JPH03187382A - ホスホリパーゼｄの遺伝情報を有するｄｎａ及びその用途 - Google Patents
ホスホリパーゼｄの遺伝情報を有するｄｎａ及びその用途Info
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- JPH03187382A JPH03187382A JP1325355A JP32535589A JPH03187382A JP H03187382 A JPH03187382 A JP H03187382A JP 1325355 A JP1325355 A JP 1325355A JP 32535589 A JP32535589 A JP 32535589A JP H03187382 A JPH03187382 A JP H03187382A
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
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- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
の製造法に関する。
ホスホリパーゼＤ （Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏ
ｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔｆｄｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ
；以下ＰＬＤと略すことがある）は、例えばリン脂質で
あるレシチン（ホスファチジルコリン）のリン酸とコリ
ン残基とのエステル結合を分解してホスファチジン酸（
Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）とコリンを遊離
する酵素であって、キャベツ、ホウレンソウ、カブ、ジ
ャガイモ、レタス等の葉、ニンジン、サトウダイコン、
ヒート等の根、大麦芽、綿実、緑豆モヤシ、エントウ豆
等の植物組織（酵素ハンドブック４５１−４５２頁参照
）、ストレプトマイセス属（特公昭５２−３９９１８号
、特公昭６０−４７１６号公報参照）やノカルデイオプ
シス属（特公昭６３−６２１９５号公報参照）等の微生
物にその存在を知られ、また、ストレプトマイセス・ク
ロモフスｈ 玉（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｈｒｏ
ｍｏｆｕｓｃｕｓ）の培養液から抽出されたホスホリパ
ーゼＤの精製についての報告がなされている。（Ｊ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ８５． ７９９５ （１９７９）
） ホスホリパーゼＤは血中リン脂質測定試薬への利用のほ
か、リン脂質の加水分解やホスホリパーゼの可逆反応を
利用する塩基交換反応による誘導体の製造に利用されて
いる酵素であることが知られている。（特開昭６３−３
６７９０号、特開昭６１−２３６７９３号公報参照） 〔発明が解決しようとする問題点〕 上記の如くホスホリパーゼＤ生産菌は種々報告されてい
るが、これら種々生産菌によるホスホリパーゼＤの基質
に対する特異性には個々差異があり、さらにホスホリパ
ーゼＤのアミノ酸配列も不明であり、ましてや個々生産
菌によるホスホリパーゼＤがどのようなアミノ酸配列で
あるかは全く推定できないものであった。このような状
況下、特にストレプトマイセス・クロモフスカス（Ｓ。
ｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔｆｄｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ
；以下ＰＬＤと略すことがある）は、例えばリン脂質で
あるレシチン（ホスファチジルコリン）のリン酸とコリ
ン残基とのエステル結合を分解してホスファチジン酸（
Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）とコリンを遊離
する酵素であって、キャベツ、ホウレンソウ、カブ、ジ
ャガイモ、レタス等の葉、ニンジン、サトウダイコン、
ヒート等の根、大麦芽、綿実、緑豆モヤシ、エントウ豆
等の植物組織（酵素ハンドブック４５１−４５２頁参照
）、ストレプトマイセス属（特公昭５２−３９９１８号
、特公昭６０−４７１６号公報参照）やノカルデイオプ
シス属（特公昭６３−６２１９５号公報参照）等の微生
物にその存在を知られ、また、ストレプトマイセス・ク
ロモフスｈ 玉（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｈｒｏ
ｍｏｆｕｓｃｕｓ）の培養液から抽出されたホスホリパ
ーゼＤの精製についての報告がなされている。（Ｊ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ８５． ７９９５ （１９７９）
） ホスホリパーゼＤは血中リン脂質測定試薬への利用のほ
か、リン脂質の加水分解やホスホリパーゼの可逆反応を
利用する塩基交換反応による誘導体の製造に利用されて
いる酵素であることが知られている。（特開昭６３−３
６７９０号、特開昭６１−２３６７９３号公報参照） 〔発明が解決しようとする問題点〕 上記の如くホスホリパーゼＤ生産菌は種々報告されてい
るが、これら種々生産菌によるホスホリパーゼＤの基質
に対する特異性には個々差異があり、さらにホスホリパ
ーゼＤのアミノ酸配列も不明であり、ましてや個々生産
菌によるホスホリパーゼＤがどのようなアミノ酸配列で
あるかは全く推定できないものであった。このような状
況下、特にストレプトマイセス・クロモフスカス（Ｓ。
ｃｈｒｏｍｏｆｕｓｃｕｓ）培養液から抽出し、精製し
て得たホスホリパーゼＤの生産効率は低いため、効率の
良い高純度かつ高品質ホスホリパーゼＤ生産法が望まれ
ていた。
て得たホスホリパーゼＤの生産効率は低いため、効率の
良い高純度かつ高品質ホスホリパーゼＤ生産法が望まれ
ていた。
また、ホスホリパーゼＤを構成するポリペプチドの一次
構造、及び、該酵素のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
の塩基配列については未発表であった。
構造、及び、該酵素のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
の塩基配列については未発表であった。
従って、ホスホリパーゼＤを構成するポリペプチドの一
次構造の決定、該酵素のア【ノ酸配列をコードするＤＮ
Ａの塩基配列の決定、及び、遺伝子工学による該酵素の
生産が望まれていた。
次構造の決定、該酵素のア【ノ酸配列をコードするＤＮ
Ａの塩基配列の決定、及び、遺伝子工学による該酵素の
生産が望まれていた。
本発明者らは、上記問題点に関し鋭意研究の結果、上記
ストレプトマイセス・クロモフスヵス（Ｓ、 ｃｈｒｏ
＋ｍｏｆｕｓｃｕｓ）に属する微生物よりホスホリパー
ゼＤを構成するポリペプチドのアミノ酸配列をコードす
る遺伝子を単離精製し、該酵素を構成するポリペプチド
の一次構造の決定、及び、該酵素のアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡの塩基配列を決定した。
ストレプトマイセス・クロモフスヵス（Ｓ、 ｃｈｒｏ
＋ｍｏｆｕｓｃｕｓ）に属する微生物よりホスホリパー
ゼＤを構成するポリペプチドのアミノ酸配列をコードす
る遺伝子を単離精製し、該酵素を構成するポリペプチド
の一次構造の決定、及び、該酵素のアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡの塩基配列を決定した。
また、該ホスホリパーゼＤ遺伝子を任意のベクターに導
入し、好ましい宿主−ベクター系にて宿主微生物を形質
転換体とし、該形質転換体を培養して、ホスホリパーゼ
Ｄ遺伝子情報を発現させ、該培養物からホスホリパーゼ
Ｄを確認し、優れた工業的生産方法を確立し、本発明を
完成するに至った。
入し、好ましい宿主−ベクター系にて宿主微生物を形質
転換体とし、該形質転換体を培養して、ホスホリパーゼ
Ｄ遺伝子情報を発現させ、該培養物からホスホリパーゼ
Ｄを確認し、優れた工業的生産方法を確立し、本発明を
完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
Ｎ末端側より第１図で表されるアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡ。
るＤＮＡ。
Ｎ末端側より第１図で表されるアミノ酸配列を保持する
ことを特徴とするベクター 宿主が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、
玉上しブトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、
サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属また
はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物であ
って、宿主にとって外来性であるＮ末端側より第１図で
表わされるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを保持する
ことを特徴とす示すアミノ酸配列、 宿主にとって外来性であるＮ末端側より第１図で表わさ
れるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを保持す示すアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡの遺伝情報を保持する形質
転換体を培養して、該培養物からホスホリパーゼＤを採
取することを特徴とするホスホリパーゼＤの製造法。
ことを特徴とするベクター 宿主が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、
玉上しブトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、
サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属また
はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物であ
って、宿主にとって外来性であるＮ末端側より第１図で
表わされるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを保持する
ことを特徴とす示すアミノ酸配列、 宿主にとって外来性であるＮ末端側より第１図で表わさ
れるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを保持す示すアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡの遺伝情報を保持する形質
転換体を培養して、該培養物からホスホリパーゼＤを採
取することを特徴とするホスホリパーゼＤの製造法。
本発明の第１図で表されるアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡにおいて、その第１図にて表記されるアミノ酸配列
のＮ末端側及びＣ末端側はアミノ酸残基またはポリペプ
チド残基を含む場合であってもよく、Ｎ末端側であるＡ
ｌａの上流にはさらに一個または複数のアミノ酸残基を
有してもよく、そのアミノ酸残基としては開始コドンま
たはシグナルペプチドが挙げられ、またＣ末端側のＶａ
ｌの下流には、さらに−個以上のアミノ酸残基を有して
もよい。
ＮＡにおいて、その第１図にて表記されるアミノ酸配列
のＮ末端側及びＣ末端側はアミノ酸残基またはポリペプ
チド残基を含む場合であってもよく、Ｎ末端側であるＡ
ｌａの上流にはさらに一個または複数のアミノ酸残基を
有してもよく、そのアミノ酸残基としては開始コドンま
たはシグナルペプチドが挙げられ、またＣ末端側のＶａ
ｌの下流には、さらに−個以上のアミノ酸残基を有して
もよい。
さらに、本発明のホスホリパーゼＤを構成するアミノ酸
配列は第１図で表わされるアミノ酸残基からなるポリペ
プチドによる酵素活性発現と同様の効果を発現する第１
図中のアミノ酸配列の一部であってもよい。
配列は第１図で表わされるアミノ酸残基からなるポリペ
プチドによる酵素活性発現と同様の効果を発現する第１
図中のアミノ酸配列の一部であってもよい。
本発明の第１図で表わされるアミノ酸配列をコードする
新規なりＮＡは、そのＮ末端側及びＣ末端側のアミノ酸
残基またはポリペプチド残基を含めたアミノ酸配列の各
アミノ酸に対応する一連のコドンのうちいずれか１個の
コドンからなるＤＮＡであればよい。
新規なりＮＡは、そのＮ末端側及びＣ末端側のアミノ酸
残基またはポリペプチド残基を含めたアミノ酸配列の各
アミノ酸に対応する一連のコドンのうちいずれか１個の
コドンからなるＤＮＡであればよい。
さらに、本発明のホスホリパーゼＤを構成するアくノ酸
配列をコードするＤＮＡは第１図で表わされるアミノ酸
配列からなるポリペプチドによる酵素活性発現と同様の
効果を発現する第１図中の一部分のアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡであってもよい。
配列をコードするＤＮＡは第１図で表わされるアミノ酸
配列からなるポリペプチドによる酵素活性発現と同様の
効果を発現する第１図中の一部分のアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡであってもよい。
上記ＤＮＡの代表例として、５′末端側より第２図で表
わされる塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができる
。該ＤＮＡは、５′末端の上流側にアミノ酸をコードす
るコドンを１個以上有したものでもよく、ＴＡＡ、ＴＡ
Ｇ、及びＴＧＡ以外のコドンであればよい。さらに、好
ましくはＡＴＧ、ＧＴＧ、それら以外の開始コドン又は
シグナルペプチドに対応するコドンを有したものを挙げ
ることができる。３′末端たるＧＴＧの下流側には、ア
ミノ酸をコードするコドンを１個以上有するか、又は翻
訳終止コドンを有するかのいずれでもよく、更に、その
３′末端側にアミノ酸をコードするコドンを１個以上有
する場合には、このアミノ酸をコードするコドンの３′
末端に翻訳終止コドンを有することが好ましい。
わされる塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができる
。該ＤＮＡは、５′末端の上流側にアミノ酸をコードす
るコドンを１個以上有したものでもよく、ＴＡＡ、ＴＡ
Ｇ、及びＴＧＡ以外のコドンであればよい。さらに、好
ましくはＡＴＧ、ＧＴＧ、それら以外の開始コドン又は
シグナルペプチドに対応するコドンを有したものを挙げ
ることができる。３′末端たるＧＴＧの下流側には、ア
ミノ酸をコードするコドンを１個以上有するか、又は翻
訳終止コドンを有するかのいずれでもよく、更に、その
３′末端側にアミノ酸をコードするコドンを１個以上有
する場合には、このアミノ酸をコードするコドンの３′
末端に翻訳終止コドンを有することが好ましい。
第１図に示されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又は
第２図に示されたＤＮＡは、例えば、ホスホリパーゼＤ
を生産するホスホリパーゼＤ遺伝子の供与体である微生
物より該微生物のＤＮＡを分離精製した後、超音波、制
限酵素などを用いて切断した該ＤＮＡと切断してリニヤ
−にした発現ベクターとを両ＤＮＡの平滑または接着末
端部においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉環させ、
斯くして得られた組み換えＤＮＡベクターを複製可能な
宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーとホスホ
リパーゼＤの活性とを指標としてスクリーニングして取
得した組み換えＤＮＡベクターを保持する微生物を培養
し、該培養菌体から該組み換えＤＮＡベクターを分離精
製し、次いで該組み換えＤＮＡベクターからホスホリパ
ーゼＤ遺伝子であるＤＮＡを取得すればよい。
第２図に示されたＤＮＡは、例えば、ホスホリパーゼＤ
を生産するホスホリパーゼＤ遺伝子の供与体である微生
物より該微生物のＤＮＡを分離精製した後、超音波、制
限酵素などを用いて切断した該ＤＮＡと切断してリニヤ
−にした発現ベクターとを両ＤＮＡの平滑または接着末
端部においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉環させ、
斯くして得られた組み換えＤＮＡベクターを複製可能な
宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーとホスホ
リパーゼＤの活性とを指標としてスクリーニングして取
得した組み換えＤＮＡベクターを保持する微生物を培養
し、該培養菌体から該組み換えＤＮＡベクターを分離精
製し、次いで該組み換えＤＮＡベクターからホスホリパ
ーゼＤ遺伝子であるＤＮＡを取得すればよい。
ＤＮＡの供与体である供与微生物としては放線菌類、好
ましくはストレプトマイセス・クロモフスカス（Ｓ、
ｃｈｒｏｍｏｆｕｓｃｕｓ） Ａ −０８４８菌株（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−３５１９，ＢＰ−３６１）又はその同一菌
株を再度寄託したストレプトマイセス・クロモフスカス
Ａ−０８４８（ＦＥＲＭ ’ ＢＰ−，２，６と−２７
）を利用するとよい。
ましくはストレプトマイセス・クロモフスカス（Ｓ、
ｃｈｒｏｍｏｆｕｓｃｕｓ） Ａ −０８４８菌株（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−３５１９，ＢＰ−３６１）又はその同一菌
株を再度寄託したストレプトマイセス・クロモフスカス
Ａ−０８４８（ＦＥＲＭ ’ ＢＰ−，２，６と−２７
）を利用するとよい。
該菌株の菌学的性状、培養手段、精製手段については特
公昭６０−４７１６号公報（第１５頁２９＋１ｊｌ下か
ら３行乃至第１７頁３４欄４行）に記載の通りである。
公昭６０−４７１６号公報（第１５頁２９＋１ｊｌ下か
ら３行乃至第１７頁３４欄４行）に記載の通りである。
遺伝子の供与体である微生物に由来するＤＮＡを採取す
るには以下の如く行う。
るには以下の如く行う。
例えば、上述の供与体である微生物を、液体培地で約１
−３日間通気撹拌培養し、得られる培養物を遠心分離し
て集菌し、次いでこれを溶菌させることによってホスホ
リパーゼＤ遺伝子を含有する溶菌物を調整する。溶菌方
法としては、例えばリゾチームやβ−グルカナーゼなど
の細胞壁溶解酵素による処理が施され、必要によりプロ
テアーゼなどの他の酵素やラウリル硫酸ナトリウムなど
の界面活性剤が併用され、さらに細胞壁の物理的破壊法
である凍結融解（特開昭６３−１８５３７１号公報参照
）やフレンチプレス処理を上述の溶菌法との組み合わせ
で行ってもよい。
−３日間通気撹拌培養し、得られる培養物を遠心分離し
て集菌し、次いでこれを溶菌させることによってホスホ
リパーゼＤ遺伝子を含有する溶菌物を調整する。溶菌方
法としては、例えばリゾチームやβ−グルカナーゼなど
の細胞壁溶解酵素による処理が施され、必要によりプロ
テアーゼなどの他の酵素やラウリル硫酸ナトリウムなど
の界面活性剤が併用され、さらに細胞壁の物理的破壊法
である凍結融解（特開昭６３−１８５３７１号公報参照
）やフレンチプレス処理を上述の溶菌法との組み合わせ
で行ってもよい。
この様にして得られた溶菌物からＤＮＡを分離精製する
には、常法に従って、例えばフェノール抽出による除蛋
白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、ア
ルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜組み合わせる
ことにより行うことができる。
には、常法に従って、例えばフェノール抽出による除蛋
白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、ア
ルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜組み合わせる
ことにより行うことができる。
分離精製された微生物ＤＮＡを切断する方法は、例えば
、超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができ
るが、得られるＤＮＡ断片とベクターとの結合を容易な
らしめるため、制限酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配
列に作用する。例えば、Ｓａｉ Ｔ、 Ｓａｃ Ｉ 、
Ｋｐｎ Ｉ 、 Ｘｈｏ Ｔ、Ｍｌｕ Ｉなどの
■型制限酵素が適している。
、超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができ
るが、得られるＤＮＡ断片とベクターとの結合を容易な
らしめるため、制限酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配
列に作用する。例えば、Ｓａｉ Ｔ、 Ｓａｃ Ｉ 、
Ｋｐｎ Ｉ 、 Ｘｈｏ Ｔ、Ｍｌｕ Ｉなどの
■型制限酵素が適している。
ベクターとしては、宿主微生物体内で自律的に増殖しう
るファージ又はプラスミドから遺伝子組み換え用として
構築されたものが適している。
るファージ又はプラスミドから遺伝子組み換え用として
構築されたものが適している。
ファージベクターとしては、例えば、エシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃａｌｉ）を宿主微生物
とする場合にはλｇｔ・λＣ９λｇｔ・λ８などが使用
できる。
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃａｌｉ）を宿主微生物
とする場合にはλｇｔ・λＣ９λｇｔ・λ８などが使用
できる。
また、プラスミドベクターとしては、例えば、エシェリ
ヒア−：２ ’Ｊ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｔ）を宿主微生物とする場合には、プラスミドｐＢＲ３
２２，ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４，ｐＵｃ １２
． ｐＵｃ １３． ｐＵｃ １Ｂ、 ｐＵｃ１９、
ｐＵＣ１１Ｂ、 ｐＩＮ Ｉなどが、同様にバチルス
・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）
には、プラスミドｐＴＵＢ 、 ｐＴＵＢ ２８５など
が使用でき、サツカロミ（−２＝セレビシエ（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）には、プ
ラスミドｐＡＭ ８２、ストレプトマイセス・リビダン
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ １ｉｖｉｄａｎｓ）に
はプラスミドｐＳＥＶ １（Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅ
ｔ （１９８７） ２１０： ４６８−４７５ （ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−Ｌ１２ダ ））、ｐｕ ６８０などが使
用できる。さらに、エシェリヒア ・’：１ ’Ｊ （
Ｅ、 ｃｏｌｔ）及びストレプトマイセス・１ビダンス
（Ｓ、 １ｉｖｉｄａｎｓ）などの二種以上の宿主微生
物体内で自律的に増殖可能なシャトルベクターを利用す
ることもできる。
ヒア−：２ ’Ｊ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｔ）を宿主微生物とする場合には、プラスミドｐＢＲ３
２２，ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４，ｐＵｃ １２
． ｐＵｃ １３． ｐＵｃ １Ｂ、 ｐＵｃ１９、
ｐＵＣ１１Ｂ、 ｐＩＮ Ｉなどが、同様にバチルス
・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）
には、プラスミドｐＴＵＢ 、 ｐＴＵＢ ２８５など
が使用でき、サツカロミ（−２＝セレビシエ（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）には、プ
ラスミドｐＡＭ ８２、ストレプトマイセス・リビダン
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ １ｉｖｉｄａｎｓ）に
はプラスミドｐＳＥＶ １（Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅ
ｔ （１９８７） ２１０： ４６８−４７５ （ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−Ｌ１２ダ ））、ｐｕ ６８０などが使
用できる。さらに、エシェリヒア ・’：１ ’Ｊ （
Ｅ、 ｃｏｌｔ）及びストレプトマイセス・１ビダンス
（Ｓ、 １ｉｖｉｄａｎｓ）などの二種以上の宿主微生
物体内で自律的に増殖可能なシャトルベクターを利用す
ることもできる。
この様なベクターを、先に述べたホスホリパーゼＤ遺伝
子供与体である微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素
と同じ制限酵素で切断して、ベクター断片を得ることが
好ましい。
子供与体である微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素
と同じ制限酵素で切断して、ベクター断片を得ることが
好ましい。
微生物ＤＮＡ断片とベクター断片とを結合させる方法は
、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよく、例
えば、微生物ＤＮＡ断片の接着末端とベクター断片の接
着末端とのアニーリングの後、適当なりＮＡリガーゼの
作用により微生物ＤＮＡ断片とベクター断片との組み換
えＤＮＡを作成する。必要ならばアニーリングの後、宿
主微生物に移入して、生体内のＤＮＡリガーゼを利用し
て組み換えＤＮＡを作成することもできる。
、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよく、例
えば、微生物ＤＮＡ断片の接着末端とベクター断片の接
着末端とのアニーリングの後、適当なりＮＡリガーゼの
作用により微生物ＤＮＡ断片とベクター断片との組み換
えＤＮＡを作成する。必要ならばアニーリングの後、宿
主微生物に移入して、生体内のＤＮＡリガーゼを利用し
て組み換えＤＮＡを作成することもできる。
宿主微生物としては、組み換えＤＮＡが安定かつ自律的
に増殖可能で、且つ外来性ＤＮＡの形質が発現のできる
ものであればよく、例えば宿主微生物がエシェリヒア・
Ｄ ’Ｊ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に属
する微生物の場合、エシェリヒア・ＤＩＪＤ）１１ （
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨＩ） 、エシ
ェリヒア・旦ＩＪ）Ｉ８１０１ （ε５ｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ １０１）、エシェリヒア・コリ
ＩＡ ３１１０ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
Ｗ ３１１０）、エシェリヒア・Ｄ ’Ｊ Ｃ６００
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃ６００）、等
が利用できる。また、宿主微生物が玉上しプトマイセス
・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ １ｉｖｉｄ
ａｎｓ）の場合、ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ
−２４（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ １ｉｖｉｄａｎｓ
ＴＫ−２４） （ＦＥＲＭＢＰ−１１Ｆ１．Ｓ ）
、ストレプトマイセス・リビダンス ＴＫ −２１（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ １ｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ−２
１）、その他、ストレプトマイセス・グリセロファスカ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃ
ｕｓ） 、ストレプトマ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）等を利用できる。
に増殖可能で、且つ外来性ＤＮＡの形質が発現のできる
ものであればよく、例えば宿主微生物がエシェリヒア・
Ｄ ’Ｊ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に属
する微生物の場合、エシェリヒア・ＤＩＪＤ）１１ （
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨＩ） 、エシ
ェリヒア・旦ＩＪ）Ｉ８１０１ （ε５ｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ １０１）、エシェリヒア・コリ
ＩＡ ３１１０ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
Ｗ ３１１０）、エシェリヒア・Ｄ ’Ｊ Ｃ６００
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃ６００）、等
が利用できる。また、宿主微生物が玉上しプトマイセス
・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ １ｉｖｉｄ
ａｎｓ）の場合、ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ
−２４（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ １ｉｖｉｄａｎｓ
ＴＫ−２４） （ＦＥＲＭＢＰ−１１Ｆ１．Ｓ ）
、ストレプトマイセス・リビダンス ＴＫ −２１（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ １ｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ−２
１）、その他、ストレプトマイセス・グリセロファスカ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃ
ｕｓ） 、ストレプトマ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）等を利用できる。
宿主微生物に組み換えＤＮＡを移入する方法としては、
例えば、宿主微生物がエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒ ｉ
ｃｈ ｉａ）属に属する微生物の場合には、カルシウム
イオンの存在下で組み換えＤＮＡの移入を行い、またバ
チルス属に属する微生物の場合にはコンピテントセル法
またはリポソーム組み換えＤＮＡのプロトプラスト宿主
細胞内への電気的な融合移入法などを採用することがで
き、さらにマイクロインジェクション法を用いてもよい
。
例えば、宿主微生物がエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒ ｉ
ｃｈ ｉａ）属に属する微生物の場合には、カルシウム
イオンの存在下で組み換えＤＮＡの移入を行い、またバ
チルス属に属する微生物の場合にはコンピテントセル法
またはリポソーム組み換えＤＮＡのプロトプラスト宿主
細胞内への電気的な融合移入法などを採用することがで
き、さらにマイクロインジェクション法を用いてもよい
。
宿主微生物への目的組み換えＤＮＡ移入の有無について
の選択は、予め台底したホスホリパーゼＤのＤＮＡプロ
ーブを３２ｐ等で放射能ラベル化し、予め予想した遺伝
子ライブラリーとのコロニーハイブリダイゼーション法
によりポジティブ株を目的の形質転換体として選択すれ
ばよい。
の選択は、予め台底したホスホリパーゼＤのＤＮＡプロ
ーブを３２ｐ等で放射能ラベル化し、予め予想した遺伝
子ライブラリーとのコロニーハイブリダイゼーション法
によりポジティブ株を目的の形質転換体として選択すれ
ばよい。
上記の遺伝子操作に−、船釣に使用される量的関係は、
供与微生物からのＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡを０．１
−１０μｇに対し、制限酵素を約１１０ｕ、リガーゼ約
３００ ｕ、その他の酵素約１１０ｕ、程度が例示され
る。
供与微生物からのＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡを０．１
−１０μｇに対し、制限酵素を約１１０ｕ、リガーゼ約
３００ ｕ、その他の酵素約１１０ｕ、程度が例示され
る。
かくして得られた形質転換体である微生物例えば、エシ
ェリヒア属に属し、エシェリヒア・ニ悲（Ｅ、 ｃｏｌ
ｉ）に属する微生物は、栄養培地に培養されることによ
り多量のホスホリパーゼＤを安定して産生じ得る。
ェリヒア属に属し、エシェリヒア・ニ悲（Ｅ、 ｃｏｌ
ｉ）に属する微生物は、栄養培地に培養されることによ
り多量のホスホリパーゼＤを安定して産生じ得る。
形質転換体を具体的に例示すれば、第２図に示されたＤ
ＮＡをプラスミドｐＵＣ１１Ｂ （宝酒造■製）に組み
込み、宿主微生物エシェリヒア・ｚｌＪＤ）１１ （
Ｅ、ｃｏｌｉ Ｄｌｌｌ） （ＡＴＣＣ３３８４９）
（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、。
ＮＡをプラスミドｐＵＣ１１Ｂ （宝酒造■製）に組み
込み、宿主微生物エシェリヒア・ｚｌＪＤ）１１ （
Ｅ、ｃｏｌｉ Ｄｌｌｌ） （ＡＴＣＣ３３８４９）
（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、。
ｅｔ、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ、
ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８２）、
５０４−５０６）にトランスフォーメーションし、
ホスホリパーゼＤを生成する微生物を選択して得たエシ
ェリヒア・コリ ＤＨ１（Ｅ、ｃｏｌｉＤｌｌｌ） ・
ｐｃＰＬＤｌ（ＦＥＲＭ−ＢＰ −２／ｙ Ｉ？ ３
）が挙げられる。
ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８２）、
５０４−５０６）にトランスフォーメーションし、
ホスホリパーゼＤを生成する微生物を選択して得たエシ
ェリヒア・コリ ＤＨ１（Ｅ、ｃｏｌｉＤｌｌｌ） ・
ｐｃＰＬＤｌ（ＦＥＲＭ−ＢＰ −２／ｙ Ｉ？ ３
）が挙げられる。
この様にして一度選択された組み換えＤＮＡは、該組み
換えＤＮＡを保持する形質転換微生物から取り出され、
他の宿主微生物に移入することも容易に実施できる。
換えＤＮＡを保持する形質転換微生物から取り出され、
他の宿主微生物に移入することも容易に実施できる。
また、さらに、該組み換えＤＮＡから制限酵素などによ
り切断してホスホリパーゼＤを構成するポリペプチドの
アミノ酸配列をコードするＤＮＡを切出し、前記と同様
な方法により切断して得られる他の開環ベクター末端と
を結合させて新規な特徴を有する組み換えＤＮＡを作製
して、他の宿主微生物に移入することも容易に実施でき
る。
り切断してホスホリパーゼＤを構成するポリペプチドの
アミノ酸配列をコードするＤＮＡを切出し、前記と同様
な方法により切断して得られる他の開環ベクター末端と
を結合させて新規な特徴を有する組み換えＤＮＡを作製
して、他の宿主微生物に移入することも容易に実施でき
る。
この様な例を具体的に例示すれば、第２図に示すレタＤ
ＮＡヲフラスミトｐＳＥＶ１ （ＦＥＲＭ−”ｊ （ｇ
タ ）に組み込み、宿主微生物ストレプトマイセス・ユ
ビダンス ＴＫ−２４（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ １
ｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ−２４）（ＰＥＲＭ ＢＰ−！
４１ｒＨ：）−ｙンス７．ｒ−メーションし、ホスホリ
パーゼＤを生成する微生物を選択して得たストレプトマ
イセス・リビダンスＴＫ −２４（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ １ｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ−２４） ・ｐＳＥＶ
ｌ−ＰＬＤ（ＰＥＲＭ−”’２１ｇ ）を挙げること
ができへ る。
ＮＡヲフラスミトｐＳＥＶ１ （ＦＥＲＭ−”ｊ （ｇ
タ ）に組み込み、宿主微生物ストレプトマイセス・ユ
ビダンス ＴＫ−２４（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ １
ｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ−２４）（ＰＥＲＭ ＢＰ−！
４１ｒＨ：）−ｙンス７．ｒ−メーションし、ホスホリ
パーゼＤを生成する微生物を選択して得たストレプトマ
イセス・リビダンスＴＫ −２４（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ １ｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ−２４） ・ｐＳＥＶ
ｌ−ＰＬＤ（ＰＥＲＭ−”’２１ｇ ）を挙げること
ができへ る。
また、本発明のホスホリパーゼＤは公知の遺伝子操作手
段によりペプチドの変異をなしてもよく、この様なムテ
ィンのＤＮＡは、本発明のホスホリパーゼＤ遺伝子から
遺伝子工学的手法により作製される人工変異遺伝子を意
味し、この人工変異遺伝子は部位特異的塩基変換法及び
目的遺伝子の特定ＤＮＡ断片を人工変異ＤＮＡ断片で置
換するなどの種々なる遺伝子工学的方法を使用して得ら
れ、斯くして取得された人工変異遺伝子のうち特に優れ
た性質を有するホスホリパーゼＤムティンＤＮＡについ
ては最終的にはこのムティンＤＮＡをベクターに挿入せ
しめて組み換えＤＮＡを作威し、これを宿主微生物に移
入させることによって、ホスホリパーゼＤムティンの製
造が可能である。
段によりペプチドの変異をなしてもよく、この様なムテ
ィンのＤＮＡは、本発明のホスホリパーゼＤ遺伝子から
遺伝子工学的手法により作製される人工変異遺伝子を意
味し、この人工変異遺伝子は部位特異的塩基変換法及び
目的遺伝子の特定ＤＮＡ断片を人工変異ＤＮＡ断片で置
換するなどの種々なる遺伝子工学的方法を使用して得ら
れ、斯くして取得された人工変異遺伝子のうち特に優れ
た性質を有するホスホリパーゼＤムティンＤＮＡについ
ては最終的にはこのムティンＤＮＡをベクターに挿入せ
しめて組み換えＤＮＡを作威し、これを宿主微生物に移
入させることによって、ホスホリパーゼＤムティンの製
造が可能である。
ホスホリパーゼＤをコードするＤＮＡを含むベクターの
具体的な例示としては、エシェリヒア・］ 茎ＤＨＩ
（Ｅ、 ｃｏｌｉ ＤＨＩ） ・ｐｃＰＬＤ １より採
取したプラスミドｐｃＰＬＤ１ 、ストレプトマイセス
・ｇ ５ダンス ＴＫ−２４（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ １ｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ−２４）より採取したｐＳ
ＥＶ−ＰＬＤが挙げられる。（それぞれの制限酵素地図
を第４図、第５図に示す。）また、プラスミドｐｃＰＬ
Ｄ１より得られるＰＬＤ遺伝子の制限酵素開裂地図は、
第６図に示される通りであった。（図中ｔＺＺ２Ｚｌは
シグナルペプチドを示す、）上述の方法によって得られ
たホスホリパーゼＤを構成するポリペプチドのアミノ酸
配列をコードするＤＮＡの塩基配列は、５ｃｉｅｎｃｅ
２１４ １２０５１２１０（１９８１年）に示されて
いるジデオキシ法で解読し、またホスホリパーゼＤを構
成するポリペプチドの全アミノ酸配列は、塩基配列より
予測決定した。また、以下の方法により培養精製した該
ホスホリパーゼＤであるポリペプチドを用いて、液相プ
ロティンシーケンサ−（ベックマン社製：ＢＥＣＫＭＡ
Ｎ ５ｙｓｔｅ＋＊ ８９０ ＭＥ）によりそのＮ末端
アミノ酸配列が、予測決定されたアミノ酸配列の一部と
一致することを確認した。プラスミドｐｃＰＬＤ１及び
プラスミドｐＳＥＶ−ＰＬＤの構築については第７図に
示す。（図中〔コはホスホリパーゼＤ遺伝子を示す。〕 形質転換体により該ホスホリパーゼＤを製造するに当た
っては、該形質転換体を栄養培地で培養して菌体内又は
培養液中に該ホスホリパーゼＤを産生せしめ、培養終了
後、得られた培養物を濾過又は遠心分離などの手段によ
り菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法又はリゾ
チームなどの酵素的方法で破壊し、又、必要に応じてＥ
ＤＴＡ及び／又は適当な界面活性剤等を添加して該ホス
ホリパーゼＤを可溶化し、水溶液として分離採取する。
具体的な例示としては、エシェリヒア・］ 茎ＤＨＩ
（Ｅ、 ｃｏｌｉ ＤＨＩ） ・ｐｃＰＬＤ １より採
取したプラスミドｐｃＰＬＤ１ 、ストレプトマイセス
・ｇ ５ダンス ＴＫ−２４（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ １ｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ−２４）より採取したｐＳ
ＥＶ−ＰＬＤが挙げられる。（それぞれの制限酵素地図
を第４図、第５図に示す。）また、プラスミドｐｃＰＬ
Ｄ１より得られるＰＬＤ遺伝子の制限酵素開裂地図は、
第６図に示される通りであった。（図中ｔＺＺ２Ｚｌは
シグナルペプチドを示す、）上述の方法によって得られ
たホスホリパーゼＤを構成するポリペプチドのアミノ酸
配列をコードするＤＮＡの塩基配列は、５ｃｉｅｎｃｅ
２１４ １２０５１２１０（１９８１年）に示されて
いるジデオキシ法で解読し、またホスホリパーゼＤを構
成するポリペプチドの全アミノ酸配列は、塩基配列より
予測決定した。また、以下の方法により培養精製した該
ホスホリパーゼＤであるポリペプチドを用いて、液相プ
ロティンシーケンサ−（ベックマン社製：ＢＥＣＫＭＡ
Ｎ ５ｙｓｔｅ＋＊ ８９０ ＭＥ）によりそのＮ末端
アミノ酸配列が、予測決定されたアミノ酸配列の一部と
一致することを確認した。プラスミドｐｃＰＬＤ１及び
プラスミドｐＳＥＶ−ＰＬＤの構築については第７図に
示す。（図中〔コはホスホリパーゼＤ遺伝子を示す。〕 形質転換体により該ホスホリパーゼＤを製造するに当た
っては、該形質転換体を栄養培地で培養して菌体内又は
培養液中に該ホスホリパーゼＤを産生せしめ、培養終了
後、得られた培養物を濾過又は遠心分離などの手段によ
り菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法又はリゾ
チームなどの酵素的方法で破壊し、又、必要に応じてＥ
ＤＴＡ及び／又は適当な界面活性剤等を添加して該ホス
ホリパーゼＤを可溶化し、水溶液として分離採取する。
この様にして得られた該ホスホリパーゼＤの水溶液を濃
縮するか、又は濃縮することなく硫安分画、ゲル濾過、
アフィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグ
ラフィー、イオン交換クロマトグラフィーにより処理し
て、純度のよい該ホスホリパーゼＤを得ることができる
。
縮するか、又は濃縮することなく硫安分画、ゲル濾過、
アフィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグ
ラフィー、イオン交換クロマトグラフィーにより処理し
て、純度のよい該ホスホリパーゼＤを得ることができる
。
形質転換体である微生物の培養形態はその栄養生理的性
質を考慮して培養条件を選択すれば良く、通常多くの場
合は、液体培養で行うが、工業的には深部通気撹拌培養
を行うのが有利である。培地の栄養源としては、微生物
の培養に通常用いられるものが広く使用されうる。
質を考慮して培養条件を選択すれば良く、通常多くの場
合は、液体培養で行うが、工業的には深部通気撹拌培養
を行うのが有利である。培地の栄養源としては、微生物
の培養に通常用いられるものが広く使用されうる。
炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、
例えばグルコース、サッカロース、ラクトース、マルト
ース、フラクトース、糖蜜などが使用される。窒素源と
しては利用可能な窒素化合物であれば良く、例えばペプ
トン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物など
が使用される。
例えばグルコース、サッカロース、ラクトース、マルト
ース、フラクトース、糖蜜などが使用される。窒素源と
しては利用可能な窒素化合物であれば良く、例えばペプ
トン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物など
が使用される。
その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カ
ルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、
特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使
用される。
ルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、
特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使
用される。
培養温度は微生物が発育し、ホスホリパーゼＤを生産す
る範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・：ｌ ＩＪ
（Ｅ、 ｃｏｌｉ）の場合、好ましくは２０４２°Ｃ
程度、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓ。
る範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・：ｌ ＩＪ
（Ｅ、 ｃｏｌｉ）の場合、好ましくは２０４２°Ｃ
程度、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓ。
１ｉｖｉｄａｎｃｅ）の場合は２８−３０°Ｃ程度であ
る。培養条件は、条件によって多少異なるが、ホスホリ
パーゼＤが最高収量に達する時期を見計って適当な時期
に培養を終了すればよく、エシェリヒア・コリ（Ｅ、
ｃｏｌｔ）の場合、通常は１２−４８時間程度、ストレ
プトマイセス・リビーダンス（Ｓ。
る。培養条件は、条件によって多少異なるが、ホスホリ
パーゼＤが最高収量に達する時期を見計って適当な時期
に培養を終了すればよく、エシェリヒア・コリ（Ｅ、
ｃｏｌｔ）の場合、通常は１２−４８時間程度、ストレ
プトマイセス・リビーダンス（Ｓ。
１ｉｖｉｄａｎｃｅ）の場合、４８〜７２時間程度であ
る。
る。
培地ｐＨは菌が発育し、ホスホリパーゼＤを生産する範
囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・二１（Ｅ、ｃｏ
ｌＬ）の場合、好ましくはｐＨ６，０−８，０程度、ス
トレプトマイセス・リビダンス（Ｓ、 １ｉｖｉｄａｎ
ｃｅ）の場合、ｐＨ７，０−７，５程度である。
囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・二１（Ｅ、ｃｏ
ｌＬ）の場合、好ましくはｐＨ６，０−８，０程度、ス
トレプトマイセス・リビダンス（Ｓ、 １ｉｖｉｄａｎ
ｃｅ）の場合、ｐＨ７，０−７，５程度である。
培養物中のホスホリパーゼＤは、菌体を含む培養液その
ままを採取し、利用することもできるが、一般には常法
に従って、ホスホリパーゼＤが培養液中に存在する場合
には、濾過、遠心分離などによりホスホリパーゼＤ含有
溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。ホスホ
リパーゼＤが菌体内に存在する場合には、得られた培養
物を濾過又は遠心分離などの手段により、菌体を採取し
、次いでこの菌体を機械的方法又はリゾチームなどの酵
素的方法で破壊し、又、必要に応じてＥＤＴＡ等のキレ
ート剤及び／又は界面活性剤を添加してホスホリパーゼ
Ｄを可溶化し水溶液として分離採取する。
ままを採取し、利用することもできるが、一般には常法
に従って、ホスホリパーゼＤが培養液中に存在する場合
には、濾過、遠心分離などによりホスホリパーゼＤ含有
溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。ホスホ
リパーゼＤが菌体内に存在する場合には、得られた培養
物を濾過又は遠心分離などの手段により、菌体を採取し
、次いでこの菌体を機械的方法又はリゾチームなどの酵
素的方法で破壊し、又、必要に応じてＥＤＴＡ等のキレ
ート剤及び／又は界面活性剤を添加してホスホリパーゼ
Ｄを可溶化し水溶液として分離採取する。
この様にして得られたホスホリパーゼＤ含有溶液を、例
えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に、硫安、硫酸ナトリウム
などの塩析処理、或いは親水性有機溶媒、例えば、メタ
ノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈澱法に
より沈澱せしめればよい。
えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に、硫安、硫酸ナトリウム
などの塩析処理、或いは親水性有機溶媒、例えば、メタ
ノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈澱法に
より沈澱せしめればよい。
次いでこの沈澱物を、水に溶解し、半透膜にて透析せし
めて、より低分子量の不純物を除去することができる。
めて、より低分子量の不純物を除去することができる。
また、吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、ア
フィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー等により精製し
、これらの手段を用いて得られるホスホリパーゼＤ含有
溶液から、減圧濃縮凍結乾燥等の処理により精製された
ホスホリパーゼＤが得られる。
フィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー等により精製し
、これらの手段を用いて得られるホスホリパーゼＤ含有
溶液から、減圧濃縮凍結乾燥等の処理により精製された
ホスホリパーゼＤが得られる。
以上の製造法により得られるホスホリパーゼＤとして例
えば下記の諸物性を有するホスホリパーゼＤが例示され
る。
えば下記の諸物性を有するホスホリパーゼＤが例示され
る。
（１）作用
リン脂質のリン酸と含窒素塩基とのエステル結合に作用
してリン化合物と相当する含窒素塩基と遊離する。レシ
チンについての作用を例示すれば次式の通りである。
してリン化合物と相当する含窒素塩基と遊離する。レシ
チンについての作用を例示すれば次式の通りである。
ＣＨ，０ＣＯＲ
レシチン（ホスファチジルコリン）
ＣＨ２０ＣＯＲ
ホスファチジン酸
コリン
また、レシチンをホスホリパーゼＤで加水分解を行ない
、またその可逆反応において核酸系ヌクレオシドとレシ
チン等リン脂質を基質とする塩基交換反応による制癌剤
効果を有する核酸系ヌクレオシドリン脂質複合体を製造
することもできる。
、またその可逆反応において核酸系ヌクレオシドとレシ
チン等リン脂質を基質とする塩基交換反応による制癌剤
効果を有する核酸系ヌクレオシドリン脂質複合体を製造
することもできる。
（２）活性の測定法
０、２ Ｍ ｔ−ＩＪ 、２．−塩酸緩衝液（ｐＨ８，
０） ０．１ ｒｇｌ。
０） ０．１ ｒｇｌ。
０．１ｍＭレシチンエマルジョン ０．１ｍｆ。
０．１Ｍ塩化カルシウム ０．０５ｎ／！
。
。
１％ト’Ｊ ）ンＸ１００ ０．１
ｍｌ。
ｍｌ。
水 ０
．１ｍｊ２よりなる反応液に、酵素溶液０．０５ｎ＋ｆ
を加え３７°Ｃ１１０分間反応させた後、５分間煮沸し
て反応を停止した。次いで反応液を３７℃まで冷却し、
これに、４−アミノアンチピリン（３■／ｄ）０、ＩＴ
ＩＩＩ！、、２ｕ、／ｍＩ！、パーオキシダーゼ０．１
ｍｊ！、水０．１−を加えて３７°Ｃｌ２Ｏ分間反応せ
しめた後１％トリトンＸ１００２ ｔｎｌを加え、５０
０ｎｍの吸光度を求めた。ホスホリパーゼＤ、１単位（
Ｕｎｉｔ、 ｕ、）は１分間に１ ｐ ｍｏｌｅのコリ
ンを生成せしめる酵素活性と定める。また、酵素活性の
算出は次式に従う。
．１ｍｊ２よりなる反応液に、酵素溶液０．０５ｎ＋ｆ
を加え３７°Ｃ１１０分間反応させた後、５分間煮沸し
て反応を停止した。次いで反応液を３７℃まで冷却し、
これに、４−アミノアンチピリン（３■／ｄ）０、ＩＴ
ＩＩＩ！、、２ｕ、／ｍＩ！、パーオキシダーゼ０．１
ｍｊ！、水０．１−を加えて３７°Ｃｌ２Ｏ分間反応せ
しめた後１％トリトンＸ１００２ ｔｎｌを加え、５０
０ｎｍの吸光度を求めた。ホスホリパーゼＤ、１単位（
Ｕｎｉｔ、 ｕ、）は１分間に１ ｐ ｍｏｌｅのコリ
ンを生成せしめる酵素活性と定める。また、酵素活性の
算出は次式に従う。
％式％
（式中、ΔＡ、。。は５００ｎｍにおける吸光度を示す
。） （３）基質特異性 上記の活性の測定の反応液において、基質としてレシチ
ン、リゾレシチン、スフィンゴミエリンのエマルジョン
（１０ｍＭ、 ０．１ ｍｌ＞を用い、同様の操作を行
ない、コリンの定量をして、リゾレシチンに対する酵素
作用を１００として相対活性を求める。
。） （３）基質特異性 上記の活性の測定の反応液において、基質としてレシチ
ン、リゾレシチン、スフィンゴミエリンのエマルジョン
（１０ｍＭ、 ０．１ ｍｌ＞を用い、同様の操作を行
ない、コリンの定量をして、リゾレシチンに対する酵素
作用を１００として相対活性を求める。
（４） ｐＨ安定性
ｐＨ５：酢酸緩衝液
ｐＨ６−７：ジメチルグルタル酸−水酸化ナトリウム緩
衝液 ｐｌ＋８−９：）リスー塩酸緩衝液 ｐＨｌＯニゲリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（各々１
０ｍパ）の各ρＵで、酵素溶液（Ｉｍｇ／巌）を３７゛
Ｃ１６０分間インキユヘートした後、上記の活性測定法
に従ってホスホリパーゼＤの活性を求める。
衝液 ｐｌ＋８−９：）リスー塩酸緩衝液 ｐＨｌＯニゲリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（各々１
０ｍパ）の各ρＵで、酵素溶液（Ｉｍｇ／巌）を３７゛
Ｃ１６０分間インキユヘートした後、上記の活性測定法
に従ってホスホリパーゼＤの活性を求める。
酵素はｐＨ’ｌ−９で比較的安定である。
（５）至適ｐＨ
ｐＨ６−７、５ニジメチルグルタル酸−水酸化ナトリウ
ム緩衝ン夜、 ｐｌ＋７−９ニドリス−塩酸緩衝液、 ｐｌ＋９−１０ニゲリシン−水酸化ナトリウム緩衝液の
各々の緩衝液を用い、上記の活性測定法に従ってホスホ
リパーゼＤの活性を求める。その至適ｐｎは７．５−８
付近である。
ム緩衝ン夜、 ｐｌ＋７−９ニドリス−塩酸緩衝液、 ｐｌ＋９−１０ニゲリシン−水酸化ナトリウム緩衝液の
各々の緩衝液を用い、上記の活性測定法に従ってホスホ
リパーゼＤの活性を求める。その至適ｐｎは７．５−８
付近である。
（６）熱安定性
１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０） 、酵素溶
液濃度（１ｍｇ／ ｍｐ、 ）の条件で、４０，５０゜
６０．７０，８０°Ｃ（７）各／？（７）温度にて１ｏ
分間インキュベートした後、上記の活性測定法に従って
ホスホリパーゼＤの活性を求める。
液濃度（１ｍｇ／ ｍｐ、 ）の条件で、４０，５０゜
６０．７０，８０°Ｃ（７）各／？（７）温度にて１ｏ
分間インキュベートした後、上記の活性測定法に従って
ホスホリパーゼＤの活性を求める。
酵素は７０°Ｃまで安定である。
（７）分子量及び等電点
セファデツクス（、−１５０ゲル濾過による分子量約５
０，０００ 、 Ｓ Ｄ Ｓ−ボリアクリルアよドディ
スク電気泳動による分子量約５７．０００゜また、等電
点電気泳動法による等電点（Ｐ【）はｐＨ５，１である
。
０，０００ 、 Ｓ Ｄ Ｓ−ボリアクリルアよドディ
スク電気泳動による分子量約５７．０００゜また、等電
点電気泳動法による等電点（Ｐ【）はｐＨ５，１である
。
このようにして得られたホスホリパーゼＤは、同様の微
生物由来であるストレプトマイセス・ハチジヨウエンシ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈａｃｈｉｊｏｅｎｓ
ｉｓ）Ａ １１４３菌株より得られるホスホリパーゼＤ
（特開昭４ｆ３−９９３８６号）よりも至適ｐＨ，ｐＨ
安定性、熱安定性においてより優れている。さらにスト
レプトマイセス・ハチジヨウエンシス（Ｓ ｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓｈａｃｈｉｊｏｅｎｓｉｓ ）Ａ １１
４３菌株はホスホリパーゼＤのほかにホスホリパーゼＣ
をも生産する（特開昭４９−５５８９３号）ため、はぼ
完全な精製を行なわない限り、その最終標品にホスホリ
パーゼＣの混入を住い、これによる副反応を生じる欠点
を有している。これに対し、本発明においては容易な精
製で、しかも純度の高いホスホリパーゼＤが得られるも
ので、従って、本発明で得られるホスホリパーゼＤは特
に有用な酵素であるといえる。
生物由来であるストレプトマイセス・ハチジヨウエンシ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈａｃｈｉｊｏｅｎｓ
ｉｓ）Ａ １１４３菌株より得られるホスホリパーゼＤ
（特開昭４ｆ３−９９３８６号）よりも至適ｐＨ，ｐＨ
安定性、熱安定性においてより優れている。さらにスト
レプトマイセス・ハチジヨウエンシス（Ｓ ｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓｈａｃｈｉｊｏｅｎｓｉｓ ）Ａ １１
４３菌株はホスホリパーゼＤのほかにホスホリパーゼＣ
をも生産する（特開昭４９−５５８９３号）ため、はぼ
完全な精製を行なわない限り、その最終標品にホスホリ
パーゼＣの混入を住い、これによる副反応を生じる欠点
を有している。これに対し、本発明においては容易な精
製で、しかも純度の高いホスホリパーゼＤが得られるも
ので、従って、本発明で得られるホスホリパーゼＤは特
に有用な酵素であるといえる。
（実施例〕
以下、実施例を挙げて本発明の詳細な説明するが本発明
はこれによって何ら限定されるものではない。
はこれによって何ら限定されるものではない。
実施例１゜
く放線菌からのＤＮＡの抽出〉
Ｉ−リブティックソイ培地（３０ｇ ／ Ｑ Ｔｒｙｐ
ｔｉｃＳｏｙ Ｂｒｏｔｈ （ＤＴＦＣＯ社製））５
００ｍｊ２に、ホスホリパーゼＤ生産性放線菌ストレプ
トマイセス・り０ ’Ｅ ’７ スカスＡ−０８４８（
ＰＥＲＭ−１３１’ Ｌ／ｙｇＬ）を植菌し３０°Ｃで
３日間振盪培養した。培養液を高速冷却遠心機（日立５
ＣＲ−２０ＢＡ型）を用い、１４．０００ ｒｐｍ （
２５，０００Ｇ）で１０分間遠心分離し、放線菌体を集
菌した。放線菌体を２０ｍ１のＴＥＳ（５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ｔ（Ｃｆｆｉ ｐＨ８，０、５０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ ｐＨ８，０，１５％５ｕｃｒｏｓｅ）に懸濁し、最
終濃度が１ｍｇ ／ ｍｌになるようにリゾチーム（Ｓ
ＩＧＭＡ社製）を加え、３７°Ｃで１０分間処理し、細
胞壁を破壊した。これに１０％ＳＤＳを０．５ ｍｌ加
え、さらに２１ｍ１のフェノール：クロロホルム−１：
１混合液を加え撹拌した後、１４．００Ｏｒｐｍ （
２５，０ＯＯＧ）で１５分間遠心し、分離した水層を他
の容器に移し、４２ｍｆｌのエタノールを加え析出して
くる染色体をガラス棒にからめて取得した。
ｔｉｃＳｏｙ Ｂｒｏｔｈ （ＤＴＦＣＯ社製））５
００ｍｊ２に、ホスホリパーゼＤ生産性放線菌ストレプ
トマイセス・り０ ’Ｅ ’７ スカスＡ−０８４８（
ＰＥＲＭ−１３１’ Ｌ／ｙｇＬ）を植菌し３０°Ｃで
３日間振盪培養した。培養液を高速冷却遠心機（日立５
ＣＲ−２０ＢＡ型）を用い、１４．０００ ｒｐｍ （
２５，０００Ｇ）で１０分間遠心分離し、放線菌体を集
菌した。放線菌体を２０ｍ１のＴＥＳ（５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ｔ（Ｃｆｆｉ ｐＨ８，０、５０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ ｐＨ８，０，１５％５ｕｃｒｏｓｅ）に懸濁し、最
終濃度が１ｍｇ ／ ｍｌになるようにリゾチーム（Ｓ
ＩＧＭＡ社製）を加え、３７°Ｃで１０分間処理し、細
胞壁を破壊した。これに１０％ＳＤＳを０．５ ｍｌ加
え、さらに２１ｍ１のフェノール：クロロホルム−１：
１混合液を加え撹拌した後、１４．００Ｏｒｐｍ （
２５，０ＯＯＧ）で１５分間遠心し、分離した水層を他
の容器に移し、４２ｍｆｌのエタノールを加え析出して
くる染色体をガラス棒にからめて取得した。
この染色体を２０ ｍｌ Ｔ Ｅ （１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ｔｉｃ １ｐＨ８，０、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８
，０）に？容器し、２０ｍｆｌのフェノール：クロロホ
ルム−１：１混合ン夜を加え撹拌した後、１４．００Ｏ
ｒｐｍ （２５，０００Ｇ）で１５分間遠心し、分離し
た水層を他の容器に移し、３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５，
５緩衝液２戚とエタノール５０ｍ１を加え、撹拌後−７
０°Ｃで２０分間冷却した後、３．０００ ｒｐｍ （
２，０００Ｇ）で１５分間遠心し、沈殿した染色体を７
５％エタノールで洗い、乾燥せしめ、染色体標品５５０
μｇを得た。
ｓ−ｔｉｃ １ｐＨ８，０、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８
，０）に？容器し、２０ｍｆｌのフェノール：クロロホ
ルム−１：１混合ン夜を加え撹拌した後、１４．００Ｏ
ｒｐｍ （２５，０００Ｇ）で１５分間遠心し、分離し
た水層を他の容器に移し、３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５，
５緩衝液２戚とエタノール５０ｍ１を加え、撹拌後−７
０°Ｃで２０分間冷却した後、３．０００ ｒｐｍ （
２，０００Ｇ）で１５分間遠心し、沈殿した染色体を７
５％エタノールで洗い、乾燥せしめ、染色体標品５５０
μｇを得た。
実施例２゜
く放線菌遺伝子ライブラリー〇作成〉
放線菌染色体２μｇを制限エンドヌクレアーゼ５ａｆｌ
（東洋紡績社製）４ｕで５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２
（ｐＨ７、５） 、１００ｍＭ Ｎａ＋、ｅ、１０ｍＭ
ＭｇＣ４２ｇ、１ｍＭ ＤＴＴ （ジチオスレイ
トール）、１０μｇ／ｄＢＳＡ（牛血清アルブミン（ベ
ーリンガー・マンハイム社製））、存在下３７°Ｃ１２
時間切断処理した。
（東洋紡績社製）４ｕで５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２
（ｐＨ７、５） 、１００ｍＭ Ｎａ＋、ｅ、１０ｍＭ
ＭｇＣ４２ｇ、１ｍＭ ＤＴＴ （ジチオスレイ
トール）、１０μｇ／ｄＢＳＡ（牛血清アルブミン（ベ
ーリンガー・マンハイム社製））、存在下３７°Ｃ１２
時間切断処理した。
また、ベクタープラスミドｐＵｃ １１８ （Ｃｏｆ
Ｅ １ｏｒｉ、 Ａｍｐ’ ＋ Ｍ １３１Ｇ ；宝
酒造社製）２μｇを、先と同じ条件下で５ａｆｆｉ１４
ｕで、３７°Ｃ１１６時間切断処理した後、フェノール
・クロロホルム処理を行い、エタノール沈澱した。この
直鎖状になったｐＵＣ１１８を大腸菌由来アルカリホス
ファターゼ（東洋紡績社製）で５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ２ （ｐＨ８，０）１ｍＭＭｇＣｆｆｉｚ存在下、
６５°Ｃ１１時間反応させ、５′末端のリン酸基を除去
した。
Ｅ １ｏｒｉ、 Ａｍｐ’ ＋ Ｍ １３１Ｇ ；宝
酒造社製）２μｇを、先と同じ条件下で５ａｆｆｉ１４
ｕで、３７°Ｃ１１６時間切断処理した後、フェノール
・クロロホルム処理を行い、エタノール沈澱した。この
直鎖状になったｐＵＣ１１８を大腸菌由来アルカリホス
ファターゼ（東洋紡績社製）で５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ２ （ｐＨ８，０）１ｍＭＭｇＣｆｆｉｚ存在下、
６５°Ｃ１１時間反応させ、５′末端のリン酸基を除去
した。
以上の操作を行ったｐＵｃ １１８１００ｎｇ、放線菌
染色体２００ｎｇをＴ４ＤＮＡライゲース（宝酒造社製
）１００ｕで、６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−１１ｃｆ （ｐＨ
１７，６）、６．６ｍＭＭｇＣＬ！ｚ、１０ｎ＋Ｍ
ＤＴＴ （ジチオスレイトール）、６６０ｕＭ ＡＴ
Ｐ （ベーリンガー・マンハイム社製）存在下１６°Ｃ
１１６時間ライゲーションした。これをに、 Ｓｈｉｇ
ｅｓａｄａの方法（細胞工学（１９８３）２．６１６−
６２６）によってコンピテント細胞としたＥ、 ｃｏｌ
ｉ ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）（ＦＬｒｅｃ Ａ
１＋ ｅｎｄ Ａ １． ｇｙｒ Ａ９６＋ ｔｈｉ−
１＋ ｈｓｄＲ１７ＣＴ ｗ−＋ ｍｋ＋ ）、 Ｓｕ
ｐ Ｅ ４４＋ ｒｅｊ！ Ａ １＋ λ−（Ｔ、
Ｍａｎｉａｔｉｓ、、 ｅｔ ａｌ、 Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ：Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ （１９８２） 、 ５０４−５０６ ）
にトランスフォーメーションし、５０μｇ／ｍｌアンピ
シリン含有り平板寒天培地（バタトトリプトン（ＤＩＦ
ＣＯ社製）１５ ｇ／ｌ、酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製
）５ｇ／ｊ２．Ｎａ（／！５ｇ／ｆ、バタトアガ−（Ｄ
ＩＦＣＯ社製） １５ ｇ／ｌ）にて−夜培養し、約
１００，０００のアンピシリン耐性コロニーを得、放線
菌遺伝子ライブラリーとした。
染色体２００ｎｇをＴ４ＤＮＡライゲース（宝酒造社製
）１００ｕで、６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−１１ｃｆ （ｐＨ
１７，６）、６．６ｍＭＭｇＣＬ！ｚ、１０ｎ＋Ｍ
ＤＴＴ （ジチオスレイトール）、６６０ｕＭ ＡＴ
Ｐ （ベーリンガー・マンハイム社製）存在下１６°Ｃ
１１６時間ライゲーションした。これをに、 Ｓｈｉｇ
ｅｓａｄａの方法（細胞工学（１９８３）２．６１６−
６２６）によってコンピテント細胞としたＥ、 ｃｏｌ
ｉ ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）（ＦＬｒｅｃ Ａ
１＋ ｅｎｄ Ａ １． ｇｙｒ Ａ９６＋ ｔｈｉ−
１＋ ｈｓｄＲ１７ＣＴ ｗ−＋ ｍｋ＋ ）、 Ｓｕ
ｐ Ｅ ４４＋ ｒｅｊ！ Ａ １＋ λ−（Ｔ、
Ｍａｎｉａｔｉｓ、、 ｅｔ ａｌ、 Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ：Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ （１９８２） 、 ５０４−５０６ ）
にトランスフォーメーションし、５０μｇ／ｍｌアンピ
シリン含有り平板寒天培地（バタトトリプトン（ＤＩＦ
ＣＯ社製）１５ ｇ／ｌ、酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製
）５ｇ／ｊ２．Ｎａ（／！５ｇ／ｆ、バタトアガ−（Ｄ
ＩＦＣＯ社製） １５ ｇ／ｌ）にて−夜培養し、約
１００，０００のアンピシリン耐性コロニーを得、放線
菌遺伝子ライブラリーとした。
実施例３゜
〈放射性オリゴヌクレオチドプローブの作製〉遺伝子的
解析が未だ行われていないホスホリパーゼＤにおけるオ
リゴヌクレオチドプローブを作製するにあたって、まず
はじめに発酵法により得られたホスホリパーゼＤを完全
なまでに精製し、次いでそのホスホリパーゼＤのＮ末端
側のアごノ酸配列について研究し、その結果Ｎ末端側か
らの２０アミノ酸配列を後述Ａにて示されるアミノ酸配
列のとうり解析・決定した。この判明したＮ末端側から
の２０７ξノ酸をベースとして、オリゴヌクレオチドプ
ローブを作製するに当り、この２゜アミノ酸配列を基に
、その遺伝子の５“末端側からの６０塩基配列を後述Ｂ
にて示される多種のオリゴヌクレオチドとして予想した
。この予想配列を基に設計されるオリゴヌクレオチドプ
ローブには無数の配列がありうるが、本発明ではその内
の数種類を設計し、幾度かの試行錯誤の結果、その中で
も特に後述Ｃにて示される５０塩基からなる１つのオリ
ゴヌクレオチドが本発明に最も有用であることを見出し
、 該オリゴヌクレオチドを以下 の操作でプローブとして使用した。
解析が未だ行われていないホスホリパーゼＤにおけるオ
リゴヌクレオチドプローブを作製するにあたって、まず
はじめに発酵法により得られたホスホリパーゼＤを完全
なまでに精製し、次いでそのホスホリパーゼＤのＮ末端
側のアごノ酸配列について研究し、その結果Ｎ末端側か
らの２０アミノ酸配列を後述Ａにて示されるアミノ酸配
列のとうり解析・決定した。この判明したＮ末端側から
の２０７ξノ酸をベースとして、オリゴヌクレオチドプ
ローブを作製するに当り、この２゜アミノ酸配列を基に
、その遺伝子の５“末端側からの６０塩基配列を後述Ｂ
にて示される多種のオリゴヌクレオチドとして予想した
。この予想配列を基に設計されるオリゴヌクレオチドプ
ローブには無数の配列がありうるが、本発明ではその内
の数種類を設計し、幾度かの試行錯誤の結果、その中で
も特に後述Ｃにて示される５０塩基からなる１つのオリ
ゴヌクレオチドが本発明に最も有用であることを見出し
、 該オリゴヌクレオチドを以下 の操作でプローブとして使用した。
上記Ｃにて示されるオリゴヌクレオチドをアール・エル
・レッシンジャーらの方法（Ｒ，Ｌ。
・レッシンジャーらの方法（Ｒ，Ｌ。
Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ、、 Ｗ、Ｂ、 Ｌｕｒｓｆｏｒｄ
Ｊｏｕｒｎａｌ Ａｍ、 Ｃｈｅｍ。
Ｊｏｕｒｎａｌ Ａｍ、 Ｃｈｅｍ。
５ｏｃｉｅｔｙ ９８．３６５５）に基づきＤＮＡシン
セサイザー（ヘックマン社製： Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｙ
ｓｔｅｍｌ ｐｌｕｓ）を用いて作製した。
セサイザー（ヘックマン社製： Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｙ
ｓｔｅｍｌ ｐｌｕｓ）を用いて作製した。
完成したオリゴヌクレオチド２００ｎｇをＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼバッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ−１１
ｃｆｆｉ （ｐａｌ ８．０ ）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ
２．１０ｍＭ２−メルカプトエタノール）および、２０
μＣｉの：ｌＺＰ ＡＴＰ （アマ−ジャムジャパン
社製）存在下、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡
績社製）８６５μで３７°Ｃ１３０分間反応せしめ、ア
イソトープ３２ｐを取り込ませ放射性オリゴヌクレオチ
ドプローブとした。
レオチドキナーゼバッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ−１１
ｃｆｆｉ （ｐａｌ ８．０ ）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ
２．１０ｍＭ２−メルカプトエタノール）および、２０
μＣｉの：ｌＺＰ ＡＴＰ （アマ−ジャムジャパン
社製）存在下、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡
績社製）８６５μで３７°Ｃ１３０分間反応せしめ、ア
イソトープ３２ｐを取り込ませ放射性オリゴヌクレオチ
ドプローブとした。
実施例４゜
くホスホリパーゼＤ遺伝子含有クローンのスクリーニン
グ〉 前述の如くにより得た遺伝子ライブラリー即ち平板寒天
培地上のアンピシリン耐性コロニー上にナイロンメンブ
レンフィルター（ＰＡＬＬ社製：バイオダインＡ）を重
ね、フィルター上に該コロニ菌体の一部を移行させた。
グ〉 前述の如くにより得た遺伝子ライブラリー即ち平板寒天
培地上のアンピシリン耐性コロニー上にナイロンメンブ
レンフィルター（ＰＡＬＬ社製：バイオダインＡ）を重
ね、フィルター上に該コロニ菌体の一部を移行させた。
該コロニー菌体の一部を移行させたフィルターを別の５
０μｇ７ｍｌアンピシリン含有り寒天平板培地上に重ね
、フィルター上の菌体を３７°Ｃで１６時間培養した。
０μｇ７ｍｌアンピシリン含有り寒天平板培地上に重ね
、フィルター上の菌体を３７°Ｃで１６時間培養した。
培養後、このフィルターをアルカリ変性溶液（０，５Ｎ
Ｎａ０１ｌ、１、５ Ｎ ＮａＣ１）に５分間浸し、
さらに３Ｍ酢酸すＩ・リウム緩衝液（ｐｌ＋５．５ ）
に５分間浸した後乾燥した。このフィルターを８０°Ｃ
で１時間加熱し、菌体中にあったプラスミドＤＮＡをフ
ィルターに固定した。
Ｎａ０１ｌ、１、５ Ｎ ＮａＣ１）に５分間浸し、
さらに３Ｍ酢酸すＩ・リウム緩衝液（ｐｌ＋５．５ ）
に５分間浸した後乾燥した。このフィルターを８０°Ｃ
で１時間加熱し、菌体中にあったプラスミドＤＮＡをフ
ィルターに固定した。
さらにこのフィルターをハイブリダイゼーション？８液
（ＮａＣｆｆ１４３．８ ｇ／ Ｑ、クエン酸三ナトリ
ウム２２．ｔｇ／ｆｆ、５０ｍＭリン酸３ナトリウム（
ｐＨａ ５ ） 、ドデシル硫酸ナトリウム１ｇ／２、
フィコール（ファルマシア社製）Ｉｇ／ｆｆ、ホＩＪビ
ニルピロリドンＬｇ／１２、ＢＳＡ（ヘーリンガー・マ
ンハイム社製）Ｉｇ／４２、サケ精子ＤＮＡ（ファルマ
シア社製）２５０■／２、ホルムアミド０．４１／ｉり
に浸し、４２°Ｃで１時間プレハイブリダイゼーション
を行った。その後、フィルターを新しいハイブリダイゼ
ーション溶液に浸し、先に用意した放射性オリゴヌクレ
オチドプローブを加え、４２°Ｃで２４時間ハイブリダ
イゼーションを行った。
（ＮａＣｆｆ１４３．８ ｇ／ Ｑ、クエン酸三ナトリ
ウム２２．ｔｇ／ｆｆ、５０ｍＭリン酸３ナトリウム（
ｐＨａ ５ ） 、ドデシル硫酸ナトリウム１ｇ／２、
フィコール（ファルマシア社製）Ｉｇ／ｆｆ、ホＩＪビ
ニルピロリドンＬｇ／１２、ＢＳＡ（ヘーリンガー・マ
ンハイム社製）Ｉｇ／４２、サケ精子ＤＮＡ（ファルマ
シア社製）２５０■／２、ホルムアミド０．４１／ｉり
に浸し、４２°Ｃで１時間プレハイブリダイゼーション
を行った。その後、フィルターを新しいハイブリダイゼ
ーション溶液に浸し、先に用意した放射性オリゴヌクレ
オチドプローブを加え、４２°Ｃで２４時間ハイブリダ
イゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション後、洗浄液（Ｎａ（、ｅ４．３
８ｇ／ｌ、クエン酸三ナトリウム２．２１ｇ／ｌ、ドデ
シル硫酸ナトリウム１ｇ／ｌ）でフィルターを３回洗浄
し、次いでこのフィルターを５０°Ｃの洗浄液に１０分
間浸し、余分なプローブを洗い落とした。フィルターは
風乾後Ｘ線フィルム（富士写真フィルム社製： Ｎｅ
ｙ ＲＸＯ−）１）に重ね、遮光下、−７０”Ｃで２４
時間オートラジオグラフィーを行った。
８ｇ／ｌ、クエン酸三ナトリウム２．２１ｇ／ｌ、ドデ
シル硫酸ナトリウム１ｇ／ｌ）でフィルターを３回洗浄
し、次いでこのフィルターを５０°Ｃの洗浄液に１０分
間浸し、余分なプローブを洗い落とした。フィルターは
風乾後Ｘ線フィルム（富士写真フィルム社製： Ｎｅ
ｙ ＲＸＯ−）１）に重ね、遮光下、−７０”Ｃで２４
時間オートラジオグラフィーを行った。
オートラジオグラフィー終了後、フィルムを現像し、ポ
ジティブシグナルを示すコロニーを確認した。該コロニ
ーを、ホスホリパーゼＤをコードするＤＮＡを含む形質
転換体として取得し、エシェリヒア・コリ ＤＨＩ
・ｐｃＰＬＤｌ （微工研条寄第２６８３号、 ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−！６♂３ ）として寄託した。
ジティブシグナルを示すコロニーを確認した。該コロニ
ーを、ホスホリパーゼＤをコードするＤＮＡを含む形質
転換体として取得し、エシェリヒア・コリ ＤＨＩ
・ｐｃＰＬＤｌ （微工研条寄第２６８３号、 ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−！６♂３ ）として寄託した。
なお、ハイブリダイゼーションの最適条件はオリゴヌク
レオチドプローブの形状によって様々異なるため、本発
明では何度かの試行錯誤の末に選択した前述Ｃの５０塩
基オリゴヌクレオチドプローブが上記のハイブリダイゼ
ーション条件下で最適となることを見出し、それにより
約１０万のコロニーの中にただ一つ存在した、ホスホリ
パーゼＤの遺伝子を含む形質転換体のポジティブシグナ
ルが識別可能となった。
レオチドプローブの形状によって様々異なるため、本発
明では何度かの試行錯誤の末に選択した前述Ｃの５０塩
基オリゴヌクレオチドプローブが上記のハイブリダイゼ
ーション条件下で最適となることを見出し、それにより
約１０万のコロニーの中にただ一つ存在した、ホスホリ
パーゼＤの遺伝子を含む形質転換体のポジティブシグナ
ルが識別可能となった。
実施例５゜
く組み換えプラスミドの抽出〉
エシェリヒア・コリ ＤＨＩ・ｐｃＰＬＤｌよりティー
・マニアチスらの方法（Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉｓ、、
ｅｔ ａｌ。
・マニアチスらの方法（Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉｓ、、
ｅｔ ａｌ。
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ｃｏ１ｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ （１９８２）＋８６−９４
）によって、ホスホリパーゼＤをコードするＤＮＡを含
む組み換えプラスごドｐｃＰＬＤ１を抽出した。その制
限酵素地図を第４図に示す。
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ （１９８２）＋８６−９４
）によって、ホスホリパーゼＤをコードするＤＮＡを含
む組み換えプラスごドｐｃＰＬＤ１を抽出した。その制
限酵素地図を第４図に示す。
このプラスミド中の放線菌染色体由来部分のＤＮＡをジ
デオキシ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１４ １２０５１２１
０ （１９８１））により塩基配列を決定し、ホスホリ
パーゼＤをコードする全ＤＮＡが含まれていることを確
認すると共にその全塩基配列を決定した。結果を第３図
に示す。
デオキシ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１４ １２０５１２１
０ （１９８１））により塩基配列を決定し、ホスホリ
パーゼＤをコードする全ＤＮＡが含まれていることを確
認すると共にその全塩基配列を決定した。結果を第３図
に示す。
実施例６゜
〈培養と細胞抽出物の調製〉
ｐｃＰＬＤｌを保有したＥ、 ｃｏｌｉ ＤＨＩ ・ｐ
ｃＰＬＤｌを５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有り培地（
１，０％Ｂａｃｔｏ Ｔｒｉｐｔｏｎ （ＤＩＦＣＯ
社製）０．５％酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製）１．０％
ＮａＣ１） ２０ ｍｌ中で３７゛ｃで１８時間培養し
た後、遠心分離（６，０００ｒｐｎ＋。
ｃＰＬＤｌを５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有り培地（
１，０％Ｂａｃｔｏ Ｔｒｉｐｔｏｎ （ＤＩＦＣＯ
社製）０．５％酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製）１．０％
ＮａＣ１） ２０ ｍｌ中で３７゛ｃで１８時間培養し
た後、遠心分離（６，０００ｒｐｎ＋。
１０分間）により集菌し１００μｊ２の１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｆｐＨ８，Ｏ緩衝液に懸濁した。超音波破砕
機を用いて菌体を破砕した後、１４．０００ ｒｐｍ
、５分間遠心分離し、上滑を取得して細胞抽出物とした
。
ｉｓ−ＨＣｆｐＨ８，Ｏ緩衝液に懸濁した。超音波破砕
機を用いて菌体を破砕した後、１４．０００ ｒｐｍ
、５分間遠心分離し、上滑を取得して細胞抽出物とした
。
実施例７゜
く細胞抽出液のホスホリパーゼＤ活性の確認〉Ｅ、 ｃ
ｏｌｉ ＤＨＩ ・ｐｃＰＬＤｌでのＰＬＤ遺伝子の
発現を確認するために、細胞抽出液中のホスホリパーゼ
Ｄ活性を測定した。
ｏｌｉ ＤＨＩ ・ｐｃＰＬＤｌでのＰＬＤ遺伝子の
発現を確認するために、細胞抽出液中のホスホリパーゼ
Ｄ活性を測定した。
基質溶液（５ｍＭホスファチジルコリン、３．８％クロ
ロホルム、１％トリトンＸ−１００，４０ＩＩＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｆ （ｐＨ８，０）、１０ ｍＭ ＣａＣ１２
）を０．５ ｄ取り、３７°Ｃに５分間置いた後、細胞
抽出液を５０μｌ加え、撹拌し、３７℃で１０分間反応
させた。その後、クロモジエン溶液（０，６ｍＭ、４−
アミノアンチビリン、８０μｇ ７ｍｌフェノール、２
、４ｍＭ ＥＤＴＡ 、 ４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ（／
！ （ｐＨ８，０）、７、２ ｐｕｒｐｕｒｏｇａｌｌ
ｉｎ ｕｎｉｔｓ／ Ｗ１１ペルオキシダーゼ、１、２
ｕｎｉｔｓ／ ｒｔｄｌコリンオキシダーゼ）を２．
５１Ｒ１を加え、撹拌し、３７°Ｃで４時間反応させた
。この反応液の５００ｎｍの吸光度を測定し、ホスホリ
パーゼＤ活性の指標とした。
ロホルム、１％トリトンＸ−１００，４０ＩＩＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｆ （ｐＨ８，０）、１０ ｍＭ ＣａＣ１２
）を０．５ ｄ取り、３７°Ｃに５分間置いた後、細胞
抽出液を５０μｌ加え、撹拌し、３７℃で１０分間反応
させた。その後、クロモジエン溶液（０，６ｍＭ、４−
アミノアンチビリン、８０μｇ ７ｍｌフェノール、２
、４ｍＭ ＥＤＴＡ 、 ４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ（／
！ （ｐＨ８，０）、７、２ ｐｕｒｐｕｒｏｇａｌｌ
ｉｎ ｕｎｉｔｓ／ Ｗ１１ペルオキシダーゼ、１、２
ｕｎｉｔｓ／ ｒｔｄｌコリンオキシダーゼ）を２．
５１Ｒ１を加え、撹拌し、３７°Ｃで４時間反応させた
。この反応液の５００ｎｍの吸光度を測定し、ホスホリ
パーゼＤ活性の指標とした。
形質転換していないＥ、 ｃｏｌｉ ＤＨ１の抽８１に
ついて、上記と同じ操作を行ない対照とした。結果を第
１表に示す。
ついて、上記と同じ操作を行ない対照とした。結果を第
１表に示す。
Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｄｔ（１・ｐｃＰＬＤｌでのホスホリ
パーゼＤ活性の発現が確認された。
パーゼＤ活性の発現が確認された。
第
表
実施例８゜
〈放線菌へのホスホリパーゼＤ遺伝子の導入〉プラスミ
ドベクターｐｃＰＬ０１２μｇを制限エンドヌクレアー
ゼＭｌｕＩ６ｕとＸｈｏｌｌＯｕ（東洋紡績社製）で切
断し、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）遺伝子を含む３ Ｋ
ｂｐのＤＮＡフラグメントを１％低融点アガロースゲル
（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ社製）電気泳動で分離し、６７ｍＭＴｒｉｓ
−Ｈ（、ｅ （ｐＨ８，８） 、 ６．７ｍＭ Ｍ＊Ｃ
ｆｚ 、 １６．６ｍＭ （Ｎｕｎ）ｚｓＯ４＋ １
０ｍＭ２−メルカプトエタノール。
ドベクターｐｃＰＬ０１２μｇを制限エンドヌクレアー
ゼＭｌｕＩ６ｕとＸｈｏｌｌＯｕ（東洋紡績社製）で切
断し、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）遺伝子を含む３ Ｋ
ｂｐのＤＮＡフラグメントを１％低融点アガロースゲル
（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ社製）電気泳動で分離し、６７ｍＭＴｒｉｓ
−Ｈ（、ｅ （ｐＨ８，８） 、 ６．７ｍＭ Ｍ＊Ｃ
ｆｚ 、 １６．６ｍＭ （Ｎｕｎ）ｚｓＯ４＋ １
０ｍＭ２−メルカプトエタノール。
６．７μＨエチレンジアミン４酢酸、５０μＭ ｄＮＴ
Ｐ（ベーリンガー・マンハイム社製）、１６７μｇ／ｄ
ＢＳＡ（ベーリンガー・マンハイム社製）存在下、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績社製）２．４ｕでフラグ
メントの両端を平滑末端化した。
Ｐ（ベーリンガー・マンハイム社製）、１６７μｇ／ｄ
ＢＳＡ（ベーリンガー・マンハイム社製）存在下、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績社製）２．４ｕでフラグ
メントの両端を平滑末端化した。
また、放線菌のベクタープラスミドｐＳＥＶ １（Ｈｏ
ｒｉｎｏｖｃｈｉ、 Ｓ、、 ＮｉＮ１５ｈｉｙａ、
Ｍ、＋ Ｎａｋａｍｕｒａ。
ｒｉｎｏｖｃｈｉ、 Ｓ、、 ＮｉＮ１５ｈｉｙａ、
Ｍ、＋ Ｎａｋａｍｕｒａ。
Ａ、、 Ｂｅｐｐｕ、 Ｔ、 Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎ
ｅｔ （１９８７）２１０：４６８ ４７５ （ＰＥ
ＲＭ ＢＰ−，２／６ｒ４１））２μｇを制限エンド
ヌクレアーゼ５ａｃｌＣ東洋紡績社製）８ｕで切断し、
先と同じ条件下で両端を平滑末端化した後、５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ （ｐＨ８，０）、１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃ１ｚ存在下バクテリアアルカリフオスフアターゼ（東
洋紡績社製）６ｕで両末端のリン酸基を除去した。以上
の操作を行ったＰＬＤ遺伝子含有フラグメント２００ｎ
ｇとプラス５ドｐＳＥＶ１１００ｎｇをＴ４ＤＮＡライ
ゲース（宝酒造社製）１００ｕで、６６ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｆ （ｐＨ７，６）、 ６．６ｍＭ ＭｇＣｌ！
、ｚ 。
ｅｔ （１９８７）２１０：４６８ ４７５ （ＰＥ
ＲＭ ＢＰ−，２／６ｒ４１））２μｇを制限エンド
ヌクレアーゼ５ａｃｌＣ東洋紡績社製）８ｕで切断し、
先と同じ条件下で両端を平滑末端化した後、５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ （ｐＨ８，０）、１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃ１ｚ存在下バクテリアアルカリフオスフアターゼ（東
洋紡績社製）６ｕで両末端のリン酸基を除去した。以上
の操作を行ったＰＬＤ遺伝子含有フラグメント２００ｎ
ｇとプラス５ドｐＳＥＶ１１００ｎｇをＴ４ＤＮＡライ
ゲース（宝酒造社製）１００ｕで、６６ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｆ （ｐＨ７，６）、 ６．６ｍＭ ＭｇＣｌ！
、ｚ 。
１０ｍＭ ＤＴＴ、 ６６０ μＭ ＡＴＰ （ベー
リンガー・マンハイム社製）存在下１６°ｃ、１６時間
ライゲーションした。これをホップウッドらの方法（Ｄ
、Ａ、 Ｈｏｐｗｏｏｄ、、 ｅｔ ａｌ、 Ｇｅｎｅ
ｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆ Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ、 八 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ、 ＴｈｅＪｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕ
ｎｄａｔｉｏｎ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｉｎ５ｔｔｔ
ｕｔｅ。
リンガー・マンハイム社製）存在下１６°ｃ、１６時間
ライゲーションした。これをホップウッドらの方法（Ｄ
、Ａ、 Ｈｏｐｗｏｏｄ、、 ｅｔ ａｌ、 Ｇｅｎｅ
ｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆ Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ、 八 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ、 ＴｈｅＪｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕ
ｎｄａｔｉｏｎ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｉｎ５ｔｔｔ
ｕｔｅ。
１０３−１２２）によってコンピテント細胞としたスト
レプトマイセス・リビダンスＴＫ−２４（ＦＥＲＭ２６
♂ｒ）にトランスフォーメーションし、トリブチツクソ
イ平板寒天培地（３％トリブチイックソイ、２％バタト
アガー（以上ＤＩＦＣＯ社製））上に拡げ、２８°Ｃで
１日間培養した後、その上に１００μｇ／ｙｄチオスト
レプトンを含むニュートリエンドブロース寒天培地（１
，８％ニュートリエンドブロース （田辺製薬社製Ｌ１
１．３％シュークロース、０．５％アガー（和光純薬工
業社製））を重層し、２８°Ｃ１１日間培養してチオス
トレプトン耐性コロニーを得た。これをＰＬＤ遺伝子含
有ベクターであるプラスミドｐＳＥＶＩ−ＰＬＤ（第５
図参照）保有放線菌株とした。こうして得られた形質転
換体をストレプトマイセス・リビダンスＴＫ−２４・ｐ
ＳＥＶｌ−ＰＬＤ （微工研条寄第 ９６ｇ６号。
レプトマイセス・リビダンスＴＫ−２４（ＦＥＲＭ２６
♂ｒ）にトランスフォーメーションし、トリブチツクソ
イ平板寒天培地（３％トリブチイックソイ、２％バタト
アガー（以上ＤＩＦＣＯ社製））上に拡げ、２８°Ｃで
１日間培養した後、その上に１００μｇ／ｙｄチオスト
レプトンを含むニュートリエンドブロース寒天培地（１
，８％ニュートリエンドブロース （田辺製薬社製Ｌ１
１．３％シュークロース、０．５％アガー（和光純薬工
業社製））を重層し、２８°Ｃ１１日間培養してチオス
トレプトン耐性コロニーを得た。これをＰＬＤ遺伝子含
有ベクターであるプラスミドｐＳＥＶＩ−ＰＬＤ（第５
図参照）保有放線菌株とした。こうして得られた形質転
換体をストレプトマイセス・リビダンスＴＫ−２４・ｐ
ＳＥＶｌ−ＰＬＤ （微工研条寄第 ９６ｇ６号。
ＦＥＲＭ−ｒ３Ｆ↓６れ）として寄託した。
実施例９゜
〈ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ−２４・ｐＳＥ
Ｖｌ −ＰＬＤの培養と活性発現〉 前述の如くして得た放線菌の形質転換体であるストレプ
トマイセス・リビダンスＴＫ−２４・ｐＳＥＶＩＰＬＤ
を１０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含む３％トリブ
チイックソイ （ＤＩＦＣＯ社製）培地で２８°Ｃ１３
日間培養した。この培養液を１４．０００ｒｐＩ１１で
２分間遠心分離し、上清を分取した。この培養上清のホ
スホリパーゼＤ活性を前述実施例７と同様の方法で測定
した。また形質転換していないストレプトマイセス・リ
ビダンスＴＫ−２４の培養上清についても、同様にホス
ホリパーゼＤ活性を測定した。結果を第２表に示す。ベ
クターｐＳＥＶＩＰＬＤの移入により、ホスホリパーゼ
Ｄ活性の発現が確認された。
Ｖｌ −ＰＬＤの培養と活性発現〉 前述の如くして得た放線菌の形質転換体であるストレプ
トマイセス・リビダンスＴＫ−２４・ｐＳＥＶＩＰＬＤ
を１０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含む３％トリブ
チイックソイ （ＤＩＦＣＯ社製）培地で２８°Ｃ１３
日間培養した。この培養液を１４．０００ｒｐＩ１１で
２分間遠心分離し、上清を分取した。この培養上清のホ
スホリパーゼＤ活性を前述実施例７と同様の方法で測定
した。また形質転換していないストレプトマイセス・リ
ビダンスＴＫ−２４の培養上清についても、同様にホス
ホリパーゼＤ活性を測定した。結果を第２表に示す。ベ
クターｐＳＥＶＩＰＬＤの移入により、ホスホリパーゼ
Ｄ活性の発現が確認された。
第２表
〔発明の効果〕
ホスホリパーゼＤのＮ末端アミノ酸配列に基いて合成し
たオリゴヌクレオチドを使用して、ホスホリパーゼＤ生
産菌株に由来する染色体ＤＮＡライブラリーからホスホ
リパーゼＤ遺伝子の全ＤＮＡ配列を明確とした新規なホ
スホリパーゼＤ遺伝子を分離したもので、該ホスホリパ
ーゼＤ遺伝子を使用して、任意の宿主−ベクター系でホ
スホリパーゼＤの生産及び培養を行うことを可能とした
。
たオリゴヌクレオチドを使用して、ホスホリパーゼＤ生
産菌株に由来する染色体ＤＮＡライブラリーからホスホ
リパーゼＤ遺伝子の全ＤＮＡ配列を明確とした新規なホ
スホリパーゼＤ遺伝子を分離したもので、該ホスホリパ
ーゼＤ遺伝子を使用して、任意の宿主−ベクター系でホ
スホリパーゼＤの生産及び培養を行うことを可能とした
。
さらに、ホスホリパーゼＤ遺伝子の単離により、ホスホ
リパーゼＤの耐熱性向上や基質特異性の変換など種々の
プロティンエンジニアリングが可能となった。
リパーゼＤの耐熱性向上や基質特異性の変換など種々の
プロティンエンジニアリングが可能となった。
第１図はホスホリパーゼＤを構成するポリペプチドのア
ミノ酸配列を示す。 第２図はホスホリパーゼＤを構成するポリペプチドのア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡを示す。 第３図はプラスミドｐｃＰＬＤ１の放線菌由来部分のＤ
ＮＡの全塩基配列を示す。 第４図は大腸菌プラスミドｐｃＰＬＤ１の制限酵素地図
を示す。 第５図は放線菌プラスミドｐＳＥＶ−ＰＬＤの制限酵素
地図を示す。 第６図はホスホリパーゼＤ遺伝子の制限酵素サイト地図
を示す（図中 匹〃はシグナル配列を示す。） 第７図はプラスミドの構築を示す。（図中口はホスホリ
パーゼＤ遺伝子を示す。）
ミノ酸配列を示す。 第２図はホスホリパーゼＤを構成するポリペプチドのア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡを示す。 第３図はプラスミドｐｃＰＬＤ１の放線菌由来部分のＤ
ＮＡの全塩基配列を示す。 第４図は大腸菌プラスミドｐｃＰＬＤ１の制限酵素地図
を示す。 第５図は放線菌プラスミドｐＳＥＶ−ＰＬＤの制限酵素
地図を示す。 第６図はホスホリパーゼＤ遺伝子の制限酵素サイト地図
を示す（図中 匹〃はシグナル配列を示す。） 第７図はプラスミドの構築を示す。（図中口はホスホリ
パーゼＤ遺伝子を示す。）
Claims (11)
- （１）Ｎ末端側より第１図で表されるアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡ。 - （２）ＤＮＡ塩基配列が５′末端側より第２図で表わさ
れる請求項第１項記載のＤＮＡ。 - （３）Ｎ末端側より第１図に表わされるアミノ酸配列を
コードするＤＮＡを保持することを特徴とするベクター
。 - （４）上記ベクターがプラスミドｐｃＰＬＤ１又はプラ
スミドｐＳＥＶ−ＰＬＤである請求項第３項記載のベク
ター。 - （５）宿主が、￥エシェリヒア￥（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ）属、￥ストレプトマイセス￥（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ）属、￥サッカロミセス￥（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ）属又は￥バチルス￥（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
属に属する微生物であって、宿主にとって外来性である
第１図に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを保持す
ることを特徴とする形質転換体。 - （６）￥エシェリヒア￥（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属
に属する微生物が、￥エシェリヒア￥・￥コリ￥（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に属する微生物である
請求項第５項記載の形質転換体。 - （７）形質転換体が、￥エシェリヒア￥・￥コリ￥ Ｄ
Ｈ１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１）・
ｐｃＰＬＤ１「微工研条寄第２６８３号、ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−２６８３」である請求項第６項記載の形質転換体。 - （８）ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
）属に属する微生物が、￥ストレプトマイセス￥・￥リ
ビダンス￥（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａ
ｎｓ）に属する微生物である請求項第５項記載の形質転
換体。 - （９）形質転換体が、￥ストレプトマイセス￥・￥リビ
ダンス￥ ＴＫ２４（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉ
ｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４）・ｐＳＥＶ１−ＰＬＤ「微工
研条寄第２６８６号、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６８６」であ
る請求項第８項記載の形質転換体。 - （１０）宿主が、￥エシェリヒア￥・￥コリ￥（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、￥ストレプトマイセス￥
・￥リビダンス￥（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖ
ｉｄａｎｓ）、￥サッカロミセス￥・￥セレビシエ￥（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
、又は￥バチルス￥・￥ズブチルス￥（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）であって、宿主にとって外来性
である第１図に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを
保持する形質転換体を培養して、該ＤＮＡの遺伝情報を
発現せしめ、該培養物からホスホリパーゼＤを採取する
ことを特徴とするホスホリパーゼＤの製造法。 - （１１）第２図に示すＤＮＡを保持する形質転換体を培
養して、該ＤＮＡの遺伝情報を発現せしめ、該培養物か
らホスホリパーゼＤを採取することを特徴とする請求項
第１０項記載の製造法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1325355A JPH03187382A (ja) | 1989-12-15 | 1989-12-15 | ホスホリパーゼｄの遺伝情報を有するｄｎａ及びその用途 |
| DE1990616630 DE69016630T2 (de) | 1989-12-15 | 1990-12-11 | DNS mit der genetischen Information der Phospholipase D und seine Verwendung. |
| EP19900403529 EP0435725B1 (en) | 1989-12-15 | 1990-12-11 | DNA having the genetic information of phospholipase D and its use |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1325355A JPH03187382A (ja) | 1989-12-15 | 1989-12-15 | ホスホリパーゼｄの遺伝情報を有するｄｎａ及びその用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03187382A true JPH03187382A (ja) | 1991-08-15 |
Family
ID=18175894
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1325355A Pending JPH03187382A (ja) | 1989-12-15 | 1989-12-15 | ホスホリパーゼｄの遺伝情報を有するｄｎａ及びその用途 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0435725B1 (ja) |
| JP (1) | JPH03187382A (ja) |
| DE (1) | DE69016630T2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995009234A1 (en) * | 1993-09-30 | 1995-04-06 | Japan Tobacco Inc. | Plant-derived phospholipase d gene |
| CN102286440A (zh) * | 2011-07-22 | 2011-12-21 | 天津科技大学 | 高活力磷脂酶d及细胞表面展示磷脂酶d酵母全细胞催化剂的制备 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103013947B (zh) * | 2012-12-17 | 2014-12-17 | 宁夏乙征生物工程有限公司 | 一种重组磷脂酶d的生产方法 |
| CN110317800B (zh) * | 2019-06-27 | 2021-04-27 | 厦门大学 | 一种用重组短芽孢杆菌生产磷脂酶d的方法 |
| CN112575023B (zh) * | 2020-12-31 | 2023-08-22 | 河南省商业科学研究所有限责任公司 | 一种在链霉菌中高效表达磷脂酶d的方法及重组链霉菌 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU3548289A (en) * | 1988-04-15 | 1989-11-03 | Biogen, Inc. | Processes for purifying phospholipase a2 and producing phospholipase a2-like polypeptides |
-
1989
- 1989-12-15 JP JP1325355A patent/JPH03187382A/ja active Pending
-
1990
- 1990-12-11 EP EP19900403529 patent/EP0435725B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-11 DE DE1990616630 patent/DE69016630T2/de not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995009234A1 (en) * | 1993-09-30 | 1995-04-06 | Japan Tobacco Inc. | Plant-derived phospholipase d gene |
| US5747327A (en) * | 1993-09-30 | 1998-05-05 | Japan Tobacco Inc. | Phospholipase D gene originated from plant |
| CN102286440A (zh) * | 2011-07-22 | 2011-12-21 | 天津科技大学 | 高活力磷脂酶d及细胞表面展示磷脂酶d酵母全细胞催化剂的制备 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69016630T2 (de) | 1995-09-07 |
| EP0435725A1 (en) | 1991-07-03 |
| DE69016630D1 (de) | 1995-03-16 |
| EP0435725B1 (en) | 1995-02-01 |
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