JPH0318149B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の技術分野〕 この発明は、試料中の特定の抗原または抗体を
定量分析するための免疫分析方法に関する。

〔発明の技術的背景とその問題点〕

従来の免疫分析方法として、たとえば、ラジオ
アイソトープで標識した抗体（または抗原）と生
体により採取した試料中の抗原（または抗体）と
の抗原抗体反応を利用して試料中の特定の抗原
（または抗体）を定量分析するラジオイムノアツ
セイ法や、酸素で標識した抗体（または抗原）と
生体より採取した試料中の抗原（または抗体）と
の抗原抗体反応により抗原抗体結合物を得、その
抗原抗体結合物に標識した酸素による酸素反応を
利用して試料中の特定の抗原（または抗体）を定
量分析するエンザイムイムノアツセイ法等があ
る。

しかしながら、前記ラジオイムノアツセイ法
は、放射性物質を利用するので設備が大がかりに
なるという欠点があり、また、ラジオイムノアツ
セイ法およびエンザイムイムノアツセイ法のいず
れにおいても、十分な検出感度に達するまでには
数時間から数十時間を要して分析に長時間を要す
るという欠点がある。

〔発明の効果〕

この発明は前記事情に鑑みてなされたものであ
り、極めて短い分析時間で試料中の抗原や抗体を
分析することのできる免疫分析用試薬およびその
免疫分析用試薬を用いた免疫分析方法を提供する
ことを目的とするものである。

〔発明の概要〕

前記目的を達成するためにこの発明の概要は、
補体活性により細胞溶解作用を受ける赤血球の細
胞膜に抗原または抗体を結合すると共に内部に酵
素または酵素と特異的に反応する基質を収容する
赤血球、赤血球内の酵素または基質と特異的に反
応する基質または酵素および補体を有することを
特徴とするものであり、また補体活性により細胞
溶解作用を受ける赤血球の細胞膜に抗原または抗
体を結合すると共に内部に酵素または酵素と特異
的に反応する基質を収容する赤血球、赤血球内の
酵素または基質と特異的に反応する基質または酵
素および補体を有する試薬と、抗体または抗原を
有する試料とを混合し、生ずる抗原抗体反応によ
り活性化された補体の細胞溶解作用により赤血球
の細胞膜を溶解することにより生ずる酵素反応の
生成物を定量することによつて、試料中の抗原ま
たは抗体を定量することを特徴とするものであ
る。

〔発明の実施例〕

先ず、この発明に係る免疫分析用試薬は、補体
活性により細胞溶解作用を受ける赤血球の細胞膜
に抗体を結合すると共に内部に酵素を収容する赤
血球、赤血球内に収容した酵素と特異的に反応す
る基質および補体を有する。

抗原を結合し酵素を収容することのできる細胞
としては、動物たとえば羊の赤血球を好適に用い
ることができる。赤血球の細胞膜は脂質、糖質、
タンパク質から成つているので、その細胞膜に結
合する抗体の種類は多い。これに対して、リポゾ
ームはその膜が脂質からなつているので、その膜
に結合する抗体の種類は限定される。したがつ
て、赤血球はリポゾームよりも優れている。な
お、他の動物の赤血球であつても、細胞膜に抗体
を結合し、また、細胞内に酵素を収容することが
できれば、この発明における細胞として使用する
ことができる。

細胞膜に結合する抗体は、後述するこの出願に
係る他の発明である免疫分析方法で使用する試料
中の抗原と特異な抗原抗体反応を惹起するものが
適宜に選ばれる。たとえば、試料中の抗原がα−
フエトプロテインであるときは、α−フエトプロ
テイン抗体が挙げられる。

また、細胞内に収容する酵素は、たとえば酸化
酵素たとえばグルコースオキシダーゼ、ウリカー
ゼ、グリセロールオキシダーゼ、およびコレステ
ロールオキシダーゼ、脱水素酵素たとえば乳酸脱
水素酵素、ブドウ糖脱水酵素およびグルタミン酸
脱水素酵素、脱炭酸酵素たとえばグルタメートデ
カルボキシダーゼ、ウレアーゼ、ピルベートデカ
ルボキシダーゼ、あるいは前記各種の酵素を混合
したものが挙げられる。また、細胞内に酵素を収
容する態様として、そのような酵素を含有する微
生物を細胞内に収容するものであつてもよい。細
胞内に前記酵素を収容するかわりに前記した各種
の酵素と特異的に反応する基質を収容してもよ
い。ただし、酵素を収容した細胞を有する免疫分
析用試薬を長期間にわたつて保存しておくと、酵
素が失活してしまうことがあるので、細胞内に収
容するのは酵素よりも基質であるのが好ましい。

細胞内に収容する酵素の量としては、細胞膜に
結合する抗体と反応する抗原量1nｇ／ml〜1μ
ｇ／mlに対し十分に過剰な量たとえば酵素活性値
に換算して100U／ml以上、好ましくは500U／ml
〜1000U／mlである。このように抗体量に対して
細胞内の酵素量が大過剰であるので、この発明の
免疫分析用試薬を用いた免疫分析測定を短時間の
うちに行なうことができる。

羊の赤血球の細胞膜に抗体たとえばα−フエト
プロテイン抗体を結合し、赤血球内に酵素たとえ
ばグルコースオキシダーゼを収容した細胞の調整
は、たとえば次のようにし行なうことができる。

先ず、動物たとえばウサギ、ヤギ、マウス、ラ
ツト等にα−フエトプロテインをたとえば皮下注
射すると、これら動物の感作により動物体内でα
−フエトプロテイン抗体が産生する。皮下注射後
１週間程経過してから、その動物より所定量の血
液を採取し、得られた血液の上澄み液を分離する
ことにより、α−フエトプロテイン抗体を有する
抗血清を得る。なお、抗原抗体反応の特異性を向
上させるために、前記抗血清をさに精製してもよ
い。一方、他の動物たとえばヒツジから所定量の
血液を採取してこれを精製し、等張液たとえば
0.15Mの濃度の塩を含有する緩衝液（PH７）と混
合することにより赤血球をサスペンドした等張液
を得る。次いで、ヒツジの赤血球をサスペンドし
た等張液と前記のα−フエトプロテイン抗体を有
する抗血清とを混合すると、ヒツジの赤血球の細
胞膜上にα−フエトプロテイン抗体が吸着され、
α−フエトプロテイン抗体を細胞膜に結合する赤
血球を有する等張液が得られる。この等張液中に
サスペンドした赤血球中には細胞液、ミトコンド
リア等が含まれているので、常法である透析法に
よつて赤血球内から細胞液等を排出して赤血球内
に酵素であるグルコースオキシダーゼを収容す
る。収容するグルコースオキシダーゼ量として
は、全赤血球につき500〜1000U／mlであるが、
これに限ることはなく、後述する免疫分析測定法
の必要に応じて適宜に決定することができる。

補体は、動物の血液中に含まれているものを使
用することができ、たとえばモルモツトの血清を
補体含有液としてそのまま使用することができ
る。

免疫分析用試薬中の基質は、前記細胞中に収容
された酵素と特異的に酵素反応をする前述の基質
を使用することができる。基質の量としては、細
胞内に収容されている酵素に対応する量でよい。

以上のようにして調整して得た、抗体を細胞上
に結合すると共に内部に酵素を収容する細胞を含
有する緩衝液と補体を含有する血清と基質とを混
合すると、この発明に係る免疫分析用試薬を得る
ことができる。

次に、以上のようにして得られる免疫分析用試
薬を用いた免疫分析方法について述べる。

分析の手順としては、先ず免疫分析用試薬と試
料たとえば患者より採取した血液試料とを混合す
る。第１図に示すように、免疫分析用試薬中の細
胞に結合された抗体３と血液試料中の抗原４とが
抗原抗体反応を惹起すると、免疫分析用試薬中の
補体が前記抗原抗体反応により活性化され、補体
活性による細胞溶解作用により細胞膜１が溶解し
て細胞内に収容されていた酵素２が細胞外に放出
される。放出された酵素２と免疫分析用試薬中の
基質５とが酵素反応することにより反応生成物が
得られる。次いで、この反応生成物を適宜の手段
により定量する。定量手段としては、たとえば反
応生成物がイオンであるときにはイオン電極を、
反応生成物が過酸化水素であるときには過酸化水
素電極を使用する電気化学的手段を採用すること
ができ、また、反応生成物と他の試薬とを反応さ
せて反応液を呈色させ、反応液の吸光度を測定す
る分光分析的手段を採用することもできる。反応
生成物の定量により、血液試料中に含有されてい
る抗原を定量することができる。つまり、免疫分
析用試薬中の細胞に結合した抗体量と細胞内に収
容された酵素量とが試薬調整の際に既知であるこ
と、試料中の抗原と細胞に結合した抗体とが定量
的に反応すること、細胞外に放出された酵素と細
胞外にあらかじめ存在する基質とが定量的に反応
することから、あらかじめ実験的に得られた検量
線により酵素反応の生成物の定量から試料中の抗
原を定量することができるのである。しかも、細
胞に結合した抗体量に比して細胞内に収容した酵
素量は大過剰であるので、この発明に係る免疫分
析方法によると、従来方法では数10時間も要して
いた分析を、５〜10分程度で行なうことができ
る。

免疫分析方法の実験例 あらかじめ調製したα−FP抗体含有の免疫分
析用試薬とα−FP含有既知の血液試料とを以下
の条件に従つて混合し、抗原抗体反応の結果、細
胞外に放出されたグルコースオキシダーゼの作用
により免疫分析用試薬中のグルコースが酸化され
て生ずる過酸化水素を過酸化水素電極で定量し
た。

過酸化水素電極より出力される電流増加値と血
液試料中のα−FP量との関係を第２図に示す。
第２図に示すように電流増加値とα−FP量とは
直線的な相関関係があるまた、ラジオイムノアツ
セイ法（RIAで示す）により血液試料中のα−
FP定量結果とこの発明に係る免疫分析方法（本
法と示す）によるα−FP定量結果とは、第３図
に示すように、きわめて良い相関がある。したが
つて、第２図に示すグラフを検量線として、α−
FP含有量未知の血液試料につきこの発明の免疫
分析方法によりα−FPを精度よく、かつ迅速に
定量することができることが裏付けられる。

〔発明の効果〕

この発明によると、抗原抗体反応と酵素反応と
を組み合わせて、試料中の抗原あるいは抗体を、
酵素反応生成物の定量をするだけで、迅速かつ正
確に定量することができる。また、赤血球の細胞
膜に結合する抗体を任意に選択し、結合すること
ができることに対応して、広範囲に、結合した抗
体と特異的に反応する抗原を定量することができ
る。

さらに特性が安定しており一定期間の保存が可
能である。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明に係る免疫分析方法の原理を
示す説明図、第２図はこの発明に係る免疫分析方
法における酵素反応生成物の生成量を検知する電
極より出力される電流の増加値と試料中の抗原量
との相関を示すグラフ、および第３図はラジオイ
ムノアツセイ法の分析結果とこの発明に係る免疫
分析方法の分析結果との相関を示すグラフであ
る。 １……細胞膜、２……酵素、３……抗体、４…
…抗原、５……基質、６……生成物。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ その細胞膜に抗体を結合せしめると共に内部
   に酵素を収容した赤血球と、この赤血球内の酵素
   と反応する基質と、抗原抗体反応により前記細胞
   膜の溶解作用を起こす補体とを有することを特徴
   とする免疫分析用試薬。 ２ その細胞膜に抗体を結合せしめると共に内部
   に酵素を収容した赤血球と、この赤血球内の酵素
   と反応する基質と、抗原抗体反応により前記細胞
   膜の溶解作用を起こす補体とを有する免疫分析用
   試薬と、前記抗体と反応する抗原を有する試料と
   を混合し、抗原抗体反応により活性化された補体
   の細胞膜溶解作用により前記赤血球の細胞膜を溶
   解することにより生じる前記酵素と前記基質との
   酵素反応の生成物を定量することによつて、前記
   抗原を定量することを特徴とする免疫分析方法。