″″５葉酸　　　　　　　　４４１．４１　　　　６Ｘ
　１０−’４、７６６ ２、６４８ アミノ安息香酸　　　１３７．１４　　　　３Ｘ　１０
″″６バルクイオンおよび微量元素 バルクイオンは、細胞の生長および膜電位および浸透圧
のバランスを維持するために必要である。

それらは、また、酵素反応においてコファクターの役割
を演する。ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネ
シウム、塩素、リン酸および硫酸のイオンのすべては、
正常な細胞の代謝において重要な機能をはたす。借地中
の特定のナトリウム対カリウムの比は、膜内外電位の調
節において重要であり、これについてはさらに説明する
。重炭酸塩または二酸化炭素は、また、必要であり、そ
して低い密度の細胞培養のために借地中に供給しなくて
はならない。高い密度の細胞の培養において、０．４１
１ 細胞自体は、外部の重炭酸塩および二酸化炭素を必要と
しないで、十分なレベルで発生することができる。微量
の無機元素（鉄、亜鉛、セレン、ケイ素、バナジウム、
銅、ニッケルおよびモリブデン）は、多くの酵素の機能
のために必要である（例えば、グルタチオンリダクター
ゼにおけるＳｅ　＋　４　）。

微量元素は、また、膜内外のシグナリング（ｓｉｇｎａ
ｌｉｎｇ）の事象を直接調節することができる（例えば
、インスリンの応答のバナデートの調節）。

微量金属は、一般に、血清不含借地において使用されな
い。上の表１に記載する特定の化合物は、培地の調製に
普通に使用され、そして示す水和状態が本発明の培地の
粉末状態の安定性のために有利であるので、ここにおい
て好ましい。置換は当業者にとって実施することができ
るであろう。

アミノ酸 次のアミノ酸をこの培地中に含めることができる：Ｌ−
アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）、Ｌ−システィン（Ｌ−Ｃｙ
ｓ）、Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｉｎ）、Ｌ−ヒスチジン
（Ｌ−Ｈｉｓ）、Ｌ−ヒドロキシプロリン（Ｌ　−Ｈｙ
ｄｒｏｘｙ　−Ｐ　ｒｏ）　、Ｌ−イソロイシン（Ｌ　
−Ｉ　ｌｅ）　、Ｌ−ｏイシン（Ｌ−Ｌｅｕ）　、Ｌ　
−リジン（Ｌ−Ｌｙｓ）、Ｌ−メチオニン（Ｌ−Ｍｅｔ
）、Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−Ｐｈｅ）、Ｌ−スレオ
ニン（Ｌ−Ｔｈｒ）　、Ｌ−）リプトファン（Ｌ−Ｔｒ
ｐ）　、Ｌ−チロシン（Ｌ−Ｔｙｒ）およびＬ−パリ：
／　（Ｌ−Ｖａｌ）　。Ｌ−アラニン（Ｌ　−Ａ　ｌａ
）、Ｌ−アスパラギン（Ｌ−Ａｓｎ）、Ｌ−アスパラギ
ン酸（Ｌ　−Ａ　ｓｐ）、Ｌ−グルタミン酸（Ｌ　−Ｇ
　ｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）　、Ｌ−プロリン（Ｌ　
−Ｐ　ｒｏ）およびＬ−セリン（Ｌ　−Ｓ　ｅｔ）。さ
らに、アミノ酸誘導体のグルタチオンおよびプトレシン
が本発明の培地中に存在する。再び、上の表１に列挙す
る形態は、とくに容易に溶解する粉末状培地の調製のた
めに、好ましい。しかしながら、これらのアミノ酸の別
の形態を選択することができる。

ビタミン／補酵素 ある数の水溶性ビタミンおよび補酵素は細胞の培養を助
けることが知られている。ビオチン、パントテン酸、葉
酸、フォリニン酸、ニアシアンアミドにコチンアミド）
、ｐ−アミノ安息香酸、ピリドキサール、ピリドキシン
、リボフラビン、チアミン、およびビタミンＢＩ２を、
この培地において使用する。

炭水化物 グルコース、ピルベートおよびグルタミンを本発明の培
地においてエネルギー源および炭素源として利用する。

ピルベートはナトリウムピルベートとして供給する。こ
の方法の制御のためには、細胞がエネルギー源として使
用する成分を変更することが望ましいことがある。例え
ば、グルコースの代わりにガラクトースまたはフルクト
ースを使用することができ、そしてグルタミンの濃度を
変更することができる。本発明の１つの臭化エチジウム
において、グルコースは完全に放置される。

この培地は別のエネルギー源の使用を可能とする。

この培地は、また、人工膵臓装置の開発および特別のグ
ルコースレベルの外因性添加を必要とする実験系、例え
ば、グルコースの輸送の研究において研究道具として使
用することができる。

核酸誘導体 アデニンおよびハイポキサンチンをプリン源として供給
する。チミジンはピリミジン源として供給する。

脂質 本発明の配合物は、次の脂質、脂質前駆体および脂質誘
導体を含む：コリン、エタノールアミン、ｉ−イノシト
ール、リノール酸およびリポ酸。追加の脂質および他の
誘導体、例えば、メチパリネオレート（ｍｅｔｈｙｌ　
　１ｉｎｅｏｌａｔｅ）を、特定の細胞のタイプのため
に要求されるとき、添加するか、あるいは代わりに使用
することができる。エタノールアミンは膜のリン脂質生
合成経路における主要成分である。

緩衝剤 ここに記載する栄養培地の緩衝剤系は独特である。この
系は、ｐＨ調節のための空気平衡化を使用する容易さお
ぶび柔軟性を提供する。培地は主として血清不合または
非常に低い血清濃度の培養に意図するので、これは本発
明の重要な面である。

血清濃度を低下すると、１０％の二酸化炭素／空気と平
衡にあるｐＨの調節に通常適する重炭酸塩のレベルは禁
止的となることが発見された。本発明の緩衝系は、また
、ｐＨを生理学的に適合性の範囲内に維持するために従
来要求された二酸化炭素濃度のわずられしい調節の代替
の手段を提供する。

この緩衝系は、重炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、
二酸化炭素および両性イオンを利用する。

両性イオンの緩衝剤は、最初にグツド（Ｇｏｏｄ）ら［
生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｓｔｒｙ）（１９６６）５　：
　４６７］により記載された。両性イオンの緩衝剤は、
次のものを包含するが、これらに限定されない：ＨＥＰ
ＥＳ　（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−
２−エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳＯ（３−［Ｎ−モル
ホリノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）　、Ｂ
ＥＳ　（Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−
アミノエタンスルホン酸）、およびＴＡＰＳＯ（３−［
Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノコ−２−
ヒドロキシプロパンスルホン酸）。両性イオンの緩衝剤
は、個々に使用することができるか、あるいは最終濃度
が約１０ミリモル〜５０ミリモル、好ましくは約２５ミ
リモルであるような組み合わせで使用することができる
。低い密度の培養において細胞代謝のために要求される
二酸化炭素の少量は、本発明の培地に、大気の二酸化炭
素および培地中に存在するＨＣＯ３−の平衡を経て供給
される。高い密度の培養のために、十分な二酸化炭素は
通常の細胞の代謝を経て生成される。細胞を機能化する
非常に密に充填されたビーズを有する、とくに中空繊維
のバイオリアクターの場合において、大量の二酸化炭素
が発生する。緩衝系が二酸化炭素／重炭酸塩の平衡に基
づく場合、環境は急速に酸性過ぎるようになって、細胞
は最適レベルで機能することはできなくなる。本発明の
培地における空気平衡化緩衝系はこの問題を排除する。

ｐＨ指示薬のフェノールレッドを使用する必要性は本発
明の培地において排除される。なぜなら、この培地の緩
衝系は、空気平衡化系において普通の培養条件下にｐＨ
を生理学的範囲内に維持するであろうからである。これ
は所望の細胞産生物の精製において究めて有利である。

なぜなら、フェノールレッドは蛋白質に結合して、蛋白
質のクロマトグラフィーの挙動を変化させるからである
。

さらに、フェノールレッドは細胞の生合成および代謝に
影響を及ぼすことがある。したがって、フェノールレッ
ドの排除は、必要な精製工程を減少しかつ回収可能な産
生物の増加において意味がある。

培地は約ｐＨ７，０〜約ｐＨ７，４および３７℃で配合
することができる。これより高いｐＨ１例えば、約ｐＨ
８，０は、この方法の制御の手段として追加の塩基を添
加する代わりに、培養した細胞によって生成された乳酸
を中和するための、連続的に供給するバイオリアクター
のための方法の制御の手段として使用できる。培地を中
空繊維のバイオリアクター中で使用するとき、ｐＨ７，
３５（３７℃）における配合は好ましい。ｐＨ７゜２〜
ｐＨ７，８（３７℃）における配合は他の用途に好まし
い。

高い密度の培養物中の両性イオンの緩衝剤の使用はこと
に望ましい。最適なプロセスのｐＨは細胞系などに依存
して変化する。両性イオンの緩衝剤ＨＥＰＥＳＳＭＯＰ
ＳＯ，ＢＥＳ、およびＴＡＰＳＯのｐＫａ　（３７℃）
値は、それぞれ、７゜３．６．７５．６．９および７．
４である。特定の緩衝系は、両性イオンの緩衝剤を使用
して操作して種々の細胞の要求を満足することができる
。

ハイブリドーマについて、培地は約ｐＨ７，３５（３７
℃）で配合し、高い密度におけるプロセスｐＨはしばし
ばｐＨ６，８（３７℃）であり、そして両性イオンの緩
衝剤はその範囲における最適なｐＫａ値のためによりす
ぐれた緩衝容量を有する。他の細胞系はｐＨ７またはｐ
Ｈ７，２以上に維持することが要求することがある。し
たがって、より高いｐＫａをもつ緩衝剤（例えば、ＴＡ
ＰＳＯ）に切り替える能力は非常に価値がある。

モル浸透圧濃度 培地のナトリウム対カリウムの比および合計のモル浸透
圧濃度は、高いレベルのネズミ免疫グロプリンの生成ま
たは他の組み換えタンパク質の産生との適合のために調
節した。好ましいナトリウム対カリウムの比は約３０で
あるが、約２５〜約３５の範囲であることができる。こ
の培地のモル浸透圧濃度は低く、約２８５〜約３１５、
好ましくは約２９５〜約３０５　ｍｏｓｍであることが
できる。

ここに記載する培地は、中空繊維のバイオリアクター、
発酵器、スピンナーフラスコおよびローラーボトルにお
けるモノクローナル抗体の生産にとくによく適する。こ
れらのタイプの培養において日常的に使用する高いレベ
ルのガス交換は、本発明の配合物と適合する。培地のモ
ル浸透圧濃度は培養の間の多少の上昇を可能とするよう
に低いレベルに保持し、その間なおモル浸透圧濃度を健
康な生産的細胞を維持するために適当な範囲内に維持す
る。中空繊維反応器において使用するため、培地は好ま
しくは約２９５　ｍｏｓｍで再構成する。さらに、生物
適合性還元剤、例えば、グルタチオンを培地中に含めて
、これらの高いレベルのガス交換から生ずる潜在的に酸
化性の複雑さを補償した。

本発明の基礎栄養培地の処方は上の表に記載されている
。成分の量はモル濃度ならびに濃度で与えられている。

この表の処方は本発明の好ましい実施態様である。各成
分の量は、２桁で変化させることができる、すなわち、
上の表に記載する量の約５０％〜約２００％の間で変化
することができる。各成分の濃度はそれが細胞に入る機
構、能動的または受動的な移送、および生物学的活性の
所望レベルについて十分な移送を達成するために要求さ
れる濃度を基準にして選択した。

個々の成分の水和状態および調製された基礎栄養培地は
、便利さに従って変化させることができる。ここに与え
る水和状態は、培地の調製の分野において普通に使用さ
れているものである。しかしながら、実際的事柄として
、調製された培地をできるだけ乾燥して得ることが好ま
しい。

前述の基礎栄養培地は、使用前に再構成するために、乾
燥または濃縮した調製物として配合しかつ包装すること
ができる。本発明の好ましい実施態様において、培地は
、上の表に記載する最初の６０種類の成分からなる、乾
燥粉末として調製する。次いで、乾燥培地を再構成する
とき、残りの２成分を添加する。再構成は使用直前に実
施できる。あるいは、培地を再構成し、そして包装する
ことができる。この培地の貯蔵寿命は、乾燥粉末として
約４℃において貯蔵したとき、少なくとも数年である。

液体培地は、調製したばかりのとき、あるいは乾燥粉末
から再構成したとき、安定性に劣るが、約約４℃におい
て貯蔵したとき、約２か月間以上または６か月間安定で
ある。

再構成は、上の表に記載する相対的濃度が存在するかぎ
り、培地の重炭酸塩、塩基または他の成分の濃厚原溶液
を添加することによって実施することができる。それら
の成分を固体として添加する場合、再構成は無菌の、脱
イオンした組織培養等級の水を添加することによって達
成される。培地は使用前に滅菌する。粉末状培地を再構
成するためのプロトコールは実施例１に記載されている
。

追加の酸化防止剤、還元剤、ビタミン、炭水化物、アミ
ノ酸および／または誘導体、核酸および／または誘導体
、および蛋白質は、再構成の前、間または後に添加する
ことができる。主要な添加する成分は蛋白質および／ま
たは池のホルモンである。

前述のように、本発明の基礎栄養培地は、低いレベルの
血清で、あるいは規定した蛋白質で補充するように案出
されている。この培地は、培養する特定の細胞系のため
に適した量の血清で補充するとき、細胞の生長および代
謝を支持するであろう。しかしながら、典型的には先行
技術の培地を使用したときより、かなり低いレベルの血
清が本発明の培地の補充に必要であることが立証された
。

この配合物は、血清不含で使用することができ、あるい
は非常の低いレベル、好ましくは約１容量％より低いレ
ベルで使用できるが、これより高いレベルを必要に応じ
て使用できる。

ここに記載する培地は、最少の数の規定された蛋白質で
補充するとき、血清不含細胞培養のために使用できる。

精確な蛋白質の補充は、培養する細胞の要求に依存する
であろう。ネズミハイブリドーマのための精確な蛋白質
の補充は、インスリン、アルブミンおよび鉄飽和トラン
スフェリンから成る。インスリンは、約１．０〜１０．
０μｇ／ｍｌ、好ましくは約５．０μｇ／ｍｌの濃度で
存在できる。アルブミンは、約１０．０〜１０００゜０
μｇ／ｍｌ、好ましくは約５０．　０　μｇ／ｍｌノｌ
Ｉ度で存在できる。鉄飽和トランスフェリンは、必要に
応じて、鉄源として約Ｏ０１〜約２５．０μｇ／　ｍ　
ｌ　、好ましくは約１０．０１１ｇ／ｍｌの濃度で使用
することができる。基礎栄養培地をこれらのタンパク質
で補充することは、高いおよび低い密度の細胞培養物に
ついてきわめてすぐれていることが発見された。無機鉄
の補充物質、例えば、硫酸第二鉄およびクエン酸第二鉄
を使用して、鉄飽和トランスフェリンの性質を示すこと
ができる。

無機鉄補充物質は、約１μモル〜約５０μモルの濃度で
存在することができる。必要に応じて、追加のタンパク
質を添加することができる。

次の実施例によって、本発明を例示する。これらの実施
例は本発明を限定することを意味しない。

本発明の説明を通じて、次の略号を使用した。

ＢＳＡ　　　−ウシ血清アルブミン ℃　　−セ氏度 Ｃｍ”　　　　−立方センチメートル ＤＭＥ　　　−ダルベツコ変性イーグルＦＢＳ　　　−
胎児ウシ血清 ｇ　　−グラム Ｌ　　−リットル Ｍ　　−モル ａ＋Ｍ　　　−ミリモル ｍｇ　　　　−ミリグラム ｗｉｎ　　−分 ｍｌ　　　　−ミリリットル ｍｏｓ＋＋＋　　　　−ミリモル浸透圧濃度（μｍｏｌ
／Ｋｇ） Ｍ　　−モル ＭＷ　　　−分子量 Ｎ　　−規定 ｎｍ　　　　−ナノモル ｏｓｓ　　　　−モル浸透圧濃度（ｍｍｏｌ／ＫＰＢＳ
　　　−リン酸塩緩衝化食塩水 ％　　−パーセント ｒｐｍ　　　　−回転数７分 Ｖ　　一体積 ｗｔ　　　　−重量 実施例■ （培地の調製） 粉末状培地 この培地は、上の表に記載する最初の６０種類の成分（
すなわち、Ｎ　ａＨＣＯｓおよびＮａＯＨを除外するす
べての成分）を、上の表に記載する量で混合することに
よって調製した。これらの成分を粉砕して乾燥粉末を形
成した。特記しない限り、両性イオンの緩衝剤は次の実
施例において２５ミリモルのＨＥＰＥＳであると仮定す
る。

重炭酸塩／塩基の原溶液 重炭酸塩／塩基（Ｎ　ａＨＣＯｓ／　Ｎ　ａＯＨ）の原
溶液を次のようにして調製した： （１）ｐＨ７，２（３７℃）について、原溶液は１７．
９２２ｍｇのＮ　ａＨＣＯｓを７１１．２ｍｌのＮａＯ
Ｈの１．０ＯＮの溶液に添加することによって調製した
。次いで、この体積を１リツトルに調節した。

ｍｇのＮａＨｃＯｓを９５０．ＱｍｌのＮａＯＨの１゜
０ＯＮの溶液に添加することによって調製した。

次いで、この体積を１リツトルに調節した。

粉末状培地の再構成および蛋白質の補充６リツトルの組
織培養等級の水を１０．０リツトルの容器に入れ、これ
に１９５．７ｇの量の粉末状培地［１０リットル等価（
ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）パッケージ］を添加した。この
パッケージをｉｏｏ。

Ｑｍｌのアリコートの水で２回すすいだ。次に、１５０
．０ｇ＋１（１５，０ｍｌ／Ｌ培地）の重炭酸塩／塩基
の原溶液をこの容器に添加した。適当な重炭酸塩／塩基
の原溶液は、培地の用途に依存して選択した。容器の側
面を６３０．Ｑｍｌの水ですすいで、すべての粉末を確
実に溶解した。１０．０ｍｌ（１，０ＩＩｌｌ／Ｌ培地
）のアルブミン／トランスフェリンの原溶液およびイン
スリンの原溶液の各々を添加した。体積を１０．ＯＬに
した。

標準の再構成した培地のｐＨは、ブラッドガス分析器（
ｂｌｏｏｄ　　ｇａｓ　　ａｎａｌｙｚｅｒ）　　［コ
ーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）］　　（３７℃において）
で７．１８±０．０３であると決定された。バイオリア
クターの再構成した培地のｐＨは、７．３５±０．０３
であると決定された。モル浸透圧濃度は、蒸気圧浸透圧
測定［ウェスコ−（Ｗｅｓｃｏｒ）　］によって２９５
±５．０であると決定された。

再構成した培地は、マスターフレックス（Ｍａｓｔｅｒ
ｆｌｅｘ）　　（商標）ポンプ（＃２５ヘッド）［コー
ル−パー７−　（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ）　］を使用
してほぼ５００．０ｍｌ／分で濾過滅菌した。この溶液
をミリ−スタック（Ｍｉｌｌｉ−ｓｔａｃｋ）　ＧＳ　
（商標）ガラスフィルター［ミリボア（Ｍｉｌｌｐｏｒ
ｅ）　Ｍ　５Ｇ−８Ｏ５Ｃ２２）を通過させて、無菌の
ガラスまたはポリカーボネートのカーボイに入れた。

再構成した培地は、滅菌性および細胞の増殖を促進する
能力を評価するために試験した。培地の１０．０ｆｆｌ
ｌのアリコートを、次のタンパク質補充物質Ａで補充し
た： ５０．０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＩＣＮバイ
オケミカルス）１．０μｇ　／　ｍ　ｌの鉄飽和ヒトト
ランスフェリン（ＩＣＮバイオケミカルス） ５．０μｇ／ｍ１のウシインスリン（シグマ・ケミカル
・カンパニー）アリコートを組織培養フラスコ（Ｔ−７
５）中に無菌的に入れ、これに１００万のＣＲＬ　　１
６０６ネズミハイブリドーマ細胞［アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（Ａ　ｍｅｒｉｃａｎ　　
Ｔ　ｙｐｅ　　Ｃｕｌｔｕｒｅ　　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ、　　ｌ　２３　Ｑ　Ｉ　　Ｐａｒｋｌａｗｎ　　Ｄ
ｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ
、　　Ｕ、　　Ｓ、　　Ａ、　　２０８５２）から入手
したコを添加した。フラスコをしつかり留めて、３７℃
で２４時間インキュベーションした。

次いで、１００ｕＬのアリコートを１０．Ｑｍｌ（７）
ＰＢＳで希釈し、そして細胞濃度をコールタ−カウンタ
ー（Ｃｏｕｌｔｅｒ　　Ｃｏｕｎｔｅｒ）　　（商標）
粒子カウンタ［コールタ−・エレクトロニクス（Ｃｏｕ
ｌｔｅｒ　　Ｅ　１ｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）コで決定した
。少なくとも２ｏｏ、ｏｏｏ細胞細胞７創ｌ測され、こ
の培地の培養を支持する能力を示した。

びんに入れた培地を室温において一夜放置して滅菌性を
評価した。くもりまたは微生物汚染の他の証拠は観察さ
れなかった。次いで、この培地を４℃で貯蔵した。

実施例ＩＩ この実施例は、タンパク質補充物質Ａを補充した実施例
■の血清不合培地中の細胞の生長およびモノクローナル
抗体の生産を、血清補充ＤＭＥ（ダルベツコ変性イーグ
ル）培地中の細胞の生長およびモノクローナル抗体の生
産と比較する。本発明の培地を使用して、よりすぐれた
細胞の生長および抗体の生産が見られた。

ネズミハイブリドーマ系統ＣＲＬ　　１６０６の細胞の
アリコートを、表ＩＩに示すように、実施例Ｉの再構成
した培地（ｐＨ７，２）中に接種した。これを培養物Ｉ
ＩＡと表示した。細胞の他のアリコートを、１０％（Ｖ
／Ｖ）の胎児ウシ血清（ＧＩＢＣＯ／ＢＢＬ）を補充し
たＤＭＥ培地中に接種した。この培地および細胞をポリ
スチレンのローラーボトル（コーニング、４９０　ｃｍ
”）中に入れた。培養物ＩＩＡを含有するローラーボト
ルを密閉した。培養物ＩＩＢを含有するローラービンを
、密閉前に１０％の二酸化炭素／空気で通気した。両者
のローラーボトルを、約１．Ｑｒｐｍのローラー装置上
のインキュベーターに３７℃において入れた。

各培養物のアリコートを毎日取り出し、そして細胞濃度
をコールタ−カウンターの粒子カンタ−（コールタ−・
エレクトロニクス）で決定した。

細胞の生存能力は、トリパンブルー色素の排除アッセイ
（シグマ・ケミカル・カンパニー）によって決定した。

結果を表■に示す。

細胞を毎日のアリコートの各々から遠心によって取り出
した。アリコートの各々からのコンディショニングした
培地は、実験の終了まで、４℃で貯蔵した。アリコート
の各々中に存在する抗体（抗フィブロネクチンＩｇＧ）
は、エライザ（ＥＬＩＳＡ）分析によって決定した。

表■ 生存可能細胞（１０”＃） 時間　　　　ｍＡ　　　　　Ｉ［Ｂ ｏ　　　０．０２１±、００１　０．０２２±、００１
２５　　０．０４０±、００１　０．０２１±、００１
　　　３．２４７　　０．０９８±、００１　０．０５
９±、００１　　　８．１７１　　０．３１０±、０１
７　０．１８５±、００５　　１６．６９７　　１．２
００±、０１６　０．７４０±、０２６　　８０．３１
２０　　２．３００±、０３０　２．０００±、０２８
　　２６２．９１４４　　　　０゜９１０土、０１８　
　　１．５００±、０１０　　　　３０７．８１６９　
　　　　　　　　　　　　　　１０００、０抗体（ｍｇ
／／） ｍＡ　　　　ｎＢ ２．２ ４．５ １１．５ １００、０ １４９、６ ２３８、６ ４２０、０ 実施例ＩＩＩ この実施例は、両者とも同一の規定された蛋白質を補充
した、本発明の培地中および他の血清不含培地中の細胞
の生長および抗体の生産を比較する。実施例ＩＩにおけ
るように、ＣＲＬ１６０６細胞を、表ＩＩ（時間Ｏ）に
示すように、本発明の培地（培養物１１１Ａ）または商
業的に入手可能な調製物から調製した培地（培養物１１
１Ｂ）を含有するローラーボトル中に接種した。培養物
ＩＩＩＡはタンパク質補充物質Ａを補充した実施例Ｉ　
（ｐＨ７，２）を接種することによって調製した。培養
物ＩＩＩＢは、３部のＤＭＥ培地（ＧＩＢＣＯ／ＢＢＬ
）を１部のＦ１２培地（Ｇ　Ｉ　ＢＣｏ／ＢＢＬ）　、
２５ｍＭのＨＥＰＥＳ　（シグマ・ケミカル・カンパニ
ー）　、０．０２ｍＭのエタノールアミン（シグマ・ケ
ミカル・カンパニー）および３．０ｍＭの重炭酸ナトリ
ウム（シグマ・ケミカル・カンパニー）と混合し、そし
てタンパク質補充物質Ａを補充することによって調製し
た。

両者の調製物のｐＨは、コーニングのブラッド−ガス分
析器に従い３７℃で７．２に到達するまで、水酸化ナト
リウムで調節した。両者の配合物のモル浸透圧濃度は、
ウェスコールの蒸気圧浸透圧計に従ってほぼ２９５ＩＩ
ＩｏｓＩｌｌに調節した。実施例Ｉの手順を反復した。

結果を表■に記載する。

表■ 生存可能細胞（１０’／Ｌ） 時間　　　１［ＩＡ　　　　　　Ｉ［［Ｂｏ　　　　０
．０５０±、００１　０．０４９±、００１２１　　　
０．０９４±、００４　０．０８６±、００４　　　　
９．４４６　　　０．３６０±、００９　０．２９０±
、００６　　　ｊｏ、１７１　　　１．１００±、００
３　０．７００±、０１０　　　７３．６９３　　　２
．０００±、０３２　１．４００±、０１４　　　２０
９．７１１７　　　０．６３０±、０１２　１．１００
±、００４　　　４５２゜３１４０　　　　　　　　　
　０、４４０±、０１９　　　４５７．０１６５　　　
　−−　　　　　　−−　　　　　　７９２．０抗体（
ｍｇ／ｌ） １［［Ａ　　　　　ｌｌｌＢ １２．５ ２１．０ ７２．５ １３２、０ １３６、２ ２３１、０ １６５、０ 実施例ＩＶ この実施例は、本発明の培地に基づく培養において生成
されたモノクローナル抗体の純度と血清補充した培地に
基づく培養において生成されたモノクローナル抗体の純
度とを比較する。

２つのローラーボトルを、培地の１ｍｌ当り２゜１±Ｏ
，ｌＸｌ０’のＣＲＬ　１６０６細胞で接種した。一方
のローラーボトル（培養物ＩＶＡ）はタンパク質補充物
質Ａを補充した実施例Ｉの培地（ｐＨ７、２）を含有し
た。他方のローラーボトル（培養物ＩＶＢ）は１０％の
（Ｖ／Ｖ）の胎児ウシ血清を補充したＤＭＥ培地を含有
した。コンディショニングした培地の試料は、培養の１
日および４日の後に、実施例ＩＩに記載するようにして
調製した。次いで、試料中に含有される蛋白質を、高性
能大きさ排除クロマトグラフィー［ＨＰＳ　Ｅ　Ｃ５Ｚ
ｏｒｂａｘ　（商標）、イー・アイ・テュホン・デ・ニ
モアス・カンパニー（Ｅ、１．　ｄｕＰｏｎｔ　　ｄｅ
　　Ｎｅｍｏｕｒｓ　　Ｃｏ、　　）　、０．　７５Ｘ
２５ｍａ＋のカラム、アイソクラチック（ｉｓｏｃｒａ
ｔｉｃ）　０．　３Ｍの塩化ナトリウム１０．０５Ｍの
リン酸ナトリウム；　ｐＨ７，Ｏ；　０．　２５ｍｌ／
ｍ１ｎｌ　！：ｌ：よッテ検査した。

表■は、高度に精製したＢＳＡ　（ウシ血清アルブミン
）またはＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）の標準に類似する
保持時間で移動する物質の相対量を表わす。２８０ｎｍ
における吸収を測定し、そして積分したピーク面積を決
定した。さらに、培養物ＶＩＢ中で生成されたモノクロ
ーナル抗体は、１０％の胎児ウシ血清補充物によって存
在するウシＩｇＧおよびアルブミン（３，２±０．　３
５ｍｇ／ｍ１の合計ＩｇＧおよびアルブミン）の中に検
出できなかったことが示される。

表■ ピーク面積単位 試料　　　　ＩｇＧ（Ｒｆ＃１６．７）　　　　　ＢＳ
Ａ（Ｒｆ＃１７．７）ＩＶＡ、第１日　　基線　　　　
　　　　　５．７７０（Ｒｆ＝　１７．６３）ＩＶＡ、
第４日１５，６４７（Ｒｆ＝１６．７５）　　　　５，
４７０（Ｒｆ＝１７．９５）ＩＶＡ、第１日　　埋没　
　　　　　　　　６８６．５２８（Ｒｆ＝　１７．６３
）ＩＶＡ、第４日　　埋没　　　　　　　　６４１．５
９２（Ｒｆ＝　１７．９２）２８０ｎｆｆｌにおいて、
ＩｇＧの１　、　０　ｇ／　ｍｌ溶液のＩｇＧの吸収は
１．Ｏｍｇ／ｍ１ＢｓＡの溶液のそれの１．７１５倍で
ある。こうして、表■のデータが示唆するように、培養
物ＩＶＡ、第４日の試料はほぼ１７０μｇ／ｍｌのＩｇ
Ｇを含有し、そしてモノクローナル抗体は６３％の純度
であった：［ＩｇＧ１　　　　　　１．６６８ｘ　［Ｂ
ｓ＾］［ＢＳＡ］＋［ＩｇＧ１　　　　　　　　［ＢＳ
Ａ］＋（１，６６８ｘ［ＢＳＡコ）１、６６８Ｘ　［Ｂ
ａＡ］ （１＋１．６６８）　Ｘ　［ＢＳＡ］ １、６６８ １＋１．６６８ ０．６３　　＝　　６３％ ここで： ＝　　１．６６８　Ｘ　［ＢＳＡ］ さらに、高度に精製したＩｇＧは、試料の大きさ排除の
クロマトグラフィーの工程後においてのみ、得ることが
できるように思われる。より高い産生物の力価およびよ
り大きい産生物の純度の両者をもつ粗製のコンディショ
ニングした培地は、細胞をさらに数日間培養することに
よって容易に得ることができる。この実施例の条件下に
、培養物ＩＶＡ中の細胞は第４日までに１．０００，０
００細胞／ｍｌの密度に到達しただけであり、これは飽
和密度の半分より少ない。

実施例Ｖ この実施例は、凍結保存から細胞を生き返らせるための
、この培地の利用を明らかにする。この実施例は、また
、前もった適合［「ウイーニング（ｍｅａｎｉｎｇ）　
Ｊ　］手順を必要としないで、高い血清濃度の存在下に
前に培養した細胞の増殖を、この培地が支持できること
を立証する。

ＨＢ１２７細胞系（ＳＰ２１０　　Ａｇ１４）の細胞を
ＡＴＣＣから入手した。この細胞系は、常に、血清補充
培地中で生長されてきた。この５Ｐ２１０ネズミハイブ
リド一マ系列は、実施例Ｉ〜ＩＶにおいて使用したＣＲ
Ｌ　　１６０６系統と異なる親融合相手から誘導された
。これらの２つの細胞系は一緒に、工業的に普通に使用
される細胞を生産するモノクローナル抗体の大部分の代
表である。この実施例は、両者が血清補充ＤＭＥ培地よ
り本発明の培地においてよりよく生長することを立証す
る。

細胞を融解し、そして２つの等しい部分に分割した。こ
れらの部分を、３７℃において、タンパク質補充物質Ａ
を補充した実施例Ｉの再構成した培地（ｐＨ７，２）中
で（培養物ＶＡ）、あるいは１０％の血清を補充したＤ
ＭＥ培地中で（培養物ＶＢ）−夜インキユベーションし
た。第２日において、培養の各々における培地を新鮮な
調製物との遠心によって交換した。培養物をインキュベ
ーターに戻した。第５日に、培養の各々における細胞を
計数した。培養物ＶＡにおいて、６８７゜０００細胞／
ｍｌが観測され、これに対して培養物ＶＢにおいて、わ
ずかに２５１．０００細胞／ａ＋１が観測された。した
がって、血清補充培地中で常に生長されてきた、この細
胞系でさえ、中間のウィーニング培養物を必要としない
で、本発明の血清不含培地において有意により良好に生
長した。

実施例ＶＩ この実施例は、低い濃度の血清の存在下における細胞系
の固定依存性（ａｎｃｈｏｒａｇｅ　　ｄｅｐｅｎｄｅ
ｎｔ）細胞系の培養ために、この培地が適することを立
証する。細胞系は２つの異なる種および２つの異なる組
織から検査した。

この実験のため、ＬＬＣ−ＰＫｌ　（ブタ腎臓）細胞（
ＡＴＣＣ番号ＣＬＩＯＩ）およびＣＡＰＥ（ウシ内皮）
細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２０９）をＡＴＣＣから入手
した。細胞系の各々のための細胞接種物は、原培養物を
５．　　Ｑｍｌのトリプシン／ＥＤＴＡ　（エチレンジ
アミン四酢酸）（ＧＩＢＣｏ／ＢＢＬ）の溶液で処理し
、そして単細胞をタンパク質補充物質Ａを補充した実施
例Ｉの再構成した培地中に懸濁することによって調製し
た。

次いで、各細胞系の細胞を、表Ｖに示す濃度で胎児ウシ
血清を補充した再構成した培地を含有する、３回の反復
試験のＴ−２５フラスコに添加した。

フラスコを密閉し、そして３７℃のインキュベーターに
入れた。

培養の５日後に、培地を各フラスコから取り出し、そし
て培養物を上のようなトリプシン／ＥＤＴＡ溶液で処理
した。細胞がフラスコの表面から分離した後、細胞をリ
ン酸塩緩衝化食塩溶液中に再懸濁した。細胞の数をコウ
ルターカウンターの粒子カウンター（コウルター・エレ
クトリクス）で決定した。結果を表Ｖに示す。

表Ｖ 細胞／フラスコ 細胞系　　血清　　　　最初　　第５日ＣＬ−１０１１
％　　　　９．５Ｘ１０’　　１１．４＋、４Ｘ１０’
ＣＣＬ　２０９　　２％　　　１．　ＯＸ　１０’　　
　３．３±、２Ｘ１０’実施例ＶＩＩ 本発明の培地を、アミコン・バイクツアイバー（Ａｍｉ
ｃｏｎ　　Ｖｉｔａｆｉｂｅｒ）　Ｉ　Ｉ−Ｐ３Ｑ　（
商標）［Ｗ、　Ｒ，ブレイス・アンド・カンパニー（Ｇ
ｒａｃｅ　　＆　　Ｃｏ、　）のアミコン・デイビジョ
ン（Ａｍｉｃｏｎ　　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）　］中空繊維
のバイオリアクター　（ＭＷ３０，０００の公称限外濾
過カット−オフ）におけるモノクローナル抗体の生産に
使用した。この系は、中空繊維のカートリッジを連続的
に循環する培地と新鮮な培地との交換を可能とした。培
養した細胞でカートリッジが充填されるにつれて、この
交換の速度を増加した。最終の交換速度（充填したカー
トリッジについて）はほぼ２゜ＯＬ／日であり、そして
８１．ＯＬの培地を全バイオリアクター実験の間に使用
した。

滅菌およびアセンブリングに引続いて、中空繊維のカー
トリッジおよびバイオリアクターの系を、順次に組織培
養等級の水で、そして実施例Ｉの培地（ｐＨ７，２）で
フラッシュした。実施例Ｉの粉末から次の蛋白質補充物
質で記載する再構成手順によって再構成した本発明の培
地とのインキュベーションによって、この系の培地含有
表面を、蛋白質で被覆した：　１．　Ｏｍｇ／ｍｌのＢ
ＳＡ、１゜０μｇ／ｍｌのＴＦおよび５．０μｇ／＋１
のＩＮＳ。

この系の滅菌は、この培地で３日間操作後、培地の透明
度の視的観察によって評価した。

次いで、カートリッジを３Ｘ１０”のＣＲＬ１６０６細
胞で接種した。毎日の試料を採取し、モしてｐＨについ
て測定した。ｐＨが６．８以下に低下する毎に、培地の
供給速度を最大２．ＯＬ／日まで増加した。その速度に
到達したとき、培地をｐＨ７，３５で再構成した同一の
培地に切換えた。

試料を表■に示す細胞空間から採取し、そしてモノクロ
ーナル抗体の産生物（ＭＡＲ）を実施例ＩＶにおけるよ
うにＨＰＳＥＣによって特徴づけかつ定量した。試料の
ほとんどにおいて、ＭＡＲの純度は９５％より大きかっ
た。４９日の操作にわたる、この中空繊維のバイオリア
クターによるＭＡＲの累積生産を表■に示す。

表■ 操作の合計日数　　　　　累積生産（ｇ）７　　　　　
　　　　０、００６ １０　　　　　　　　　０、０２２ １４　　　　　　　　　０、３７０ １８　　　　　　　　　１、４４１ ２１　　　　　　　　　２、２０２ ２４　　　　　　　　　２、５７０ ２８　　　　　　　　　２、８５２ ３６　　　　　　　　　３、４５８ ３９　　　　　　　　　３、８４７ ４４　　　　　　　　　４、２９９ ４８　　　　　　　　　４、６６２ １０．０００および３０．０００のＭＷの限外濾過のカ
ットーオウを有する他の繊維を使用して構成した他の中
空繊維のバイオリアクターを使用して、同様な結果を得
た。

実施例ＶＩＩＩ この実施例は、本発明の培地中で機能する種々の両性イ
オンの緩衝剤の能力を実証する。種々の両性イオンの緩
衝剤を含有する５つの培地を試験した。

この実施例の培地は、実施例Ｉの培地に基づき、そして
１０μｇ／ｍｌのインスリンおよび１０μｇ　／　ｍ　
Ｉ！のトランスフェリンを補充する。二重反復試験の２
００ｍ１のローラーびんに、試験した各培地について培
地１ｍｆ当たり２Ｘ１０’のＣＲＬ　　１６０６細胞で
接種した。第１培地は、２０ミリモルのＨＥＰＥＳを含
有する、実施例Ｉの培地であった。他方の培地は両性イ
オンの緩衝剤の条件に基づいて異なる。培地２〜５は、
それぞれ、２５ミリモルのＭＯＰＳｏ、２５ミリモルの
ＢＥＳＳ１２．５ミリモルのＨＥＰＥＳおよび１２．５
ミリモルのＭＯＰＳＯおよび１２．５ミリモルのＢＥＳ
を含有する。

細胞は第３〜６日に計数した。細胞の増殖はすべての条
件において観測した；生存能力をもつ細胞の数を表ＶＩ
Ｉに示す。第７日の培養物からの抗体の力価を、ＨＰＳ
ＥＣにより決定し、そして表ＶＩＩに示す。

表ＶＩＩ 生存能力をもつ細胞（ＸＩＯ’） 日： 緩衝剤　　　　　　　　　　　３４ ２５　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　　　　　　　　　３４　９１
２５　ｍＭ　ＭＯＰＳＯ２５７６ ２５ｍＭ　ＢＥＳ　　　　　　　　　　２６　８１１２
．５　ｍＭ　ＩＩＩＥＰＥＳ；１２．５ｍＭ　ＭＯＰＳ
ｏ　　２７　８ｇ１２、５　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ；１２．
５ｍＭ　ＢＥＳ　　　４１　１２５５　６８ｇ７ｍ１ １８０　２４０　２０４．５ １８０　２２０　１６２．０ １８０　２４０　１５４．５ １８５　２２５　１９６．５ ２１０　２４５　２２６．５ 抗体 これらの結果が示すように、種々の両性イオンの緩衝剤
を等しい有効量で使用することができる。

実施例ＩＸ この実施例は、本発明の培地の種々の両性イオンの緩衝
剤を使用して、高い密度の中空繊維のバイオリアクター
において、細胞のその場のウィーニング、増殖、および
抗体の産生を促進することを実証する。

バイクツアイバー（Ｖｉｔａｆ　１ｂｅｒ）ＶＦ３７０
０バイオリアクター（Ｗ、Ｒ，ブレイス・アンド・カン
バ＝−［Ｗ、Ｒ，Ｇｒａｃｅ　　＆Ｃｏ、−Ｃｏｎｎ、
］のアミコン・デイビジョン（Ａｍｉｃｏｎ　　　Ｄｉ
ｖｉｓｉｏｎコ　）をＨＢ５５細胞とともにインキュベ
ーションした。ＨＢ５５細胞は、アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクションから入手したハイブリドーマ
系列である。ＨＢ　　５５細胞は２％以下のＦＢＳ　（
胎児ウシ血清）にローラーびん中でウィーニングするこ
とができなかった。１０ｇ細胞を余分の毛管空間中に８
００ｍ１のコンディショニングした培地で送り込み、そ
して直ちに２つの重ねたパック（培地を充填した１０７
’の血液バッグ）に取り付けた。

底の重ねたパックは、１％のＦＢＳを補充した実施例Ｖ
ＩＩＩの培地を含有するＨＥＰＥＳを含有１、か・ト部
の雷わｔ−パ０．りは面漕本会主ない同一培地を含有し
た。いったん両者のバッグが消費されると、血清不合培
地のみを取り付けた。細胞はこの手順により首尾よくウ
ィーニングされ、そして第１３日まで抗体を最大に産生
じ続けた。第１４日と第１５日に行った測定の間で、供
給ポンプは１２〜１８時間停止した（原因はわからない
）。

細胞の集団は多少の損傷を受けたが、次の数日間にわた
って回収された。

その８２日の作動の間に、バイオリアクターは、２３０
〜３００ｍｇ／日（ＲＩＤによる、またはＨＰＳＥＣに
より２８０〜３４０ｍｇ／日）のかなりの一定速度で、
１７ｇ（ＲＩＤ分析による、またはＨＰＳＥＣにより２
０ｇをかなり越える）の抗体を産生じた。実施例ＶＩＩ
Ｉに記載する培地は表ＶＩＩＩに記載されているように
取り付け、そして培地の供給速度はこの時間の間ちょう
ど３１／日に一定に保持した。各培地によりＲＩＤまた
はＨＰＳＥＣにより測定した、産生された抗体の量を、
また、表ＶＩＩ１．に記載する。

表ＶＩ　Ｉ　Ｉ 日数　　　　緩衝剤系　　　　　　　抗体（ｍｇ／日）
ＲＩＤ　　　ＨＰＳＥＣ １９−２３２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　　　　　　　　　２
３２．５　　３０４．４２４−３３　２５　ｍＭ　ＢＥ
Ｓ　　　　　　　　　　２６２．５　　２８６．３３４
−４３　１２．５　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１２．５　ｍＭ
　ＢＥＳ　　３０６．９　　３４９．１４４−５３　２
５　ｍＭ　ＭＯＰＳＯ２６３，３３１５，０５４−６２
１２，５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、　１２．５　ｍＭ　ＭＯＰ
ＳＯ２５６，７２９７，７６３−８２２５ｍＭ　ＨＥＰ
ＥＳ　　　　　　　　　２４６．４　　２９８．４試み
られたものの最良の性能の緩衝剤系は、１２゜５ミリモ
ルのＨＥＰＥＳ／１２．５ミリモルのＢＥＳであった。

しかしながら、緩衝剤系の間の差は小さい。興味あるこ
とには、この結果は実施例ＶＩＩＩの結果と一致し、実
施例Ｖｌｌｌにおいて、ＣＲＬ　　１６０６細胞をロー
ラーびん中で増殖させ、そして最大の抗体の産生を１２
．５ミリモルのＨＥＰＥＳ／１２．５ミリモルのＢＥＳ
で緩衝化した培地において観測した。

実施例Ｘ この実施例は、規定されたタンパク質の補充物質として
トランスフェリンを置換する無機鉄化合物の能力を実証
する。

ＣＲＬ　　１６０６細胞を、試験培地を含有する２００
ｍ１のローラーびん中に第０日に接種し、そして３７℃
において１．５ｒｐｍでインキュベーションした。基礎
培地Ａ　（ＢＭＡ）は、５０μｇ／ｍｌの血清アルブミ
ンおよび５μｇ／ｍｌのインスリンを補充した、実施例
Ｉの非補充培地であった。基礎培地Ｂ　（ＢＭＢ）は、
ＢＭＡ＋５Ｑミリモルのモノチオグリセロールであった
。基礎培地（ＢＭＣ）は、ＢＭＡ十鉄キレート剤ＤＦＯ
であった。試験培地は５μｇ／ｍｌのトランスフェリン
（ＴＦ）　、５０μモルの硫酸第二鉄（Ｆｅｗ（ＳＯ４
）ｓ）　、５０μモルの硫酸第一鉄（ＦｅＳＯ４）、マ
たは５０μモルのクエン酸第二鉄（Ｆｅｃ６Ｈ５０ｔ）
のいずれかを補充した、異なる基礎培地であった。これ
らの実験の結果を表ＩＸに示す。

表ＩＸ ＢＭＢ　＋　ＴＦ ＢＭＢ　＋　Ｆｅｚ（ＳＯ４）ｓ １３　３１　５８　７２ １９５９　１００１２０ ０　４８　８２ ２９　７４　９０ 聞＾＋ＴＦ　　　　　　２　１７　５５１１０μＭＡ　
＋　Ｆｅ２（ＳＯ４）ｓ　　２　２０　６６１２２μＭ
Ａ＋Ｆｅ５Ｏｉ　　　　２　２　２　２μＭＣ２ μＭＣ＋　ＴＦ　　　　　　　　　　　　１７３２５５
２６２２６７　４８ＢＭＣ＋　ＦｅＣｅＨｓＯｙ　　　
　　　　　８０１７１２２８２５４　３２ＢＩＣ＋　Ｆ
ｅｗ（ＳＯ４）ｓ　　　　　　　　１２６２１３２４７
２２６表ＩＸの結果が示すように、硫酸第二鉄およびク
エン第二鉄の両者は鉄源としてトランスフェリンの代替
物であることができる。

本発明の原理、好ましい実施態様および操作のモードを
以上に説明した。しかしながら、ここに０２２ ６２３１ ８２２７ おいて保護されることを意図する本発明は、開示した特
定の形態は限定でなく説明を目的とすると見なすべきで
あるので、限定的に解釈すべきでない。種々の変更およ
び変化は本発明の精神を逸脱しないで可能である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記表１ ￥炭水化物および誘導体￥ ▲数式、化学式、表等があります▼ ￥バルクイオンおよび微量元素￥ ▲数式、化学式、表等があります▼ ￥アミノ酸￥ ▲数式、化学式、表等があります▼ ￥核酸誘導体￥ ▲数式、化学式、表等があります▼ ￥脂質および誘導体￥ ▲数式、化学式、表等があります▼ ￥緩衝剤￥ ▲数式、化学式、表等があります▼ ＊双生イオン緩衝剤は一種でも又は一種以上の適当な双
   生イオン緩衝剤の組合わせでもあることができる。従つ
   て分子量及びｍｇ／ｌは使用された特定の緩衝剤に依存
   する。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ￥アミノ酸誘導体￥ ▲数式、化学式、表等があります▼ ￥水溶性ビタミンおよび補酵素￥ ▲数式、化学式、表等があります▼ 記載する成分のすべてからなる、生体外での哺乳動物細
   胞培養のための基礎栄養培地。 ２、前記成分が表１に記載する量で存在する特許請求の
   範囲第１項記載の栄養培地。 ３、前記成分が表１に記載する量の約５０〜約２００％
   の量で存在する特許請求の範囲第１項記載の栄養培地。 ４、両性イオン緩衝剤は、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、Ｂ
   ＥＳ、ＴＡＰＳＯまたはそれらの任意の組み合わせであ
   る特許請求の範囲第１項記載の栄養培地。 ５、無機鉄源、または規定されたタンパク質、または両
   者が補充されている特許請求の範囲第１項記載の栄養培
   地。 ６、無機鉄源が硫酸第二鉄、クエン酸第二鉄、フマル酸
   第一鉄または硫酸アンモニウム第一鉄である特許請求の
   範囲第５項記載の栄養培地。 ７、前記規定されたタンパク質がアルブミン、インスリ
   ンおよび鉄飽和トランスフェリンからなる特許請求の範
   囲第５項記載の栄養培地。 ８、下記表１ ￥炭水化物および誘導体￥ ▲数式、化学式、表等があります▼ ￥バルクイオンおよび微量元素￥ ▲数式、化学式、表等があります▼ ￥アミノ酸￥ ▲数式、化学式、表等があります▼ ￥核酸誘導体￥ ▲数式、化学式、表等があります▼ ￥脂質および誘導体￥ ▲数式、化学式、表等があります▼ ￥緩衝剤￥ ＊双生イオン緩衝剤は一種でも又は一種以上の適当な双
   生イオン緩衝剤の組合わせでもあることができる。従つ
   て分子量及びｍｇ／ｌは使用された特定の緩衝剤に依存
   する。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ￥アミノ酸誘導体￥ ▲数式、化学式、表等があります▼ ￥水溶性ビタミンおよび補酵素￥ ▲数式、化学式、表等があります▼ に記載する２〜６２種類の成分からなる、生体外での哺
   乳動物細胞培養のための基礎栄養培地。 ９、約２８５〜約３１５ミリ浸透モルの浸透圧濃度を有
   する特許請求の範囲第１項記載の栄養培地。 １０、約２９５〜約３０５ミリ浸透モルの浸透圧濃度を
   有する特許請求の範囲第９項記載の栄養培地。 １１、約７．０〜約８．０のｐＨ（３７℃）を有する特
   許請求の範囲第１項記載の栄養培地。 １２、約７．２のｐＨを有する特許請求の範囲第１１項
   記載の栄養培地。 １３、約７．３５〜約７．８のｐＨを有する特許請求の
   範囲第１１項記載の栄養培地。 １４、約２５〜約３５のナトリウム対カリウム比を有す
   る特許請求の範囲第１項記載の栄養培地。 １５、前記比は約３０である特許請求の範囲第１４項記
   載の栄養培地。 １６、血清または他の生物学的抽出物が補充されている
   特許請求の範囲第１項記載の栄養培地。 １７、前記血清または抽出物が培地の約１容量％までと
   して存在する特許請求の範囲第１６項記載の栄養培地。 １８、空気平衡化されている緩衝液系からなる特許請求
   の範囲第１項記載の培地。 １９、下記表１ ￥炭水化物および誘導体￥ ▲数式、化学式、表等があります▼ ￥バルクイオンおよび微量元素￥ ▲数式、化学式、表等があります▼ ￥アミノ酸￥ ▲数式、化学式、表等があります▼ ￥核酸誘導体￥ ▲数式、化学式、表等があります▼ ￥脂質および誘導体￥ ▲数式、化学式、表等があります▼ ￥緩衝剤￥ ▲数式、化学式、表等があります▼ ＊双生イオン緩衝剤は一種でも又は一種以上の適当な双
   生イオン緩衝剤の組合わせでもあることができる。従つ
   て分子量及びｍｇ／ｌは使用された特定の緩衝剤に依存
   する。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ￥アミノ酸誘導体￥ ▲数式、化学式、表等があります▼ ￥水溶性ビタミンおよび補酵素￥ ▲数式、化学式、表等があります▼ に記載する最初の６０種類の成分のすべてからなる乾燥
   基礎栄養培地調製物。 ２１、前記成分の各々が表１に記載する量の約５０〜約
   ２００％の量で存在する特許請求の範囲第１９項記載の
   乾燥栄養培地調製物。 ２２、上記第１９項記載の乾燥調製物に表１の残りの２
   成分を添加することによって配合された再構成された基
   礎栄養培地。 ２３、約２８５〜約３１５ミリ浸透モルの浸透圧濃度お
   よび約７．０〜約８．０のｐＨを有する特許請求の範囲
   第２３項記載の再構成された培地。 ２４、下記表１ ￥炭水化物および誘導体￥ ▲数式、化学式、表等があります▼ ￥バルクイオンおよび微量元素￥ ▲数式、化学式、表等があります▼ ￥アミノ酸￥ ▲数式、化学式、表等があります▼ ￥核酸誘導体￥ ▲数式、化学式、表等があります▼ ￥脂質および誘導体￥ ▲数式、化学式、表等があります▼ ￥緩衝剤￥ ＊双生イオン緩衝剤は一種でも又は一種以上の適当な双
   生イオン緩衝剤の組合わせでもあることができる。従つ
   て分子量及びｍｇ／ｌは使用された特定の緩衝剤に依存
   する。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ￥アミノ酸誘導体￥ ▲数式、化学式、表等があります▼ ￥水溶性ビタミンおよび補酵素￥ ▲数式、化学式、表等があります▼ に記載する２〜６２種類の成分からなる乾燥基礎栄養培
   地。 ２５、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ラク
   トースまたはスクロースが補充されている特許請求の範
   囲第２４項記載の培地。