JPH03180184A - リボ核酸（ｒｎａ）の合成方法 - Google Patents

リボ核酸（ｒｎａ）の合成方法

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JPH03180184A JP2121066A JP12106690A JPH03180184A JP H03180184 A JPH03180184 A JP H03180184A JP 2121066 A JP2121066 A JP 2121066A JP 12106690 A JP12106690 A JP 12106690A JP H03180184 A JPH03180184 A JP H03180184A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、特定の核酸配列（ターゲット配列〉を含むデ
オキシリボ核酸（ＤＮＡ）からＲＮＡを合成する方法に
係わる。
分子生物学では核酸配列の特定フラグメントの単離及び
／又は検出に関する研究が盛んに行われている。基本的
問題の１つは、核酸を単離した後で核酸配列の特定フラ
グメントの量及び／又は存在を調べることにあるつこの
問題は簡単には解決できない。なぜなら、生物学的材料
、例えば細胞培養物及び／又は組織培養物並びに尿及び
血液のような体液はしばしば核酸複合体を含み、検出す
ベき配列を含むのはこの複合体の極めて小さいフラクシ
ョンにすぎないからである。米国特許第４．６８３，２
０２号でＣｅｔｕｓはこの問題を解決すべく、いわゆる
ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃ
ｔｉｏｎ）法でターゲット配列を複製する方法を開示し
ている。この方法はターゲット配列のフラグメントをｆ
ｇ識するプライマーを少なくとも２つ使用するものであ
り、ターゲット配列を複数のサイクルで加速度的に複製
せしめる。この方法を使用するとターゲット配列が３時
間の間に２０サイクルで約１０５倍に複製され、その結
果ターゲット配列の検出が可能になる。
ごく最近になって、５ＩＳＫＡ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ
ｓはＷＯ８８／１０３１５で二重鎖ＤＮＡフラグメント
がら出発するＲＮＡ製造方法を開示した。
この５ＩＳＫ＾特許出願の方法でも前出のＣｅＬｕ５の
方法と同様に、ＤＮＡが存在する被検液がち前記二重Ｉ
ＤＮＡＤＮＡフラグメントために２つのプライマーを使
用する。　５ＩＳＫへの発明では、一方のプライマーに
例えばバクテリオファージＴ７プロモーターのプロモー
ター配列を与える。その結果、Ｔ７−ＲＮＡポリメラー
ゼを用いてＲＮＡを転写できるようになる。
この方法はＣｅｔｕｓの方法と同様の欠点、即ちターゲ
ット配列を複製するのに必ず２つのプロモーターを使用
しなければならないという欠点を有する。
本発明は、ターゲット配列を有するデオキシリボ核酸（
ＤＮＡ〉からＲＮＡを合成する新規の方法を提供する。
本発明の方法では、前記ＤＮＡを１つ又は複数の制限酵
素で処理し、得られたＤＮＡフラグメントを分離ステッ
プによって一重鎖にしその後ターゲット配列の部分に対
応するヌクレオチド配列に結合したプロモーター配列を
含む１つの核酸プライマーを、適当な条件下で、対応す
る一重鎖ＤＮＡにハイブリダイズし、次いでハイブリッ
ド形態で得られた２つの核酸配列をＤＮＡポリメラーゼ
により自由３°末端から伸長させて二重［０８＾とし、
これをＲＮＡポリメラーゼのマトリックスとして使用し
てＲＮＡを合成する。
この新規の合成方法の大きな利点は、１つ以上の制限酵
素の使用によって、プロモーター配列を備えた核酸プラ
イマーを１つ用いるだけで二重鎖ＤＮＡを形式できるよ
うになったという点にある。
あとは、ＲＮＡポリメラーゼによって前記二重ｇＤＮＡ
からＲＮＡを転写すればよい０本発明の方法では更に、
前記二重ｊｌｌＤＮＡを得るのに分離ステップを一度し
か必要としない。
この新規の方法を使用すれば、ターゲット配列に対応す
る一重鎖ＲＮ＾フラグメントが多数得られる。出発時の
ターゲット配列より多いこれらのＲＮＡフラグメントは
、特定の方法で迅速且つ簡単に検出することができる。
これらの方法の１つは、合成ＲＮ＾を変性条件でゲル電
気泳動にかけ次いでブロッティングすることによって検
出しそのｔ灸特定の標識したオリゴヌクレオチド配列（
プローブ）とハイブリダイズさせることからなる。適当
な標識物質は標識用の放射性物質、例えば’１１゜３２
ｐ又は２％５である。酵素反応の影響下で変換し得、そ
の結果検出が可能になるような物質も標識物質として使
用し得る０例えば、アビジン／ビオチン複合体は標識物
質として極めて適している。
本発明は、−重鎖ＤＮＡ又は二重鎖ＤＮＡからＲＮＡフ
ラグメントを合成するためのテストキットにも係わる。
このテストキットは、１つ又は複数の制限酵素並びにプ
ロモーター配列を備えた１つの核酸プライマー、ＤＮＡ
ポリメラーゼ及びＲＮＡポリメラーゼを含む。
以下に、ターゲット配列を有するＤＮＡからＲＮＡフラ
グメントを合成する方法を詳細に説明する。
「ターゲット配列を有するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）
から（合成する〉」という表現は、本発明の方法が二重
鎖ＤＮＡ又は−重鎖ＤＮＡを用いて開始されることを意
味する。
「ターゲット配列」という用語は、しばしばゲノムと呼
ばれる総ＤＮＡ中に存在する検出すべき一配列を意味す
る。この種のターゲット配列は、例えばウィルスのコー
ティングタンパク質の一部分をなす特定のタンパク質を
コードすることができる。
本発明の方法を二重ＭＤＮＡから始める場合には、１種
類以上の制限酵素を用いてゲノムからターゲット配列を
取出すことができる。そのためには、所定の重複末端（
付着端〉又は端がそろったプラント末端のいずれかを発
生させる制限酵素を使用し得る。好ましくはＤＮＡの４
又は６ヌクレオチド配列を認識する制限酵素を用いる。
本発明の方法を一重ＭＤＮＡがら始める場合には、クラ
スＩＩ制限酵素に属するエンドヌクレアーゼ、例えばＦ
ｏｋ　Ｉ酵素を極めて有効に使用し得る。この酵素の作
用及び特性はＰｏｄｈａｊｓｋａ及び５ｚｙｂａｌｓｋ
ｉの論文（Ｇｅｎｅ、４０（１９８５）　、１７５−１
８２）に詳述されている。このタイプの酵素を使用すれ
ば、−重鎮ＤＮＡからターゲット配列を取出すことがで
きる。
二重鎖ＤＮＡからなるターゲット配列の２つの鎖はその
部分離しなければならない。この種の分離は、温度の上
昇、酵素反応の使用、例えばヘリカーゼもしくはトポイ
ソメラーゼの使用、又はアルカリ液（ｌｙｅ）での処理
のような化学反応によって通常の手法で実施できる。
その後、「ターゲット配列の部分に対応するヌクレオチ
ド配列に結合したプロモーター配列を含む核酸プライマ
ー」を、制限酵素によって発生した自由３′末端を有す
るターゲット配列を含む先に形成した一重鎖ＤＮＡ分子
に適当な条件下でハイブリダイズさせる。
核酸プライマーという用語は、ターゲット配列に対して
十分な相同性（ｈｏ請ｏ１ｏｇｙ）を有する核酸配列（
有機化学合成又は組換えＤＮＡ法によって作られる）を
意味し、従って適当な条件下でこの核酸プライマーをタ
ーゲット配列にハイブリダイズすることができる。プラ
イマーはしばしば少なくとも１０ヌクレオチドの長さを
有し、好ましくは約３５ヌクレオチドの長さを有する。
「プロモーター配列」は、ＲＮ＾ポリメラーゼによって
特異的に認識される核酸配列である（有機化学合成又は
組換えＤＮＡ法によって作られる）。前記ＲＮ＾ポリメ
ラーゼは認識配列に結合して転写プロセスを開始しその
結果ＲＮ＾フラグメントが形成される。原則として、入
手できるＲＮ＾ポリメラーゼによって認識されるもので
あればいずれのプロモーター配列を使用してもよい。適
当なプロモーターは、特定のバクテリオファージポリメ
ラーゼ、例えばバクテリオファージＴ３、Ｔ７又はＳＦ
３によって認識されるプロモーターである。Ｔ７及び５
Ｐ６ＲＮ＾ポリメラーゼが好ましい。
「プロモーター配列がターゲット配列の部分に対応する
ヌクレオチド配列に結合している」というのは、そのプ
ロモーター配列がターゲット配列の少なくとも一部分に
よって認識されるヌクレオチド配列に１つ又は複数のヌ
クレオチドを介して公知の態様で直接的に又は間接的に
結合しているという意味である。前記認識は、適当な条
件下でヌクレオチド配列とターゲット配列との間に十分
な相同性が存在すれば実施される。
適当な条件で核酸プライマーのハイブリダイゼーション
を行った後は、ハイブリッド形態で得られた２つの核酸
配列をＤＮＡポリメラーゼによって自由３°末端から伸
長させ、二重鎖ＤＮＡフラグメントを得る。
そのために使用し得る適当なりＮＡポリメラーゼは大腸
菌（Ｅ、ｃｏｌ　１）ＤＮＡポリメラーゼエ、大腸菌Ｄ
ＮＡポリメラーゼ■のにｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔ４
　ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＭＹ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆
転写酵素等である。
形成された二重鎖ＤＮＡから適当なＲＮ＾ポリメラーゼ
によって合成されるＲＮＡは、存在するＲＮ＾ポリメラ
ーゼの量に多少とも継続的に依存しながら合成される。
合成されたＲＮＡは本発明に従い前記した方法の１つに
よって検出することができる。複数のＲＮ＾分子を検出
したい場合には、既に合成したＲＮ八を公知の増殖法に
よって増やすことができる。
この種の増殖法としては例えば５ＩＳＫＡ　Ｄｉａｇｎ
ｏｓｔｉｅｓの特許出願明細書（Ｗｏ　８８／１０３１
５）に記載のものが挙げられる。
本発明がより良く理解されるように、以下に非限定的実
施例を挙げる。
え販ｌ 標準的方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｃ５Ｈ）、即ちプロテ
イナーゼにで消化し、フェノール／クロロホルムで抽出
し、次いでアルコール沈澱にかける方法を用いて、ＣＭ
Ｖ　（サイトメガロウィルス）感染の疑いのある被験者
の白血球１０８個からＤＮＡを単離する。
ＤＮＡをＥｃｏＲＶ消化バッファ　（１０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ（ｐＨ７，５）、７ｍＭ　ＭｇＣｌ□、７ｎ＋Ｍ　２
−メルカプトエタノール、１００ｆ１００ｆｉ！、ｌ０
０１Ｊ８／＋１１１ウシ血清アルブミン）中にｔｕｇ／
ｕｌの濃度で溶解し、ＤＮＡ１μｇ当たり３単位のＥｃ
ｏＲＶ制限酵素を加え、３７℃で２時間消化処理する。
ＥｃｏＲＶ制限酵素はＣＭＶ−ＤＮＡの配列、例えばヌ
クレオチド番号２０６９”−２０７４（Ｖｉｒｕｓ　Ｒ
ｅ５ｅｒａｃｈ、２．１９８５，１０７−１２１の＾ｋ
ｒｉＢの論文参照）を認識し、プラント末端フラグメン
トを発生させる。
次いで、ＤＮＡ含有試料を（沸騰水浴又はヒートブロッ
クにより）９５℃で１０分間加熱してＤＮＡを変性させ
る。この試料をドライアイスで急冷する。５５個のヌク
レオチドからなるプライマー（式■参照）を２μｇ加え
、プライマーのアニーリングを６５℃で１分間行い、更
に４２℃で１分間実施する。２００ＩＩＮのｄへＴＰ、
２００、ＭのｄＴＴＰ、２００．ＭのｄＧＴＰ、２００
ｕＭのｄＣＴＰ、１ｍＭの＾ＴＰ、１ｍＭのＣＴＰ、１
ｍＭのＣＴＰ及び１ｍＭのＵＴＰの存在下で２０単位の
トリ骨髄芽球症ウィルス逆転写酵素を加え、得られた混
合物を４２℃で１５分間インキュベートする。Ｐｒｏｍ
ｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ社のＲＮａｓｉｎ’をリボヌクレ
アーゼ阻害剤として１単位／＋１の濃度で加える（１単
位は５μｇのＲＮａｓｅ−＾の活性を阻害するのに必要
な阻害剤量の５０％に相当する）。Ｔ７　ＲＮ＾ポリメ
ラーゼを加え、この混合物を３７℃で２５分間インキュ
ベートする。
転写体を検出するためには、試料を７．４％（ｖｏｌ／
ｖｏｌ）ホルムアルデヒド／１０ｘＳＳＣ中で５５℃で
２０分間変性処理する。この試料を氷上で冷却した後、
スロットプロット装Ｗ（Ｂｉｏ　Ｒａｄ）を用いてニト
ロセルロース膜上に固定する。
そのフィルターを０．５％ウシ血清アルブミン１０．５
％ポリビニルピロリドン／　５　ｘ　５ＳＰＥ／　１％
ＳＤＳ中５５℃で１０分間にわたり予めハイブリダイズ
し、次いで同一バッファ中で″２Ｐ標識オリゴヌクレオ
チドプローブ５’−ＧＡＴ　ＧＧＣＣＣＣにＴＡ　ＣＡ
Ｔ　ＧＧＴ　ＣＡＴ　ＣＡＴ＾Ｃ＾＾ＧＣ−３°（２−
５ｘ　１０’　ｃｐｍ／ｎ＋ｌ）とハイブリダイズさせ
る。前記プローブは正確な極性でヌクレオチド番号２１
５５から２１２６の間に位置する配列である。
フィルターを５５℃で１時間ハイブリダイズし、次いで
室温で１　ｘ　５ＳＰＥ／　１％ＳＤＳにより３ｘ５分
間洗浄し、更に５５℃で２分間洗浄する。いわゆる「増
感スクリーン」を用いて一７０℃で１６時間オートラジ
オグラフィーを行う。
オートラジオグラムから、本発明の方法を用いるとＤＮ
ＡマトリックスからＣＭＶ−ＲＮ＾転写体を合成できる
ことが！認される。
７７　ＲＮ八八リメラーゼ結合部位と転写開始部位と検
出すべきＣＭＶターゲット配列の部分に対応する配列（
３０−ｍａｒ）とを含む５５個のヌクレオチドからなる
プライマー ５°−＾＾Ｔ　　ＴＴ＾　ＡＴＡ　　ＣＧＡ　　ＣＴＣ
八ＣＴ　　ＡＴＡ　　ＧＧＣ八　＾ＴＣＣＴＣＡＣＴ　
　ＡＣＡ　　ＴＧＴ　　ＧＴＧ　　Ｇ八人　ＡＣＡ　＾
ＴＧ　　ＴＧ＾−３″。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）ターゲット配列を有するデオキシリボ核酸（ＤＮ
    Ａ）からリボ核酸（ＲＮＡ）を合成する方法であって前
    記ＤＮＡを１種類以上の制限酵素で処理し、得られたＤ
    ＮＡフラグメントを分離して一重鎖ＤＮＡを形成しその
    後ターゲット配列の部分に対応するヌクレオチド配列に
    結合したプロモーター配列を含む１つの核酸プライマー
    を、適当な条件下で、対応する一重鎖ＤＮＡにハイブリ
    ダイズし、次いでハイブリッド形態で得られた２つの核
    酸配列をＤＮＡポリメラーゼにより自由３′末端から伸
    長させて二重鎖ＤＮＡを形成し、これをＲＮＡポリメラ
    ーゼのマトリックスとして使用してＲＮＡを合成するこ
    とからなる合成方法。
  2. （２）合成したＲＮＡを変性条件下でゲル電気泳動にか
    け、次いでブロッティングすることによって検出し、そ
    の後特定の標識したオリゴヌクレオチド配列とハイブリ
    ダイズさせることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. （３）請求項１に記載のＲＮＡ合成を行うためのテスト
    キット。
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