JPH03184997A - Ｂ細胞分化因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、人について活性を有するＢ細胞分化因子（
以下、ｒＢｃＤＦＪと略記することがある。）に関する
。

〔従来の技術〕

抗原刺激を受は活性化された成熟Ｂ細胞は、Ｔ細胞の助
けにより分裂増殖するが、さらにＢ細胞が抗体産生細胞
にまで最終的に分化するには、１種またはそれ以上のＴ
細胞由来の分化誘導性の物質か必須であることが知られ
ている。この物質の存在はＲ，Ｗ、　Ｄｕｔｔｏｎら、
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ　　Ｒｅｖ、　２３．６６　　（
１９７５）　、　Ａ、　ＳｃｈｉｍｐｌとＥ、　Ｗｅｃ
ｋｅｒ　ら、ＮａｔｕｒｅＮ、　Ｂｉｏｌ、　　２３７
．　１５　（１９７２）により明らかにされた。彼らは
マウスのリンパ球混合物培養後の培養上清中または抗原
やマイトゲンにより刺激を受けたマウスのリンパ球培養
上清中に存在する物質が、マウスのＴ細胞を除去された
リンパ球細胞集団やヌードマウス由来のリンパ球のヒツ
ジ赤血球（ＳＲＢＣ）に対する１次免疫応答を増幅させ
ることを見出し、そのような作用を有する活性物質にＴ
リンパ球代替因子、すなわちＴＲＦという呼称を与えた
。

それ以来、ＴＲＦは抗原非特異的に主要組織適合遺伝子
複合体（以下、ＭＨＣと略する。）の−致を必要としな
い様式でＢ細胞に作用し、Ｂ細胞の分裂増殖を誘導せず
、Ｂ細胞の抗体産生細胞への分化を誘導する液性因子で
あると定義されている。

その後、このようなり細胞分化因子の存在を示す証拠が
蓄積されており、人においてもマウス同様の分化因子の
存在が示唆されている。現在では上述のように定義され
たＢ細胞を抗体産生細胞へ分化させる因子をＢＣＤＦと
総称するようになった。

このようにＢＣＤＦは人の体内でＢ細胞の抗体産生機能
に重要な働きをしている。ＢＣＤＦの臨床への応用は大
別して３つ考えられる。第１は、ＢＣＤＦによりＢＣＤ
Ｆ抗体を作り、ＢＣＤＦと抗ＢＣＤＦ抗体によるＢＣＤ
Ｆのイムノアッセイ系を用いて免疫学的な病態の解析に
応用することである。第２は、各種疾患の治療への応用
である。

例えば、Ｔ細胞のヘルパー機能低下に伴うＢ細胞抗体産
生能低下による免疫不全症患者にＢＣＤＦ単独または他
のリンホカインと共に投与することにより抗体産生機能
を正常に戻すことが考えられる。

さらに、ＢＣＤＦの応用として次のことが考えられる。

すなわち、Ｂ細胞増殖因子（ＢＣＧＦ）（Ｋ、　Ｙｏｓ
ｈｉｚａｋｉ　　ら、Ｊ、　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１
３０．１２４１（１９８３））。

その他のリンホカインを含むＴ細胞因子を培地に加える
ことにより正常Ｂ細胞を長期培養てきることが報告され
ている（Ｂ、　５ｒｅｄｎｉ　ら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍ
ｅｄ、。

１５４、１５００（１９８１）参照）。これらの培養正
常Ｂ細胞あるいはＥＢウィルスで形質転換したＢ細胞に
対し、適当な時期にＢＣＤＦを作用させることにより生
体外で抗体を産生させることが出来る。特定の抗体、例
えば、病原細菌、病原ウィルス、病原原虫、癌細胞など
の表面にある特定抗原を認識する抗体を産生ずるＢ細胞
をモノクローン化し、クローン化正常Ｂ細胞またはＥＢ
ウィルスで形質転換した細胞をＢＣＤＦとその他のリン
ホカインを組合せて培養し、有用なモノクローナル抗体
を産生させることが出来る。これら抗体は感染症や癌の
治療および診断に利用することが出来る。

従来、ＢＣＤＦを得る方法として、人末梢血などより分
離した正常人Ｔ細胞をマイトゲン刺激することによりＢ
ＣＤＦを産生させる方法が採られてきた。しかし、この
方法では、Ｔ細胞を十分に得ることが困難である点、マ
イトゲンを用いているため、ＢＣＤＦに有害なマイトゲ
ンが混入し、これを除去するのが困難である点、またＴ
細胞培養にはウシ胎児血清など血清成分を培地に添加す
る必要があり、これら添加タンパク質とＢＣＤＦを十分
分離することが出来ず、ＢＣＤＦを医療に用いるために
必要な純化ＢＣＤＦが得られないことが障害となってい
る点など問題が多く、工業的にＢＣＤＦを産生すること
は出来なかった。

また、人Ｔ細胞を人癌細胞と細胞融合して人Ｔ融合細胞
を得、これによりＢＣＤＦを産生せしめる方法も報告さ
れている（Ｏｋａｄａら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｏｄ、。

１５７．５８３　（１９８３））。しかし、人融合細胞
は継代中にリンホカイン産生能が低下して行くことが多
い。このように、これまでに実用的ＢＣＤＦ産生人融合
細胞は未だ開発されていない。

〔発明が解決しようとする課題〕

したがって、この発明の目的は上記問題点のないＢＣＤ
Ｆを提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは１人Ｔ細胞白血病ウィルス（以下、ｒＨＴ
ＬＶＪと略す。）により形質転換された人Ｔ細胞が高い
効率でＢＣＤＦを生産することを見出し、かかる知見に
基づいて本発明を完成したのである。すなわち、この発
明は下記の理化学的性質を有するＢ細胞分化因子 （１）分子量 ３．５±０．５ＸＩＯ’ダルトン（ゲル濾過法）２．２
±０．２Ｘ　１０’ダルトン（ＳＤＳ・ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法） （２）等電点　ｐＨ４，９〜５．１ （３）比活性　４．８　ＸＩＯ”以上（Ｕｌｏ、　０．
２８１１）を提供するものである。

人ＢＣＤＦ産生人Ｔ細胞株の作製は以下のように行なう
ことが出来る。人の末梢血・扁桃・馴帯血なとよりフィ
ルコールバックなどを用いた密度勾配遠心法等でリンパ
球を分離し、Ｎ、　ｙａｍａｍｏｔｏ。

５ｃｉｅｎｃｅ、２１７．　７３７　（１９８２）の方
法に準じてＨＴＬＶを用いて人Ｔ細胞を形質転換（トラ
ンスフォーメーション）する。例えば、下記の方法を用
いることができる。ウィルス産生細胞株ＭＴ−２をＸ線
照射（１２０００〜１４０００ラド）で不活化した細胞
１ｘ１０７／ｍｎと、上述のようにして得た人リンパ球
ｌＸｌＯ７／ｍＡを２０％ＦＣ８１１００μｇ／ｍＡ’
カナマイシン、２　ｔｔｇ／ｍ１ＮａＨＣＯａ、２５　
ｍＭ　Ｎ　−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒ
ａｚｉｎｅ−Ｎ　−−２−ｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｉｃ
　ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地
を入れたプラスチックシャーレ（ファルコン＃３００８
）に接種し５％Ｃ０２存在下３７°Ｃで培養する。１週
間に２回、半分の培地を新鮮な培地と交換しつつ２〜３
力月培養した後、リミティングダイリューション法によ
り株化する。株化した細胞の培養上清のＢＣＤＦ活性を
測定し、ＢＣＤＦ活性を有する株を得る。

この方法により株化した細胞として例えば、ＶＴｌと標
識された人Ｔ細胞株を用いることか出来る。ＶＴ−１を
増殖させるための特別な条件はなく、一般に用いられて
いる培養条件を適宜採用して行なえばよい。また、ＢＣ
ＤＦの産生も一般的な方法で行なえばよいが、好ましく
はタンパク質を含まない培地を用いて行なうべきである
。以下に、ＶＴ−１を用いてＢＣＤＦを製造する方法の
１例を示す。

ＶＴ−１を増殖させるのに好適な条件、例えば、ウシ胎
児血清（Ｆｅ２）を含む培地にてＶＴ−１を培養し、Ｖ
Ｔ−１の細胞数を増やした後、細胞を分離洗浄してＢＣ
ＤＦ産生に最適な条件、例えば、Ｆｅ２なとのタンパク
質を含まぬ完全合成培地に細胞を移し、さらに培養する
ことにより夾雑タンパク質の少ないＢＣＤＦを得ること
ができる。

ＶＴ−１を培養するのに用いる培地の主成分は市販の培
地でよい。例えば、ＲＰＭ１１６４０培地、改良イーグ
ル培地（ＭＥＭ）、　ダルベツコ改良イーグル培地（Ｄ
ＭＥＭ）、　　クリック培地などを使用することができ
る。これらの培地に対する添加物としてｉ）１＋ｎＡ’
当り約２０〜２５０単位、理想的には１ｍＡ当り約１０
０単位のペニシリン、ｉｉ）１ｍＡ当り１μｇ〜１０ｏ
１１ｇ１理想的にはＩｍＡ？当りＩＯμｇのゲンタマイ
シン、ｉｉｉ）１ｍ１当り２０〜２５０μｇ、理想的に
は１００μｇのストレプトマイシン、ｉｖ）Ｉｍｎ当り
約１００〜１０００μｇ、理想的には１ｍｊ？当り約３
００μｇの新鮮Ｌ−グルタミン、ｖ）１０〜６０ｍＭ、
理想的には２５ｍＭのヘペス緩衝液、ｖｉ）８〜２０ｍ
　Ｍ　、理想的には１６ｍＭのＮａＨＣＯ３、ｖｕ）　
５　Ｘ１０−４〜５Ｘ１０−’Ｍ、理想的には５Ｘ１０
−５Ｍの２−メルカプトエタノールなどを必要に応じて
用いることが出来る。

■Ｔ−１の細胞数を増やすのに最適な培地として、例え
ば上述の培地にさらに１〜３０％、好ましくは２０％の
Ｆｅ２を添加した培地を用いる。

ＢＣＤＦ産生のための最適な培地としては、Ｆｅ２を添
加しない上述の培地がある。Ｆｅ２を添加しない完全合
成培地中で４８時間培養後もＶＴ−１の生存率は７０％
以上が保持されている。

Ｔ細胞よりＢＣＤＦを生産する場合、従来は培地にＦｅ
２のようなタンパク質を添加したり、マイトゲンを添加
したりすることか必須であった（Ｔ、　Ｔｅｒａｎｉｓ
ｈｉら、Ｊ、　　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　１２８゜
１９０３　　（１９８２）　、　Ａ、　Ｍｕｒａｇｕｃ
ｈｉら、Ｊ、　　ｏｆＩｍｍｕｎｏｌ、　　１２７．　
４１２　（１９８１）参照）。

これに対してＶＴ−１を使用してＢＣＤＦを生産する場
合、培地にＦｅ２のような血清、血液中のタンパク質成
分、その他タンパク質成分を加える必要がなく、また通
常用いられているＴ細胞またはＢ細胞に対するマイトゲ
ンも加える必要がないことは特筆に値する。そのため、
高価なＦｅ２を用いないで安価にＢＣＤＦを生産するこ
とが出来るばかりでなく、人体に有害な異種タンパク質
やマイトゲンを含まない安全なりＣＤＦを容易に得るこ
とが出来る。

ＶＴ−１を用いてＢＣＤＦを生産する上記方法は種々の
環境的条件で行なわれる。しかし、好ましくはＶＴ−１
培養物は約３５〜３８°Ｃの温度範囲において約５〜ｌ
Ｏ％の炭酸ガスを含む湿度調節空気中に保持すべきであ
る。また、理想的には培地のｐＨは約７．０〜７．４と
僅かにアルカリ性の条件下に保持すべきである。ＶＴ−
１は平底ミクロプレートなと種々のタイプの培養器上１
００μｌ単位などの種々の容量で接種される。ファルコ
ン・ラブウェア・ディヴイジョン、ベクトン・ディッキ
ンソン・エンド・コーポレーション（ＦａｌｃｏｎＬａ
ｂｗａｒｅ、　Ｄｉｖ、　Ｂｅｃｔｏｎ、　Ｄｉｃｋｉ
ｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏ、）から市販されているフラス
コＮα３０１３または３０２５のような組織培養フラス
コも使用できる。別法として上記ファルコン・ラブウェ
アから市販されているボトルＮα３０２７のような回転
びんも培養容器として使用できる。

ＶＴ−１を培養して細胞数を増やすための最適条件とし
て、細胞の当初密度は培地１ｍＡあたりｌＸｌ０’細胞
ないし５Ｘ１０５細胞、好ましくは２Ｘ１０５細胞であ
る。上述の条件でＶＴ−１を培養すると、通常２〜７日
で培地１ｍｊ！当り５×１０５細胞から２Ｘ］０’細胞
程度細胞網胞密度が増加するので、再び新しい培地を加
えて培地ＩｍＡ’当りｌＸｌ０’　〜５×１０４細胞に
まで細胞密度を下げ、再び培養を続ける。このようにし
て目的とする細胞数になるまでＶＴ−１の培養を続けた
後、細胞を遠心分離等で分離し、細胞をタンパク質を含
まぬ完全合成培地で洗ってから新しい完全合成培地に接
種する。この時の細胞の当初密度は培地１ｒｒｌあたり
約ｌＸｌ０’細胞ないしｌＸｌＯ７細胞であることが好
ましく、理想的には培地ＩｎｎあたりｌＸｌ０’細胞で
ある。

ＶＴ−１を培養することによって生産されるＢＣＤＦ量
は経時的に変化する。例えば１ｍｊ２当りｌＸｌ０’初
発細胞密度でＶＴ−１をＲＰＭＩ１６４０培地（ｌｒｙ
ｌ当りペニシリン１００単位、ストレプトマイシン１０
０μｇ１ゲンタマイシン１０１１ｇおよびＮａＨＣｏ、
　１６　μＭを含む）で培養すると、ＢＣＤＦ活性は４
８時間後にピークレベルに達する。さらに、次の２４時
間に存在するＢＣＤＦ活性は僅かに減少する。このよう
にＲＰＭＩＩ６４０培地中のＶＴ−１でＢＣＤＦを生産
する至適培養時間は約２４〜７８時間である。

ＢＣＤＦの精製 ＢＣＤＦは塩析、真空透析、限外濾過、ゲル濾過クロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、り０マドフオーカシング
、逆相クロマトグラフィー焦点電気泳動およびゲル電気
泳動等の種々の方法によって上述の培養物上清から濃縮
して精製できる（実施例１参照）。

ＢＣＤＦの物理化学的性質 上述の方法でｖＴ−１より生産されるＢＣＤＦは以下の
性質を有する。

（１）分子量 前もってＰＢＳで平衡化したＡｃＡ　　３４カラム（Ｌ
ＫＢ、　Ｂｒｏｍｍａ、　Ｓｗｅｄ、）にＢＣＤＦを含
む、濃縮されたｖＴ−１培養上清を流し、ＰＢＳで溶出
すると、分子量３．５±０．５ＸＩＯ’ダルトンに対応
する位置にＢＣＤＦが溶出する。上述の方法で精製した
ＢＣＤＦを上述の方法でＨＰＬＣ用ＴＳＫ２０００ＳＷ
Ｇ（東洋ソーダ）を用いてゲル濾過すると、分子量３．
５±０．５Ｘ］０’ダルトンに対応する位置にＢＣＤＦ
が溶出する。又、５ＤＳＰＡＧＥ　（ＳＤＳ・ポリアク
リルアミドゲル電気泳動）にて泳動すると、２．２±０
．２×１０４ダルトンに対応する位置にＢＣＤＦが溶出
される。

（２）等電点 前述の方法でＶＴ−１より得たＢＣＤＦを含む培養液を
限外濾過により濃縮し、ＡｃＡ　　３４カラムにより分
離精製したＢＣＤＦをｐＨ７〜４の範囲でファルマシア
ＭｏｎｏＰカラムを用いてクロマトフオーカシングを行
なうと、ｐＨ４，９〜５．１の位置にＢＣＤＦが溶出す
る。これよりＢＣＤＦの等電点はｐＨ４，９〜５．１と
推定される。

（３）比活性　４．８　×１０３以上（Ｕｌｏ、　Ｄ、
　２ＬＯ）ＢＣＤＦＣＤ側定法 人ＢＣＤＦに反応してＩｇＧを産生する人Ｂ細胞株ＣＥ
　Ｓ　Ｓ　（Ｋ、　Ｙｏｓｈｉｚａｋｉら、Ｊ、　ｏｆ
　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ。

１３２．２９４８　（１９８４））を用いてＢＣＤＦ活
性を測定した。ＢＣＤＦ活性を測定する検液と６×１０
４個＋７）ＣＥＳＳを２００１ｔ１２（ＤＩＯ９６ＦＣ
３を含むＲＰＭＩ　Ｉ　６．４０培地（］ｍ！！当りペ
ニシリン１００単位、ストレプトマイシン１００μｇ１
ゲンタマイシン１ｏμｇおよびＮａＨＣＯ，。

］、６６ｍを含む）に入れる。この混合物を９６穴マイ
クロプレート中で３日間、５％　ｃｏ２存在下、３７°
Ｃで培養し、培養上清のＩｇＧ量を酵素免疫測定法によ
り測定する。

この条件において最大のＩｇＧ生産量（最高のＣＥＳＳ
の反応）の５０％を示すＢＣＤＦの活性をＩＵ／ｍｊ２
とした。

〔実施例〕

次に、本発明を実施例により説明する。

実施例１ （１）ＶＴ−１によるＢＣＤＦの製造 ２１容プラスチツクローラー培養器（ファルコン＃３０
２７）（以下、ローラーと称する。）中のＩＩ！の２０
％ＦＣ３含有ＲＰＭＩＩ６４０培地（２ｍＭグルタミン
、５Ｘ１０−’Ｍ　２ＭＥ、１００単位／ｍｌペニシリ
ン、１１０１ｚ／ｍＪ！ストレプトマイシン、２０μｇ
／ｍｌ！ゲンタマイシン、１６　ｍＭ　ＮａＨＣＯ２を
含有）に２Ｘ］０’／ｎｕ細胞数にＶＴ−１を接種し、
８　ｒｐｍで回転させつつ３日間、３７°Ｃで培養した
。培養後、培養物を遠心分離して細胞を集めＲＰＭ１１
６４０培地で２回細胞を洗った後、細胞を２１容ローラ
ー中１１のＲＰＭ１１６４０培地に１ｘｌＯ＠／ｍｊ７
細胞濃度に懸濁した。ローラーを８　ｒｐｍで回転させ
つつ２日間、３７°Ｃで培養する。培養後、培養物を遠
心分離して培養上清を得た。

上述のようにＶＴ−１を培養して得たＢＣＤＦを含む培
養上清よりＢＣＤＦを以下の方法で精製した。無細胞上
清１０Ｉ２を限外濾過膜（アミコンＹＭ−１０、アミコ
ン・コーポレーション、マサチューセッツ、ＵＳＡ）を
装着した限外濾過装置（アミコン大量処理用セル２００
０型、アミコン・コーポレーション、マサチューセッツ
、ＵＳＡ）を用いて窒素ガスにより４ｋｇ／ｃＩ］ｆの
圧力をかけ濾過した。濾過膜上部に残った１　００ｍ１
ｌの濃縮液をさらに限外濾過膜（アミコンＹＭ−１０）
を装着した限外濾過装置（アミコン、スタンダードセル
５２型）を用い窒素ガスにより４’ｋｇ／ｃｄの圧力を
かけて濾過した。濾過膜上部に残った５ｍｊ７の濃縮液
を採取した。

上述の濃縮した上清をＡｃＡ−３４ゲル濾過カラム（Ｌ
ＫＢ　Ｐｒｏｄｕｋｅｒ、　Ｓｗｅｄｅｎ、　２．６　
Ｘ　９０　ｃｍ）で６ 処理した。なお、ゲル濾過カラムはあらかじめＰＢＳ　
（ホスフェート・バッファーセイライン、０．１５Ｍ食
塩を含む０．０１Ｍホスフェート・バッファー、ｐＨ７
，０）で平衡化した。濃縮上清をＰＢＳで溶出し、溶出
液を５ｒｒｌずつ分取し、分取液のＢＣＤＦＣＤ上測定
した。ＢＣＤＦＣＤ上有する分画は分子量（３，５±０
．５Ｘ］Ｏ’ダルトンに相当するフラクションにＢＣＤ
Ｆが含まれていることがわかった。ゲル濾過カラムは次
の分子量マーカーで検定した。ブルーデキストラン２０
００（ファルマシア・ファインケミカルス、スウェーデ
ン）２Ｘ］、０’、フェリチン４．５×１Ｏｓ１アルド
ラーゼ１．５８×１０４、オブアルブミン４．５×１０
’、キモトリプシノーゲン２．５×１０４、チトクロー
ムＣ１，ｌ７ＸＩＯ’、またＢＣＤＦを含むフラクショ
ンを集め、限外濾過膜（アミコンＹＭ−１Ｏ）を装置し
た限外濾過装置を用いて２５ｍＭピペラジン−塩酸緩衝
液（ｐＨ６，３）に置換した。

クロマトフオーカシング ＡｃＡ−３４カラムクロマトグラフイーで分画されたＢ
ＣＤＦ画分をあらかじめ２５ｍＭピペラジン−塩酸緩衝
液（ｐ）（６，３）で平衡化したＭ　ｏｎ。

Ｐカラム（ファルマシア・ファインケミカルス、スウェ
ーデン）に通した。このカラムを２５ｍＭピペラジン−
塩酸緩液で洗った後、塩酸でｐＨ４，５に調整した４　
０ｒｙｌの１／１０希釈ポリバツフアー７４（ファルマ
シア・ファインケミカルス、スウェーデン）で溶出した
。カラム操作はファースト・プロティン・リキッド・ク
ロマトグラフィーＦＰＬＣ（ファルマシア・ファインケ
ミカルス、スウェーデン）を用い、流速は毎分０．５ｍ
ｊ２で行なった。溶出液を１ｍｊ７ずつ分取し、ＢＣＤ
ＦＣＤ上ｐＨを測定した。ＢＣＤＦＣＤ上ｐＨ４，９〜
５．１の位置に溶出された。

Ｍｏｎｏ　Ｐカラムより得たＢＣＤＦ活性画分を０．１
％　ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸水溶液）で緩衝化した逆
相クロマトグラフィー用カラムＰ　ｒ。

ＲＰＣＨＲ５／１０（ファルマシア・ファイン・ケミカ
ルス）にかけ、溶出液０．１％ＴＦＡ中のアセトニトリ
ル濃度を０から６０％まで直線的に増加させＢＣＤＦを
溶出した。アセトニトリル５０〜５５％で溶出される。

○、Ｄ、２８０のピークは他の０．　Ｄ、　２．８のピ
ークとは完全に分離しており、このピークに対応してＢ
ＣＤＦ活性が検出された。このピークを凍結乾燥して精
製ＢＣＤＦを得た。

ＶＴ−１のＦＣ８無添加培養上清１６８Ｉ！カラ精製し
たＢＣＤＦは、表１に示すごとく活性の回収率１８％で
、蛋白量当りの活性は約１．０００倍に上がった。

表　　　　１ （２１８ＣＤＦ精製蛋白の性質 （ｉ）分子量 前もってＰＢＳで平衡化したＡｃＡ ３４カラム （ＬＫＢ、　Ｂｒｏｍｍａ、　Ｓｗｅｄ、）にＢＣＤＦ
を含む、濃縮されたＶＴ−１培養上清を流し、ＰＢＳで
溶出したところ、分子量３．５±０．５×１０４ダルト
ンに対応する位置にＢＣＤＦか溶出した。

上述の方法で精製したＢＣＤＦを上述の方法でＨＰＬＣ
用ＴＳＫ−２０００３ＷＧ　（東洋ソーダ）を用いてゲ
ル濾過したところ、分子量３．５±０．５×１０４ダル
トンに対応する位置にＢＣＤＦが溶出シタ。マタ、５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥ　（ＳＤＳ　・ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法）にて泳動したところ、分子量２．２±０．２
×１０４ダルトンに対応する位置にＢＣＤＦが溶出され
た。

（ｉｉ）等電点 前述の方法でＶＴ−１より得たＢＣＤＦを含む培養液を
限外濾過により濃縮し、ＡｃＡ３４カラムにより分離精
製したＢＣＤＦをｐＨ７〜４の範囲でファルマシアＭｏ
ｎｏ　Ｐカラムを用いてクロマトフオーカシングを行な
ったところ、ｐＨ４，９〜５．１の位置にＢＣＤＦが溶
出した。これよりＢＣＤＦの等電点はｐＨ４，９〜５．
１と推定される。

０ （ｆｆｉ）比活性 上述したように、ＢＣＤＦの比活性は４．８　ＸＩＯ３
以上（Ｕｌｏ、Ｄ、　２．、）である。

（３）　　Ｂ　ＣＤ　Ｆの免疫学的性質（ｉ）人末梢血
よりＢ細胞を調製し、これよりブラスト化Ｂｍ胞を分離
した（Ｋ、　Ｙｏｓｈｊｚａｋｊら、Ｊ。

ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　　１３２．２９４８（１
９８４）参照）。すなわち、人Ｂ細胞をパーコールのグ
ラージェント（５０％〜７０％）中で遠心分離（４℃、
４００Ｇ、１５分）し、パーコールＰＢＳ溶液５０％〜
５５％に存在する細胞層を分取し、ブラスト化した低比
重Ｂ細胞を集めた。

低比重Ｂ細胞を１　ｍｌあたり２Ｘ１０５細胞に９６穴
プラスチツクマイクロプレート中の２００μｌのＲＰＭ
１１６４０培地に懸濁した。培地には１単位／ｍｎのＢ
ＣＤＦを含むＶＴ−１培養上清、１０％ＦＣ３，０，０
０２５％５ＡＣ１１ｍｌあたり１００単位のペニシリン
、１　ｍｌあたり１００μｇのストレプトマイシン、１
　ｍｌあたり１０μｇのゲンタマイシン、１６ｍＭのＮ
ａ　ＨＣＯ２を含有させた。

培養物を空気中５％炭酸ガス含有の湿度調節環境下３７
°Ｃに保ち、５日後Ｂ細胞を集めた。この細胞の抗体産
生能力をＢＣＤＦ活性検定の項に記述した通り検定した
。その結果、表２に示すように、ＢＣＤＦの添加量に対
応した抗体産生１１胞によるプラークを検出した。

表２ （五）人末梢血よりＢ細胞を調製し、５ＡＣ０，００２
Ｆ＋％を含む培地（１０％ＦＣ８，０，００２５％ＳＡ
Ｃ，１ｍｌ！あたり１００単位のペニシリン。

１ｍ！！あたり１００μｇのストレプトマイシン。

１ｍＡあたり１０μｇのゲンタマイシン、１６ｍＭのＮ
　ａ　ＨＣＯｓを含有するＲＰＭ１１６４０培地）にて
３日間培養後、（１）と同様のパーコールグラージェン
ト処理をしてブラスト化Ｂ細胞を分離した。

以下、（ｉ）と同じ方法により、Ｂ細胞の抗体産生能力
を検定した。結果を表３に示す。

表３ 〔発明の効果〕 本発明におけるＨＴＬＶをＴ細胞に感染させることによ
り得た形質転換された人Ｔ細胞株は、前述のＢＣＤＦ産
生方法に比べ、大量のＢＣＤＦを培地中に産生ずる点、
この細胞株は継代培養が出来、継代中にＢＣＤＦ産生能
力か低下することがない点、又、この細胞株は蛋白質を
全く含まない３ 完全合成培地中で、マイトゲンのような刺激剤を全く加
えることなくＢＣＤＦを産生し、混入蛋白質の少ないＢ
ＣＤＦを得、比較的容易な精製方法で純化したＢＣＤＦ
を得られる点などの特徴を有しており、本発明によりは
じめて人ＢＣＤＦの工業的生産が可能となった。

４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 下記の理化学的性質を有するＢ細胞分化因子。 （１）分子量 ３．５±０．５×１０＾４ダルトン（ゲル濾過法）２．
   ２±０．２×１０＾４ダルトン（ＳＤＳ・ポリアクリル
   アミドゲル電気泳動法） （２）等電点ｐＨ４．９〜５．１ （３）比活性４．８×１０＾３以上（Ｕ／Ｏ．Ｄ．＿２
   ＿８＿０）