JPH03183481A - 抗生物質サーモルビンに対する抵抗性を付与するｄｎａ配列 - Google Patents
抗生物質サーモルビンに対する抵抗性を付与するｄｎａ配列Info
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- JPH03183481A JPH03183481A JP2315682A JP31568290A JPH03183481A JP H03183481 A JPH03183481 A JP H03183481A JP 2315682 A JP2315682 A JP 2315682A JP 31568290 A JP31568290 A JP 31568290A JP H03183481 A JPH03183481 A JP H03183481A
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、適切なベクターにより適当な微生物宿主中に
形質転換するとき、サーモルピン（ｔｈｅｒｍｏｒｕｂ
ｉｎ） （以後：ＴＲＢ）に対する抵抗性を付与する
ことができる、新規なりＮＡ断片またはその下位断片（
ｓｕｂ −ｆｒａｇｍｅｎｔ）に関する。
形質転換するとき、サーモルピン（ｔｈｅｒｍｏｒｕｂ
ｉｎ） （以後：ＴＲＢ）に対する抵抗性を付与する
ことができる、新規なりＮＡ断片またはその下位断片（
ｓｕｂ −ｆｒａｇｍｅｎｔ）に関する。
サーモルピンは、米国特許第３，３００，３７９号およ
びジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイア
ティ−（Ｊ、 Ａｍ、 Ｃｈｅｗ、 Ｓｏｃ、 ）
（１９７２）９４．３２６９−７２に記載されている、
サーモアクチノミセス・アンチビチクス（Ｔ ｈｅｒＬ
Ｉｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ
ｕｓ） Ａ Ｔ ＣＣ１４５７０により産生されるポリ
ケチドの抗生物質である。 本発明の１つの目的は、適
当なベクターにより感受性微生物宿主中に形質転換する
とき、ＴＲＢに対する抵抗性を付与することができるＤ
ＮＡ配列である。
びジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイア
ティ−（Ｊ、 Ａｍ、 Ｃｈｅｗ、 Ｓｏｃ、 ）
（１９７２）９４．３２６９−７２に記載されている、
サーモアクチノミセス・アンチビチクス（Ｔ ｈｅｒＬ
Ｉｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ
ｕｓ） Ａ Ｔ ＣＣ１４５７０により産生されるポリ
ケチドの抗生物質である。 本発明の１つの目的は、適
当なベクターにより感受性微生物宿主中に形質転換する
とき、ＴＲＢに対する抵抗性を付与することができるＤ
ＮＡ配列である。
このような抵抗性のための機構は、まだ、明確に証明さ
れないが、この開示は作用の機構またはそれについての
理論に限定することを意図しない。
れないが、この開示は作用の機構またはそれについての
理論に限定することを意図しない。
便宜上、本発明のＤＮＡ配列は、前述したように、ｒＴ
ＲＢ−Ｒを付与する配列」と呼ぶ。
ＲＢ−Ｒを付与する配列」と呼ぶ。
このようなＴＲＢ−Ｒを付与する配列の例は、サーモア
クチノミセス・アンチビチクス（Ｔｈｅｒｍｏ ａ ｃ
ｔ ｉ ｎ ｏｍｙ ｃ ｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔ
ｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ１４５７０から制限断片として得る
ことができる、約４．０ＫｂｐのＳａｕ ３ＡＩ断片
中に含有される。
クチノミセス・アンチビチクス（Ｔｈｅｒｍｏ ａ ｃ
ｔ ｉ ｎ ｏｍｙ ｃ ｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔ
ｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ１４５７０から制限断片として得る
ことができる、約４．０ＫｂｐのＳａｕ ３ＡＩ断片
中に含有される。
サーモアクチノミセス・アンチビチクス（Ｔｈｅｒｍｏ
ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ
） ＡＴＣＣ１４５７０は、アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション（ｔｈｅ Ａ ｍｅｒｉｃａｎ
Ｔ ｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ、米国マリイランド州２０８５２、ロックビレ）
から要求に応じて得ることができる、一般に入手可能な
菌株である［参照、バクテリアおよびバクテリオファー
ジのＡＴＣＣカタログ（Ａ Ｔ ＣＣＣａｔａｌｏｇｕ
ｅ ｏｆ Ｂ ａｃｔｅｒｉａ＆ Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｐｈａｇｅｓ） 、第１７版、１９８９、ｐ、２４
９］。
ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ
） ＡＴＣＣ１４５７０は、アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション（ｔｈｅ Ａ ｍｅｒｉｃａｎ
Ｔ ｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ、米国マリイランド州２０８５２、ロックビレ）
から要求に応じて得ることができる、一般に入手可能な
菌株である［参照、バクテリアおよびバクテリオファー
ジのＡＴＣＣカタログ（Ａ Ｔ ＣＣＣａｔａｌｏｇｕ
ｅ ｏｆ Ｂ ａｃｔｅｒｉａ＆ Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｐｈａｇｅｓ） 、第１７版、１９８９、ｐ、２４
９］。
こうして、本発明は、サーモアクチノミセス・アンチビ
チクス（Ｔ ｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｗｙｃｅｓ ａ
ｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ’）ＡＴＣＣ１４５７０のゲノ
ムの５ａｔｉ３ＡＩにより得ることができる、約４．０
ＫｂｐのＤＮＡ断片（またはそれを含有するＤＮＡ配列
）、その下位断片であり、それは中ないし低い厳格さで
有意な程度に上の断片と、あるいはそれから誘導化可能
なプローブとハイブリダイゼーションし、そして感受性
微生物宿主中に形質転換するとき、ＴＲＢに対する抵抗
性を付与することができる。したがって、本発明は、ま
た、高い厳格さの下に、前述の制限断片またはその下位
断片とハイブリダイゼーションし、そして感受性宿主の
形質転換とき、ＴＲＢに対する抵抗性を付与する能力を
維持するＤＮＡ配列を包含する。
チクス（Ｔ ｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｗｙｃｅｓ ａ
ｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ’）ＡＴＣＣ１４５７０のゲノ
ムの５ａｔｉ３ＡＩにより得ることができる、約４．０
ＫｂｐのＤＮＡ断片（またはそれを含有するＤＮＡ配列
）、その下位断片であり、それは中ないし低い厳格さで
有意な程度に上の断片と、あるいはそれから誘導化可能
なプローブとハイブリダイゼーションし、そして感受性
微生物宿主中に形質転換するとき、ＴＲＢに対する抵抗
性を付与することができる。したがって、本発明は、ま
た、高い厳格さの下に、前述の制限断片またはその下位
断片とハイブリダイゼーションし、そして感受性宿主の
形質転換とき、ＴＲＢに対する抵抗性を付与する能力を
維持するＤＮＡ配列を包含する。
すべての上のＤＮＡ配列はｒＴＲＢ−Ｒを付与する配列
」により包含され、したがって、これは、次のものを包
含する： ａ）感受性微生物宿主中に形質転換するとき、ＴＲＢに
対する抵抗性を付与することができる、サーモアクチノ
ミセス・アンチビチクス（Ｔ ｈｅｒｍ。
」により包含され、したがって、これは、次のものを包
含する： ａ）感受性微生物宿主中に形質転換するとき、ＴＲＢに
対する抵抗性を付与することができる、サーモアクチノ
ミセス・アンチビチクス（Ｔ ｈｅｒｍ。
ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ
） ＡＴＣＣ１４５７０のゲノムのＳａｕ ３ＡＩ処
理により得ることができる約４．０ＫｂｐのＤＮＡ断片
、その下位断片またはそれを含有するＤＮＡ配列、ｂ）
感受性微生物宿主中に形質転換するとき、ＴＲＢに対す
る抵抗性を付与することができ、そしてａ）において上
に述べたＤＮＡ断片とハイブリダイゼーションする核酸
配列、 Ｃ）上のａ）において述べた断片とハイブリダイゼーシ
ョンし、そしてＴＲＢ−Ｒ仲介抵抗性を付与することが
できるＤＮＡインサートの一部分、ｄ）ａ）またはｂ）
において定義したＤＮＡ配列に対して同義性をもつ遺伝
暗号の結果として同義性をもち、そして感受性微生物宿
主中に形質転換するとき、ＴＲＢに対する抵抗性を付与
することができるＤＮＡ配列。
） ＡＴＣＣ１４５７０のゲノムのＳａｕ ３ＡＩ処
理により得ることができる約４．０ＫｂｐのＤＮＡ断片
、その下位断片またはそれを含有するＤＮＡ配列、ｂ）
感受性微生物宿主中に形質転換するとき、ＴＲＢに対す
る抵抗性を付与することができ、そしてａ）において上
に述べたＤＮＡ断片とハイブリダイゼーションする核酸
配列、 Ｃ）上のａ）において述べた断片とハイブリダイゼーシ
ョンし、そしてＴＲＢ−Ｒ仲介抵抗性を付与することが
できるＤＮＡインサートの一部分、ｄ）ａ）またはｂ）
において定義したＤＮＡ配列に対して同義性をもつ遺伝
暗号の結果として同義性をもち、そして感受性微生物宿
主中に形質転換するとき、ＴＲＢに対する抵抗性を付与
することができるＤＮＡ配列。
ＴＲＢ−Ｒを付与する配列は、感受性微生物宿主中に形
質転換するとき、ＴＲＢ−Ｒ仲介抵抗性を付与するベク
ターの構成において使用できる。
質転換するとき、ＴＲＢ−Ｒ仲介抵抗性を付与するベク
ターの構成において使用できる。
次の定義は、この説明において使用する用語および表現
に関する。それらはこの分野において普通に理解されそ
して使用れるが、便宜上ここに報告する： 「組み換えＤＮＡクローニングベクター」または「ベク
ター」 （簡潔さのため）は、自律的に複製しまたは組
み込む因子であり、次のものを包含するが、これらに限
定されないニブラスミド、コスミド、ファージなど。
に関する。それらはこの分野において普通に理解されそ
して使用れるが、便宜上ここに報告する： 「組み換えＤＮＡクローニングベクター」または「ベク
ター」 （簡潔さのため）は、自律的に複製しまたは組
み込む因子であり、次のものを包含するが、これらに限
定されないニブラスミド、コスミド、ファージなど。
「制限断片」は、１または２以上の制限酵素でＤＮＡを
消化することによって得られる、直線のＤＮＡ配列であ
る。
消化することによって得られる、直線のＤＮＡ配列であ
る。
「核酸配列」は、ＤＮＡまたはＲＮＡの自然、合成また
はハイブリッド由来のポリヌクレオチド配列である。
はハイブリッド由来のポリヌクレオチド配列である。
「感受性微生物宿主」は、本発明のＴＲＢ−Ｒを付与す
る配列で形質転換されないかぎり、ＴＲＢの存在下に増
殖することができない宿主細胞である。
る配列で形質転換されないかぎり、ＴＲＢの存在下に増
殖することができない宿主細胞である。
「形質転換体」は形質転換を行う受容体の宿主細胞であ
るが、「形質転換」は遺伝子型を変化させそして受容体
の細胞中で変化を生ずる、受容体宿主細胞中のＤＮＡの
導入である。
るが、「形質転換」は遺伝子型を変化させそして受容体
の細胞中で変化を生ずる、受容体宿主細胞中のＤＮＡの
導入である。
「宿主細胞」は、そのための形質転換ベクターが知られ
ているか、あるいはこの分野における知識に基づいて案
出することができる、既知の原核生物または真核生物の
微生物であることができる。
ているか、あるいはこの分野における知識に基づいて案
出することができる、既知の原核生物または真核生物の
微生物であることができる。
こうして、それは哺乳動物、鳥類、両生類、酵母菌、バ
クテリアおよび植物の由来の細胞を包含する。宿主の好
ましい群は、バクテリア、例えば、Ｅ、 ｃｏｌｉ
Ｋ１２またはサーモアクチノミセス・アンチビチクス（
Ｔ ｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂ
ｉ。
クテリアおよび植物の由来の細胞を包含する。宿主の好
ましい群は、バクテリア、例えば、Ｅ、 ｃｏｌｉ
Ｋ１２またはサーモアクチノミセス・アンチビチクス（
Ｔ ｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂ
ｉ。
ｔｉｃｕｓ）により代表される。
微生物宿主の最も好ましい群の１つは、ＴＲＢを産生ず
る微生物、例えば、上に報告したサーモアクチノミセス
（Ｔ ｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）菌株により
代表される。
る微生物、例えば、上に報告したサーモアクチノミセス
（Ｔ ｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）菌株により
代表される。
表現ｒＴＲＢ−Ｒ仲介抵抗性」は、感受性微生物宿主を
ＴＲＢ−Ｒを付与する配列で形質転換することによって
産生される、サーモルピン抗生物質に対する抵抗性を意
図する。
ＴＲＢ−Ｒを付与する配列で形質転換することによって
産生される、サーモルピン抗生物質に対する抵抗性を意
図する。
用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸のハイブリダ
イゼーションを意図し、すなわち、えつの−本鎖のポリ
ヌクレオチドが二本鎖の分子を形成し、２つの鎖におけ
る相補的塩基の間に水素結合が存在する、プロセスであ
る。ハイブリダイゼーションは、ＤＮＡおよびＲＮＡの
両者の相補的鎖の間で起こって、二重らせんのＤＮＡ、
二重らせんのＲＮＡまたは二重らせんのＤＮＡ−ＲＮＡ
のハイブリッドの分子を産生ずることができる。
イゼーションを意図し、すなわち、えつの−本鎖のポリ
ヌクレオチドが二本鎖の分子を形成し、２つの鎖におけ
る相補的塩基の間に水素結合が存在する、プロセスであ
る。ハイブリダイゼーションは、ＤＮＡおよびＲＮＡの
両者の相補的鎖の間で起こって、二重らせんのＤＮＡ、
二重らせんのＲＮＡまたは二重らせんのＤＮＡ−ＲＮＡ
のハイブリッドの分子を産生ずることができる。
このプロセスにより、標識したＤＮＡまたはＲＮＡのプ
ローブとのハイブリダイゼーションにより特定のＤＮＡ
配列を同定することができる。ハイブリダイゼーション
の条件は、時には、使用する緩衝化塩類溶液、一般に塩
化ナトリウム／クエン酸ナトリウム溶液（通常、５ＳＣ
）の濃度に依存して「低い」、「高い」または「中程度
の」厳格さとする。とくに、「中程度ないし低い厳格さ
」は１ｘＳＳＣ（すなわち、０．１５モルの塩化ナトリ
ウムおよび０．０１５モルのクエン酸ナトリウム）また
はそれ以上の範囲のこの溶液の濃度を呼ぶが、「高い厳
格さ」は約０．１〜０．５ｘＳＳＣの範囲の濃度を呼ぶ
。
ローブとのハイブリダイゼーションにより特定のＤＮＡ
配列を同定することができる。ハイブリダイゼーション
の条件は、時には、使用する緩衝化塩類溶液、一般に塩
化ナトリウム／クエン酸ナトリウム溶液（通常、５ＳＣ
）の濃度に依存して「低い」、「高い」または「中程度
の」厳格さとする。とくに、「中程度ないし低い厳格さ
」は１ｘＳＳＣ（すなわち、０．１５モルの塩化ナトリ
ウムおよび０．０１５モルのクエン酸ナトリウム）また
はそれ以上の範囲のこの溶液の濃度を呼ぶが、「高い厳
格さ」は約０．１〜０．５ｘＳＳＣの範囲の濃度を呼ぶ
。
本発明のＴＲＢ−Ｒを付与する配列を使用して、適当な
ＴＲＢ−Ｒを付与するベクターで感受性微生物宿主中に
形質転換するとき、選択可能なＴＲＢに対する抵抗性を
付与することができる。例えば、アンピシリン抵抗性遺
伝子を有するＥ、 ｃｏｌｉのプラスミドベクター（例
えば、ｐＵｃ１８）を使用して、ＴＲＢ−Ｒを付与する
配列を適当な制限部位中に挿入して、２つの抵抗性マー
カー：アンピシリン（Ａｍｐ）およびＴＲＢ （ＴＲＢ
−Ｒ）をもつプラスミドを得ることができる。次いで、
新しいプラスミドを、ＴＲＢ抵抗性遺伝子（ＴＲＢ−Ｒ
）の内部に少なくとも１つの認識部位を有する制限酵素
で消化することによって、直線化し、こうして複製由来
および非変更のアンピシリンに対する抵抗性を残すこと
ができる。ＴＲＢ−Ｒ領域中の外来ＤＮＡの挿入は、形
質転換した有機体を、同時のアンピシリン抵抗性および
ＴＲＢ感受性について選択可能とする。
ＴＲＢ−Ｒを付与するベクターで感受性微生物宿主中に
形質転換するとき、選択可能なＴＲＢに対する抵抗性を
付与することができる。例えば、アンピシリン抵抗性遺
伝子を有するＥ、 ｃｏｌｉのプラスミドベクター（例
えば、ｐＵｃ１８）を使用して、ＴＲＢ−Ｒを付与する
配列を適当な制限部位中に挿入して、２つの抵抗性マー
カー：アンピシリン（Ａｍｐ）およびＴＲＢ （ＴＲＢ
−Ｒ）をもつプラスミドを得ることができる。次いで、
新しいプラスミドを、ＴＲＢ抵抗性遺伝子（ＴＲＢ−Ｒ
）の内部に少なくとも１つの認識部位を有する制限酵素
で消化することによって、直線化し、こうして複製由来
および非変更のアンピシリンに対する抵抗性を残すこと
ができる。ＴＲＢ−Ｒ領域中の外来ＤＮＡの挿入は、形
質転換した有機体を、同時のアンピシリン抵抗性および
ＴＲＢ感受性について選択可能とする。
ＴＲＢ−Ｒを付与する配列は前述の部分的５ａｕ３Ａ’
ｒ制限断片である場合、便利に使用できる内部の制限部
位は（、］ａｌおよび／またはＥｃｏＲＶ制限部位であ
る（参照、第１図）。
ｒ制限断片である場合、便利に使用できる内部の制限部
位は（、］ａｌおよび／またはＥｃｏＲＶ制限部位であ
る（参照、第１図）。
本発明の他の実施態様に従い、ＴＲＢ−Ｒを付与する配
列は、適当なベクターを経て、サーモアクチノミセス・
アンチビチクス（Ｔ ｈｅｒｍｏａｃｔｉｎ。
列は、適当なベクターを経て、サーモアクチノミセス・
アンチビチクス（Ｔ ｈｅｒｍｏａｃｔｉｎ。
ｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ） ＡＴＣＣ１
４５７０菌株または任意の他のＴＲＢ産生菌株中に導入
することができる。この産生体の菌株の形質転換は、そ
の抗微生物産生物に対する菌株の抵抗性を付与するか、
あるいはより適当には、その抵抗性の程度を増加するこ
とによって、抗生物質の産生収率を改良することができ
る。事実、多数の場合において、抗生物質を産生ずる微
生物学的プロセスの効率は、産生体のそれ自体の産生物
の高い濃度に対する感受性により制限される［参照、カ
タギリに９、ジャーナル・オブ・アンチビオチフス（Ｊ
、 Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ） 、７．４５−５２．１
９５４］。
４５７０菌株または任意の他のＴＲＢ産生菌株中に導入
することができる。この産生体の菌株の形質転換は、そ
の抗微生物産生物に対する菌株の抵抗性を付与するか、
あるいはより適当には、その抵抗性の程度を増加するこ
とによって、抗生物質の産生収率を改良することができ
る。事実、多数の場合において、抗生物質を産生ずる微
生物学的プロセスの効率は、産生体のそれ自体の産生物
の高い濃度に対する感受性により制限される［参照、カ
タギリに９、ジャーナル・オブ・アンチビオチフス（Ｊ
、 Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ） 、７．４５−５２．１
９５４］。
本発明の配列の他の応用は、臨床的分離物中の同様なり
ＮＡ配列の存在を中程度ないし低い厳格さ下に検出する
プローブとして、それを使用することである。この目的
で、標識したＴＲＢ−Ｒ配列により表されるプローブを
試験試料の核酸分画とハイブリダイゼーションさせる。
ＮＡ配列の存在を中程度ないし低い厳格さ下に検出する
プローブとして、それを使用することである。この目的
で、標識したＴＲＢ−Ｒ配列により表されるプローブを
試験試料の核酸分画とハイブリダイゼーションさせる。
この試験の陽性は分離物中のこの種の抵抗性の存在を示
し、こうして試験した菌株が、サーモルピンに対するす
るＴＲＢ−Ｒ型の抵抗性を発生することができるか、あ
るいは既に発生している可能性を示唆する。
し、こうして試験した菌株が、サーモルピンに対するす
るＴＲＢ−Ｒ型の抵抗性を発生することができるか、あ
るいは既に発生している可能性を示唆する。
本発明のＴＲＢ−Ｒを付与する配列は、サーモアクチノ
ミセス・アンチビチクス（Ｔ ｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏ
ｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ） Ａ Ｔ
ＣＣ１４５７０ｎｏＤＮＡ抽出物から、特異的制限酵素
（例えば、Ｓａｕ ３ＡＩ）を使用する部分的消化、
ＴＲＢに対して自然に感受性である所定の宿主細胞につ
いて既知のベクターの結合、ＴＲＢに対する抵抗性を獲
得した形質転換した細胞の選択、および獲得した抵抗性
の原因であるＤＮＡ配列の分離により、調製することが
できる。単一のプロセスの工程は、この分野においてそ
れ自体既知の技術に従い実施され、これらの技術はこの
開示中に含まれる情報を基準にして当業者は容易に反復
することができるので、ここで詳細に説明しない。
ミセス・アンチビチクス（Ｔ ｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏ
ｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ） Ａ Ｔ
ＣＣ１４５７０ｎｏＤＮＡ抽出物から、特異的制限酵素
（例えば、Ｓａｕ ３ＡＩ）を使用する部分的消化、
ＴＲＢに対して自然に感受性である所定の宿主細胞につ
いて既知のベクターの結合、ＴＲＢに対する抵抗性を獲
得した形質転換した細胞の選択、および獲得した抵抗性
の原因であるＤＮＡ配列の分離により、調製することが
できる。単一のプロセスの工程は、この分野においてそ
れ自体既知の技術に従い実施され、これらの技術はこの
開示中に含まれる情報を基準にして当業者は容易に反復
することができるので、ここで詳細に説明しない。
本発明のＴＲＢ−Ｒを付与する配列を調製する他の方法
は、この開示にかんがみて当業者にとって明らかであり
、そして、例えば、サーモアクチノミセス・アンチビチ
クス（Ｔ ｈｅｒｍｏａｃｔｆｎｏｍｙｃｅｓ ａｎ
ｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ） Ａ Ｔ ＣＣ１４５７０の前
述の断片またはその下位断片のような配列を使用して、
中程度ないし低い厳格さ（または高い厳格さ）において
それとハイブリダイゼーションしそしてＴＲＢ−Ｒを付
与する能力を有するＤＮＡ配列を取り出す方法を包含す
る。また、合成プローブは、ＴＲＢ−Ｒを付与する配列
またはその一部分、例えば、詳しくは、ＴＲＢ抵抗性の
遺伝情報を指定する遺伝子の配列決定後、慣用方法によ
り調製することができる。
は、この開示にかんがみて当業者にとって明らかであり
、そして、例えば、サーモアクチノミセス・アンチビチ
クス（Ｔ ｈｅｒｍｏａｃｔｆｎｏｍｙｃｅｓ ａｎ
ｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ） Ａ Ｔ ＣＣ１４５７０の前
述の断片またはその下位断片のような配列を使用して、
中程度ないし低い厳格さ（または高い厳格さ）において
それとハイブリダイゼーションしそしてＴＲＢ−Ｒを付
与する能力を有するＤＮＡ配列を取り出す方法を包含す
る。また、合成プローブは、ＴＲＢ−Ｒを付与する配列
またはその一部分、例えば、詳しくは、ＴＲＢ抵抗性の
遺伝情報を指定する遺伝子の配列決定後、慣用方法によ
り調製することができる。
ＴＲＢ−Ｒを付与する配列を調製する他の方法は、通常
の形質転換技術または同様な既知の技術に従い、ＴＲＢ
−Ｒ仲介抵抗性を付与するために使用するｃＤＮＡ中に
ＲＮＡ配列をコピーすることを包含する。
の形質転換技術または同様な既知の技術に従い、ＴＲＢ
−Ｒ仲介抵抗性を付与するために使用するｃＤＮＡ中に
ＲＮＡ配列をコピーすることを包含する。
次の節において報告または言及する分子生物学の方法お
よびプロトコルの多くは、この分野においてそれ自体既
知であり、そして当業者の背景の知識の一部分である。
よびプロトコルの多くは、この分野においてそれ自体既
知であり、そして当業者の背景の知識の一部分である。
それらは、また、多数の参考文献およびマニュアル、例
えば、次のものにおいて報告されている：ホブウッド（
Ｈｏｐｗｏｏｄ） Ｄ 。
えば、次のものにおいて報告されている：ホブウッド（
Ｈｏｐｗｏｏｄ） Ｄ 。
Ａ、ら、（１９８５）ストレプトマイセスの遺伝子操作
、実験室のマニュアル（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐ
ｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓ ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ、 ａ Ｌ ａｂｏｔａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）
、Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄ
ａｔｉ。
、実験室のマニュアル（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐ
ｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓ ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ、 ａ Ｌ ａｂｏｔａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）
、Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄ
ａｔｉ。
ｎ１英国ノーウィッチ；マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ
）Ｔ、ら、分子クローニング、研究所のマニアル（Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 ａ Ｌ ａ
ｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ） 、Ｃ，Ｓ、Ｈ，Ｌａ
ｂｏｔａｔｏｒｙ、 コールド・スプリングｊハーバ−
（Ｃｏｌｄ Ｓ ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ。
）Ｔ、ら、分子クローニング、研究所のマニアル（Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 ａ Ｌ ａ
ｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ） 、Ｃ，Ｓ、Ｈ，Ｌａ
ｂｏｔａｔｏｒｙ、 コールド・スプリングｊハーバ−
（Ｃｏｌｄ Ｓ ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ。
ｒ） 、ニューヨーク：および分子生物学における現在
のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ ｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）
、ｌ ９８７、Ｇ ｒｅｅｎＰ ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ａ ５ｓｏｃｉａｔｅｓおよびＷｉｌｅｙ −１ｎｔ
ｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク。
のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ ｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）
、ｌ ９８７、Ｇ ｒｅｅｎＰ ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ａ ５ｓｏｃｉａｔｅｓおよびＷｉｌｅｙ −１ｎｔ
ｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク。
この明細書において、退屈な、時間を消費する、当業者
にとって以上である、これらの既知の技術の長い報告を
回避するために、既知のプロトコルおよび方法の両者に
ついての、所定の参考文献およびマニュアルの引用に広
範な報告を行う。明瞭のため、前述のマニュアルを、そ
れぞれ、「ホブウッド」、「マニアチス」および「現在
のプロトコル」と呼ぶ。
にとって以上である、これらの既知の技術の長い報告を
回避するために、既知のプロトコルおよび方法の両者に
ついての、所定の参考文献およびマニュアルの引用に広
範な報告を行う。明瞭のため、前述のマニュアルを、そ
れぞれ、「ホブウッド」、「マニアチス」および「現在
のプロトコル」と呼ぶ。
第１図。サーモアクチノミセス・アンチビチクス（Ｔ
ｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔ
ｉｃｕｓ） Ａ Ｔ ＣＣ１４５７０のゲノムＤＮＡの
約４．０ＫｂｐのＳａｕ ３ＡＩのＤＮＡ断片の部分
的制限地図。
ｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔ
ｉｃｕｓ） Ａ Ｔ ＣＣ１４５７０のゲノムＤＮＡの
約４．０ＫｂｐのＳａｕ ３ＡＩのＤＮＡ断片の部分
的制限地図。
認識部位のおおよその番号および位置は、適当な制限酵
素を使用する単一のおよび二重の消化により決定され、
生ずるＤＮＡ断片の寸法はゲル電気泳動により決定され
る。
素を使用する単一のおよび二重の消化により決定され、
生ずるＤＮＡ断片の寸法はゲル電気泳動により決定され
る。
地図はその末端に２つのＸｈｏｌＩ部位（約２００ｂｐ
）を含有するインサートを明らかにし、これらはＳａｕ
３ＡＩおよびＢａｍＨＩの粘着末端、および少なく
ともＣ１ａｌ、ＥｃｏＲＩ。
）を含有するインサートを明らかにし、これらはＳａｕ
３ＡＩおよびＢａｍＨＩの粘着末端、および少なく
ともＣ１ａｌ、ＥｃｏＲＩ。
ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮａｒＩ、ＮｄｅＩ、Ｘ
ｂａＩ、ＸｈｏＩＩのための内部の制限部位を接合する
ことによって発生した。
ｂａＩ、ＸｈｏＩＩのための内部の制限部位を接合する
ことによって発生した。
次の制限酵素のための認識部位は検出されなかった：Ｂ
ａｍＨＩ、Ｂｇｌ Ｉ Ｌ ＫｐｎＩ、Ｐｓｔｒ、Ｓａ
ｃｌＳＳａｉｌＳＳｍａＩ、５ｐｈｌ。
ａｍＨＩ、Ｂｇｌ Ｉ Ｌ ＫｐｎＩ、Ｐｓｔｒ、Ｓａ
ｃｌＳＳａｉｌＳＳｍａＩ、５ｐｈｌ。
ｐＵｃ１８の多数のクローニング部位の制限部位は、へ
りに報告されている。
りに報告されている。
第２図は、サーモアクチノミセス・アンチビチクス（Ｔ
ｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏ
ｔｉｃｕｓ） ＡＴＣＣ１４５７０のゲノムＤＮＡを使
用するハイブリダイゼーション実験（サザンプロット）
の結果を示す。プラスミドｐＴＲＢ８のＥｃｏＲＩ−３
ａｌｌ断片を、サザンハイブリダイゼーションにおいて
プローブとして使用した。ゲノムＤＮＡを制限酵素で消
化し、次いで制限されたＤＮＡの電気泳動で分離し、次
いでナイロン膜上に移した。
ｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏ
ｔｉｃｕｓ） ＡＴＣＣ１４５７０のゲノムＤＮＡを使
用するハイブリダイゼーション実験（サザンプロット）
の結果を示す。プラスミドｐＴＲＢ８のＥｃｏＲＩ−３
ａｌｌ断片を、サザンハイブリダイゼーションにおいて
プローブとして使用した。ゲノムＤＮＡを制限酵素で消
化し、次いで制限されたＤＮＡの電気泳動で分離し、次
いでナイロン膜上に移した。
ジゴキシゲニン標識したプローブを、サーモアクチノミ
セス・アンチビチクス（Ｔ ｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍ
ｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ） Ａ Ｔ Ｃ
Ｃ１４５７０からのゲノムＤＮＡと、６８℃において１
６時間ハイブリダイゼーションした。過剰のプローブを
１５ミリモルのＮａＣ１および１．５ミリモルのクエン
酸ナトリウムで同一温度において洗浄した。レーン１は
陽性の対照としてプローブを含有した。レーン２は、陰
性の対照としてＩＫｂｐのＤＮＡラダー（ＧＩ ＢＣＯ
−ＢＲＬカタログ １９８８．５２０−５６１５）を含
有した。制限したゲノムのＤＮＡを次のようにして他の
レーンに適用した、レーン３：ＢａｍＨＩ；レーン４：
ＣＩａｌ；レーン５：ＢｇｌＩＩ；レーン６ ： Ｅｃ
ｏＲＩ ；レーン７：ＰｓｔＩ；レーン８ ： Ｐｖｕ
Ｉ １．分子量のマーカーを左側および右側に示す。
セス・アンチビチクス（Ｔ ｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍ
ｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ） Ａ Ｔ Ｃ
Ｃ１４５７０からのゲノムＤＮＡと、６８℃において１
６時間ハイブリダイゼーションした。過剰のプローブを
１５ミリモルのＮａＣ１および１．５ミリモルのクエン
酸ナトリウムで同一温度において洗浄した。レーン１は
陽性の対照としてプローブを含有した。レーン２は、陰
性の対照としてＩＫｂｐのＤＮＡラダー（ＧＩ ＢＣＯ
−ＢＲＬカタログ １９８８．５２０−５６１５）を含
有した。制限したゲノムのＤＮＡを次のようにして他の
レーンに適用した、レーン３：ＢａｍＨＩ；レーン４：
ＣＩａｌ；レーン５：ＢｇｌＩＩ；レーン６ ： Ｅｃ
ｏＲＩ ；レーン７：ＰｓｔＩ；レーン８ ： Ｐｖｕ
Ｉ １．分子量のマーカーを左側および右側に示す。
レーン１〜４は、より短い電気泳動分離からのものであ
り、より短いＤＮＡ断片を立証する（対応する分子量マ
ーカーは左側に存在する；レーン５〜８はより長い実験
からのものであり、そして対応する分子量マーカーは、
この場合において、右側に存在する）。
り、より短いＤＮＡ断片を立証する（対応する分子量マ
ーカーは左側に存在する；レーン５〜８はより長い実験
からのものであり、そして対応する分子量マーカーは、
この場合において、右側に存在する）。
次の実施例によって、本発明およびその実施方法をさら
に説明する。これらの実施例は、本発明の範囲の限定を
意図しない。
に説明する。これらの実施例は、本発明の範囲の限定を
意図しない。
実施例Ｉ
ＴＲＢ−Ｒを付与する配列の分離
１．１ サーモアクチノミセス・アンチビチクス（Ｔ
ｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏ
ｔｉｃｕｓ） Ａ Ｔ ＣＣ１４５７０の合計のＤＮＡ
を分離し、制限エンドヌクレアーゼＳａｕ ３ＡＩで
部分的に消化し、そしてホップウッド（とくにｐ、７９
−８０を参照）および現在のプロトコル（と（に節２、
ユニット２．６および詳しくは２．６．１〜２．６゜８
参照）に記載されている手順に従いアガロースゲルの電
気泳動により大きさで分画した。
ｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏ
ｔｉｃｕｓ） Ａ Ｔ ＣＣ１４５７０の合計のＤＮＡ
を分離し、制限エンドヌクレアーゼＳａｕ ３ＡＩで
部分的に消化し、そしてホップウッド（とくにｐ、７９
−８０を参照）および現在のプロトコル（と（に節２、
ユニット２．６および詳しくは２．６．１〜２．６゜８
参照）に記載されている手順に従いアガロースゲルの電
気泳動により大きさで分画した。
１．２ 次いで、３．５〜１０Ｋｂの断片をＢａｍＨ
Ｉで直線化し、ホスファターゼ処理したプラスミドｐＵ
ｃ１８ （商業的に入手可能：その制限地図は現在のプ
ロトコル１．５．４に報告されている）と結合した。こ
の結合工程は本質的にホップウッド（ｐ、１５４−１５
７）に従い実施する、ｐＵＣ１８の直線化およびホスフ
ァターゼ処理は、通常の手順に従い実施する、参照、ホ
ップウッドｐ１３１−１３５．１５８−１５９および１
６４゜ １．３ 次いで、得られる結合混合物を使用して、Ｅ
、 ｃｏｌｉ細胞を形質転換する（参照、例えば、ホッ
プウッドｐ、３１−３２および１２０−１２１、それ以
上の技術的および方法の詳細について）。アンピシリン
（５０ｍｇ／Ｉりで選択後、組み換え原形質膜を含有す
る、約３６００の形質転換体が得られた。
Ｉで直線化し、ホスファターゼ処理したプラスミドｐＵ
ｃ１８ （商業的に入手可能：その制限地図は現在のプ
ロトコル１．５．４に報告されている）と結合した。こ
の結合工程は本質的にホップウッド（ｐ、１５４−１５
７）に従い実施する、ｐＵＣ１８の直線化およびホスフ
ァターゼ処理は、通常の手順に従い実施する、参照、ホ
ップウッドｐ１３１−１３５．１５８−１５９および１
６４゜ １．３ 次いで、得られる結合混合物を使用して、Ｅ
、 ｃｏｌｉ細胞を形質転換する（参照、例えば、ホッ
プウッドｐ、３１−３２および１２０−１２１、それ以
上の技術的および方法の詳細について）。アンピシリン
（５０ｍｇ／Ｉりで選択後、組み換え原形質膜を含有す
る、約３６００の形質転換体が得られた。
１．４ 次いで、これらの形質転換体を、５ｍｇ／ｌの
チアミン、０．１％のカサミノ酸および２５ ｍ ｇ
／ １のＴＲＢを含有するＭ９（現在のプロトコル１．
１．１−１．１．２）最小平板上で複製させて、ＴＲＢ
抵抗性について選択した；９クローンを抗生物質の存在
下に増殖する能力について選択した。制限マツピングに
より、それらはすべて同一であるように思われた。これ
らのクローン中に存在するプラスミドをｐ Ｔ ＲＢ’
８と命名した。
チアミン、０．１％のカサミノ酸および２５ ｍ ｇ
／ １のＴＲＢを含有するＭ９（現在のプロトコル１．
１．１−１．１．２）最小平板上で複製させて、ＴＲＢ
抵抗性について選択した；９クローンを抗生物質の存在
下に増殖する能力について選択した。制限マツピングに
より、それらはすべて同一であるように思われた。これ
らのクローン中に存在するプラスミドをｐ Ｔ ＲＢ’
８と命名した。
実施例２
選択したプラスミドがＴＲＢ−Ｒを付与する配列を含有
することの確証。
することの確証。
２．１ プラスミドｐＴＲＢ８を上で得られた細胞か
ら抽出しく現在のプロトコル１．６．１−１゜６．６）
核酸Ｅ、 ｃｏｌｉ ＤＨ５アルファ能力細胞を再形
質転換するために使用する（実施例１．３に記載されて
いる方法に従う）。すべてのアンピシリン抵抗性形質転
換体は、また、ＴＲＢに対して抵抗性であり、こうして
ＴＲＢ抵抗性はｐＵＣ１８に結合されたことが実証され
る。
ら抽出しく現在のプロトコル１．６．１−１゜６．６）
核酸Ｅ、 ｃｏｌｉ ＤＨ５アルファ能力細胞を再形
質転換するために使用する（実施例１．３に記載されて
いる方法に従う）。すべてのアンピシリン抵抗性形質転
換体は、また、ＴＲＢに対して抵抗性であり、こうして
ＴＲＢ抵抗性はｐＵＣ１８に結合されたことが実証され
る。
２．２ プラスミドの制限地図は、その末端に２つの
Ｘｈｏ１１部位を含有する抗体４．０Ｋｂｐの長さのイ
ンサート（参照、第１図）を明らかにし、これらはＳａ
ｕ ３ＡＩおよびＢａｍＨＩ粘着末端の接合により由
来し、Ｃ１ａＩ、Ｅｃ。
Ｘｈｏ１１部位を含有する抗体４．０Ｋｂｐの長さのイ
ンサート（参照、第１図）を明らかにし、これらはＳａ
ｕ ３ＡＩおよびＢａｍＨＩ粘着末端の接合により由
来し、Ｃ１ａＩ、Ｅｃ。
ＲＩ、ＥｃｏＲＶ、Ｈｆｎｄｌ ＩＩ、Ｎａｒｌ。
Ｎｄｅ ｌ５Ｘｈｏ Ｉ Ｉは存在するが、ＢａｍＨＩ
。
。
ＢｇｌｌＩ、Ｋｐｎｌ、ＰｓｔＩ、Ｓａｃ Ｉ、Ｓａ
］ Ｉ、Ｓｍａ Ｉ、’ Ｓｐｈ Ｉの認識部位は明ら
かに存在しない。
］ Ｉ、Ｓｍａ Ｉ、’ Ｓｐｈ Ｉの認識部位は明ら
かに存在しない。
２．３ インサートの主要な部分を、既知の手順に従
い、ＥｃｏＲＩおよび５ａｌＩで消化し、ジゴキシゲニ
ン標識し、そして種々の制限酵素（ＢａｍＨＬ Ｂｇ
Ｉ Ｉ Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕｌＩおよび
Ｃ１ａｌ）で消化したサーモアクチノミセス・アンチビ
チクス（Ｔ１１６ｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ａ
ｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ） ＡＴＣＣ１４５７０のゲノ
ムのＤＮＡとサザンブロツトハイブリダイゼーションし
た。ハイブリダイゼーションは、慣用方法で、また、標
識つけキットの製造業者の指示に報告されているように
して実施する［パイオケミア・ベーリンガー・マンハイ
ム（Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉａ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ） 、ＤＮＡの標識および検出、非
放射性、１９８９］。プローブの標識つけはジゴキシゲ
ニン−１１−ｄＵＴＰ ［べ一リンガー・マンハイム・
パイオケミア（Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈ
ｅｉｍ Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉａ）を使用して実施した
が、ゲノムのＤＮＡは、すでに上に報告した手順に従っ
た後、１％のアガロース上で電気泳動的に分離し、そし
てナイロン膜上に移した［シーン−スクリーン・プラス
（Ｇ ｅｎｅ Ｓ ｃｒｅｅｎ Ｐ １ｕＳ）；ニ
ュー・イングランド・ニュークリアー（Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ） 〕ｏ分離したＤＮＡ
のバンドを含有するゲルを、０．４ＮのＮａＯＨ−０，
６モルのＮａＣｌ中で室温において３０分間インキュベ
ーションして、ＤＮＡを変性し、次いでそれを１．５モ
ルのＮａＣ１−０，５モルのトリス−ＨＣｌ ｐＨ７
，５とともに３０分間インキュベーションし、そしてｌ
０ＸＳＳＣ（１，５モルのＮａＣｌ−０，１５モルのク
エン酸ナトリウム）中で調製したナイロン膜［ジーン・
スクリーン−プラス（Ｇ ｅｎｅ Ｓ ｃｒｅｅｎ
Ｐ １ｕｓ）、ＮＥＮ］上に移した。これはｌ０ＸＳ
ＳＣ中で一夜続け、次いでこの膜を空気乾燥し、そして
紫外線処理した。標識したプローブとのハイブリダイゼ
ーションは既知の手順に従い６８℃において実施し、こ
の手順は密封可能なプラスチックバッグ中の５ｘＳＳＣ
，０，１％（ｗ／ｖ）のＮ−ラウリルサルコシン、０．
２％（ｗ／ｖ）の５ＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）お
よび１％のブロッキング試薬を含有する溶液［ベーリン
ガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ） 、ＤＮＡの標識つけおよび検出の非放射性
キットＮｏ、１０９３６５７バイアル１１コの１０ｍ１
と予備ハイブリダイゼーションし、このバッグを密封し
、そして６８℃において約１時間インキュベーションす
ることを包含する。次いで、予備ハイブリダイゼーショ
ン溶液を廃棄し、そして約２．５ｍｌの新鮮なハイブリ
ダイゼーション溶液を変性した標識したプローブの溶液
（最終濃度、約１０ｎｇ／ｍ１）と−緒に膜上に配置す
る。再密封したバッグを６８℃において約１６時間イン
キュベーションする。過剰のプローブを６８℃において
０．１×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳで洗浄除去する
。
い、ＥｃｏＲＩおよび５ａｌＩで消化し、ジゴキシゲニ
ン標識し、そして種々の制限酵素（ＢａｍＨＬ Ｂｇ
Ｉ Ｉ Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕｌＩおよび
Ｃ１ａｌ）で消化したサーモアクチノミセス・アンチビ
チクス（Ｔ１１６ｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ａ
ｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ） ＡＴＣＣ１４５７０のゲノ
ムのＤＮＡとサザンブロツトハイブリダイゼーションし
た。ハイブリダイゼーションは、慣用方法で、また、標
識つけキットの製造業者の指示に報告されているように
して実施する［パイオケミア・ベーリンガー・マンハイ
ム（Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉａ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ） 、ＤＮＡの標識および検出、非
放射性、１９８９］。プローブの標識つけはジゴキシゲ
ニン−１１−ｄＵＴＰ ［べ一リンガー・マンハイム・
パイオケミア（Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈ
ｅｉｍ Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉａ）を使用して実施した
が、ゲノムのＤＮＡは、すでに上に報告した手順に従っ
た後、１％のアガロース上で電気泳動的に分離し、そし
てナイロン膜上に移した［シーン−スクリーン・プラス
（Ｇ ｅｎｅ Ｓ ｃｒｅｅｎ Ｐ １ｕＳ）；ニ
ュー・イングランド・ニュークリアー（Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ） 〕ｏ分離したＤＮＡ
のバンドを含有するゲルを、０．４ＮのＮａＯＨ−０，
６モルのＮａＣｌ中で室温において３０分間インキュベ
ーションして、ＤＮＡを変性し、次いでそれを１．５モ
ルのＮａＣ１−０，５モルのトリス−ＨＣｌ ｐＨ７
，５とともに３０分間インキュベーションし、そしてｌ
０ＸＳＳＣ（１，５モルのＮａＣｌ−０，１５モルのク
エン酸ナトリウム）中で調製したナイロン膜［ジーン・
スクリーン−プラス（Ｇ ｅｎｅ Ｓ ｃｒｅｅｎ
Ｐ １ｕｓ）、ＮＥＮ］上に移した。これはｌ０ＸＳ
ＳＣ中で一夜続け、次いでこの膜を空気乾燥し、そして
紫外線処理した。標識したプローブとのハイブリダイゼ
ーションは既知の手順に従い６８℃において実施し、こ
の手順は密封可能なプラスチックバッグ中の５ｘＳＳＣ
，０，１％（ｗ／ｖ）のＮ−ラウリルサルコシン、０．
２％（ｗ／ｖ）の５ＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）お
よび１％のブロッキング試薬を含有する溶液［ベーリン
ガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ） 、ＤＮＡの標識つけおよび検出の非放射性
キットＮｏ、１０９３６５７バイアル１１コの１０ｍ１
と予備ハイブリダイゼーションし、このバッグを密封し
、そして６８℃において約１時間インキュベーションす
ることを包含する。次いで、予備ハイブリダイゼーショ
ン溶液を廃棄し、そして約２．５ｍｌの新鮮なハイブリ
ダイゼーション溶液を変性した標識したプローブの溶液
（最終濃度、約１０ｎｇ／ｍ１）と−緒に膜上に配置す
る。再密封したバッグを６８℃において約１６時間イン
キュベーションする。過剰のプローブを６８℃において
０．１×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳで洗浄除去する
。
得られる結果は、ｐＴＲＢＳ中のインサートがサーモア
クチノミセス・アンチビチクス（Ｔ ｈｅｒｓｏａｃｔ
ｉｎｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ） Ａ
ＴＣＣ１４５７０のゲノム中に独特配列として存在する
という仮説と一致する。 本発明の主な特徴および態様
は、次の通りである。
クチノミセス・アンチビチクス（Ｔ ｈｅｒｓｏａｃｔ
ｉｎｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ） Ａ
ＴＣＣ１４５７０のゲノム中に独特配列として存在する
という仮説と一致する。 本発明の主な特徴および態様
は、次の通りである。
１、ａ）感受性微生物宿主中に形質転換するとき、ＴＲ
Ｂに対する抵抗性を付与することができる、サーモアク
チノミセス・アンチビチクス（Ｔ ｈｅｒｍｏａｃｔｉ
ｎｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ） Ａ
Ｔ ＣＣ１４５７０のゲノムのＳａｕ ３ＡＩ処理に
より得ることができる約４．０ＫｂｐのＤＮＡ断片、そ
の下位断片またはそれを含有するＤＮＡ配列、ｂ）感受
性微生物宿主中に形質転換するとき、ＴＲＢに対する抵
抗性を付与することができ、そしてａ）において上に述
べたＤＮＡ断片とハイブリダイゼーションする核酸配列
、 Ｃ）上のａ）において述べた断片とハイブリダイゼーシ
ョンし、そしてＴＲＢ−Ｒ仲介抵抗性を付与することが
できるＤＮＡインサートの一部分、 ｄ）ａ）またはｂ）において定義したＤＮＡ配列に対し
て同義性をもつ遺伝暗号の結果として同義性をもち、そ
して感受性微生物宿主中に形質転換するとき、ＴＲＢに
対する抵抗性を付与することができるＤＮＡ配列、 から選択されるヌクレオチド配列からなるＴＲＢ−Ｒを
付与する配列。
Ｂに対する抵抗性を付与することができる、サーモアク
チノミセス・アンチビチクス（Ｔ ｈｅｒｍｏａｃｔｉ
ｎｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ） Ａ
Ｔ ＣＣ１４５７０のゲノムのＳａｕ ３ＡＩ処理に
より得ることができる約４．０ＫｂｐのＤＮＡ断片、そ
の下位断片またはそれを含有するＤＮＡ配列、ｂ）感受
性微生物宿主中に形質転換するとき、ＴＲＢに対する抵
抗性を付与することができ、そしてａ）において上に述
べたＤＮＡ断片とハイブリダイゼーションする核酸配列
、 Ｃ）上のａ）において述べた断片とハイブリダイゼーシ
ョンし、そしてＴＲＢ−Ｒ仲介抵抗性を付与することが
できるＤＮＡインサートの一部分、 ｄ）ａ）またはｂ）において定義したＤＮＡ配列に対し
て同義性をもつ遺伝暗号の結果として同義性をもち、そ
して感受性微生物宿主中に形質転換するとき、ＴＲＢに
対する抵抗性を付与することができるＤＮＡ配列、 から選択されるヌクレオチド配列からなるＴＲＢ−Ｒを
付与する配列。
２、感受性微生物宿主中に形質転換するとき、ＴＲＢに
対する抵抗性を付与することができる、サーモアクチノ
ミセス・アンチビチクス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍ
ｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ） ＡＴＣＣ１
４５７０のゲノムのＳａｕ ３ＡＩ処理により得るこ
とができる約４．０ＫｂｐのＤＮＡ断片、その下位断片
またはそれを含有するＤＮＡ配列である、ＴＲＢ−Ｒを
付与する配列。
対する抵抗性を付与することができる、サーモアクチノ
ミセス・アンチビチクス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍ
ｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ） ＡＴＣＣ１
４５７０のゲノムのＳａｕ ３ＡＩ処理により得るこ
とができる約４．０ＫｂｐのＤＮＡ断片、その下位断片
またはそれを含有するＤＮＡ配列である、ＴＲＢ−Ｒを
付与する配列。
３、感受性微生物宿主中に導入するとき、ＴＲＢに対す
る抵抗性を付与することができ、そしてサーモアクチノ
ミセス・アンチビチクス（Ｔｈｅｒｓｏａｃｔｉｎｏａ
＋ｙｃｅｓ ａｎｔｆｂｉｏｔｉｃｕｓ） ＡＴＣＣ
１４５７０のゲノムのＳａｕ ３ＡＩ処理により得る
ことができる約４．０ＫｂｐのＤＮＡ断片、その下位断
片またはそれを含有するＤＮＡ配列とハイブリダイゼー
ションする核酸配列である、ＴＲＢ−Ｒを付与する配列
。
る抵抗性を付与することができ、そしてサーモアクチノ
ミセス・アンチビチクス（Ｔｈｅｒｓｏａｃｔｉｎｏａ
＋ｙｃｅｓ ａｎｔｆｂｉｏｔｉｃｕｓ） ＡＴＣＣ
１４５７０のゲノムのＳａｕ ３ＡＩ処理により得る
ことができる約４．０ＫｂｐのＤＮＡ断片、その下位断
片またはそれを含有するＤＮＡ配列とハイブリダイゼー
ションする核酸配列である、ＴＲＢ−Ｒを付与する配列
。
４、感受性微生物宿主中に形質転換するとき、ＴＲＢに
対する抵抗性を付与することができる、サーモアクチノ
ミセス・アンチビチクス（７’ ｈｅｒｓｏａｃｔｆｎ
ｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｆｂｉｏｔｊｃｕｓ） ＡＴＣ
Ｃ１４５７０のゲノムのＳａｕ ３ＡＩ処理により得
ることができる約４．０ＫｂｐのＤＮＡ断片、その下位
断片またはそれを含有するＤＮＡ配列とハイブリダイゼ
ーションするＤＮＡインサートの一部分である、ＴＲＢ
−Ｒを付与する配列。
対する抵抗性を付与することができる、サーモアクチノ
ミセス・アンチビチクス（７’ ｈｅｒｓｏａｃｔｆｎ
ｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｆｂｉｏｔｊｃｕｓ） ＡＴＣ
Ｃ１４５７０のゲノムのＳａｕ ３ＡＩ処理により得
ることができる約４．０ＫｂｐのＤＮＡ断片、その下位
断片またはそれを含有するＤＮＡ配列とハイブリダイゼ
ーションするＤＮＡインサートの一部分である、ＴＲＢ
−Ｒを付与する配列。
５、上記第１．２．３または４項記載のＴＲＢ−Ｒを付
与する配列からなる、微生物宿主の形質転換に適した組
み換えプラスミド。
与する配列からなる、微生物宿主の形質転換に適した組
み換えプラスミド。
６、上記第５項記載の組み換えプラスミドと形質転換し
た微生物宿主細胞。
た微生物宿主細胞。
７、サーモルピンの産生体である、上記第６項記載の微
生物細胞。
生物細胞。
８、ａ）感受性微生物宿主中に形質転換するとき、ＴＲ
Ｂに対する抵抗性を付与することができる、サーモアク
チノミセス・アンチビチクス（Ｔ ｈｅｒｍｏａｃｔｉ
ｎｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ） Ａ
Ｔ ＣＣ１４５７０のゲノムのＳａｕ ３ＡＩ処理に
より得ることができる約４．０ＫｂｐのＤＮＡ断片、そ
の下位断片またはそれを含有するＤＮＡ配列、ｂ）感受
性微生物宿主中に形質転換するとき、ＴＲＢに対する抵
抗性を付与することができ、そしてａ）において上に述
べたＤＮＡ断片とハイブリダイゼーションする核酸配列
、 Ｃ）上のａ）において述べた断片とハイブリダイゼーシ
ョンし、そしてＴ ＲＢ−Ｒ仲介抵抗性を付与すること
ができるＤＮＡインサートの一部分、 ｄ）ａ）またはｂ）において定義したＤＮＡ配列に対し
て同義性をもつ遺伝暗号の結果として同義性をもち、そ
して感受性微生物宿主中に形質転換するとき、ＴＲＢに
対する抵抗性を付与することができるＤＮＡ配列、 から選択されるヌクレオチド配列からなるＴＲＢ−Ｒを
付与する配列を調製する方法であって、ａ）ＴＲＢ産生
体である微生物のゲノムからＤＮＡ分画を抽出し、そし
てそれを特異的制限酵素で部分的に消化し、 ｂ）制限断片を感受性宿主細胞のためのベクターに結合
し、 Ｃ）獲得した抵抗性により形質転換した細胞を選択し、
そしてそれからＴＲＢ−Ｒを付与する配列を分離する、 からなる方法。
Ｂに対する抵抗性を付与することができる、サーモアク
チノミセス・アンチビチクス（Ｔ ｈｅｒｍｏａｃｔｉ
ｎｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ） Ａ
Ｔ ＣＣ１４５７０のゲノムのＳａｕ ３ＡＩ処理に
より得ることができる約４．０ＫｂｐのＤＮＡ断片、そ
の下位断片またはそれを含有するＤＮＡ配列、ｂ）感受
性微生物宿主中に形質転換するとき、ＴＲＢに対する抵
抗性を付与することができ、そしてａ）において上に述
べたＤＮＡ断片とハイブリダイゼーションする核酸配列
、 Ｃ）上のａ）において述べた断片とハイブリダイゼーシ
ョンし、そしてＴ ＲＢ−Ｒ仲介抵抗性を付与すること
ができるＤＮＡインサートの一部分、 ｄ）ａ）またはｂ）において定義したＤＮＡ配列に対し
て同義性をもつ遺伝暗号の結果として同義性をもち、そ
して感受性微生物宿主中に形質転換するとき、ＴＲＢに
対する抵抗性を付与することができるＤＮＡ配列、 から選択されるヌクレオチド配列からなるＴＲＢ−Ｒを
付与する配列を調製する方法であって、ａ）ＴＲＢ産生
体である微生物のゲノムからＤＮＡ分画を抽出し、そし
てそれを特異的制限酵素で部分的に消化し、 ｂ）制限断片を感受性宿主細胞のためのベクターに結合
し、 Ｃ）獲得した抵抗性により形質転換した細胞を選択し、
そしてそれからＴＲＢ−Ｒを付与する配列を分離する、 からなる方法。
９、微生物はサーモアクチノミセス・アンチビチクス（
Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉＭｏ
ｔｉｃｕｓ） ＡＴＣＣ１４５７０である、上記第８項
記載の方法。
Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉＭｏ
ｔｉｃｕｓ） ＡＴＣＣ１４５７０である、上記第８項
記載の方法。
１０、工程ａ）の制限酵素はＳａｕ ３ＡＩである、
上記第８または９項記載の方法。
上記第８または９項記載の方法。
１１、制限断片は約４．０ＫｂｐのＤＮＡ断片であり、
そしてベクターはＢａｍＨＩで直線化し、そしてホスフ
ァターゼ加熱したプラスミドｐＵＣ１８である、上記第
８〜１０項のいずれかに記載の方法。
そしてベクターはＢａｍＨＩで直線化し、そしてホスフ
ァターゼ加熱したプラスミドｐＵＣ１８である、上記第
８〜１０項のいずれかに記載の方法。
１２、感受性宿主細胞はＥ、 ｃｏｌｉである、上記第
８〜１１項のいずれかに記載の方法。
８〜１１項のいずれかに記載の方法。
１３、微生物細胞のゲノムから、対応する領域、または
それらを含有するインサートを検出し、分離し、あるい
は精製するための、上記第１．２．３または４項記載の
ＴＲＢ−Ｒを付与する配列の使用。
それらを含有するインサートを検出し、分離し、あるい
は精製するための、上記第１．２．３または４項記載の
ＴＲＢ−Ｒを付与する配列の使用。
１４、微生物細胞はＴＲＢ産生体である、上記第１３項
記載の使用。
記載の使用。
１５、ＴＲＢに対する微生物宿主の抵抗性を導入しまた
は増加するための上記第１．２．３または４項記載のＴ
ＲＢ−Ｒを付与する配列の使用。
は増加するための上記第１．２．３または４項記載のＴ
ＲＢ−Ｒを付与する配列の使用。
１６、微生物細胞はＴＲＢ産生体である、上記第１５項
記載の使用。
記載の使用。
１７、上記第１．２．３または４項記載の標識したＴＲ
Ｂ−Ｒ配列により表現されるプローブを核酸分画とハイ
ブリダイゼーションさせ、そして必要に応じて前記プロ
ーブとハイブリダイゼーションする核酸断片を分離する
ことからなる、ＴＲＢに対する抵抗性を付与することが
できる核酸配列、またはそれを含有するインサートを分
離し、同定し、または精製する方法。
Ｂ−Ｒ配列により表現されるプローブを核酸分画とハイ
ブリダイゼーションさせ、そして必要に応じて前記プロ
ーブとハイブリダイゼーションする核酸断片を分離する
ことからなる、ＴＲＢに対する抵抗性を付与することが
できる核酸配列、またはそれを含有するインサートを分
離し、同定し、または精製する方法。
第１図は、サーモアクチノミセス・アンチビチクス（Ｔ
ｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏ
ｔｉｃｕｓ） ＡＴＣＣ１４５７０のゲノムＤＮＡの約
４，０ＫｂｐのＳａｕ ３ＡＩのＤＮＡ断片の部分的
制限地図である。 第２図は、サーモアクチノミセス・アンチビチクス（Ｔ
ｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏ
ｔｉｃｕｓ） ＡＴＣＣ１４５７０のゲノムＤＮＡを使
用するハイブリダイゼーション実験（サザンプロット）
の結果を示す。 Ｔ抗７ｆ丁かｖのプ７ンノロ・／ト ＦＩＧ。
ｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏ
ｔｉｃｕｓ） ＡＴＣＣ１４５７０のゲノムＤＮＡの約
４，０ＫｂｐのＳａｕ ３ＡＩのＤＮＡ断片の部分的
制限地図である。 第２図は、サーモアクチノミセス・アンチビチクス（Ｔ
ｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏ
ｔｉｃｕｓ） ＡＴＣＣ１４５７０のゲノムＤＮＡを使
用するハイブリダイゼーション実験（サザンプロット）
の結果を示す。 Ｔ抗７ｆ丁かｖのプ７ンノロ・／ト ＦＩＧ。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ａ）感受性微生物宿主中に形質転換するとき、ＴＲ
Ｂに対する抵抗性を付与することができる、サーモアク
チノミセス・アンチビチクス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎ
ｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ１
４５７０のゲノムのＳａｕ ３ＡＩ処理により得ること
ができる約４．０ＫｂｐのＤＮＡ断片、その下位断片ま
たはそれを含有するＤＮＡ配列、 ｂ）感受性微生物宿主中に形質転換するとき、ＴＲＢに
対する抵抗性を付与することができ、そしてａ）におい
て上に述べたＤＮＡ断片とハイブリダイゼーションする
核酸配列、 ｃ）上のａ）において述べた断片とハイブリダイゼーシ
ョンし、そしてＴＲＢ−Ｒ仲介抵抗性を付与することが
できるＤＮＡインサートの一部分、 ｄ）ａ）またはｂ）において定義したＤＮＡ配列に対し
て同義性をもつ遺伝暗号の結果として同義性をもち、そ
して感受性微生物宿主中に形質転換するとき、ＴＲＢに
対する抵抗性を付与することができるＤＮＡ配列、から
選択されるヌクレオチド配列からなるＴＲＢ−Ｒを付与
する配列。 ２、感受性微生物宿主中に形質転換するとき、ＴＲＢに
対する抵抗性を付与することができる、サーモアクチノ
ミセス・アンチビチクス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍ
ｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ１４５
７０のゲノムのＳａｕ ３ＡＩ処理により得ることがで
きる約４．０ＫｂｐのＤＮＡ断片、その下位断片または
それを含有するＤＮＡ配列である、ＴＲＢ−Ｒを付与す
る配列。 ３、感受性微生物宿主中に導入するとき、ＴＲＢに対す
る抵抗性を付与することができ、そしてサーモアクチノ
ミセス・アンチビチクス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍ
ｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ１４５
７０のゲノムのＳａｕ ３ＡＩ処理により得ることがで
きる約４．０ＫｂｐのＤＮＡ断片、その下位断片または
それを含有するＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションす
る核酸配列である、ＴＲＢ−Ｒを付与する配列。 ４、感受性微生物宿主中に形質転換するとき、ＴＲＢに
対する抵抗性を付与することができる、サーモアクチノ
ミセス・アンチビチクス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍ
ｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ１４５
７０のゲノムのＳａｕ ３ＡＩ処理により得ることがで
きる約４．０ＫｂｐのＤＮＡ断片、その下位断片または
それを含有するＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションす
るＤＮＡインサートの一部分である、ＴＲＢ−Ｒを付与
する配列。 ５、上記第１、２、３または４項記載のＴＲＢ−Ｒを付
与する配列からなる、微生物宿主の形質転換に適した組
み換えプラスミド。 ６、上記第５項記載の組み換えプラスミドと形質転換し
た微生物宿主細胞。 ７、ａ）感受性微生物宿主中に形質転換するとき、ＴＲ
Ｂに対する抵抗性を付与することができる、サーモアク
チノミセス・アンチビチクス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎ
ｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ１
４５７０のゲノムのＳａｕ ３ＡＩ処理により得ること
ができる約４．０ＫｂｐのＤＮＡ断片、その下位断片ま
たはそれを含有するＤＮＡ配列、 ｂ）感受性微生物宿主中に形質転換するとき、ＴＲＢに
対する抵抗性を付与することができ、そしてａ）におい
て上に述べたＤＮＡ断片とハイブリダイゼーションする
核酸配列、 ｃ）上のａ）において述べた断片とハイブリダイゼーシ
ョンし、そしてＴＲＢ−Ｒ仲介抵抗性を付与することが
できるＤＮＡインサートの一部分、 ｄ）ａ）またはｂ）において定義したＤＮＡ配列に対し
て同義性をもつ遺伝暗号の結果として同義性をもち、そ
して感受性微生物宿主中に形質転換するとき、ＴＲＢに
対する抵抗性を付与することができるＤＮＡ配列、から
選択されるヌクレオチド配列からなるＴＲＢ−Ｒを付与
する配列を調製する方法であって、 ａ）ＴＲＢ産生体である微生物のゲノムからＤＮＡ分画
を抽出し、そしてそれを特異的制限酵素で部分的に消化
し、 ｂ）制限断片を感受性宿主細胞のためのベクターに結合
し、 ｃ）獲得した抵抗性により形質転換した細胞を選択し、
そしてそれからＴＲＢ−Ｒを付与する配列を分離する、
からなる方法。 ８、微生物細胞のゲノムから、対応する領域、またはそ
れらを含有するインサートを検出し、分離し、あるいは
精製するための、上記第１、２、３または４項記載のＴ
ＲＢ−Ｒを付与する配列の使用。 ９、ＴＲＢに対する微生物宿主の抵抗性を導入しまたは
増加するための上記第１、２、３または４項記載のＴＲ
Ｂ−Ｒを付与する配列の使用。 １０、上記第１、２、３または４項記載の標識したＴＲ
Ｂ−Ｒ配列により表現されるプローブを核酸分画とハイ
ブリダイゼーションさせ、そして必要に応じて前記プロ
ーブとハイブリダイゼーションする核酸断片を分離する
ことからなる、ＴＲＢに対する抵抗性を付与することが
できる核酸配列、またはそれを含有するインサートを分
離し、同定し、または精製する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP89203015 | 1989-11-28 | ||
| EP89203015.6 | 1989-11-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03183481A true JPH03183481A (ja) | 1991-08-09 |
Family
ID=8202513
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2315682A Pending JPH03183481A (ja) | 1989-11-28 | 1990-11-22 | 抗生物質サーモルビンに対する抵抗性を付与するｄｎａ配列 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0430066B1 (ja) |
| JP (1) | JPH03183481A (ja) |
| KR (1) | KR910009927A (ja) |
| AT (1) | ATE110777T1 (ja) |
| CA (1) | CA2030912A1 (ja) |
| DE (1) | DE69012065D1 (ja) |
| IE (1) | IE904270A1 (ja) |
-
1990
- 1990-11-22 AT AT90122299T patent/ATE110777T1/de active
- 1990-11-22 JP JP2315682A patent/JPH03183481A/ja active Pending
- 1990-11-22 DE DE69012065T patent/DE69012065D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-22 EP EP90122299A patent/EP0430066B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-27 IE IE427090A patent/IE904270A1/en unknown
- 1990-11-27 KR KR1019900019272A patent/KR910009927A/ko not_active Withdrawn
- 1990-11-27 CA CA002030912A patent/CA2030912A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0430066B1 (en) | 1994-08-31 |
| IE904270A1 (en) | 1991-06-05 |
| DE69012065D1 (de) | 1994-10-06 |
| KR910009927A (ko) | 1991-06-28 |
| EP0430066A1 (en) | 1991-06-05 |
| ATE110777T1 (de) | 1994-09-15 |
| CA2030912A1 (en) | 1991-05-29 |
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