JPH03180190A - Ｎ‐アセチルノイラミン酸の酵素的製造方法 - Google Patents
Ｎ‐アセチルノイラミン酸の酵素的製造方法Info
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- JPH03180190A JPH03180190A JP2293791A JP29379190A JPH03180190A JP H03180190 A JPH03180190 A JP H03180190A JP 2293791 A JP2293791 A JP 2293791A JP 29379190 A JP29379190 A JP 29379190A JP H03180190 A JPH03180190 A JP H03180190A
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- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野］
本発明は、（ａ） Ｎ−アシルグルコサミン−２−エピ
メラーゼ（Ｅ、Ｃ，５，１，３，８）の存在下にＮ−ア
セチルグルコサミンをＮ−アセチルマンノサミンに異性
化し、次いで（ｂ）Ｎ−アセチルマンノサミンをＮ−ア
セチルノイラミン酸−ピルバート−リアーゼ（Ｅ、Ｃ，
４，１，３゜３）の存在下にピルビン酸を用いてＮ−ア
セチルノイラミン酸に転換することによるＮ−アセチル
ノイラミン酸の製造方法に関する。
メラーゼ（Ｅ、Ｃ，５，１，３，８）の存在下にＮ−ア
セチルグルコサミンをＮ−アセチルマンノサミンに異性
化し、次いで（ｂ）Ｎ−アセチルマンノサミンをＮ−ア
セチルノイラミン酸−ピルバート−リアーゼ（Ｅ、Ｃ，
４，１，３゜３）の存在下にピルビン酸を用いてＮ−ア
セチルノイラミン酸に転換することによるＮ−アセチル
ノイラミン酸の製造方法に関する。
〔従来の技術および発明が解決しようとする課題〕Ｎ−
アセチルノイラミン酸（以下Ｎｅｕ５Ａｃと略す）はシ
アル酸類の重要な代表物質である。シアル酸は、例えば
細胞表面にありそして細胞の分化、成熟および細胞内相
互作用の際に重要な作用を行う、糖脂類および糖タンパ
ク質のような糖接合体のグリコシド末端を占める。末端
にシアル酸を有する短鎖のオリゴ糖、特にＮｅｕ５＾Ｃ
の合或はますます重要になってきている。同様に癌疾病
のＮｅｕ５Ａｃ−誘導体による治療に関して報告されて
いる（Ｓ、５ａｂｅｓａｎ ら、 Ｊ、 Ａｍ、 Ｃｈ
ｅｍ、 Ｓｏｃ、 １０８ （１９８６）、 ２０６８
−２０８０； Ｒ，５ｃｈａｕｅｒ、 Ｒ，Ａｄｖ、
Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、 Ｃｈｅｍ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、
４０． （１９８２）、 １３２−２３４を参照のこと
）。
アセチルノイラミン酸（以下Ｎｅｕ５Ａｃと略す）はシ
アル酸類の重要な代表物質である。シアル酸は、例えば
細胞表面にありそして細胞の分化、成熟および細胞内相
互作用の際に重要な作用を行う、糖脂類および糖タンパ
ク質のような糖接合体のグリコシド末端を占める。末端
にシアル酸を有する短鎖のオリゴ糖、特にＮｅｕ５＾Ｃ
の合或はますます重要になってきている。同様に癌疾病
のＮｅｕ５Ａｃ−誘導体による治療に関して報告されて
いる（Ｓ、５ａｂｅｓａｎ ら、 Ｊ、 Ａｍ、 Ｃｈ
ｅｍ、 Ｓｏｃ、 １０８ （１９８６）、 ２０６８
−２０８０； Ｒ，５ｃｈａｕｅｒ、 Ｒ，Ａｄｖ、
Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、 Ｃｈｅｍ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、
４０． （１９８２）、 １３２−２３４を参照のこと
）。
Ｎｅｕ５Ａｃは従来天然源から単離されていた（Ｋｕｈ
ｍｉＩｃｈ、 Ｓｃｈｗａｌｂｅｎｎｅｓｔｅｒ；上記
５ｈａｕｅｒを参照のこと）。この源はしかしながらそ
の入手可能性が限定されておりそしてその精製は、その
中に存在する多数のシア・リン酸によって困難でありか
つ時間がかかる。
ｍｉＩｃｈ、 Ｓｃｈｗａｌｂｅｎｎｅｓｔｅｒ；上記
５ｈａｕｅｒを参照のこと）。この源はしかしながらそ
の入手可能性が限定されておりそしてその精製は、その
中に存在する多数のシア・リン酸によって困難でありか
つ時間がかかる。
Ｎ−アセチルマンノサミンおよびピルビン酸（以下Ｍａ
ｎＮＡｃおよびＰｙｒと略す）からＮｅｕ５Ａｃを酵素
的に合成することは既に６０年以来知られている（Ｃｏ
ｍｂら、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ２３５ （
１９６０）、 ２５２９−２５３７）。
ｎＮＡｃおよびＰｙｒと略す）からＮｅｕ５Ａｃを酵素
的に合成することは既に６０年以来知られている（Ｃｏ
ｍｂら、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ２３５ （
１９６０）、 ２５２９−２５３７）。
使用された酵素はＮ−アセチルノイラミン酸−ピルバー
ド−リアーゼ（Ｅ、Ｃ，４，１，３，３，） （以下リ
アーゼと略す）である。その際次の反応が起こる：’Ｃ
ＯＯ１１ ＨＯ ２Ｃ二〇 ）１−Ｃ−Ｈ −Ｃ−ＯＨ −Ｃ−ＯＨ ＣＨ，０Ｈ ＣＩ。
ド−リアーゼ（Ｅ、Ｃ，４，１，３，３，） （以下リ
アーゼと略す）である。その際次の反応が起こる：’Ｃ
ＯＯ１１ ＨＯ ２Ｃ二〇 ）１−Ｃ−Ｈ −Ｃ−ＯＨ −Ｃ−ＯＨ ＣＨ，０Ｈ ＣＩ。
−Ｃ−ＯＨ
ＨｚＯＨ
−
アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）より新しい論文
において（Ｍ、−Ｊ、 Ｋｉｍら、 Ｊ、 Ａｍ。
において（Ｍ、−Ｊ、 Ｋｉｍら、 Ｊ、 Ａｍ。
Ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ、 １１０． （１９８Ｂ） ６４
８１−６４８６並びにＣ０Ａｕｇ５ら、 Ｔｅｔｒａｈ
ｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３０＋ （１９８９）
、 ２２１７−２２２０） Ｎｅｕ５Ａｃの合成につい
て報告されており、その際リアーゼは固定された状態で
不溶性担体（ＰＡＮまたはアガロース）上に共有結合で
連結して使用される。この固定された状態で、原則にお
いて、連結による活性の損失を記載し得る。担体に固定
された酵素を使用して連続的に製造することは、単に抗
菌性作用剤を用いて可能であるにすぎない。
８１−６４８６並びにＣ０Ａｕｇ５ら、 Ｔｅｔｒａｈ
ｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３０＋ （１９８９）
、 ２２１７−２２２０） Ｎｅｕ５Ａｃの合成につい
て報告されており、その際リアーゼは固定された状態で
不溶性担体（ＰＡＮまたはアガロース）上に共有結合で
連結して使用される。この固定された状態で、原則にお
いて、連結による活性の損失を記載し得る。担体に固定
された酵素を使用して連続的に製造することは、単に抗
菌性作用剤を用いて可能であるにすぎない。
このＮ−アセチルノイラミン酸の形成のための出発物質
は比較的高価なＮ−アセチルマンノサミンであり、これ
はＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）から入手
できることが既に上に引用したＭ、−Ｊ、 Ｋｉｍの論
文に示されている。該文献は、ＭａｎＮＡｃの入手可能
性としてＧｌｃＮＡｃの、ＭａｎＮＡｃの形成下での化
学的方法での塩基触媒異性化またはＮｅｕ５Ａｃの製造
過程におけるＧｌｃＮＡｃの、ＭａｎＮＡｃへのエピメ
ラーゼ触媒異性化の採用を考慮しているが、エピメラー
ゼ、およびＧｌｃＮＡｃをＭａｎＮＡｃに転換するエピ
メラーゼの有用性はずっと以前から知られてはいるが、
具体的には報告されていない（ＧｈｏｓｈらＪ、 ｏｆ
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ２４０ （１９６５） １
５３１−６）。
は比較的高価なＮ−アセチルマンノサミンであり、これ
はＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）から入手
できることが既に上に引用したＭ、−Ｊ、 Ｋｉｍの論
文に示されている。該文献は、ＭａｎＮＡｃの入手可能
性としてＧｌｃＮＡｃの、ＭａｎＮＡｃの形成下での化
学的方法での塩基触媒異性化またはＮｅｕ５Ａｃの製造
過程におけるＧｌｃＮＡｃの、ＭａｎＮＡｃへのエピメ
ラーゼ触媒異性化の採用を考慮しているが、エピメラー
ゼ、およびＧｌｃＮＡｃをＭａｎＮＡｃに転換するエピ
メラーゼの有用性はずっと以前から知られてはいるが、
具体的には報告されていない（ＧｈｏｓｈらＪ、 ｏｆ
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ２４０ （１９６５） １
５３１−６）。
一方では是認されたＧｌｃＮＡｃから出発し他方では中
間分離を回避できそして好ましくは活性の低下を回避す
る方法を達成するという課題が、本発明の基礎になって
いる。
間分離を回避できそして好ましくは活性の低下を回避す
る方法を達成するという課題が、本発明の基礎になって
いる。
この目的のために開発された本発明による方法は、Ｎ−
アセチルノイラミン酸の形成を、エピメラーゼだけでな
くリアーゼをも包含しそしてＮ−アセチルグルコサミン
およびピルバートが供給される反応器内で引起し、そし
てその流出物からＮ−アセチルノイラミン酸を得ること
を特徴とする。
アセチルノイラミン酸の形成を、エピメラーゼだけでな
くリアーゼをも包含しそしてＮ−アセチルグルコサミン
およびピルバートが供給される反応器内で引起し、そし
てその流出物からＮ−アセチルノイラミン酸を得ること
を特徴とする。
該方法は、優れた方法で、ＧｌｃＮＡｃがリアーゼのた
めに転換されないことおよび後者は比較的安価なことモ
してそれ故リアーゼの活性のため最適ではない条件の下
で使用され得ることという事実を利用する。該方法は、
両方の酵素の安定性−およびｐＨ−最適条件が似ている
という知見に基づく。
めに転換されないことおよび後者は比較的安価なことモ
してそれ故リアーゼの活性のため最適ではない条件の下
で使用され得ることという事実を利用する。該方法は、
両方の酵素の安定性−およびｐＨ−最適条件が似ている
という知見に基づく。
反応条件を最善の状態にすることによって、エピメラー
ゼおよびリアーゼという両方の酵素の活性を相互に一致
しそして例えばエピメラーゼに対するピルバートの抑制
作用は、より低いピルバート濃度によって押さえられる
。反応系内に存在するピルバートはそれ自体比較的低い
濃度で形成されるＭａｎＮＡｃに対して著しく過剰であ
りその結果Ｎｅｕ５此への転換はＭａｎＮＡｃの消費の
もとて円滑に進行し、ＧｌｃＮＡｃからのＮｅｕ５Ａｃ
の形成はＭａｎＮＡｃによって促進される。
ゼおよびリアーゼという両方の酵素の活性を相互に一致
しそして例えばエピメラーゼに対するピルバートの抑制
作用は、より低いピルバート濃度によって押さえられる
。反応系内に存在するピルバートはそれ自体比較的低い
濃度で形成されるＭａｎＮＡｃに対して著しく過剰であ
りその結果Ｎｅｕ５此への転換はＭａｎＮＡｃの消費の
もとて円滑に進行し、ＧｌｃＮＡｃからのＮｅｕ５Ａｃ
の形成はＭａｎＮＡｃによって促進される。
反応器内の適当な濃度は５０〜５００ｍＭｏｌ Ｇｌｃ
ＮＡｃ／２、特に約２００ｍＭｏｌ Ｇ１ｃＮＡｃ／
ｌおよび３０〜２００ｍＭ。
ＮＡｃ／２、特に約２００ｍＭｏｌ Ｇ１ｃＮＡｃ／
ｌおよび３０〜２００ｍＭ。
ｌピルバート／ｆｆｉ、特に５０〜５００ｍＭｏ ｌ
ピルバート／ｌ、殊に約８０ｍＭｏｌまでのピルバート
／ｌである。
ピルバート／ｌ、殊に約８０ｍＭｏｌまでのピルバート
／ｌである。
好ましくは、連続的にそして特に酵素膜反応器内で操作
される。
される。
酵素膜反応器（ＥＭＲ）においては、溶解状態でその中
に存在する酵素は反応器出口の前に位置する適合したカ
ットオフを有する限外濾過膜によって保有される。相当
する活性の減少を伴う担体固定は従って不必要である。
に存在する酵素は反応器出口の前に位置する適合したカ
ットオフを有する限外濾過膜によって保有される。相当
する活性の減少を伴う担体固定は従って不必要である。
反応器は作業を始める前に滅菌され、その結果抗菌性作
用剤の添加を省略し得る。
用剤の添加を省略し得る。
ＥＭＲは出発条件下に操作されるので、流入−ｐＨを対
応して調整すれば、同様に緩衝物質を省略し得る。これ
らの物質の省略は、記載された方法で同様に行われてい
る（上述のＲ，５ｈａｕｅｒを参照のこと）後の生成物
分離を容易にする。
応して調整すれば、同様に緩衝物質を省略し得る。これ
らの物質の省略は、記載された方法で同様に行われてい
る（上述のＲ，５ｈａｕｅｒを参照のこと）後の生成物
分離を容易にする。
エピメラーゼだけでなくリアーゼも同一の反応系におい
て使用することは、両方の酵素の酵素活性に適合した適
当な反応条件の選択を不可欠にする： それ故、第一に、リアーゼによるＮｅｕ５Ａｃ形成だけ
でなくエピメラーゼによるＭａｎＮＡｃ形威のため形成
素反応のｐＨ依存性を試験する：添付の第１図および第
２図は、およそ中性の範囲（ｐ）１７）が選択されたｐ
Ｈ値が両方の反応に有利であることが分かる２５℃で得
られた曲線を示す。
て使用することは、両方の酵素の酵素活性に適合した適
当な反応条件の選択を不可欠にする： それ故、第一に、リアーゼによるＮｅｕ５Ａｃ形成だけ
でなくエピメラーゼによるＭａｎＮＡｃ形威のため形成
素反応のｐＨ依存性を試験する：添付の第１図および第
２図は、およそ中性の範囲（ｐ）１７）が選択されたｐ
Ｈ値が両方の反応に有利であることが分かる２５℃で得
られた曲線を示す。
ｐＨ７，５でのＮｅｕ５＾Ｃ形成の平衡定数の温度依存
性の試験（第３図を参照のこと）は、Ｎｅｕ５ＡｃＪ１
３ｔｃには原則的にできる限り低い温度が有益であるこ
とを明らかにする：しかしながら、低温（例えば１０℃
の）では酵素活性の明らかな減少が起こりそして前に行
われた反応としての転換に関して速度を決定する糖の変
旋光作用（α−アノマー＝β−アノマー）が低温でより
僅かにすばやく消失するので、約２５℃で作業するのが
適当である。
性の試験（第３図を参照のこと）は、Ｎｅｕ５ＡｃＪ１
３ｔｃには原則的にできる限り低い温度が有益であるこ
とを明らかにする：しかしながら、低温（例えば１０℃
の）では酵素活性の明らかな減少が起こりそして前に行
われた反応としての転換に関して速度を決定する糖の変
旋光作用（α−アノマー＝β−アノマー）が低温でより
僅かにすばやく消失するので、約２５℃で作業するのが
適当である。
第２Ａ図に示すように、ピルビン酸によるＧｌｃＮＡｃ
のＭａｎＮＡｃへの異性化はピルビン酸の濃度が上昇す
ると共にますます抑制される。さらに試験は、生成物と
して望まれるＮ−アセチルノイラミン酸がエピメラーゼ
に対して抑制作用を及ぼすことをも示している。
のＭａｎＮＡｃへの異性化はピルビン酸の濃度が上昇す
ると共にますます抑制される。さらに試験は、生成物と
して望まれるＮ−アセチルノイラミン酸がエピメラーゼ
に対して抑制作用を及ぼすことをも示している。
ＥＭＲ内で、同じ反応系で進行する二段階合成のために
ＧｌｃＮＡｃおよびピルバートが供給される。エピメラ
ーゼおよびリアーゼが反応器内に存在すると、その時ま
ず第一に次の化学方程式に従い、アシルグルコサミン−
２−エピメラーゼによるＧＩｃＮＡｃのＭａｎＮＡｃへ
の転換が起こる： 形成されたＭａｎＮＡｃはその時にピルバートの大過剰
に直面し、それによってＮｅｕ５Ａｃへの次の転換が促
進される。
ＧｌｃＮＡｃおよびピルバートが供給される。エピメラ
ーゼおよびリアーゼが反応器内に存在すると、その時ま
ず第一に次の化学方程式に従い、アシルグルコサミン−
２−エピメラーゼによるＧＩｃＮＡｃのＭａｎＮＡｃへ
の転換が起こる： 形成されたＭａｎＮＡｃはその時にピルバートの大過剰
に直面し、それによってＮｅｕ５Ａｃへの次の転換が促
進される。
その逆反応は、さらに、第４図から推断され得るように
、形成されたＮｅｕ５Ａｃと比較してかなり過剰に存在
するピルバートの量によって強く抑制される。
、形成されたＮｅｕ５Ａｃと比較してかなり過剰に存在
するピルバートの量によって強く抑制される。
第５図は、本質的に本発明による反応系内に非常に過剰
に存在するピルバートの量によって、ＮｅｕＳＡｃ形成
の平衡定数のより高い値への移動が促進されることを示
す。
に存在するピルバートの量によって、ＮｅｕＳＡｃ形成
の平衡定数のより高い値への移動が促進されることを示
す。
異性化およびＮｅｕＳＡｃ形成は同じ系内で同時に存在
する酵素によって同時に進行するべきなので、酵素の活
性を互いに調整することが重要であり、その際、平衡に
おいてほぼ同等の変化が得られるべきであるということ
から出発する。
する酵素によって同時に進行するべきなので、酵素の活
性を互いに調整することが重要であり、その際、平衡に
おいてほぼ同等の変化が得られるべきであるということ
から出発する。
それに次いで、反応器内での両方の酵素の活性比（その
値はそれぞれの酵素の転換速度からの商の逆数に対応す
る）が互いに役立つ。
値はそれぞれの酵素の転換速度からの商の逆数に対応す
る）が互いに役立つ。
出発物質のＧｌｃＮＡｃおよびピルバートの供給の際に
、ＧｌｃＮＡｃＯ量には制御機能が付随し、その結果こ
れは少なくとも比較しうるモル濃度で反応器内に存在す
べきであるということを考慮に入れるべきであり、しか
し好ましくはピルバートに対して過剰に使用される。ピ
ルバートの大過剰は、エピメラーゼがピルバートによっ
て抑制されるので回避されるべきである。
、ＧｌｃＮＡｃＯ量には制御機能が付随し、その結果こ
れは少なくとも比較しうるモル濃度で反応器内に存在す
べきであるということを考慮に入れるべきであり、しか
し好ましくはピルバートに対して過剰に使用される。ピ
ルバートの大過剰は、エピメラーゼがピルバートによっ
て抑制されるので回避されるべきである。
形成されるＮｅｕ５Ａｃは、平衡状態に応じて多少著し
い再分裂の逆反応の影響下にある。この反応は確かにピ
ルバートの過剰によって抑制される（第４図参照）が、
連続的な反応媒体をＢＭＲからイオン交換体カラムを経
て送りそして残りを反応器に送り戻すことが有効である
。交互に操作される２つのカラムが有効である。
い再分裂の逆反応の影響下にある。この反応は確かにピ
ルバートの過剰によって抑制される（第４図参照）が、
連続的な反応媒体をＢＭＲからイオン交換体カラムを経
て送りそして残りを反応器に送り戻すことが有効である
。交互に操作される２つのカラムが有効である。
第６図に示すように、アニオン交換カラム（Ｄ。
ｗｅｘｌＸ２、ギ酸塩、２５℃）上でＮｅｕ５ＡｃがＭ
ａｎＮＡｃより強く固定され従ってカラム上に集中され
ることができる。同様に結合されたＰｙｒは相応して置
換されねばならない。
ａｎＮＡｃより強く固定され従ってカラム上に集中され
ることができる。同様に結合されたＰｙｒは相応して置
換されねばならない。
最適に全転換のため、従来存在する技術に従って、０．
２〜１０時間、特に約４時間の持続時間が有用である。
２〜１０時間、特に約４時間の持続時間が有用である。
調整された反応について見出された広いｐ）（範囲を考
慮して、第１図および第２図から明らかにわかるように
、さほど活性損失もなく ｐＨ６および８の開操作され
得る。小さいｐＨ変化は達せられる転換にほとんど影響
をもたらさないので、この広い範囲は緩衝物質の使用の
ない連続作業における操作を容易にする。緩衝物質の省
略は、それにより処理が容易にされるので、価値がある
。
慮して、第１図および第２図から明らかにわかるように
、さほど活性損失もなく ｐＨ６および８の開操作され
得る。小さいｐＨ変化は達せられる転換にほとんど影響
をもたらさないので、この広い範囲は緩衝物質の使用の
ない連続作業における操作を容易にする。緩衝物質の省
略は、それにより処理が容易にされるので、価値がある
。
緩衝物質は、通常、生成物分離のために使用される陰イ
オン交換体に結合されそして適当なりロマトグラフィー
の条件により分離されねばならないイオン化合物である
。典型的なりロマトグラムを第６図４こ明示する。それ
は陰イオン交換体のり。
オン交換体に結合されそして適当なりロマトグラフィー
の条件により分離されねばならないイオン化合物である
。典型的なりロマトグラムを第６図４こ明示する。それ
は陰イオン交換体のり。
ｗｅに１×２が使用される。溶離剤としてギ酸１ｍｏｌ
／ｌが用いられる。はぼファクター８のスケールアップ
が当該酸について行われ、その際分離能力が維持される
。
／ｌが用いられる。はぼファクター８のスケールアップ
が当該酸について行われ、その際分離能力が維持される
。
Ｎ−アセチルグルコサミン
Ｎａ−ピルバート
ＴＰ
ＭｇＣ１ｚ ・６Ｈ２０
基質を水に溶解する。
７．２に調整する。
・ の ２
エピメラーゼ
２００ ・１０−’ ｍｏｌ ／ １
１００ ・１０−’ ｍｏｌ／ １
５ ・１０−３ｍｏｌ／ ４１！
５ ・１０−’ ｍｏｌ／ １
希苛性ソーダ溶液でｐＨ
１１，９■／ ｍｌ
アルドラーゼ ３．４■／ｄ夫東
条住 温度 ２５ ℃反応器
出口でのｐＨ７，２〜７．５ 反応器容積 １２ ｄ持続時
間 ２．８５時間猪果 反応器の出口で次の濃度が測定されたニーＮ−アセチル
メイラごン酸 ３５ｍｍｏｌ／ ＩＮ−アセチル
マンノサミン ２０ｍｍｏｌ／ １使用されたＮ
ａ−Ｐｙｒに関して３５％の変化が得られた。Ｎ−アセ
チルノイラミン酸の空時収量は１０９ｇ／（ｆ−ｄ）で
あった。
条住 温度 ２５ ℃反応器
出口でのｐＨ７，２〜７．５ 反応器容積 １２ ｄ持続時
間 ２．８５時間猪果 反応器の出口で次の濃度が測定されたニーＮ−アセチル
メイラごン酸 ３５ｍｍｏｌ／ ＩＮ−アセチル
マンノサミン ２０ｍｍｏｌ／ １使用されたＮ
ａ−Ｐｙｒに関して３５％の変化が得られた。Ｎ−アセ
チルノイラミン酸の空時収量は１０９ｇ／（ｆ−ｄ）で
あった。
添付の図面は本発明のよりよい理解に役立つ。
それぞれ、
第１図、第２図および第４図は、ｐＨ値による酵素の相
対活性の曲線を示し、 第２Ａ図はピルバート濃度によるエピメラーゼの相対活
性の曲線を示し、 第３図はＮｅｕＳＡｃ形成の平衡定数の温度依存の曲線
を示し、 第５図は種々のＭａｎＮＡｃ濃度範囲に関するＰｙｒ／
ＭａｎＮＡｃ比による平衡転換を示し：そして第６図は
陰イオン交換カラム体上でのＭａｎＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａ
ｃおよびＰｙｒ−ＩＩの溶離特性を示す。
対活性の曲線を示し、 第２Ａ図はピルバート濃度によるエピメラーゼの相対活
性の曲線を示し、 第３図はＮｅｕＳＡｃ形成の平衡定数の温度依存の曲線
を示し、 第５図は種々のＭａｎＮＡｃ濃度範囲に関するＰｙｒ／
ＭａｎＮＡｃ比による平衡転換を示し：そして第６図は
陰イオン交換カラム体上でのＭａｎＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａ
ｃおよびＰｙｒ−ＩＩの溶離特性を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、Ｎ−アセチルノイラミン酸形成を、エピメラーゼだ
けでなくリアーゼをも包含しそしてＮ−アセチルグルコ
サミンおよびピルバートが供給される反応器内で引起し
、そしてその流出物からＮ−アセチルノイラミン酸を得
ることを特徴とする、（ａ）Ｎ−アシルグルコサミン−
２−エピメラーゼ（Ｅ．Ｃ．５．１．３．８）の存在下
にＮ−アセチルグルコサミンをＮ−アセチルマンノサミ
ンに異性化し、次いで（ｂ）Ｎ−アセチルマンノサミン
をＮ−アセチルノイラミン酸−ピルバート−リアーゼ（
Ｅ．Ｃ．４．１．３．３）の存在下にピルビン酸を用い
てＮ−アセチルノイラミン酸に転換することによるＮ−
アセチルノイラミン酸の製造方法。 ２、反応が連続的に行われる、請求項１記載の方法。 ３、反応が１０００ｕ以上のカットオフを持つ限外濾過
膜を持つ酵素膜反応器内で行われる、請求項２記載の方
法。 ４、エピメラーゼおよびリアーゼが、反応器内で、それ
ぞれの酵素転換速度からの商の逆数に対応する活性比に
ある、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。 ５、反応器内でピルバートに対してＮ−アセチルグルコ
サミンの過剰に配慮し、場合によりピルバートが後配量
される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。 ６、反応器の流出物を送ってイオン交換体カラムにより
Ｎ−アセチルノイラミン酸を分離しそして残りを反応器
内に戻す、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。 ７、酵素反応をｐＨ７．５でかつ２５℃で進行させる、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 ８．０．２〜１０時間の、特に４時間の平均持続時間で
行われる、請求項３〜７のいずれか１項に記載の方法。
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