JPH03190877A - バルビツール酸塩のアッセイ法およびそれに用いる化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、イムノアッセイに関する。さらに詳しくは、
バルビッール酸塩の蛍光偏光イムノアッセイに用いるた
めの新規化合物および抗血清、該１ 化合物および抗血清の使用方法、および該化合物および
抗血清を製造するための新規中間体に関する。本発明は
また、血清試料中の分析対象物の改良イムノアッセイに
関する。

（従来の技術および発明が解決しようとする課題）バル
ビッール酸塩は、一般に、鎮静剤、催眠薬および抗けい
れん薬として処方される合成薬の１種である。これら薬
剤は、穏やかな鎮静状態から昏睡にいたる中枢神経系の
抑制を引き起こす。抑制の度合は、バルビッール酸塩の
種類、使用量、バルビッール酸塩の投与方法、および薬
剤を摂取する個体の神経系の興奮性に依存する。バルビ
ッール酸塩を過剰に使用すると冒慣性または中毒になる
ことがある。バルビッール酸塩の過剰投与または突然の
投与中止は、昏睡、または死さえも弓き起こす。

バルビッール酸塩の合法的入手は困難になってきたが、
それてもバルビッール酸塩の使用、およびときには乱用
が依然続いている。

ヒト系においてバルビッール酸塩を検出するこ２ とは、バルビッール酸塩の使用および過剰投与の診断を
確かめ、適当な治療法を選択する上で手助けになる。

バルビッール酸塩の検出に用いる生物学的試料としては
、尿、血清、血漿および組織が挙げられる。バルビッー
ル酸塩は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ガスク
ロマトグラフィー（ＧＣ）、および高速液体クロマトグ
ラフィー（ＨＰＬＣ）を含む多くの方法により検出され
てきた。しかしながら、これらの方法は一般に薬剤の化
学的抽出を含み、高度の熟練者と長いアッセイ時間とを
要する複雑で面倒な方法である。加えて、ＴＬＣは感度
を欠くし、ＧＣにおいては、アッセイ面に薬剤を誘導体
化することがしばしば要求される。

一般に、バルビッール酸塩について生物学的試料をアッ
セイする上で、競合イムノアッセイ法がＴＬＣ，ＧＣお
よびＨＰ　Ｌ　Ｃ？、（どの方法に代わる好ましい方法
として挙げられる。これらの競合結合イムノアッセイ法
の一つとして、蛍光偏光イムノアッセイ法がある。

一般に、競合イムノアッセイ（しばしば［競合結合イム
ノアッセイＪと称する）：よ、被験試料中のりガント分
析対象物の存在の検出およびｉｔ測測定ために用いられ
る。リガノト分析対象物は、標識試薬（分析対象物の類
似体であり、しばしば「トレーサー」と称されろ）と、
該分析対象物および該類似体に特異的な抗体上の限られ
た数のレセプター部位に対して競合する。試料中のりガ
ント分析対象物の濃度が、試料の競合イムノアッセイに
おいて抗体に結合する類似体（トレーサー）の量を決定
する。とりわけ、分析対象物および類似体はそれぞれの
濃度に比例して抗体に結合するので、抗体に結合する類
似体の量は、アッセイしようとする試料中の分析対象物
の濃度に反比例する。

蛍光偏光イムノアッセイのような均一競合結合アッセイ
においては、抗体、並びに分析対象物（アッセイにおい
てその存在または濃度を決定しようとするりガント）お
よびリガノド類似体（分析対象物と同様、分析対象物と
ほぼ同じ親和性で抗体に結合することのできる、分析対
象物の類似体）はすへて溶液（均一相）中に存在する。

これに対して、不拘−競合結合アソセイでは、一般に抗
体は固相に結合しており、分析対象物および分析対象物
類似体は該固相と接触した溶液中に存在している。

蛍光偏光は、均一競合結合イムノアッセイにおいて生成
したトレーサー−抗体結合体の量を測定する手段を提供
する。蛍光偏光法は、蛍光標識したトレーサーが平面偏
光により励起されたときに、該トレーサーの回転速度と
は逆の相関の度合の偏光を有する蛍光を放出するという
原理に基づいている。従って、該トレーサーの一部とし
て蛍光標識を有するトレーサー−抗体結合体（とりわ（
す、咳トレーサーが該抗体に比べて遥かに小さな分子量
を有する場合）が平面偏光により励起されたとき、蛍光
放出により放出される光は高度に偏光されたままであろ
う。なぜなら、相対的にかさ高くゆっくりと回転してい
る抗体に結合している蛍光団は、光が吸収されてから蛍
光放出が起こるまでの間にその回転が非常に抑制される
からである。

これとは対照的に、未結合トレーサー分子が平面５− 偏光により励起されたときは、その回転は対応するトレ
ーサー−抗体結合体に比へて遥かに速く、そのため、励
起された未結合トレーサー群の方向は抗体結合トレーサ
ー群に比へて遥かに迅速にランダム化に向かい、その結
果、未結合トレーサーからの蛍光放出は抗体結合トレー
サーに比べて完全な脱分極に近付く。それゆえ、異なる
濃度の分析対象物を含有する試料と一定濃度の抗体およ
びトレーサーとを用いた蛍光偏光イムノアッセイにおい
ては、観察される蛍光の偏光は、分析対象物の濃度が増
加するにつれて減少していくことになる。

均一アッセイである蛍光偏光イムノアッセイ（「ＦＰｒ
ＡＪ）においては、遊離のトレーサーおよび抗体に結合
したトレーサーがともに存在している溶液中から最終的
な偏光の読み取りを行う。それゆえ、ＦＰｒＡにおいて
は、他の多くのイムノアッセイ法においては必要とされ
るような、結合トレーサーから遊離トレーサーを分離す
る工程の必要性が有利にも省略される。

６ 既知だが異なる濃度の分析対象物を含有する複数の試料
（「カリブレーク−」）および未知量の分析対象物を含
有する試料の両方について標準調製物（一定量の抗体お
よびトレーサー　一定容量の溶液、一定のｐＨ、イオン
強度、温度など）を用いることにより、ＦＰＩＡは、被
験試料（すなわち、未知）を用いた均一競合結合イムノ
アッセイにおいて生成したトレーサー−抗体複合体の量
を定量的に測定する手段を提供することができる。この
方法は、ＴＤＫセラビューティックドラッグモニタリン
グンステム（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　　Ｄｒｕｇ　　
Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ　　Ｓ　ｙｓｔｅｍ；アボット・
ラボラトリーズ、アービング、テキサス、ＵＳＡより市
販）などにおいて当該技術分野で現在用いられている。

上記ＴＤｘシステムは、たとえば、米国特許第４，４２
０゜５６８号および同第４，２６９．５１１号各明細書
に記載されている（これら文献を参考のため本明細書中
に引用する）。

検量溶液および被験試料のための標準調製物を用いるＦ
Ｐ、ＩＡンステムにおいて、カリブレーク御名液中に用
いｆ二分析対象物が、アッセイしようとする被験試料（
未知）中の分析対象物と化学的に同しであるか、または
カリブレーター中の分析対象物およびアッセイしようと
する被験試料中の分析対象物に対する抗体の親和性が知
られているときは、ＦＰｒＡはまた、被験試料中の分析
対象物の濃度を定量的に測定するための手段を提供する
。

被験試料中の分析対象物が化学的に関連した化合物の複
合混合物であり、カリブレーク−中の分析対象物が単独
の充分に定められた化合物であるときは、ＦＰＩＡは、
分析対象物を含有する被験試料（ある最小量以上（感度
））と分析対象物を含有しない被験試料（ある感度以上
）とを識別することができるが、この場合は被験試料中
の分析対象物の濃度を定性的に測定する手段を提供する
のみである。

バルビッール酸塩のための正確で信頼性のおけるイムノ
アッセイを行うには、所定の分析対象物以外の化合物と
の抗体の交差反応性を最小にする必要がある。バルビッ
ール酸塩に構造的に類似した薬剤、几とえばフェニトイ
ン、ｐ−ヒドロキンフェニトイン、グルテチミトおよび
ブリミトンなどは、競合バルビッール酸塩アッセイにお
いて一般に妨害物（望ましくない交差反応物）とされる
。

バルビッール酸塩のＦＰＩＡにおいて、そのような妨害
物との交差反応性を最小化する抗血清およびトレーサー
を使用することは有利である。

さらに、米国薬物規制局（Ｕｎｉｔｅｄ　　Ｓｔａｔｅ
ｓＤｒｕｇ　　Ｅｎｆｏｒｃｅｍｅｎｔ　　Ａｇｅｎｃ
ｙ；ＤＥＡ）の規制にかかる「規制薬物」と思われる組
成物を使用しない方法により、バルビッール酸塩のＦ’
ＰＴＡに使用するためのトレーサーを調製するのが望ま
しい。

そのような化合物の使用を避けることにより、規制薬物
に関するＤＥＡ規制ζこ従うのに要する著しい時間、労
力および費用を削減することができる。

最後に、分析前に試料の前処理か必要でないバルビッー
ル酸塩アッセイ法の方が、そのような前処理が必要な方
法に比へて迅速である上に誤りも少ないので望ましい。

生物学的試料中のバルビッール酸塩の検出に関１９ する従来技術については、米国特許第４．２４４９３９
号明細書（バルビッール酸トレーサーおよびその調製）
、米国特許第４，１０７，１５７号明細書（バルビッー
ル酸抗原およびそれに特異的な抗体）、米国特許第３．
７６６．１６２号明細書（バルビッール酸抗原およびそ
れに特異的な抗体）、米国特許第３，９０５，８７１号
明細書（ラクタムの酵素への結合体）、米国特許第３，
８７５，０１１号明細書（グルコース−６−リン酸デヒ
ドロゲナーゼを用いた酵素イムノアッセイ）、Ｃ１ｉｎ
ｉｃＣ１１ｎｉｃａｌＣｈｅ　　Ｉ　９８７．３３、＋
９２１（乱用薬物の偏光蛍光イムノアッセイ）、Ｃ１ｉ
ｎｉｃａｌ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　＋　９８４、−
シ」−１＋７６５（バルビッール酸塩の偏光蛍光イムノ
アッセイ）、Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、ｌ９８４．３０．
３ｏ７（偏光蛍光イムノアッセイによる血清中のフェノ
バルビタール測定）、およびＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　
　Ｄｒｕｇ　　Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ　　１９８２、土
、３９７（偏光蛍光イムノアッセイによる血清中のフェ
ノバルビタール測定）を参照することかできる。本件出
願人による米国特許出願第０ ２８４．７８１号明細書（１９８８年１２月１２日出願
）を参照することもできる。

第一級アミノ基または第二級アミノ基で誘導体化したフ
ルオレセイン類似体（該第−級アミノ基または第二級ア
ミノ基により、ＦＰＩＡにおいてトレーサーとして有用
な分析対象物類似体を調製するために該類似体を用いる
ことができる）は知られている。これらフルオレセイン
類似体の例としては、フルオレセインアミンＴ（５−ア
ミノフルオレセイン）、フルオレセインアミンＩＩ（６
アミノフルオレセイン）、４′−アミノメチルフルオレ
セイン、および４゛−（置換アミノ）メチルフルオレセ
インが挙げられる。この点に関しては、Ａｎａｌ、　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、　（１９８７）Ｉ　６２．８９（１９８
７）および米国特許第４，６１４，８２３号および同第
４．５１０．２５１号各明細書を参照することができる
。

（課題を解決するための手段） 本発明は、血清、尿および血漿などの生物学的試料中の
バルビッール酸塩のイムノアッセイ、般に血清中のイム
ノアッセイのための組成物および方法を提供する。

バルビッール酸塩に関し、本発明は、ＦＰ［、Ａを用い
、生物学的試料中の広範囲のバルビッール酸塩を単独ま
ｆ二は組合わせにおいて、その存在およびおよその量を
検出するための組成物および方法を提供する。

本発明が提供するＦＰＩＡ法は、ヒト血清試料の分析へ
の好ましい適用において、バルビッール酸塩について試
験しようとするヒト血清試料を、（１）本発明の新規な
免疫原を用いて調製した、驚くべきことに広範囲のバル
ビッール酸塩とは有意の交差反応性を示ずがバルビッー
ル酸塩アッセイ中の多くの共通妨害物に対しては低い交
差反応性しか示さない本発明の新規抗血清、および（２
）本発明による新規な蛍光ｌ・レーザー、とともにイン
キュベートすることを包含する。

本発明の免疫原および！・レーサーは合成法によって調
製することができ、そのため、Ｕ、Ｓ、ＤＥＡによって
規制される物質の使用を避けることができる。本発明は
また、新規なバルビッール酸塩誘導体を提供することに
よりそのような合成法を容易にするものであり、該誘導
体は本発明のトレーサーおよび免疫原の合成における中
間体として有利に用いることができる。

本発明によるバルビッール酸塩のＦＰＩＡは試料の前処
理を必要とせず、従って、他のバルビッール酸塩アッセ
イ法に比べて、より迅速かつ正確である。

有利かつ予期しないことに、本発明によるバルビッール
酸塩のＦＰＴＡにおいては、他のバルビッール酸塩アッ
セイの邪魔をした多くの化合物からの妨害物が、微々た
るレベルまで減少している。

たとえば、フェニトインおよびプリミドンは一般に処方
される抗けいれん剤であり、ｐ−ヒドロキノフェニトイ
ンはフェニトインの主要な代謝産物である。グルテチミ
ドは、鎮静剤／催眠薬である。

これら化合物の構造はバルビッール酸塩の構造と類似し
ているため、バルビッール酸塩のためのイムノアッセイ
に用いた抗体（すなわち、抗血清中２３ のポリクローナル抗体）が妨害物質と充分に非交差反応
的てないときは、これら化合物はｆ二とえ少量であって
もバルビッール酸塩に関して偽陽性の結果を与える。そ
れゆえ、バルビッール酸塩の正確で信頼のおけるイムノ
アッセイのためには、フェニトイン、ｐ−ヒドロキンフ
ェニトイン、グルテチミドおよびプリミドンとの抗体の
交差反応性を最小にする必要がある。予期しないことに
、本発明によるＦＰＩＡに使用した新規な抗血清とトレ
ーサーとの組合わせにより、フェニトインおよびｐ−ヒ
ドロキンフェニトインについてはそれぞれ約０５％およ
び１０％で交差反応性か保持され、他の妨害物に関して
はアッセイ感度未満で保持されるという点て、フェニト
イン、ｐ−ヒドロキノフェニトイン、グルテヂミトおよ
びプリミトンよりもバルビッール酸塩に対する選択性が
改善されることがわかった。

本発明はざらに、上記アボット・ラボラトリーズのＴＤ
ｘノステムなどの単一工ｅ、ＦＰＩへアソセイノステム
を含む、ＦＰＩＡにおい下パルピッ４ −ル酸塩を決定するのに有用な試験キットをも提供する
。本発明のキットは、本発明の新規トレサーまｆ二はそ
の水溶液またはその塩、および本発明の新規抗血ａ（バ
ルビッール酸塩とトレーサーとの両方を認識する）から
なる。

本発明は、イムノアッセイの行われる管またはシステム
に複数の異なる血清試料を移動させるためにピペットや
同様の装置などの移動手段（分配手段とも称する）を用
いる血清一般のイムノアッセイにおいて改良をもたらす
。その改良点とは、試料の移動の間に、水中のジメチル
スルホキンド（狭い濃度範囲）およびハロケン化アルカ
リ（同じく狭い濃度範囲）の溶液で移動手段を洗浄する
ことである。そのような洗浄は、分析対象物の分配手段
への付着の結果として、アッセイしようとする分析対象
物が一つの試料から他の試料へ持ち越される（ｃａｒｒ
ｙｏｖｅｒ）のを最小にするのに驚くほと有効であるこ
とがわかった。ＦＰＩＡンステム（アボット・ラボラト
リーズのＴＤｘンステムなど）を含む自動イムノアッセ
イノステムは、複数の試料を該ノステム中に移動させ゛
るのに分配手段（ｆことえば、ステンレス鋼また：よテ
フロンコーティングステンレス鋼自動ピペット）を用い
たノステムの例である。

バルビッール酸塩のＦＰＴＡを行うための本発明のキッ
トは、ＦＰＩＡの技術分野でよく知られているように、
上記洗浄液、並びに緩衝液、希釈液、抗菌剤（アジ化ナ
トリウムなと）、安定化剤（ウシ血清アルブミンやウシ
ガンマグロブリンなど）、バックグラウンドを減少させ
るための物質（硫酸銅など）などを含んでいてよい。

本発明の目的および利点は、実施例を含む下記の詳細な
記載を読むことにより一層よく理解されるであろう。

一つの態様において、本発明は、式（Ｉ）：（式中、Ｘ
、は酸素原子または硫黄原子、Ｑｌは（ａ）アミン基に
よるＱ、の親核置換のための活性基、（ｂ）Ｎ−末端ま
たは側鎖アミノ基でカルボニル基に結合した免疫原性ボ
リベプヂド、または（ｃ）フルオレセインアミン■、フ
ルオレセインアミンＩＩ、および弐Ｘ：　　ＣＨ２（Ｎ
Ｈ）Ｒ＋ｏ（式中、Ｒｏは水素原子、炭素数１〜６のア
ルキル基、またはグリンル基である）で示される基で４
°位が置換されたフルオレセインよりなる群から選ばれ
た残基であり、該残基は、式（１）の化合物においてＱ
が結合しているカルボニル基に該残基のアミノ基を介し
て結合している。Ｒ１は炭素数１〜８のアルキレン基、
炭素数３〜８のシクロアルキレン基、炭素数２〜８のア
ルケニレン基または炭素数５〜８のシクロアルケニレン
基；Ｒ７は炭素数１〜８のアルキル基、炭素数３〜８の
シクロアルキル基、炭素数２〜８のアルケニル基、炭素
数５〜８のシクロアルケニル基またはフェニル基である
たたし、（ｉ）Ｒ，は、カーボネート基の酸素原子に結
合している炭素原子以外の０または１個の炭素原子２７
− においでクロロ基またはブロモ基で置換されており、（
ｉｉ）Ｒｙは０または１個の炭素原子においてクロロ基
まにはブロモ基で置換されており、（ｉｉｉ）Ｒ２がフ
ェニル基であるときはＲ１はエチレン基ではない）で示
される化合物を包含する。

本発明の化合物（すなわち式（１）の化合物）に言及す
るときは、種々の互変体およびイオン形（約３〜約９の
間のｐ）（の水溶液中で該化合物が取り得る）、および
バルビッール酸塩環中の５位の不斉炭素原子における立
体配置を含む、該化合物が取り得る種々の立体異性体を
も包含することを意図する。

本発明の化合物のＲ，およびＲ２の定義における「アル
キル」、「アルキレン」、「アルケニル」および「アル
ケニレン」とは、直鎖および分岐鎖の両方のアルキル基
、アルキレン基、アルケニル基およびアルケニレン基を
包含する。本発明の化合物のＲおよびＲ７の定義におけ
る「シクロアルキル」、「シクロアルキレン」、「シク
ロアルケニル」および「シクロアルケニレン１とは、環
状基を意味するだけ８ てなく、１個または２個以上の炭素原子かアルキル基、
アルキレン基、アルケニル基まｆ二はアルケニレン基で
置換された環状基をも意味する。ただし、シクロアルキ
ル基およびシクロアルキレン基においては少なくとも３
個炭素原子が環自体に存在し、シクロアルケニル基およ
びシクロアルケニレン基においては少なくとも５個の炭
素原子が環自体に存在する。

他の態様において、本発明は、抗バルビッール酸塩抗血
清の製造法であって、（ａ）式（ＴＩ）（式中、Ｒ１、
Ｒ２およびＸ、は式（Ｉ）の定義と同じであり、Ｑ２は
、Ｎ−末端または側鎖アミノ基でカルボニル基に結合し
、哺乳動物中で免疫原性であるポリペブヂトである）で
示される化合物で哺乳動物を免疫し、ついで（ｂ）該免
疫した哺乳動物から血清を採取する、ことを特徴とする
方法を包含する。

さらに別の態様において、本発明は、バルビッール酸塩
の存在に関する生物学的試料のアッセイ法であって、（
ａＸｉ）試料、（ｉｉ）（Ａ）式（ＩＩ）：（式中、Ｒ
１、Ｒ７およびＸｌは式（Ｔ）の化合物の定義と同じで
あり、Ｑ、は、Ｎ−末端または側鎖アミノ基でカルボニ
ル基に結合し、哺乳動物中で免疫原性であるポリペプチ
ドである）で示される化合物で哺乳動物を免疫し、つい
で（Ｂ）該免疫した哺乳動物から血清を採取することに
より得た抗バルビッール酸塩抗血清、および（ｉｉｉ）
式（Ｉ）の化合物（式中、Ｑｌはフルオレセインアミン
■、フルオレセインアミンＴＩ、および式Ｘ＋　−ＣＨ
，−（ＮＨ）Ｒ，、（式中、ＲＩＯは水素原子、炭素数
１〜６のアルキル基、またはグリシル基である）で示さ
れる基で４°位が置換されたフルオレセインよりなる群
から選ばれｆこ残基であり、該残基は、式（１）の化合
物においてＱｌが結合しているカルボニル基に該残基の
アミノ基を介して結合している）を水溶液中で混合し、
該水溶液はフルオレセイン残基が蛍光を発するｐＨを有
し、（ｂ）工程（ａ）で得た溶液に平面偏光を通し；（
Ｃ）工程（ｂ）に従って平面偏光を照射した試料からの
蛍光の偏光を測定し、ついで（ｄ）工程（Ｃ）で測定し
た蛍光の偏光を、それぞれ既知だが異なる濃度のバルビ
ッール酸塩を含有する複数の各カリブレーク−試料につ
いて、工程（ａ）で用いた抗血清および工程（ａ）で用
いた蛍光化合物のアリコートを用いて測定した蛍光の偏
光と比較することにより、試料中に１種または２種以上
のバルビッール酸塩が存在するかどうかを確認する、こ
とを特徴とする方法を包含する。

さらに別の態様において、本発明は、哺乳動物血清中の
分析対象物のイムノアッセイのためのシステムにおいて
、移動手段を繰り返し用いることにより複数の血清試料
を該システム中へ移動さ什るシステムの改良に関する。

この改良は、血清状１ 料をシステム中に移動させる間に、溶液（水中の０１４
モル〜０．１６モル濃度にあるＮａＣ１，ＫＣｌ、Ｎａ
ＢｒおよびＫＢｒよりなる群から選ばれｆこ塩溶液ｌ容
量とジメチルスルホキンド０゜８〜Ｉ２容量とを混合し
たもの）で移動手段を洗浄することにある。

本発明はさらに、アボット・ラボラトリーズより市販さ
れているＴＤｘシステムを含む、上記本発明のＰＰＩＡ
法を行うためのシステムなどのＦＰＩＡシステムにおい
て、バルビッール酸塩を決定するのに有用な試薬を含む
キットをも包含する。

本発明のキットは、本発明のトレーサー、すなわち式（
Ｉ）においてＱｌがアミノ誘導体化フルオレセインであ
る化合物またはその塩、および本発明の抗血清、すなわ
ち式（ＩＩ）の化合物を免疫原として用いた上記方法に
より製造した抗血清（バルビッール酸塩とトレーサーの
両方を認識する）からなる。バルビッール酸塩のＰＰＩ
Ａを行うための本発明のキットはまた、本発明による洗
浄溶液、すなわち水中の０．１４モル〜０．１６モル濃
度に２ あるＮａＣ１，ＫＣＩ、ＮａＢｒおよびＫＢｒよりなる
群から選ばれた塩溶液１容量とジメチルスルホキシド０
．８〜１．２容量とを混合したもの、並びにＦＰＩＡ技
術分野でよく知られているように、緩衝液、希釈液、抗
菌剤、安定化剤、バックグラウンドを減少させる物質な
とを含んでいてよい。

式（Ｉ）においてＱｌがカルボニル基からの親核置換の
ための活性化基である化合物は、式（Ｉ）においてＱｌ
が免疫原性ポリペプチドまたはフルオレセインのアミノ
誘導体である化合物の合成中間体である。下記にも記載
するように、式（Ｉ）においてＱｌが親核置換のための
活性化基である化合物は、マロン酸のジアルキルエステ
ルを出発物質とし、−（Ｃ＝０）Ｑ、が水素原子で置換
された化合物の類似体を経て好ましく容易に合成され、
Ｕ。

Ｓ、ＤＥＡの管轄の下での規制物質である化合物を使用
もしくは製造することはない。

ＤＥＡの管轄は、規制物質自体はいうに及ばず、規制さ
れていなくとも規制物質を用いて製造される物質にも及
ぶ。それゆえ、式（ｒ）の化合物（Ｑ。

が親核攻撃のための活性化基であるものを含む）は規制
物質ではないので、式（Ｉ）の化合物を製造するのに好
ましい合成法を用いれば、ＤＥＡの管轄および付随する
問題や費用を有利に回避することができる。

アミン窒素原子の親核攻撃によるカーボネートカルボニ
ル基からの置換のための活性化であり、従って式（１）
においてＱ、て包含される基として、多くの基が知られ
ている。その例を挙げれば、クロロ基、ブロモ基、フル
オロ基、アルコキン基（たとえば、メトキシ基、エトキ
シ基なと）、置換アルコキン基（たとえば、２　２．１
−トリフルオロエトキシ基など）、アルケニルオキシ基
（たとえば、イソプロペニルオキシ基など）、フェノキ
シ基、置換フェノキシ基（たとえば、ｐ−ニトロフェノ
キシ基、ペンタフルオロフェノキシ基、３．４−ジクロ
ロフェノキシ基など）、Ｎ−スクシンイミジルオキン基
、Ｎ−フタルイミジルオキシ基、イミダゾリル基、ベン
ゾトリアゾリルオキシ基、および有機化学分野でよく知
られている他の同様の脱離基なとである。クロロ基が最
も好ましい。

式（Ｉ）においてＱｌが免疫原性ポリペプチドである化
合物は、本発明による免疫原である。本発明による免疫
原中の免疫原性ポリペプチドとしては、上記式（１）に
おいてＱｌが親核攻撃のための活性化基であるバルビッ
ール酸塩誘導体などの低分子量化合物（すなわち、ハプ
テン）に対して免疫応答（すなわち、抗体の産生）を引
き起こす担体タンパク質として適当なポリペプチドまた
はポリアミノ酸であればいかなるものであってもよく、
免疫学の当業者にはよく知られているような方法で該ハ
プテンと該担体タンパク質との結合体を哺乳動物に投与
したときに該結合体に対して該哺乳動物中で免疫応答を
引き起こすものであればよい。

免疫原性ポリペプチドは、合成ポリペプチドおよび天然
ポリペプチドのいずれでもよく、本発明によるバルビッ
ール酸塩ハプテン（上記のように、式（１）においてＱ
、が親核攻撃のための活性化基である化合物）のカーボ
ネートカルボキシル基とアミド結合を形成し得る少なく
とも１つの遊離の＝３５ アミノ基を含んでいる。免疫原性ポリペプチドの例とし
ては、ポリリシン：キーポールリンペットなどのヘモン
アニン：ニワトリ卵アルブミンなとのトリ卵アルブミン
；ｆｆ１ｆｉ乳動物の免疫グロブリンおよびガンマグロ
ブリン；哺乳動物の血清アルブミン、および哺乳動物の
チログロブリンなどが挙げられる。本発明の式（Ｉ）（
または式（ＩＮ）の化合物中に含ませるのに好ましい免
疫原性ポリペプチド（担体タンパク質）は、ウシ血清ア
ルブミン（ｒＢＳＡＪと略す）およびウシチログロブリ
ンｆｆＢＴｈｙＪと略す）であり、最も好ましいのはＢ
ＳＡである。

ＢＳＡおよびＢＴｈｙを含む多くの一般に用いられてい
る担体タンパク質は、シグマ・ケミカル社（セントルイ
ス、ミズーリ、ＵＳＡ）を含む多くの入手源から本発明
の担体タンパク質として使用するのに適した形態（一般
に少なくとも約９５％の純度）にて購入することができ
る。本発明の式（ＩＩ）の免疫原分子において、担体タ
ンパク質各１分子に対してハプテンを１分子以上結合す
ることも可能であることが理解されるであろう。実際、
各１６ 分子の担体タンパク質に対して平均して少なくとも１０
分子のハプテンが結合するのが好ましい。

式（１）においてＱｌがフルオレセインのアミノ誘導体
である化合物は、本発明のトレーサーである。

上記で説明したように、またイムノアッセイの技術分野
、とりわけＰＰ　ＩＡの技術分野でよく理解されるよう
に、本発明のトレーサーはバルビッール酸塩の分析対象
物類似体である。それゆえ、この分析対象物類似体は、
本発明の抗血清中のバルビッール酸塩認識抗体への結合
に対して、本発明のＦＰＩＡでアッセイを行っている試
料中に存在するバルビッール酸塩と競合する。アッセイ
システム中のトレーサーは、結合しているもの（そのよ
うな抗体に）も遊離のものも、フルオレセイン残基によ
り放出される蛍光により検出することができる。しかし
ながら、上記でも説明したように、抗体に結合したトレ
ーサーの蛍光の偏光は遊離のトレーサー（本質的に完全
に脱分極されている）のものよりも有意に高く、それゆ
え、試料中のフルオレセイン残基からの蛍光の偏光を測
定する（多くのよく知られた方法により）ことにより、
結合トレーサーの濃度の測定値が得られ、この値は、ト
レーサーと同しように抗血清中の抗体により認識される
バルビッール酸塩の濃度に反比例する。

本発明のトレーサー中のフルオレセイン残基は、下記式
（ｒｖ）に示すフルオレセイン自体と同様、酸（また：
よ「開環」）互変体またはラクトン（または「閉環」）
互変体であり、これら２形態の濃度比は溶液のｐａｌに
依存する。下記式（ＴＶ）はまた、本明細書中に用いた
フルオレセイン残基の番号付けをも示している。

（以下余白） 式（Ｉ　Ｖ） 酸　形　　　　　　　ラクトン形 酸形は蛍光性であり、可視領域の青色部分にある波長の
光を吸収し、約４ナノ秒の蛍光崩壊（ｆｌｕｏｒｅｓｃ
ｅｎｃｅ　　ｄｅｃａの半減期の後、可視領域の緑色部
分の光を放出する。本発明のアッセイにおいては、溶液
のｐＨは、トレーサーのフルオレセイン残基が酸形であ
るものの濃度がラクトン形であるものの濃度よりも有意
に大きくなるように設定するのが好ましい。それゆえ、
そのような溶液中のｐＨは約３〜約１２の間であれば使
用可能であるが、約５〜約１０の間のｐ）（がより好ま
しく、約６〜約８の間のｐＨが最も好ましい。

フルオレセインのアミノ誘導体を用い、該フルオレセイ
ン誘導体のアミノ基（第一級または第二級）とＲ１基に
結合したカルボキシレートのカルボ９ ニル基との間にアミド結合を生成することにより、本発
明のトレーサーを製造することができる。それゆえ、本
発明のトレーサー中のＱ、は、とりわけ、フルオレセイ
ンアミン［（５−アミノフルオレセイン）、フルオレセ
インアミンＩＩ（６−アミノフルオレセイン）、まには
式（Ｘ）ニーＣＨ２−（ＮＨ）ＲＩＱ（式中、Ｒｈｏは
、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、またはグリシ
ル（−（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＮＨｚ）基である）で示される
基で４′位が置換されたフルオレセインであってよい。

最も好ましいのは、Ｑ、が４′−アミノメチルフルオレ
セイン（「ＡＭＦＪと略す）であるトレーサーである。

本発明の中間体の前駆体、すなわち式（１）においてＱ
、−（Ｃ＝Ｏ）−が水素原子で置換された化合物の誘導
体の合成は、下記実施例において詳細に記載してあり、
マロン酸のンアルキルエステル、たとえばマロン酸ノエ
チルを出発物質として用いる（マロン酸ジメチルら同様
に用いることができる）。一般に、上記マロン酸ジアル
キルを、まず保護水酸基（後に脱保護する）を含む試薬
でアルキ０ ル化する。尿素で処理して５−モノ置換バルビッール酸
を生成し、これにさらに２回目のアルキル化を行って５
−位に他の基を導入する。尿素での処理は、第二のアル
キル化の後に行うことらできる。ついで、保護水酸基を
脱保護して本発明の対応中間体（すなわち、式（Ｉ）に
おいてＱｌが親核置換のための活性化基である化合物）
を合成することができる。先例は、この一般的方法に対
して多くの変更が可能であることを教示している。たと
えば、当業者であれば、保護水酸基を含む基が第一にで
はなく第二に導入されるようにアルキル化の順序を逆に
することができることがわかるであろう。Ｘｌが硫黄原
子である前駆体もまた、尿素の代わりにチオ尿素を用い
る他はＸｌが酸素原子である前駆体の場合と同様にして
製造することができる（Ｘ、には酸素原子か好ましい）
。

本発明の中間体、すなわち、式（Ｉ）においてＱｌが（
第一級または第二級）アミノ基によるカーボネートのカ
ルボニル基からの親核置換のための活性化基である化合
物は、よく知られた方法により、適当な溶媒（ヘンゼン
、アセトニトリル、テ）・ラヒドロフランまたはジメト
キノエタンなと）中、上記水酸基含有前駆体を、該水酸
基部位において反応性エステルを生成する活性化試薬と
反応させることにより製造することができる。これらの
活性化試薬の例としては、ホスケン、カルホニルノブロ
マイド、カルボニルノフルオライト、２．２２−トリフ
ルオロエチルクロロホルメート、ｌ−リクロロメチルク
ロロホルメート、フェニルカーボネート、置換フェニル
カーボネート、メチルカポネート、エチルカーボネート
、カルボニルジイミダゾール、カルボニルノベンゾトリ
アゾール、および有機化学分野の当業者にはよく理解さ
れるように、式（Ｉ）の化合物中のカーホネートに結合
することのできる多くの活性化基に対応する化合物（た
とえば、上記参照）などが挙げられる。上記水酸基含有
前駆体をベンゼン中でホスゲンと反応させて式（Ｉ）に
おいてＱ、がクロロ基である中間体を生成するのが最も
好ましい。

本発明の免疫原（すなわち、式Ｕ［）の化合物）は、ｐ
Ｈを約７と９の間に緩衝した水溶液中で免疫原性ポリペ
プチドと」１記中間体（ポリペプチドに対して大モル過
剰にて）とを単に混合し、周囲環境（すなわち、室、恭
（約２３°Ｃ）および約１気圧）にて約１時間から約５
時間、該溶液中で結合反応を進行させ、ついて生成した
結合体を緩衝水溶液に対して充分な透析を行うかまたは
サイズ排除クロマトグラフィーにより中間体および他の
低分子量化合物から分離すれば製造される（この点に関
しては下記実施例９および１２を参照）。

本発明のトレーサー、すなわち式（１）においてＱｌが
フルオレセインのアミノ誘導体である化合物は、フルオ
レセイン誘導体と式（１）の化合物に対応する本発明の
中間体とをほぼ等モル量にて、大モル過剰（たとえば、
２当量）の塩基（たとえば、トリエチルアミン、または
池の好ましくは揮発性のトリアルキルアミンなど）の存
在下、適当な溶媒（たとえば、ジメチルホルムアミドな
ど）中で単に混合し、周囲条件下で約６時間から約２４
時間、フルオレセイン誘導体と中間体との間て親核置換
３− を行わ什、ついて、好ましくは周囲温度、真空下て溶媒
を除去した後、クロマトグラフィーによりトレーサーを
精製すれば製造することができる（この点に関しては下
記実施例１を参照）。

本発明の免疫原は、本発明のＦＰＩＡにおいて使用する
１こめの抗バルビッール酸塩抗体を製造するために使用
する。この免疫原を用いて製造した抗体はポリクローナ
ルである。この抗体は、インビトロ免疫法によりポリク
ローナル抗体を製造するための免疫学の分野で知られた
方法を用い、抗体を産生し得る培養液中の哺乳動物細胞
（たとえば、リンパ球または膵臓細胞など）を本発明の
免疫原でインビトロ免疫することにより製造することが
できる。しかしながら、このポリクローナル抗体は、本
発明の抗バルビッール酸塩抗血清の一部として用いるの
が最も好ましい。

本発明の抗血清は、本発明の免疫原を用いて哺乳動物を
免疫し、ついで該免疫原に対して免疫応答が引き起こさ
れた後に該哺乳動物から血清を採取する標準法により製
造することができる。本発４ 明の抗血清を得るために用いる哺乳動物としては、とり
わ：す、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウスおよびラットが
挙げられる。ヒツジが好ましい。さらに、本発明の抗血
清を製造するのに用いた本発明の免疫原の免疫原性ポリ
ペプチドは、抗血清を製造するのに用いた哺乳動物種と
は異種のポリペプチドであるのが好ましい。本発明の免
疫原中の免疫原性ポリペプチドとしては、ウシ血清アル
ブミンが最も好ましい。免疫学分野の当業者には理解さ
れるように、本発明の抗血清の製造法の細かい点は、哺
乳動物の種、年令、体重およびその他の特徴、所望の抗
バルビッール酸塩抗体の力価、使用した接種物（たとえ
ば、アジュバントを使用したか否か、使用したのであれ
ばいかなるアジュバントををいかなる濃度で使用したの
か；免疫原の濃度など）の組成、およびその他の因子に
依存して若干変わるであろう。にらかかわらず、あらゆ
る哺乳動物種を用いて本発明の抗血清を容易に製造し得
ることは、当業者の充分になし得るところである。

−船釣には、本発明の抗血清を製造するに際して、本発
明の免疫原をアジュバント（フロイントの完全まｆ二は
不完全アジュバントなと）とと乙に生理学的に許容し得
る水溶液（生理食塩水なと）中で哺乳動物に皮下注射ま
たは静脈内注射にて２ａ間から約３箇月かけて数回投与
する。最後の注射からさらに幾らかの時間（約１週間か
ら約３箇月）の後に、接種した哺乳動物から血液を定期
的に採取し、標準法（本質的に血液から血球を除くこと
を含む）により該血液から血清を調製し、ついでこの血
清を抗バルビッール酸塩抗体の力価について分析する。

抗体の力価が一担許容レベルまで達したと思われたら、
一般に大量の血液を該動物から採取し、この血液から得
た血清は貯蔵しておき、アッセイまたはアッセイ用試験
キットで必要なときに応じて使用する。本発明の免疫原
で免疫した結果、許容し得る力価で抗バルヒツール酸塩
抗体を産生ずるようになった哺乳動物は、一般に、関連
する性質において可能な限り殆ど均一な抗血清源を得よ
うとする試みにおいて、できるだけ長く維持するように
する。たとえば下記実施例１３に記載しであるように、
緩衝液、安定化剤、抗菌剤、バソクグラウントを減少さ
せる物質などと混合して用いる他に、抗血清を産生ずる
哺乳動物から得た血液から血球を除いた後に得らしｆコ
抗血清を本発明の抗血清として用いることらできる。

多くのイムノアッセイシステム、ＦＰ［Ａおよび他のと
りわけ自動化ノステムにおいては、単一の移動手段を繰
り返し用いて異なる試料を分析用ノステムに移動させる
。このことは、ある一つの試料中に存在している分析対
象物が上記移動手段に付着し、後に移動してきた試料中
に持ち込まれ、後に移動してきた試料中の分析対象物に
関して偽陽性または誤って高い濃度を与える可能性があ
るという「持ち越し」の問題が生じさせる。この持ち越
しの問題を最小限に抑えるため、この繰り返して用いら
れる移動手段を移動の間に洗浄溶液で洗浄しなければな
らない。本発明を行っていく間に、本発明者らは、血清
試料のイムノアッセイにおける持ち越しを最小に抑える
のに驚くほど効果的な洗浄溶液を発見した。この溶液は
、必須成分とし７ て、水、ジメチルスルホキッド、およびＮａＣｌ、ＫＣ
Ｉ、ＮａＢｒおよびＫＢｒよりなる群から選ばれたハロ
ゲン化アルカリ（ＮａＣ１が好ましい）を含んでいる（
すなわち、本質的にこれらの成分からなる）。ここで「
本質的にこれらの成分からなる」とは、言及しｆ二成分
以外の成分は有意の量では組成物中に存在しないが、微
々たる量の他の成分（たとえば、溶解した空気、微々た
る量の他の成分、不純物として存在する他の塩または他
の種類の物質を含む）は存在してもよいことを意味する
。本発明の洗浄溶液は、通常、周囲条件下で、０，８〜
１．２容量のジメチルスルホキッドを、本質的に水中の
０．１４モル〜Ｏ１６モル（好ましくは約０．１５モル
）のＮａＣ１，ＫＣＩ、ＮａＢｒまたはＫＢｒからなる
溶液Ｉ容量と混合して溶液とすることにより製造する。

イムノアッセイまたはその一部を行うチューブ、マイク
ロタイタープレートウェル、ミリタイタープレートウェ
ル、または他の試料ホルダーへ試料を移動させるために
用いるあらゆる移動手段も、本発明の洗浄溶液により８ 有利に洗浄することができる。一般に、当該技術分野で
よく理解されるように、移動手段（まｆ二は「分配手段
」としばしば称される）は、一つの容器から他の容器へ
と所定量の流体（たとえば、血清試料など）を分配する
ために用いるピペットなどのある種のチューブである。

ピベツＩ・たる移動手段であって本発明の洗浄溶液を有
利に使用することの可能なものは、手動ピペット、エツ
ペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒ４ｓ）、および自動ピペ
ットであり、これらはガラス、プラスチック（ネオプレ
ン、テフロンなどを含む）、ステンレス鋼、プラスチッ
クをコーティングしたステンレス鋼、テフロンをコーテ
ィングしたステンレス鋼などでできている。本発明の洗
浄溶液を使用するには、試料の移動の間に少なくともか
つ好ましくは１回、移動手段を充分に濯ぐだけでよく、
各濯ぎには洗浄溶液の新たなアリコートを使用し、移動
手段を濯ぐのに使用した後の洗浄溶液の各アリコートは
捨てる。

バルビッール酸塩について血清試料のＦＰＩＡを行うた
めの本発明のキット（た七えば、アポソト・ラボ゛ラド
リーズＴＤｘシステムを使用しｊ二ちのなど）（才、ガ
ラスびん、またはガラスびんとは別の他の種類の容器、
まｆ貿よ本発明の抗血清および本発明のトレーサー中保
持する容器なとの中に本発明の洗浄溶液を含んでいるの
が有利である。

本発明の抗血清およびトレーサーは、生物学的試料、好
ましくはヒト尿または血清試料、最も好ましくはヒト血
清試料中のバルビッール酸塩について本発明のＦＰＴＡ
を行うのに使用する。

本発明によるＦＰＩＡバルビッール酸塩アッセイには、
本発明の抗バルヒツール酸塩抗血清およびバルビッール
酸塩類似体トレーサーを、１種または２種以上のバルビ
ッール酸塩の存在についてアッセイしようとする試料と
混合することが含まれる。バルビッール酸塩およびバル
ビッール酸塩類似体（蛍光）トレーサーに特異的な抗体
の濃度は、トレーサーなどの濃度およびバルビッール酸
塩の濃度（試料中に存在するなら）に比べて極めて低い
。

バルビッール酸塩（存在するなら）とトレーサーとは限
られた数の抗体結合部位に対して競合し、その結果、抗
体−蛍光分析対象物類似体複合体、およびバルビッール
酸塩分析対象物か存在するなら抗体−分析対象物複合体
も生成する。既知の濃度のバルビッール酸塩を含有する
検量試料（「カリブレーター」）を含む異なる試料の一
連のアッセイについてｌ・レーサーおよび抗体（同し抗
血清の試料から）の濃度を一定に保つことにより、イン
キュベートした後のトレーサー−抗体複合体に対するバ
ルビッール酸塩−抗体複合体の比は、血清中のバルビッ
ール酸塩の量に正比例し、試料で観察された蛍光の正味
の偏光に反比例する。それゆえ、被験試料（すなわち、
バルビッール酸塩の存在について試験しようとする試料
）から得られた蛍光の偏光を、蛍光偏光をカリブレーク
−試料中のバルビッール酸塩濃度の関数として、同じト
レーサ、同じトレーサー濃度、同じ抗血清、および該抗
血清中の抗バルビッール酸塩抗体の同じ＃度をシステム
中で行ったすべての偏光測定値と比較することにより、
試料中に含まれるバルビッール酸塩の量を少なくとも定
性的に決定することができ１ る。

本発明のＦＰＩＡはあらゆる種類のＦＰｒＡであってよ
く、手動であっても自動であってしよい。

しかしながら、本発明のＦＰＩＡは、ＴＤＸンステム（
アボット・ラボラトリーズ、アーピング、テキサス、Ｕ
ＳＡから市販されている）などの１工程の自動化システ
ムで行うのが好ましい。

本発明の抗血清と本発明のトレーサーとのいかなる組合
わせも、本発明のＦＰＩＡにおいて用いることができる
。本発明の免疫原を２種以上用いて得られた抗血清の組
み合わせ、または本発明のトレーサーの２種以上の組み
合わ仕を本発明のＦＰｒＡにおいて用いることも可能で
あるが、好ましくはない。単一の本発明の免疫原を用い
て調製した抗血清および単一の本発明のトレーサーを本
発明のＦＰＩＡに用いるのが好ましく、そのようなＦＰ
ＴＡにおいてはトレーサー中の基Ｒ，は抗血清を製造す
るのに用いｆ二免疫原中の基Ｒ１とは異なり、またトレ
ーサー中の基Ｒ２は抗血清を製造するのに用いた免疫原
中の基Ｒ３と異なってい２ るのが好ましい。Ｒ３およびＲ２基におけるこのような
相異は、ＦＰＴＡ手順においてバルビッール酸塩分析対
象物とトレーサーとが抗体への結合に関して競合するの
を容易にする利点がある。本発明のＦＰＴＡのための抗
血清とトレーサーとの最も好ましい組み合わけは、式（
２Ｉ）の免疫原（下記実施例９参照）を用いて調製した
ヒツジ抗血清と式（１）のトレーサー（下記実施例１参
照）との組み合わせである。

ＦＰＩＡ（バルビッール酸塩のための本発明のＰＰＩＡ
を含む、ヒト尿または血清中でのものを含む）を首尾よ
く行う上で採用することのできる細かい条件に関しては
多くの広範囲の変化があり得ることは当業者には理解さ
れるであろう。本発明のＦＰＩＡを行うための一つの詳
細なプロトコールを下記実施例に示す。このプロトコー
ルは本発明を限定することを意図するものではなく、実
際のＦＰＩＡシステムを説明し、本発明のＦＰＩＡを行
うためのプロトコールを確立する上での導きとなるもの
である。

本発明のＦＰＴＡにより感度良く検出することの可能な
驚くべきかつ有利に広範囲のバルビッール酸塩、および
バルビッール酸塩のアッセイにおする通常の妨害物に対
して本発明のＦＰＴＡが驚くべきかつ有利に感度を示さ
ないことが、下記実施例１４および１５に示しである。

これら実施例からもわかるように、本発明に従って検出
可能な分析対象物としては、とりわけ、バルビッール酸
塩アモバルビタール、アブロバルビタール、ブタロバル
ビクール（ｂｒａｌｌｏｂａｒｂｉｔａｌ）、ブタルビ
タール、ブタルビタール、ベンドパルビタール、フエノ
バルビタール、セコバルヒクール、およびタルブタール
などが挙げられる。

実際、本発明の前には、ヒト血清中の広範囲のバルビッ
ール酸塩のアッセイを行うための実際的なシステムはな
かった。

上記のように、本発明のＦＰＩＡは本発明の試験キット
を用いることにより容易に行うことができる。本発明の
キットにおいて、本発明の抗血清（一般に適当なｐ）（
に調節した緩衝液中で希釈し、エチレングリコールやウ
ソ血清アルブミンなどの安定化剤、アジ化ナトリウムな
どの抗菌剤などを含有する、実施例１３参照）は一つの
容器に保持し、本発明のトレーサー（一般に緩衝水溶液
中に希釈、安定化剤などを含有していてもよい、実施例
１３参照）は別の容器に保持し、キットに含まれていて
よい他の溶液（本発明の洗浄溶液、「前処理」溶液、カ
リブレーク−１希釈緩衝液などを含む）はさらに別の容
器に保持する（再び、実施例１３を参照）。あらゆる種
類の容器（その多くは当業者によく知られており、その
ような溶液を保持および移動させるのに適している）を
用いることができ、たとえば、ガラスまたはプラスチッ
クバイアルが含まれ、ねじぶたの覆いが付いているのが
好ましい。

本発明のＦＰＩＡを行うのに使用する溶液中に使用でき
る代表的な緩衝液としては、とりイつけ、ホウ酸塩、リ
ン酸塩、炭酸塩、トリスなどが挙げられる。特定の緩衝
液を用いることは本発明では重要ではないが、リン酸緩
衝液が好ましい。

＝５５ 本発明のＦＰＴＡのための下記実施例１３に記載した好
ましい手順は、アホット・ラボラトリーズＴＤｘクリニ
カルアナライザーのみならず、ＡＤｘまたはＩＭｘなど
のアボット・ラボラトリーズ自動乱用薬物システム（す
べて、アボット・ラボラトリーズ、アービング、テキサ
スから市販されている）にも有利に用いることができる
。これらのシステムを用いた場合には、アッセイは最初
から最終的な読み取りに至るまで完全に自動化されるこ
とを理解すべきである。しかしながら、手動アッセイを
行うこともできる。自動および手動アッセイの場合には
、試料の半分を前処理溶液の半分および希釈緩衝液の半
分と混合し、バックグラウンドの読み取りを行う。つい
で、残りの試料半分を希釈抗血清およびトレーサー溶液
とともに前処理溶液の残り半分および希釈緩衝液の残り
半分と混合する（実施例１３に記載したプロトコールの
工程１および工程２を参照）。ついで、インキュベート
した後、蛍光偏光を読み取り、データ処理して被験試料
中にバルビッール酸塩が存在するか５８ 否かに関する情報を得る。

下記実施例は本発明をさらに詳しく説明するものである
が、本発明はこれらに限られるものではない。

実施例１ 本実施例では、下記式（１）で示す本発明の最も好まし
いトレーサーである５−（３−［（４’−フルオレセイ
ニル）メチルアミノカルボニルオキシコシクロベント−
１−イル）−５−プロピルバルビッール酸の合成を記載
する。

式（１） ％式％］ 無水ジクロロメタン（５００ｉＱ）中の３５％過酢酸（
酢酸ナトリウム２９で前辺て処理；７６ｇ、０３４モル
）および粉末炭酸ナトリウム（９１，４ｙ、０８６モル
）の懸濁液を機械的に撹はんし、水浴で周期的に冷却し
ながら、この懸濁液に新たに解重合して得たシクロペン
タジエン（４５，５４８９，０，６９モル）を４５分か
けて滴下した。１時間撹はんした後、反応混合物を濾過
し、濾過ケーキをジクロロメタン（２００肩ので洗浄し
た。濾液および洗浄液を集め、０〜５℃に冷却した水（
２５０ｘ（りに１時間かけて加えた。この混合物をさら
にｌＯ０時間撹んした。ジクロロメタン層を分離し、水
（２ｘ　５０ｍ１２）で抽出した。回転蒸発器上で水を
除き、残渣を０．３ＲｘＨｇで蒸発させて透明な無色油
状物（１４，１６９ｇ）を得た（沸点、８２〜８５°Ｃ
）。

［４，−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）フクロベ
ント−２−エン−１−オール］ 上記で得た油状物（＋、５９２９．１５．９ミリモル）
にジメチルホルムアミド（２０ｉｆ２）、イミダゾール
（１，５１ｇ、２２，３ミリモル）およびＬブチルジメ
チルシリルクロライド（２，３９ｇ、１５．９ミリモル
）を順番に加えた。得られた溶液を１２２時間撹んし、
ジエチルエーテル（１，００ｘρ）で希釈し、各２ｍＱ
の水で６回抽出した。有機相をＭｇＳＯ４て乾燥し、濾
過し、濃縮した。ヘキサンを充填した２Ｘ１８ｃπカラ
ム上のクロマトグラフィーニかけ、各１００ｍ（ｉの２
％、４％、６％、１０％、１５％、および２０％酢酸エ
チル／ヘキサンで溶出して１２ｘρフラクノヨン２６〜
３５中に透明な無色油状物（６８３１１９）を得た。

［４−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−１−ヨー
ドシクロベント−２−エンコ ジエチルエーテル（４，，５ｉ０中のトリフェニルホス
フィン（１，２５９，４，７９ミリモル）の溶液をアセ
トニトリル（１，５ｉ（２）中のイミダゾール（３２５
肩９．４．７９ミリモル）の溶液に加え、得られた混合
物を０℃に冷却し、ヨウ素（１，１３９，４，４７ミリ
モル）（少しずつ）、ついで上記工程に記載のようにし
て調製した油状物で順番に処理した。周囲条件で１時間
撹はんした後、反応混合物を濃縮して油状スラッジとし
た。このスラッジを最少量のジクロロメタン中に溶解し
、２０％ジ９ エチルエーテル／ヘキサン（８０ｆｆｆ２）を用い、２
０％ジエチルエーテル／ヘキサンを充填したシリカゲル
の２Ｘ１０ｃｍカラムで濾過した。濃縮して黄−オレン
ジ色の油状物（１，４２７ｇ）を得、これを直ちに次の
反応に用いた。

［１−［４−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）シク
ロベント−２−エニル］マロン酸ジエチル］上記工程の
ヨウ化物をテトラヒドロフラン（２１１ｇ）中の溶液と
して、ジメチルポルムアミド（２順）中の水素化ナトリ
ウム（１０５ｍｇ、３．５１ミリモル、８０％油分散液
）（各５πＱのペンタンで３回前辺て洗浄）およびマロ
ン酸ジエチル（０，５３，Ｗ（！。

３５１ミリモル）の溶液（周囲条件にて前以て１時間撹
はんしたもの）に加えた。すぐにオレンジ色が消え、３
０分後に反応混合物を１２時間還流した。ついて、この
混合物を冷却し、ＩＮ　　ＭＣＩでｐＨ３の酸性にし、
各１５１の酢酸エチルで３回抽出した。抽出物をＭ　ｇ
　Ｓ　０４て乾燥し、濾過し、濃縮した。ヘキサンを充
填した２Ｘ１８ｃｍシリカゲルカラム上のクロマトグラ
フィーにかけ、各５０ ＯｍＱの２％、４％、６％および８％の酢酸エチル／ヘ
キサンおよび１００７！（！の１０％酢酸エチル／ヘキ
サンで溶出して１２１１１２フラクシヨン１３〜１７中
に透明な無色油状物（６９７ｘｇ）を得た。

［１−［４−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）シク
ロベント−２−エニル］アリルマロン酸ジエチル］ 上記工程で調製した油状物をジメチルポルムアミド（１
、５ｍ＋２）中に溶解し、この溶液を、ジメチルホルム
アミド（０，５ｘｄ）およびテトラヒドロフラン（０５
祿）中の水素化ナトリウム（３２ＩＩ＋９．１０８５９
モル、８０％油分散液）（前以て各５ｍρのペンタンで
３回洗浄したもの）の懸濁液に加えた。

１時間撹はんした後、透明な薄褐色の溶液が得られ、ア
リルブロマイド（１１０μｆｆ、１．２７ミリモル）を
加えた。この溶液を周囲条件にて１２２時間撹んした。

この反応液を酢酸エチル中に希釈し、水（０，５１）で
反応を停止させた。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過
し、濃縮した。ヘキサンを充填したｌＸ１８ｃｍシリカ
ゲルカラム上のクロマ）・グラフィーにかけ、５０＋１
１１２の４％酢酸エチル／ヘキサンおよび５０好の８％
酢酸エチル／ヘキサンで溶出して、６ｙ＋ｇフラクンヨ
ン５中に透明な無色油状物（＋６９ｏ）、さらにフラク
ション６〜９中に同じく１８４哩を得た。

［１−［４−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）シク
ロベンチル］プロピルマロン酸ジエチル］上記工程の最
後に記載したクロマトグラフィー手順のフラクション５
中のマロン酸ジアルケニル（１６９ｍｇ、０．４３ミリ
モル）を無水エタノール（ｌＯｄ）中に溶解し、１０％
パラジウム／炭素（１７ＩＩＩｇ）と混合した。この混
合物に水素ガスを通し、４５〜５１ｐｓｉで２時間水素
化した。触媒を濾過により取り除き、濾液を濃縮して透
明な無色油状物（ｔ５８１１９）を得た。

Ｅ５−（１−［４−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ
）シクロペンチル］）−５−プロピルバルビッール酸］ 無水エタノール（３ｘ（２）中のナトリウム（３５巧、
１．５０ミリモル）および尿素（３５Ｒ９，０，５７ミ
リモル）の溶液に、上記工程で得た油状物を加えた。エ
タノールを蒸発により除き、残留したシロップを８０℃
で６時間加熱し、ついで冷却し、ついでさらに１２２時
間撹んした。このシロップをついで酢酸エチル中に希釈
し、ＩＮ　　ＭＣＩでｐＨ４の酸性にした。有機相を分
離し、Ｍｇ５Ｏ，で乾燥し、濾過し、濃縮した。クロロ
ホルムを充填したｌＸ１２ｃｘシリカゲルカラム上のク
ロマトグラフィーにかけ、５０好の３％メタノール／ク
ロロホルムおよび５０酎の６％メタノール／クロロホル
ムで溶出して７ｍＱフラクション３中に透明な無色油状
物（２８Ｒ９）、さらにフラクション４〜フ中に同じく
６８屑２を得た。

［５−［１−（４−ヒドロキシシクロペンチル）］］５
−プロピルバルビッール酸］ ：記工程のフラクション３で得た物質（２８ｘ９）をア
セトニトリル（０，５ｚ＆）中に溶解した。この溶液を
０℃に冷却し、４８％フッ化水素酸水溶液（１滴）で処
理した。３５分間撹はんした後、この反応混合物を濃縮
し、残渣をメタノール中に溶解３− し、得られた溶液を０．２５２Ｉｉｘ　２０ｃｘＸ　２
０ｃｘシリカゲルプレート上にすし状に適用し、６％メ
タノール／クロロホルムで溶出した。主要なバンドを８
０％メタノール／クロロホルムで溶出し、濃縮して白色
固体（１２，５，ｔｌ？）を得た。同様の別のプレート
上でさらにクロマトグラフィーを行ってそれぞれ別のバ
ンドとして２１１ｇおよびＩＯｕの白色固体を得た。

［５−（Ｌ−［（４’−フルオレセイニル）メチルアミ
ノカルボニルオキシ）シクロベント−１−イル）５−プ
ロピルバルビッール酸］： 上記工程で得た主要生成物（１０ｘ９）のうち２゜５ｍ
ｙ（９，８マイクロモル）をテトラヒドロフラン（０，
２好）中に溶解し、この溶液にベンゼン中のホスゲンの
１２％溶液（０，３ｍのを加えた。１時間撹はんした後
、この溶液を乾燥窒素気流中で濃縮し、ジメチルホルム
アミド（５０μＱ）中のアミツメデルフルオレセイン塩
酸塩（すなわち、４′−［アミツメデルフルオレセイン
塩酸塩８３．９１１ｇ、９８マイクロモル）およびトリ
エチルアミン（２，８６４ μＱ、１９．６マイクロモル）の溶液で処理した。

この反応混合物を周囲条件にて１２２時間撹んした後、
溶媒をポンプで除き、得られた残渣をメタノール中に再
溶解し、０．２５ｘｉｘ　２０ｃｉｘ　２０＋ｚ灰シリ
カゲルプレート上にすし状に適用した。１０％メタノー
ル／クロロホルムで展開し、主要バンドを８０％メタノ
ール／クロロホルムで溶出し、濃縮して痕跡物（５，１
ｘ９）をオレンジ色の固体として得た。この痕跡物は、
Ｃ１８プレート上の逆相クロマトグラフィーにより５０
％アセトニトリル／水で溶出して精製することができた
。

実施例２ ５−（１−［（４°−フルオレセイニル）メチルアミノ
カルボニルオキシ〕ペント−４−イル）−５−アリルバ
ルビッール酸： 本実施例の標記トレーサーは式（３）で示される。

式（３） ０ ％式％］ テトラヒドロフラン（１０１１１の中の４−ブロモペン
タン酸エチル（１，００ｇ、４７８ミリモル）の溶液に
、水素化ホウ素すヂウム（１６７Ｉｌ＋９．７．６６ミ
リモル）を加えた。周囲条件にて１２２時間撹んした後
、この混合物をジエチルエーテル中に希釈し、０℃に冷
却し、もはや水素が発生しなくなるまで等部の水および
飽和ＮＨ４Ｃｌで処理して反応を停止させた。有機相を
ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮して無色のやや曇っ
た粘性の層状物（＋、０６３９）を得た。

［１−（２−エトキン）エトキシ−４−ブロモペンタン
］ 上記工程で調製した曇った油状物をエチルビニルエーテ
ル（２ｘρ）中に溶解し、０℃に冷却した。

［）−）ルエンスルホン酸−水和物の結晶（数個）を加
え、反応混合物を周囲温度に温め、１時間撹はんした。

この反応混合物を濃縮し、ついでヘキサンを充填した２
Ｘ１８ｃｉシリカゲルカラム上で直接クロマトグラフィ
ーにかけ、１００ｍｇの５％ジエチルエーテル／ヘキサ
ンおよび１００＋＋Ｑの１０％ジエチルエーテル／ヘキ
サンで溶出した。１０ｒｒｒＱフラクシヨン７〜１７を
濃縮して透明な無色油状物（８７２Ｒ１？）を得た。

［：［１−（２−エトキシ）エトキンベント−４−イル
コマロン酸ジエチル］ ナトリウム（８３ｍｇ、３．６３ミリモル）を無水エタ
ノール（１，５＋９）中に溶解した。ついでマロン酸ジ
エチル（０，５５πσ、３．６３ミリモル）を加え、つ
いで上記工程で調製した油状物およびヨウ化ナトリウム
（＋８０１ｇ、１．２１ミリモル）を加えた。この混合
物を１２時間還流し、冷却し、水で反応を停止させ、各
２０７１１ｆ）の酢酸エチルで３回抽出した。これら抽
出物をＭ　ｇ　Ｓ　Ｏ４で乾燥させ、６７ 濾過し、濃縮した。２Ｘ１８ＣＪＩシリカゲルカラム上
のクロマトグラフィーにかけ、１００Ｒｆ！の５％酢酸
エチル／ヘキサン、１００ｍ１２の１０％酢酸エチル／
ヘキサン、および１００ＦＩＱの５０％酢酸エチル／ヘ
キサンで溶出して、Ｉ２１ｒＱフラクシヨン２１〜２４
中に透明な無色油状物（８６１Ｍｇ）を得た。

［［ド（２−エトキシ）エトキシベント−４−イル］ア
リルマロン酸ジエチル］ 水素化カリウム（３４１ｍｉ＋、２．９８ミリモル）（
３５％鉱油懸濁液）を各５ｘ１２のヘキサンで洗浄し、
ジメチルホルムアミド（２，Ｏｘの中に懸濁した。

上記工程て得たマロン酸エステルのテトラヒドロフラン
（１，ｏｍＱ）中の溶液を加え、この混合物を１時間撹
はんして薄褐色の溶液を得た。つし）てアリルブロマイ
ド（０，２８ｘρ、　　３．２５ミリモル）を加え、こ
の混合物を周囲条件にて１時間撹はんし、ついで３時間
還流した。この混合物を冷却し、水で反応を停止させ、
各１５ｉρの酢酸エチルで４回抽出した。これら有機相
をＭ　ｇ　Ｓ　Ｏ４で乾燥させ、８ 濾過し、濃縮して油状物を得た。この油状物をヘキサン
を充填した２ＸＩ８ｃ１！シリカゲルカラム上のクロマ
トグラフィーにかけ、１００ｚＱの５％酢酸エチル／ヘ
キサン、１００靜の８％酢酸エチル／ヘキサン、および
１００靜の１０％酢酸エチル／ヘキサンで溶出した。１
２順フラクシヨン８〜１４を濃縮して透明な無色油状物
（６１４，ｆｆｌ＋）を得た。

［［１−（２−エトキシ）エトキシベント−４−イル］
５−アリルバルビッール酸コニ ナトリウムＣｌ３３ｍｇ、５．フロミリモル）を無水エ
タノール（２靜）中に溶解し、尿素（＋３１ｆｆｇ、１
．９２ミリモル）を加えた。上記工程で調製したマロン
酸エステル（５９９ｍ９）のエタノール（０，５１Ｑ）
中の溶液を加え、この溶液を１２時間還流した。回転蒸
発により殆どのエタノールを除き、水で反応を停止させ
、各１０ｍ９の酢酸エチルで４回抽出した。これら抽出
物を集めてＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮した。ク
ロロホルムを充填したｌＸｌ５ｃｘカラム上のクロマト
グラフィーにかけ、３０ｍｇのクロロホルム、５０村の
３％メタノール／クロロホルム、および５０酎の６％メ
タノール／クロロホルムで溶出し、６靜フラクシジン６
〜１２を濃縮して生成物（２９９ｍｇ）を得た。

［５−（１−ヒドロキシベント−４−イル）−５アリル
バルビッール酸］： 上記工程の生成物（ｉｏ４ｘｙ、０．３２　ミリモル）
をエタノール（３酎）中に溶解し、５％硫酸（０，２Ｘ
Ｃ）で１０分間還流処理し、この時点でＴＬＣは出発物
質が残っていないことを示した。この溶液を１０％メタ
ノール／クロロホルムを充填した１Ｘ１２ｃｉシリカゲ
ルカラムで濾過し、１０％メタノール／クロロホルムで
溶出し、溶出液を濃縮して白色固体（６１ＪＩ９）とし
た。この固体をメタノール中に再溶解し、０５２肩ｘ　
２０ｃｉｘ　２０ｃ仄プレート上にすじ状に適用した。

１０％メタノール／クロロホルムで展開し、主要バンド
を８０％メタノール／クロロホルムで溶出して白色固体
（３９ｍｇ）を得た。

［５１１−［（４’−フルオレセイニル）メチルアミノ
カルボニルオキシ］ベント−４−イル）−５−アリルバ
ルビッール酸］ 上記工程で調製した白色固体（３，０ｍ９．９４マイク
ロモル）を、実施例１のトレーサーを調製するために用
いた実施例の最後の工程に記載の方法と同様にして標記
トレーサーに変換した。

実施例３ ５−（１−［４，−（４″−フルオレセイニル）メチル
アミノカルボニルオキシ］ベント−４−イル）−５−プ
ロピルバルビッール酸： 本実施例の標記トレーサーは下記式（２）で示される。

式（２） ％式％］ プロピルマロン酸ジエエチ］・ １ 実施例２中で得た２−［１−（２−エトキシ）エトキシ
ベント−４−イルコー２−アリルマロン酸ジエチル（５
７ｍｇ、０．１７　ミリモル）を無水エタノール（１０
Ｉの中に溶解し、１０％パラジウム／炭素（６即、５６
マイクロモル）と混合した。この混合物に水素ガスを通
し、４４ｐｓｉにて４時間水素化した。セライトブラン
ドのケイソウ土で濾過して触媒を除き、濃縮して無色の
油状物（５３′ｌ１９）を得た。

［５−［１−（１−ヒドロキンペンデル）］−］５−プ
ロピルバルビッール酸］ 上記工程で得た化合物（８１１Ｎ９．０．２５ミリモル
）をテトラヒドロフラン（２酎）中に溶解し、ｌＮ　　
ＨＣＩ溶液（４滴）と２時間反応させた。この反応混合
物を濃縮し、２つの０．５ｚ肩×２０ＣＩＩ×１０ｃｘ
（高）プレート上にすし状に適用した。１５％メタノー
ル／クロロホルムで展開し、主要バンドを５０％メタノ
ール／クロロポルムで溶出して白色の半固体（４０Ｉｇ
）を得た。

［５１１−［４−（４°−フルオレセイニル）メチル７
２ アミノカルボニルオキシ］ベント−４−イル）−５−プ
ロピルバルビッール酸コ。

このアミノメチルフルオレセイントレーサーは、５−［
４−（１−ヒドロキシペンチル）］−］５−プロピルバ
ルビッール酸３ｍｇ）から、実施例１の最後の工程に記
載の方法に従って調製した。

実施例４ ５−（４−［（４’−フルオレセイニル）メチルアミノ
カルボニルオキン］シクロヘキシ−１−イル）５−アリ
ルバルビッール酸 本実施例の標記トレーサーは、下記式（５）で示される
。

式（５） ％式％ ［４−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）シクロへキ
サン−１−オールコ： 実施例１中の４−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）
フクロベント−２−エン−１−オールの調製において記
載した方法に従い、１，４−シクロヘキサンジオール（
１ｇ）をシリル化した。

［４−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−１−ヨー
ドシクロヘキサン］ このヨウ化物は、実施例１中の４−（ｔ−ブチルジメチ
ルシリルオキシ）−１−ヨートンクロベント−２−エン
の調製において記載した方法により調製した。

［＋−［１−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）シク
ロへキンルコマロン酸ジエチル］ 標記化合物は、実施例１中の１−［４，−（ｔ−ブチル
ジメチルシリルオキシ）シクロベント−２＝エニル］マ
ロン酸ジエチルの調製において記載した方法により調製
した。

＋：＋　−［４−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）
シクロヘキシル］アリルマロン酸ジエチル］このマロン
酸ジアルキルは、実施例Ｉ中の１［４，−（ｔ−ブチル
ジメチルシリルオキシ）シクロベント−２−エニルコア
リルマロン酸ジエチルの調製において記載した方法によ
り調製した。

［５−（１，［４−（ｔ−ブチルツメチルシリルオキシ
）シクロへキシル］）−５−アリルバルビッール酸］： このバルビッール酸誘導体は、実施例１中の５（１−［
４−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）シクロペンヂ
ル］）−５−プロピルバルビッール酸の調製において記
載した方法により調製した。

［５−［］−（］４−ヒドロキシシクロヘキンル］］５
−アリルバルビッール酸］ ：施例１中のＥ＋−［１−（４−ヒドロキンンクロペン
チル）］−］５−プロピルバルビッールの調製において
記載した方法によりエーテルを脱保護した。

［５−（４−［（４’−フルオレセイニル）メチルアミ
ノカルボニルオキン］シクロヘキサ−１−イル）５−ア
リルバルビッール酸］ このトレーサーは、４−ヒドロキノンクロヘキシル類似
体から、実施例１のトレーサーである５ ５−（３−［（４’−フルオレセイニル）メチルアミノ
カルホニルオキシ］シクロベント−１−イル）５−プロ
ピルバルビッール酸の調製のための最後の工程において
記載した方法により調製した。

実施例５ ５１３Ｅ−４，−［（４°−フルオレセイニル）メチル
アミノカルボニルオキンコー３−メチル−２ブテニル）
−５−アリルバルビッール酸：本実施例の標記トレーサ
ーは、下記式（６）で示される。

式（６） ［３，３−ジメチルアリルマロン酸ジエチル］水素化ナ
トリウム（４２２ａｖ９．１４．１ミリモル、８０％鉱
油分散液）を各５ｚＱのペンタンで３回洗浄し、テトラ
ヒドロフラン（１０ｍσ）とジメチルホ６ ルムアミド（５ｍＱ）との混合物中に懸濁した。マロン
酸ジエチル（２，０４９，１３，４ミリモル）を加え、
混合物を４０分間撹はんして透明な薄褐色の溶液を得た
。ついてフェニルブロマイド（２００９，１３４ミリモ
ル）を加え、溶液を１時間還流した。水で反応を停止さ
せ、ＩＮ　　ＭＣＩでｐＨ２の酸性にし、各１０７１１
２のジエチルエーテルで２回抽出した。有機相をＭ　ｇ
　Ｓ　０４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。ヘキサンを
充填して２Ｘ１８ｃｍカラム上のクロマトグラフィーに
かけ、各５０酎の２％、４％、７％、１０％、および１
５％ジエチルエーテル／ヘキサンで溶出して１２１１ｆ
ｆフラクシヨン４〜１６中に無色透明の油状物（２，７
３４９）を得た。

［（３，３−ジメチルアリル）バルビッール酸］：無水
エタノール（１ｒｐ、ｆＤ中のナトリウム（７０Ｂ、３
．０３ミリモル）の溶液に、尿素（６１肩？、ＩＯ１ミ
リモル）を加え、ついで上記工程で調製したマロン酸エ
ステル（２００７１１ｇ、０．８８ミリモル）の無水エ
タノール（１３１１２）中の溶液を加えた。エタノール
（Ｉ　ＩＩＩ（りを蒸発により除き、残留した溶液を−
夜還流した。この溶液をＩＮ　　ＭＣＩでｐＨ３の酸性
にし、各１０ｉ４の酢酸エチルで２回抽出しｆ為有機相
を集めてＭｇ５Ｏｔて乾燥し、濾過し、濃縮して白色固
体（２１４ｉｙ）を得た。

［５−（３，３−ジメチルアリル）−５−アリルバルビ
ッール酸］： テトラヒドロフラン（０，５ｍ４）およびジメチルホル
ムアミド（１０Ｍの中の上記固体の溶液に、水素化ナト
リウム（３３ｍｇ、１０９ミリモル、８０％鉱油分散液
）を加えた。この溶液を１時間撹はんし、アリルブロマ
イド（０、Ｉ　］肩（２）を加え、得られた溶液を４８
８時間撹んした。ＩＮ　　ＨＣｌでｐＨ３の酸性にして
反応を停止させ、各１ＯｙＱの酢酸エチルで３回抽出し
た。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した
。ヘキサンを充填したＬＸＩ８ｃｘシリカゲルカラム上
のクロマトグラフィーにかけ、各２５ｏ２の２０％およ
び３０％酢酸エチル／ヘキサン、ついで５０１１１σの
５０％酢酸エチル／ヘキサンで溶出して７酎フラクソヨ
ン８〜１．　Ｉ中に無色透明の油状物（ｌｏＯｚｇ）を
得た。

［５−（３Ｅ−４−ヒドロキシ−３−メチル−２ブテニ
ル）−５−アリルバルビッール酸］。

上記工程で調製したツエンバルビッール酸（１００ｍ９
）のジクロロメタン（１頗）中の溶液に、二酸化セレン
（９ｇ、８４マイクロモル）、サリチル酸（６＊ｇ、４
２マイクロモル）、およびベンゼン中のｔ−プチルヒド
ロパーオキソドの３．８Ｍ溶液（０２９ｍＱ、１０９ミ
リモル）を加えた。この溶液を１２時時間分に撹はんし
、濃縮した。３０％酢酸エチル／ヘキサンを充填したＩ
Ｘ］４ｃｍカラム上のクロマトグラフィーにかけ、各２
５酎の４０％、５０％、６０％、および７０％酢酸エチ
１１ノ／ヘキサンて溶出して所望の生成物（２１ｍ９）
イ　ｍρフラクション１４〜１９中の無色透明の油状物
として得、同時にフラクション６〜１０中に出発物質お
よび未同定の生成物からなる混合物を得た。

［５−１３Ｅ−４−［（４°−フルオレセイニル）メチ
ルアミノカルボニルオキシ］−３−メチル−２ブテニル
）−５−アリルバルビッール酸］：このトレーサーは、
上記工程で得た５−（３Ｅ９ ４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ブテニル）５−アリ
ルバルビッール酸（５ｘｙ）を出発物質として用い、実
施例１のトレーサーである５−Ｃ３［（４′−フルオレ
セイニル）メチルアミノカルポニルオキンコンクロベン
ト−１−イル）−５−プロピルバルビッール酸について
記載した方法に従って調製した。

実施例６ ５１３Ｅ−４−［（４’−フルオレセイニル）メチルア
ミノカルボニルオキシ］−３−メチル−２−ブテニル）
−５−（２−ブロモアリル）バルビッール酸 本実施例の標記トレーサーは、下記式（７）で示される
。

式（７） ％式％ （２ モアリル）バルビッール酸］ この二置換バルビッール酸誘導体は、５−（３３−ジメ
チルアリル）バルビッール酸（２２９１１Ｉｇ）を出発
物質とし、上記実施例６の５−（３，３−ジメチルアリ
ル）−５−アリルバルビッール酸の調製について記載し
た方法に従って調製した。

［５−（３Ｅ−４−ヒドロキシ−３−メチル−２ブテニ
ル）−５−（２−ブロモアリル）バルビッール酸］ 上記工程で調製したブロマイド（５０Ｒｇ、０１６ミリ
モル）の溶液に、二酸化セレン（１８％ｇ、０１６ミリ
モル）、無水エタノール（０５Ｒρ）および水（５０μ
Ｑ）を加えた。この溶液を４時間還流し、冷却し、０　
、　５０ｍｍ×２０ｃ＊Ｘ　２０ｃｘプレート上で直接
クロマトグラフィーにかけ、６％メタノール／クロロホ
ルムを用いて展開した。主要なバンドをこすり取り、８
０％メタノール／クロロホルムで溶出して白色の泡（１
２ｍ９）を得た。

［５−（３Ｅ−４−［（４’−フルオｌノセイニル）メ
チルアミノカルホニルオキシ］−３−メチル−２式（８
） ％式％ ］： このトレーサーは、上記工程で調製した白色の泡（４，
７Ｒ９）を出発物質とし、実施例１のトレーサーである
５−（３−［（４’−フルオレセイニル）メチルアミノ
カルボニルオキシコシクロベント−１−イル）−５−プ
ロピルバルビッール酸について記載した方法に従って調
製した。

実施例７ ５−＜４−（３−［（４°−フルオレセイニル）メチル
アミノカルボニルオキン］プロピル）シクロベント−２
−エン−ニーイル）−５−（２−メチル）アリルバルビ
ッール酸： 本実施例の標記トレーサーは、下記式（８）で示される
。

［シフ０ペンテニルマロン酸ジエチル］：新たに解重合
して得た一７８℃に冷却保持したシクロペンタジェン（
１７４，１？、２．　６３モル）に、ＨＣＩガス（８７
，５９，２，５０モル）を加えた。

その間に、無水エタノール（４００ｘρ）中のナトリウ
ム（２＋、４９．０．９３モル）の溶液にマロン酸ジエ
チル（１５２ｍρ、１．０モル）を加えた。シクロペン
タジェンにＭＣＩを添加完了後、得られた黄色の粗製塩
化物（−７８℃に保持）をｌｚ＆ずつ上記マロン酸エス
テル溶液を加えた。各ｌｙｅ部のマロン酸エステル溶液
の添加により、相当の熱が発生し、黄色い色は急速に消
えていき、多量の白色沈澱が生成した。このマロン酸エ
ステルをすべて添加した後、得られた懸濁液を１７時間
撹はん一８３＝ し、その後、大部分のエタノールを回転蒸発により除き
、水（２００ｘ＆）で反応を停止させ、各１００蛙のジ
エチルエーテルで５回抽出しｆ二。抽出物を集めてＭｇ
ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮して透明な黄色の油状物
を得た。この物質の一部を０゜５ｉｉＨｇで蒸留して透
明な薄縁色の油状物（１９０９１ｇ）を得た（沸点：９
１〜９４°Ｃ）。

［１，−（４−ブロモシクロベント−２−エニル）マロ
ン酸ジエチル］ 上記工程で調製したシクロペンテニルマロン酸エステル
（１，０９，４，４２ミリモル）の四塩化炭素ｃ９ｚｆ
２）中の溶液に、Ｎ−ブロモスクシンイミド（７８７ｇ
ｇ、４．４２ミリモル）およびベンゾイルペルオキシド
（５ｇｇ）を加えた。この溶液を加熱還流して反応を開
始させ、ついで５分間撹はんした。ついで、さらに３０
分間還流した。得られた懸濁液を濾過し、濾過ケーキを
各５酎の四塩化炭素で２回洗浄した。これを濃縮して所
望のブロマイドを透明な黄色の油状物として得た。

［４１１−［３−（２−エトキシ）エトキシプロピ＝８
４− ル］）シクロベント−２−エン−１−イルマロン酸ジエ
チルコニ ジエチルエーテル（３ｍＣ）中の３−（２−エトキシ）
エトキン−■−ブロモプロパン（１，３９０ｇ、６．６
３ミリモル）の冷（−７８℃）溶液に、ｔ−ブチルリチ
ウム（７，８ｉＱ、１３．３ミリモル、ペンタン中の１
．７Ｍ溶液）を加えた。３０分間撹はんした後、シアン
化銅（Ｉ）（２９７πり、３．３１ミリモル）をジエチ
ルエーテル（］、０ｘ１２）中の懸濁液としてカニユー
レにて加えた。さらに３０分間撹はんし、−５０℃に温
め、テトラヒドロフラン（２ｍのを注入した後、上記工
程で調製した黄色の油状物をテトラヒドロフラン（１ｇ
の中の溶液として加え、得られた溶液を１時間かけて０
℃に温めた。飽和ＮＨ，ＣＩで反応を停止させ、各１５
好の酢酸エチルで４回抽出した。得られた抽出物をＭｇ
ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮した。ヘキサンを充填し
た２Ｘ１８ｃｘカラム上のクロマトグラフィーにかけ、
５０酎の８％酢酢酸エチル／ヘキシンよび５０ｉｆ２（
７１１１５％酢酸エチル／ヘキサンで溶出して１２ｍＣ
フラクンヨン８〜１２中に無色透明の油状物（６１８ｉ
ｇ）を得た。

［４−（１−［３−（２−工トキノ）工トキソプロピル
］］ンクロペント−２−エン−１−イル−（２メヂル）
アリルマロン酸ジエチル］ 前辺て各５ｍＱのペンタンで３回洗浄した水素化ナトリ
ウム（１８ｚ９．０５９ミリモル）（８０％鉱油分散液
）のテトラヒドロフラン（０２次の中の冷（０℃）懸濁
液に、ジメチルホルムアミド（０４ｍＱ）中の上記工程
で調製したマロン酸エステル（１９０Ｒｇ、０５３ミリ
モル）を加えた。この溶液を３０分間撹はんしながらゆ
っくりと周囲温度に温め、暗赤色の溶液を得た。ついで
、メタリルクロライド（７３μｍ２，０．７４ミリモル
）およびヨウ化ナトリウム（５ｉｇ）を加え、得られた
混合物を４８時間撹はんした。飽和Ｎ　Ｈ、ＣＩで反応
を停止させ、ｐＨ４の酸性にし、各１０ｍρの酢酸エチ
ルで３回抽出した。抽出物をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾
過し、濃縮した。ヘキサンを充填したｌＸ１ｇ口カラム
上のクロマトグラフィーにかけ、５０村の４％酢酸エチ
ル／ヘキサンおよび５０＋（ｌの８％酢酸エチル／ヘキ
サンで溶出して６好フラクノヨン６〜９中に無色透明の
油状物（５５ｕ）を得た。

［４−（３−ヒドロキシプロピル）フクロペント２−エ
ン−１−イル−（２−メチル）アリルマロン酸ジエチル
］ 上記工程で調製したエーテル（１０９ｉｙ、０２７ミリ
モル）のテトラヒト七フラン（１，５ｙの中の溶液を１
０％硫酸水溶ｔＬ（２滴）で処理した。

３０分間撹はんした後、反応混合物を窒素流下で濃縮し
、ヘキサンを充填したＩＸ’１６ｃ１１カラム上のクロ
マトグラフィーにかけ、各２５順の１０％、２５％、お
よび４０％酢酸エチル／ヘキサンで溶出した。７１１Ｑ
フラクシヨン１０〜１１がら無色透明の油状物（７９所
）を得た。

［５−［４−（３−ヒドロキシプロピル）シクロベント
−２−エン−１−イル］−５−（２−メチル）アリルバ
ルビッール酸］ 上記工程で得た４−（３−ヒドロキシプロピル）シクロ
ベント−２−エン−１−イル−（２−メチ８フ ル）アリルマロン酸ジエチル（７９ｆｆｇ）を出発物質
として周円対応する（３．３−ジメチルアリル）マロン
酸ジエチルから（３，３−ジメチルアリル）バルビッー
ル酸を調製するのに用いた方法（実施例５参照）と同様
にしてジアルキル化ノくルビツール酸を調製した。

［５−＜４−４３−［（４°−フルオレセイニル）メチ
ルアミノカルボニルオキシ］プロピル）シクロベント−
２−エン−１−イル＞−５−（２−メチル）アリルバル
ビッール酸］： このトレーサーは、上記工程で得た化合物（５゜４　ｘ
ｇ）を出発物質として用い、実施例１のトレーサーであ
る５−（３−［（４°−フルオレセイニル）メチルアミ
ノカルボニルオキン］シクロベント＝１−イル）−５−
プロピルバルビッール酸の調製に用いた方法と同様にし
て調製した。

実施例８ ５−（４，−［（４°−フルオレセイニル）メチルアミ
ノカルボニルオキシ］ベント−２−イル）−５−アリル
バルビッール酸 ８８ 本実施例の標記トレーサーは、５−［２−（４クロロカ
ルボニルオキノ）ペンチル］−５−アリルバルビッール
酸および４゛−アミノメチルフルオレセインを出発物質
として用い、実施例１の最終工程に記載した塩基触媒ア
ミド化の方法を用し）で調製した。５−［２−（４−ク
ロロカルボニルオキシ）ペンチルコー５−アリルバルビ
ッール酸（本発明の好ましいハプテンである５−［２−
（４−カルボニルオキソ）ペンチル］−５−アリルバル
ビッール酸を包含する）の調製法は下記実施例９に記載
しである。

本実施例の標記トレーサーは、下記式（４）で示される
。

式（４） 実施例９ 本発明の最も好ましい免疫原である５−［２−（４カル
ボニルオキシ）ペンチル］−５−アリルバルビッール酸
ウソ血清アルブミン（下記式（２１））の調製法を記載
する。

式（２１） ％式％） ］ ジメチルホルムアミド（９ｄ）中の２．４−ベンタンジ
オール（１，００９，９，６０ミリモル）の溶液に、ｔ
−プチルジメチルンリルクロライド（１５２ｇ、ｌ００
１ミリモル）およびイミダゾール（９１５ｘｇ、１３．
４ミリモル）を加えた。この溶液を１２２時間撹んし、
エーテル（１００Ｘｃ）中に希釈し、各２蛙の水で５回
洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮
した。ヘキサンを充填した２ＸｌＳｃｉカラム上のクロ
マトグラフィーにかけ、各１００１１ｇの５％、１０％
、および２５％酢酸エチル／ヘキサンで溶出して１０ｍ
（ｌフラクション６〜１４中に無色透明の油状物（１゜
９２ｇ）を得た。

［４−（ｔ−ブチルジメチルノリルオキン）−２−ヨー
ドペンタン］ エーテル（５，５１１Ｑ）およびアセトニトリル（１゜
５１１Ｑ）中の上記工程で調製したアルコール（１，１
９２ｇ）、トリフェニルホスフィン（２，０１９，７６
５ミリモル）およびイミダゾール（５２１ｘｇ、７６５
ミリモル）の溶液に、ヨウ素（１，８１ｇ、７１１ミリ
モル）を少しずつ加えた。得られた黄色の懸濁液を３時
間撹はんし、回転蒸発器上で濃縮した。残渣をジクロロ
メタン中に溶解し、２Ｘ１２Ｑ１１シリカゲルカラムで
濾過し、１００ｍＱの２０％ジエチエチーテル／ヘキザ
キサ充填し溶出した。

濃縮して無色透明の油状物（１，８３３９）を得た。

［２−［４−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキン）ペン
チルコマロン酸ジエチル］： １ 前以て各５Ｉｌ１ｇのペンタンで３回洗浄した水素化ナ
トリウム（１６４π９．５４７ミリモル）のジメチルホ
ルムアミド（２１１ρ）中の冷（０℃）懸濁液に、マロ
ン酸ジエチル（０，８４ｉ（２，５４７ミリモル）を加
えた。１時間撹はんした後、上記工程で調製した粗製の
ヨウ化物（１，８３３９）をテトラヒドロフラン（２村
）中の溶液として加え、この反応混合物を６０℃で１２
時間温めた。水で反応を停止させ、ＩＮ　　ＭＣＩでｐ
Ｈ４の酸性にし、各１５１１Ｑの酢酸エチルで３回抽出
した。抽出物を集めてＭｇ　Ｓ　Ｏ４で乾燥し、濾過し
、濃縮した。ヘキサンを充填した２ＸＩ８ｃｚンリ力ゲ
ルカラム上のクロマトグラフィーにかけ、５０ｘ（ｌの
ヘキサン、１００酎の２％酢酸エチル／ヘキサン、１０
０好の５％酢酸エチル／ヘキサン、および１００ＩＩＩ
Ｑの１０％酢酸エチル／ヘキサンで溶出して１０１Ｎ４
フラクノヨン９〜１８中に無色透明な油状物（１６１２
ｇ）を得た。

［１−［１−（ｔ−プチルジメチルシリルオキシ）ペン
デル］アリルマロン酸ジエチル］ ９２− 前以て各５ｍａのペンタンで３回洗浄した水素化ナトリ
ウム（１４１ｍｇ、４．７０ミリモル）のジメチルホル
ムアミド（５１１の中の懸濁液に、上記工程で調製した
マロン酸エステルを加えた。１時間撹はんした後、アリ
ルブロマイド（０，４６πρ、５３７ミリモル）を加え
、この反応混合物を６０℃で４８時間温めた。水で反応
を停止させ、各■５好の酢酸エチルで３回抽出した。抽
出物をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮した。ヘキサ
ンを充填した２ｘｌＳｃｉカラム上のクロマトグラフィ
ーにかけ、５０ｘ（２の１％酢酸エチル／ヘキサンおよ
び１００ｘ（！の５％酢酸エチル／ヘキサンで溶出して
１０靜フラクシヨン８〜１２中に無色透明の油状物（１
，６３５ｇ）を得た。

［２−（４−ヒドロキンペンチル）アリルマロン酸ジエ
チル］。

上記工程で調製したマロン酸エステル（１８５ｉ９．０
４６ミリモル）のテトラヒドロフラン（０゜５靜）中の
溶液に、Ｔ　ＨＦ中の１．０Ｍテトラブチルアンモニウ
ムフルオライド（１，Ｏｖｔのを加えた。８時間撹はん
した後、溶液を濃縮し、ヘキサノを充填し炭酸ｌＸｌ８
ｃｘカラム上で直接クロマトグラフィーにかけ、各５０
仄ρの５％、１０％、２０％、５０％、および７５％酢
酸エチル／ヘキサンで溶出した。６ｎＱフラクンヨン９
〜１８中に無色透明な油状物（６７ｉｇ）を得た。

［５−［２−（４−ヒドロキンペンチル）］−］５−ア
リルバルビッール酸 ］水エタノール中のナトリウム（３５ｍｇ、１５２ミリ
モル）の溶液に、尿素（３３ｘｌｊ、０５５ミリモル）
および上記工程で調製したノエステル（１３２次９．０
４６ミリモル）をエタノール（０５Ｒの中の溶液として
加えた。１２時間還流した後、反応混合物を濃縮し、Ｉ
Ｎ　　ＨＣＩでｐＨ３の酸性にし、各１５ＲＱの酢酸エ
チルで３回抽出した。抽出物をＭｇ５Ｏ，で乾燥し、濾
過し、濃縮した。この物質の一部（４９Ｒ９）をメタノ
ール中の溶液として０　、　５０ｘ＊ｘ　２０ｃ＊ｘ　
２０ｃ肩プレート上に適用した。このプレートを１０％
メタノール／クロロホルムで展開した。主要なバンドを
８０％メタノール／クロロホルムで溶出して白色結晶固
体（３７ｚｇ）を得た。このアルコールを、下記工程に
おける免疫原、および実施例８に記載のフルオレセイニ
ルトレーサーを調製するのに用いた。

［５−［１−（４−カルボニルオキシ）ペンチル］５−
アリルバルビッール酸ウシ血清アルブミン免疫原］ 上記工程で調製したアルコール（３５ｘ９．０゜１４ミ
リモル）のテトラヒドロフラン（１，０ｆｆ４）中の冷
（０°Ｃ）溶液に、ベンゼン中の１２％ホスゲン溶液（
１，０ｘｅ）を加えた。得られた溶液を３時間撹はんし
、その間に周囲温度まで温めた。乾燥アルゴン流中で濃
縮して濃い無色油状物（４５所）を得た。この物質をテ
トラヒドロフラン（０，７７ｘＱ）中に溶解し、この溶
液のうち７０μｇを実施例８のトレーサーを調製するの
に用い（実施例８の最終工程参照）、残りを本工程の標
記免疫原を製造するのに用いた。それゆえ、免疫原に関
しては、溶液の残りを、１．０Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液（５，６ｉＣ；ｐＨ８，０）およびジメチルホルム＝
９５− アミド（２，４ｍ１２）中のウシ血清アルブミン（４，
００ｒｙｒｇ）の溶液に加えた。周囲温度にて３時間撹
はんした後、反応混合物を各６１２の水に対して４０時
間かけて４回透析した。この免疫原溶液を使用するとき
まで凍結した。

実施例１０ ５−［２−（４−ペンテニル）］−５−［１〜（２−カ
ルボニルオキシ）エチルコつルビツール酸ウシ血清アル
ブミン免疫原 本実施例の標記免疫原は、下記式（１７）で示される。

式（１７） ％式％］： このヨウ化物は、４−ヒドロキン−１−ペンチン（５９
）を出発物質とし、実施例９に４−（し−ブチルジメチ
ルシリルオキシ）−２−ヨードペンタ６ ンについて記載したのと同じ方法に従って調製した。

［２−（４−ペンテニル）マロン酸ジエチル］：このモ
ノ置換マロン酸エステルは、上記工程で得た粗製のヨウ
化物を出発物質とし、実施例９に１−［４−（ｔ−ブチ
ルジメチルシリルオキシ）ペンチルコマロン酸ジエチル
について記載したのと同じ方法に従って調製した。

［２−（４−ペンテニル）−１−（２−テトラヒドロピ
ラニルオキシ）エチルマロン酸ジエチルコ・テトラヒド
ロフラン（Ｉ　ｐＨ２）およびジメチルホルムアミド（
２酎）中の水素化カリウム（３３２ｉｇ、２．８９ミリ
モル）（３５％鉱油分散液、各５１１Ｑのヘキサンで３
回洗浄したもの）の懸濁液に、上記工程のモノ置換マロ
ン酸エステル（６００ｙｘ９．２６３ミリモル）を加え
た。１時間撹はんした後、２−（テトラヒドロピラニル
オキシ）−１−ヨードエタン（８０８ｉ９．３．１６ミ
リモル）を加え、この溶液を周囲温度にて１時間撹はん
し、ついで１２時間還流した。水で反応を停止させ、混
合物を各１０７！４の酢酸エチルで３回抽出した。抽出
物をＭ　ｇ　Ｓ　Ｏａで乾燥し、濾過し、濃縮した。ク
ロロホルムを充填したｌＸ１８ｃ＊ンリカゲルカラム上
のクロマトグラフィーにかけ、２％メタノール／クロロ
ホルムで溶出してｌ０ｔｒｔＱフラクシヨン５〜８中に
無色透明な油状物（７７５ｍｇ）を得た。

［５−［２−（４−ペンテニル）］−５−［＋　−（２
テトラヒドロピラニルオキシ）エチルコバルビツール酸
］ このバルビッール酸誘導体は、上記工程で調製したマロ
ン酸エステル（７６５ｉ９）を用い、実施例９で５−［
２−（４−ヒドロキンペンチル）］−５アリルバルビッ
ール酸の合成について記載した方法と同様にして調製し
た。

［５−［１−（４−ペンテニル）］−５−［１−（２ヒ
ドロキシエチル）］バルビッール酸］上記工程で得たテ
トラヒドロピラニルバルビッール酸（１４０巧、０４３
ミリモル）のエタノール（２ｉρ）中の溶液に、５％硫
酸水溶液（０，５ｘｆ２）を加えた。２０分間還流した
後、反応混合物を濃縮し、クロロホルムを充填した１、
Ｘｌ０ｃｘカラム上で直接クロマトグラフィーにかけ、
２０ｔｔｒＱのクロロホルム、２０１１ｔ２の２％メタ
ノール／クロロホルム、２０ｉρの１０％メタノール／
クロロホルム、および２０ｘＱの１５％メタノール／ク
ロロホルムで溶出した。６靜フラクシヨン９〜１２を濃
縮して白色固体（６９次９）を得た。

［５−［２−（４−ペンテニル）］−５−［１，−（２
ヒドロキシエヂル）］バルビッール酸ウつ血清アルブミ
ン免疫原］ 実施例９の最終工程に記載の方法に従い、上記工程で得
たアルコール前駆体をすべてクロロカルボニルオキシ誘
導体、ついで本実施例の標記免疫原に変換した。

実施例１１ ［５−シクロペンチルー５−［１−（２−カルボニルオ
キシ）エチルコバルつツール酸ウシ血清アルブミン免疫
原コニ 本実施例の標記免疫原は、下記式（１８）で示される。

９− 式（Ｉ８） ＳＡ ［シクロペンチルマロン酸ジエチル］。

無水エタノール（８０ｘＱ）中のナトリウム（４６ｇ、
０．２モル）の溶液に、マロン酸ジエチル（３０，４ｔ
ｔｒＱ、０．２モル）を加えた。少し撹はんしてからシ
クロペンチルブロマイド（２１，４ｉρ、０．２モル）
を加え、得られた溶液を１２時間還流した。ついで、殆
どのエタノールを回転蒸発により除き、水（２５０ｆｆ
ｆ２）で反応を停止させ、各１００畦のエーテルで３回
抽出した。抽出物をＭｇ５ｏ４で乾燥し、濾過し、濃縮
した。６”ビグロー（Ｖ　ｉｇｒｅａｕｘ）で６＋ｕ＋
Ｈｇにて蒸留して無色透明な油状物（３２，２３２９）
を得た（沸点＝１２２〜１２５℃）。

［５−シクロペンチルバルビッール酸］：無水エタノー
ル（５０ｍρ）中のナトリウム（３゜１００ ４８９．１５１ミリモル）の溶液に、尿素（３０２ｇ、
５０４ミリモル）および上記工程で調製したマロン酸エ
ステル（ｌ　ｏｇ、４３．９ミリモル）を加えた。この
溶液を一夜還流し、冷却し、濃縮した。水で反応を停止
させ、濃硫酸（１０ｍ４）で酸性にし、得られた白色固
体を、上記冷却溶液を濾過することにより回収した。こ
の固体を水、ついで５％エタノール／水から再結晶して
無色の板状物（７，００１９）を得た（融点：２２２〜
２２３℃）。

［５−シクロベンチルー５−（２−テトラヒドロピラニ
ルオキシ）エチルバルビツール酸］標記化合物は、上記
工程で合成した結晶性バルビッール酸（８６０ｉｇ）を
用い、実施例ＩＯで２（４−ペンテニル）−１−（２−
テトラヒドロピラニルオキシ）エチルマロン酸ジエチル
について記載した方法と同様にして調製した。

［５−シクロペンチル−５−（２−ヒドロキン）エチル
バルビッール酸］： このバルビッール酸誘導体は、実施例１０て５［２−（
４−ペンテニル）］−５−［１−（２−ヒドロキシエチ
ル）］バルビッール酸について記載した製造法に従い、
上記で得た生成物（２４０Ｒｇ）から合成しん。

［５−シクロペンチルー５−［１（２−カルボニルオキ
シ）エチルコバルビッール酸つシ血清アルブミン免疫原
コ 実施例９の最終工程に記載した方法に従い、上記工程で
得たアルコール前駆体（４３ｆｆ９）をクロロカルボニ
ルオキシ誘導体に変換し、ついでこれをハプテンとして
用いてラン血清アルブミンに結合して本実施例の標記免
疫原を得た。

実施例１２ ５−［４−（１−カルボニルオキシ）ペンチル」−５プ
ロピルバルビツール酸ウシヂログロプリン免疫原： 実施例３に記載の方法に従って調製した５−［４−（１
−ヒドロキシペンチル）］−］５−プロピルバルビッー
ル酸２０１Ｒ９，７８マイクロモル）をテトラヒドロフ
ラン（０，５ｘＣ）中に溶解し、ベンゼン中の１２％ホ
スゲン溶液（０，５ｘＱ）を加えた。３時間撹はんした
後、溶液を濃縮して２８Ｒ９の白色の半固体とし、これ
をンメチルホルムアミド（６００μＱ）中に溶解した。

この溶液のうち３００μρを、０．０５Ｍリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ７５；ＩＯＲσ）中のウシチログロブ
リン（２０５ｘｙ）の溶液に加えて結合させた。この結
合反応混合物を周囲条件にて２時間撹はんし、各２Ｑの
０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５）に対
して３２時間かけて４回透析した。この免疫原溶液を使
用するときまで凍結した。

本実施例の標記免疫原は、下記式（１０）で示される。

式（１０） 本実施例ではＦＰＩＡ法を記載する。

１０３ Ａ、試薬： １）前処理溶液二〇、ＩＭ）リス、１％５−スルホサリ
チル酸二水和物、Ｏ，１％硫酸胴五水和物、および０．
１％アジ化ナトリウムを含む溶液（ｐＨ７，５）。

２）トレーサー＋０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｉ（６，０；２０％（ｖ／　ｖ）ジメチルスルホキンド
、０．０１％ウシガンマグロブリン、および０１％アジ
化ナトリウムを含む）中の約ＩＱＯｎＭのトレーサー化
合物。好ましいトレーサーは、実施例Ｉのトレーサーで
ある（式（１））。

３）抗体：Ｏ，１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，
５；１％ウシ血清アルブミン、２．０％（ｖ／ｖ）エチ
レングリコール、および０．１％アジ化ナトリウムを含
む）中の、本発明の免疫原（好ましくは実施例９の式（
２１）で示される免疫原）に対して産生されたヒツジ抗
血清。［抗血清は、上記免疫原に対して免疫応答を引き
起こしたヒツジから血液を採取し、この血液から細胞成
分を取り除き、ついで得られた細胞不含抗血清を上記緩
衝液で約１０４− １　：　１４０　（ｖ／ｖ）に希釈する（すなわち、７
ｘ（の血清を上記緩衝液でｌ１２に希釈する）標準法に
より得る］。

４）洗浄溶液ニジメチルスルホキシドｌ容量を水中のＯ
，Ｉ　５ＭＮａＣ１の１容量と混合することにより調製
した、０．４５％塩化ナトリウム中に５０％（ｖ／ｖ）
ジメチルスルホキンドを含む溶液。

５）カリプレークー：０．０．２．０．５．０．１０．
０．２０．０、または４００μ９／酎のセコバルビター
ルを添加し０．１％アジ化ナトリウムで保存した正常（
すなわち、バルビッール酸塩を含まない）ヒト血清のプ
ール。

６）コントロール＝３０．７５、または３０゜０μ９／
峠のセコバルビクールを添加し０．１％アジ化ナトリウ
ムで保存した正常ヒト血清のプール。

７）希釈緩衝液二〇、１％アジ化ナトリウムおよび０．
０１％ウシガンマグロブリンを含有する０１Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７，５）。

蛍光偏光の測定はすべて市販のアボット・ラボラドリー
ズＴＤｘクリニカルアナライザーを用いて行った。

Ｂ、アッセイプロトコール １）２５μｇの未知試料またはコントロールをピペット
にて前希釈ウェルに入れる。ついで、他の試料またはコ
ントロールを移動させる前にピペットを洗浄溶液で洗浄
する。充分な容量の希釈緩衝液を加えて前希釈ウェル中
の容量を５００μＱまで上げる。前希釈ウェルからの試
料（６μのおよび前処理溶液（１２，５μＱ）をキュベ
ツトにピペットにて入れる。充分な容量の希釈緩衝液を
加えて容量を］、Ｏｉ（に上げる。バックグラウンド強
度の読み取りをする。

２）１２．５μＱの前処理溶液、各２５μＱのトレーサ
ー溶液および抗体溶液、および前希釈ウェルからの試料
（６μρ）をキュベツトに加える。充分な容量の希釈緩
衝液を加えて最終容量を２０ＩｌＩσまで上げる。

３）トレーサーの抗体への結合による蛍光偏光（正味の
偏光）は、混合物の最終偏光蛍光強度からバックグラウ
ンドの偏光蛍光強度を差し引くことにより得られる。

４）得られた偏光値は、各試料中のバルビッール酸塩濃
度に反比例する。

５）試料の正味の偏光値を、既知のセコバルビタール含
量を有するカリブレーク−を用いて作成した標準曲線と
比較する。

上記プロトコールは、ＴＤＸシステム、式（２１）の免
疫原に対して産生されたヒツジ抗血清、および式（１）
のトレーサーを用いて血清のバルビッール酸塩アッセイ
用に最適化される。ＴＤｘとは異なるアッセイシステム
、異なる抗血清、または異なるトレーサーを用いるか、
または異常に低濃度または高濃度のバルビッール酸塩を
有することが予想される試料をアッセイしようとすると
きは、上記のプロトコールに種々の変更を加えることが
できるであろう。そのような変更の一つの例としては、
前希釈ウェルからキュベツトへ移す希釈試料の容量を変
えることが挙げられる。そのような変更は、ＦＰＩＡの
技術分野の当業者には容易に１０７ なしうる。

実施例１４ 本実施例では、実施例１３に記載したプロトコールに従
ってアボット・ラボラトリーズＴＤＫアナライザーを用
いた場合の、抗血清（間接的には免疫原）および本発明
によるトレーサーの性能を説明する。

性能は、一定のプロトコールとして該システム中の一定
希釈の抗血清および該システム中の一定濃度のトレーサ
ーを用い、最大正味偏光（ミリ偏光単位（ｒｍＰＪと略
す）で表ず；１０１００Ｏは入射偏光の方向で完全な偏
光を表し、ＯｍＰは完全な脱分極を表す）、スパン（ｍ
Ｐで表ず）、および正味の蛍光強度により定量化するこ
とができる。最大正味偏光は、最大量の）・レーサーが
抗体に結合した場合（すなわち、バルビッール酸塩を含
有しない血清試料を用いた場合）の最大偏光を示す。２
５０ｍＰを越える最大正味偏光値は例外的に良好である
が、２３０ｍＰよりも大きな最大正味偏光も市販の適用
には許容し得る。スパンは、最大量０８ のトレーサーが抗体に結合（すなわち、バルビッール酸
塩が存在しない）した場合の正味の偏光と最少量のトレ
ーサーが抗体に結合（すなわち、本実施例においては、
血清試料中のセコバルビクールが４０μｇ／ＦＩ（２）
　した場合の正味の偏光との差異を示す。スパンが大き
い程、−層正確で定量的なデータ分析が可能となる。市
販の適用には、少なくとも１７０ｍＰのスパンが好まし
い。正味の偏光強度は、バックグラウンド蛍光を越えた
蛍光シグナルの大きさの測定値である。正味の強度が大
きい程、−層正確な測定値が得られるであろう。

正味の蛍光強度は、垂直偏光蛍光の強度（バックグラウ
ンドを越える）と水平偏光蛍光の強度（バックグラウン
ドを越える）を２倍したものとの合計である（平面偏光
入射光の偏光は「垂直ヨと定義される）。市販のものと
して許容し得る抗バルビッール酸塩抗血清／トレーサー
の組合わせのためには、上記アッセイシステムにおける
蛍光強度は、上記トレーサー濃度および抗血清希釈を用
いた場合、バックグラウンド強度の少なくとも３倍から
４倍なければならない。バックグラウンドの少なくとも
８倍から９倍あるのが好ましい。抗血清（ヒツジから）
およびトレーサーの性能に関するデータを下記第１４表
に示す。

ｌｌ 実施例１５（交差反応性） 本発明のアッセイは、バルビッール酸塩のアッセイとし
て特に望ましい。というのは、本発明のアッセイはこの
クラスに属する薬剤を比較的向等に検出することができ
るからであり、また（也の物質、たとえばｌ）他の麻酔
薬、２）興奮薬、および３）一般に併用投与される薬剤
などを検出することがないからである。このような他の
物質が検出されると、バルビッール酸塩と交差反応を起
こし、それゆえ偽陽性すなわち過剰に陽性の結果により
バルビッール酸塩のイムノアッセイを妨害するという問
題があった。

バルビッール酸塩およびその代謝産物について交差反応
性を試験した。既知量の被験化合物を薬物を含まない正
常ヒト血清に加え、式（２Ｉ）の免疫原に対するヒツジ
抗血清および式（１）のトレーサーを用いたアボット・
ラボラトリーズＴＤＫクリニカルアナライザー（実施例
１３参照）上での本発明のバルビッール酸塩アッセイで
アッセイすることにより被験化合物をアッセイした。交
差反応＝１１２− 性の評価は下記式に従って行った。

交差反応性（％）−１００ｘ（アッセイで検出された被
験化合物の濃度）／（添加被験化合物の既知濃度） 代表的なデータを下記第１５−１表に示す。

第１５ 被験化合物　　添加濃度 （μ９７肩Ｑ） ア田１゛ルヒ゛タール　　　　３０　、０５ 　　０ アルフェナール　　　　　　　３０　、　０７　、　５ 　　０ アモハ゛ルビタール　　　　３０　、０５ 　　０ アフ″田）ルじタール　　３０　　０ 　　５ 　　０ フ゛ラロハ′ルヒ゛タール　　３０　、　０　　５ 　　０ フ゛タハ゛ルビタール　　　３０　　０　　５ ０ １表 検出濃度 （μ９／＋０ ４２ ６０ １．４５ ０９２ ８４ ７３ ４８ ３９ ４６ ８．２１ ３７ ８３ ６．９０ ２．８５ ＋、、５６ ７．０２ ２　）３６ ６０ 交差反応性 （％） １４ ４７ ８３ ６４ ４５ ９１．０ ■８．３ １９ ８７ ７４ ４９ １０ ３０ ８０ ２０ ３０ ８１ ３３ 第１５−１表 被験化合物　　添加濃度 （μ９／ＩＩＱ） フ゛タルじタール　　　　　３０　、０　　５ 　　０ ７゛トハ゛ルＥ゛タール　　　３０　、０（７゛テター
ル）７，５ ３．０ シクロハ゛ルヒ゛タール　　　３０　　０　　５ 　　０ シクロベントハ゛ル　　　　３０　　０ヒ″タール　　
　　　　　　　　　７　、　５　　０ へ°ントへ゛ルヒ゛タール　　３０　　０７　、　５ 　　０ フェノハ゛ルし゛タール　　　３０　、０７．５ ３　、０ セコハ゛ルヒ゛タール　　　　３０　、０（カリフ゛レ
ータ−）　　　　　　７　、　５３　、　０ タルフ゛タル　　　　　　　　　３０　、　０７　、　
５ 　　０ （つづき） 検出濃度 （μ９／１ｘ１２） 　３３ ７９ ０６ ９３ ９１ １．０８ ４．９７ ２．４４ １．６５ ２８３ ４．８０ ２．２１ ０６ ２８ ８６ ０４ ０１ ３２ ００ ５ ３．０ １６０ ６３ ２．８４ 交差反応性 （％） ３１．１ ０５ ８７ ＋３，１ ５５ ６０ １６．６ ３２．５ ５５．０ ２８ ６４．０ ７３．７ ３０．２ ４３．７ ６２．０ ＋３　５ ２６．８ ４４．０ １００．０ ０００ １００．０ ７２．０ ８８．４ ９４．７ 第１５−１表　（つづき） 被験化合物　　添加濃度　　検出濃度 （μ９／＋ρ）　　（μ９／ｘの チアミラル　　　　　　　　　３０．．０　　　　　　
　４．１５７、　　５　　　　　　　１．　　１＋３０
　　　　　　　０．６１ ヒ゛ニルへ゛ルビタール　　３０．０　　　　　　　５
．２４７．５　　　　　　　２．３２ ３．０　　　　　　　　＋、２６ 交差反応性 （％） １３．８ ４　８ ０３ ７５ ０９ ２０ バルビッール酸塩と類似の構造を有する化合物について
も、本実施例の上記方法により交差反応性を試験した。

その代表的なデータを上記第１５−２表および第１５−
３表に示す。第１５−２表および第１５−３表に示した
データを調べればわかるように、本発明のアッセイノス
テムは、多くのバルビッール酸塩様化合物およびバルビ
ッール酸塩用イムノアッセイにおける他の可能な妨害物
質に対して最小の交差反応性を示す。

（以下余白） １５ 第１５−２表 被験化合物　　添加濃度　検出濃度　交差反応性（μ９
／演夕）（μ９ＩＲＱ）（％） ｐ−ヒトａキノフェニトイン　　　　　２，００　　　
０．９７　　　　　０．５７エニトイン　　　　　　　
　　　　　２００　　　　＋、０５　　　　　０．５１
００　　　１．０３　　　　　１．０５０　　　０．７
３　　　　　１．５ 第１５−３表に示した化合物は、表示の濃度まで試験し
たときにアッセイの感度（０，７μｇ／ＩＩＯ未満の結
果を示した。

第１５−３表 被験化合物 アセトアミノフェン アロキサン アミトリブチリン アモキサピン アンフェタミン カフェイン クロルプロマジン コカイン デシブラミン デキストロメトルファン ジアゼパム ジイフィリン エチクロルビノール エトサクシミド エトトイン 検出濃度（μ９／酎） ０００ ０００ ０ ０ ００ ０００ ０ ０ ０ ０００ ００ ０００ ００ ０００ ０００ １６− 第１５−３表　（つづく） 被験化合物　　　　　　　検出濃度（μ９／ＩＣ）フエ
ンタニル　　　　　　　　　　　１グルテチミツド　　
　　　　　　２００イブプロフエン　　　　　　　１０
００メフエントイン　　　　　　　　２００メタクアラ
ン　　　　　　　　　５００メチルプリロン　　　　　
　　１０００モルヒネ　　　　　　　　　　　　１０フ
エンシクリジン　　　　　　　　５０フエニルブタシン
　　　　　　１０００ブリミドン　　　　　　　　　　
　２００プロメタシン　　　　　　　　　　１０サリチ
ル酸塩　　　　　　　ｔ　ｏ、ｏ　ｏ　。

■１−ツルーデルター　　　　　　１０８−テトラヒド
ロカンナ ビノール−９−カルボン酸 テオフィリン 実施例１６（持ち越し） 試料をシステム中に移動させるためのＴＤｘシステムに
使用したピペットを濯ぐための実施例１３に記載の洗浄
溶液を用い、セコバルビタール（２００μ９／Ｊ！のを
添加した正常（すなわち、バルビッール酸塩を含まない
）ヒト血清をアッセイし、ついでピペットを洗浄した後
にバルビッール酸塩　０００ を含まない正常血清をアッセイすることにより持ち越し
を決定した。このアッセイは、式（２１）の免疫原に対
するヒツジ抗血清および式（１）のトレーサーを用い、
実施例１３に記載の方法に従って行った。持ち越しは下
記式に従って評価した。

持ち越しく％）−（バルビッール酸塩を含まない血清中
で検出されたセコバルビクールの濃度）／（セコバルビ
クールを含有する血清中で検出されたセコバルビクール
の濃度） 持ち越しく％）は驚くほど小さく、０．１３％未満かま
たはＯ，１，３％に等しいことがわかった。

以上、本発明を特定の例示のもとに本明細書で記載した
が、当業者であれば本発明の範囲？こ含まれると記載し
た事項について多くの変更または変化を認識するであろ
う。そのような変更および変化も本発明により包含され
ることを意図するものである。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）式（ I ）： ▲数式、化学式、表等があります▼ I （式中、Ｘ＿１は酸素原子または硫黄原子；Ｑ＿１は（
   ａ）アミノ基によるＱ＿１の親核置換のための活性化基
   、（ｂ）Ｎ−末端または側鎖アミノ基でカルボニル基に
   結合した免疫原性ポリペプチド、または（ｃ）フルオレ
   セインアミン I 、フルオレセインアミン I I 、およ
   び式Ｘ：−ＣＨ＿２−（ＮＨ）Ｒ＿１＿０（式中、Ｒ＿
   １＿０は水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、または
   グリシル基である）で示される基で４′位が置換された
   フルオレセインよりなる群から選ばれた残基であり、該
   残基は、式（ I ）の化合物においてＱ＿１が結合して
   いるカルボニル基に該残基のアミノ基を介して結合して
   いる；Ｒ＿１は炭素数１〜８のアルキレン基、炭素数３
   〜８のシクロアルキレン基、炭素数２〜８のアルケニレ
   ン基または炭素数５〜８のシクロアルケニレン基；Ｒ＿
   ２は炭素数１〜８のアルキル基、炭素数３〜８のシクロ
   アルキル基、炭素数２〜８のアルケニル基、炭素数５〜
   ８のシクロアルケニル基またはフェニル基である；ただ
   し、（ｉ）Ｒ＿１は、カーボネート基の酸素原子に結合
   している炭素原子以外の０または１個の炭素原子におい
   てクロロ基またはブロモ基で置換されており、（ｉｉ）
   Ｒ＿２は０または１個の炭素原子においてクロロ基また
   はブロモ基で置換されており、（ｉｉｉ）Ｒ＿２がフェ
   ニル基であるときはＲ＿１はエチレン基ではない）で示
   される化合物。
2. （２）Ｘ＿１が酸素原子であり、Ｒ＿１が−ＣＨ（ＣＨ
   ＿３）ＣＨ＿２（ＣＨ＿３）ＣＨ−、−（ＣＨ＿２）＿
   ２−、−（ＣＨ＿２）＿３（ＣＨ＿３）ＣＨ−、−（Ｃ
   Ｈ＿２）（（ＣＨ＿３）Ｃ＝ＣＨ）（ＣＨ＿２）−、 ▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、
   表等があります▼、 ▲数式、化学式、表等があります▼、および▲数式、化
   学式、表等があります▼； よりなる群から選ばれた基であり、ただし、Ｒ＿１が−
   ＣＨ（ＣＨ＿３）ＣＨ＿２（ＣＨ＿３）ＣＨ−であると
   きはＲ＿２は−ＣＨ＿２（ＣＨ＝ＣＨ＿２）であり、Ｒ
   ＿１が−（ＣＨ＿２）＿２−であるときはＲ＿２はシク
   ロペンチル基であり、Ｒ＿１が−（ＣＨ＿２）＿３（Ｃ
   Ｈ＿３）ＣＨ−であるときはＲ＿２はｎ−プロピル基お
   よびアリル基よりなる群から選ばれた基であり、Ｒ＿１
   がシクロペンチレン基であるときはＲ＿２はｎ−プロピ
   ル基であり、Ｒ＿１がシクロヘキシレン基であるときは
   Ｒ＿２はアリル基であり、Ｒ＿１が−ＣＨ＿２（（ＣＨ
   ＿３）Ｃ＝ＣＨ）ＣＨ＿２−であるときはＲ＿２はアリ
   ル基および２−ブロモアリル基よりなる群から選ばれた
   基であり、Ｒ＿１がシクロペンテニレン基であるときは
   Ｒ＿２は２−メチルアリル基であり、Ｒ＿１が ▲数式、化学式、表等があります▼ であるときはＲ＿２は２−メチルアリル基である、請求
   項（１）に記載の化合物。
3. （３）Ｒ＿１が−ＣＨ（ＣＨ＿３）ＣＨ＿２（ＣＨ＿３
   ）ＣＨ−およびシクロペンテニレン基よりなる群から選
   ばれた基であり、Ｑ＿１がフルオレセインアミン I 、
   フルオレセインアミンII、および４′位において式Ｘの
   基で置換されたフルオレセインよりなる群から選ばれた
   ものである、請求項（２）に記載の化合物。
4. （４）Ｑ＿１が免疫原性ポリペプチドである請求項（２
   ）に記載の化合物。
5. （５）ポリペプチドがウシ血清アルブミンである請求項
   （４）に記載の化合物。
6. （６）抗バルビツール酸塩抗血清の製造法であって、（
   ａ）式（II）： ▲数式、化学式、表等があります▼II （式中、Ｘ＿１は酸素原子または硫黄原子；Ｑ＿２は、
   Ｎ−末端または側鎖アミノ基でカルボニル基に結合し、
   哺乳動物中で免疫原性であるポリペプチド；Ｒ＿１は炭
   素数１〜８のアルキレン基、または炭素数５〜８のシク
   ロアルケニレン基；Ｒ＿２は炭素数１〜８のアルキル基
   、炭素数３〜８のシクロアルキル基、炭素数２〜８のア
   ルケニル基、炭素数５〜８のシクロアルケニル基または
   フェニル基である；ただし、（ｉ）Ｒ＿１は、カーボネ
   ート基の酸素原子に結合している炭素原子以外の０また
   は１個の炭素原子においてクロロ基またはブロモ基で置
   換されており、（ｉｉ）Ｒ＿２は０または１個の炭素原
   子においてクロロ基またはブロモ基で置換されており、
   （ｉｉｉ）Ｒ＿２がフェニル基であるときはＲ＿１はエ
   チレン基ではない）で示される化合物で哺乳動物を免疫
   し、ついで（ｂ）該免疫した哺乳動物から血清を採取す
   る、ことを特徴とする方法。
7. （７）哺乳動物を免疫するのに用いる化合物において、
   Ｘ＿１が酸素原子であり、Ｒ＿１が−ＣＨ（ＣＨ＿３）
   ＣＨ＿２（ＣＨ＿３）ＣＨ−、−（ＣＨ＿２）＿２−、
   −（ＣＨ＿２）＿３（ＣＨ＿３）ＣＨ−、−（ＣＨ＿２
   ）（（ＣＨ＿３）Ｃ＝ＣＨ）（ＣＨ＿２）−、 ▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、
   表等があります▼、 ▲数式、化学式、表等があります▼、および▲数式、化
   学式、表等があります▼； よりなる群から選ばれた基であり、ただし、Ｒ＿１が−
   ＣＨ（ＣＨ＿３）ＣＨ＿２（ＣＨ＿３）ＣＨ−であると
   きはＲ＿２は−ＣＨ＿２（ＣＨ＝ＣＨ＿２）であり、Ｒ
   ＿１が−（ＣＨ＿２）＿２−であるときはＲ＿２はシク
   ロペンチル基であり、Ｒ＿１が−（ＣＨ＿２）＿３（Ｃ
   Ｈ＿３）ＣＨ−であるときはＲ＿２はｎ−プロピル基お
   よびアリル基よりなる群から選ばれた基であり、Ｒ＿１
   がシクロペンチレン基であるときはＲ＿２はｎ−プロピ
   ル基であり、Ｒ＿１がシクロヘキシレン基であるときは
   Ｒ＿２はアリル基であり、Ｒ＿１が−ＣＨ＿２（（ＣＨ
   ＿３）Ｃ＝ＣＨ）ＣＨ＿２−であるときはＲ＿２はアリ
   ル基および２−ブロモアリル基よりなる群から選ばれた
   基であり、Ｒ＿１がシクロペンテニレン基であるときは
   Ｒ＿２は２−メチルアリル基であり、Ｒ＿１が ▲数式、化学式、表等があります▼ 請求項（６）に記載の方法。
8. （８）哺乳動物を免疫するのに用いる化合物において、
   免疫原性ポリペプチドが、キーホールリンペットヘモシ
   アニン、トリ卵アルブミン、ポリリシン、および免疫し
   た哺乳動物とは異なる哺乳動物種からの、血清アルブミ
   ン、免疫グロブリンおよびチログロブリンよりなる群か
   ら選ばれたものである、請求項（７）に記載の方法。
9. （９）バルビツール酸塩の存在について生物学的試料を
   蛍光偏光イムノアッセイにより分析するための試験キッ
   トであって、（Ａ）（ａ）式（II）：▲数式、化学式、
   表等があります▼II （式中、Ｘ＿１は酸素原子または硫黄原子；Ｑ＿２は、
   Ｎ−末端または側鎖アミノ基でカルボニル基に結合し、
   哺乳動物中で免疫原性であるポリペプチド；Ｒ＿１は炭
   素数１〜８のアルキレン基、炭素数３〜８のシクロアル
   キレン基、炭素数２〜８のアルケニレン基、または炭素
   数５〜８のシクロアルケニレン基；Ｒ＿２は炭素数１〜
   ８のアルキル基、炭素数３〜８のシクロアルキル基、炭
   素数２〜８のアルケニル基、炭素数５〜８のシクロアル
   ケニル基またはフェニル基である；ただし、（ｉ）Ｒ＿
   １は、カーボネート基の酸素原子に結合している炭素原
   子以外の０または１個の炭素原子においてクロロ基また
   はブロモ基で置換されており、（ｉｉ）Ｒ＿２は０また
   は１個の炭素原子においてクロロ基またはブロモ基で置
   換されており、（ｉｉｉ）Ｒ＿２がフェニル基であると
   きはＲ＿１はエチレン基ではない）で示される化合物で
   哺乳動物を免疫し、ついで（ｂ）該免疫した哺乳動物か
   ら血清を採取することにより得た抗バルビツール酸塩抗
   血清、および（Ｂ）式（ＸＸ I ）：▲数式、化学式、
   表等があります▼ＸＸ I （式中、Ｘ＿２＿１は酸素原子または硫黄原子；Ｑ＿２
   ＿１は、フルオレセインアミン I 、フルオレセインア
   ミンII、および式Ｘ：−ＣＨ＿２−（ＮＨ）Ｒ＿１＿０
   （式中、Ｒ＿１＿０は水素原子、炭素数１〜６のアルキ
   ル基、またはグリシル基である）で示される基で４′位
   が置換されたフルオレセインよりなる群から選ばれた残
   基であり、該残基は、式（ＸＸ I ）の化合物において
   Ｑ＿２＿１が結合しているカルボニル基に該残基のアミ
   ノ基を介して結合している；Ｒ＿２＿１は炭素数１〜８
   のアルキレン基、炭素数３〜８のシクロアルキレン基、
   炭素数２〜８のアルケニレン基または炭素数５〜８のシ
   クロアルケニレン基；Ｒ＿２＿２は炭素数１〜８のアル
   キル基、炭素数３〜８のシクロアルキル基、炭素数２〜
   ８のアルケニル基、炭素数５〜８のシクロアルケニル基
   またはフェニル基である；ただし、（ｉ）Ｒ＿２＿１は
   、カーボネート基の酸素原子に結合している炭素原子以
   外の０または１個の炭素原子においてクロロ基またはブ
   ロモ基で置換されており、（ｉｉ）Ｒ＿２＿２は０また
   は１個の炭素原子においてクロロ基またはブロモ基で置
   換されており、（ｉｉｉ）Ｒ＿２＿２がフェニル基であ
   るときはＲ＿２＿１はエチレン基ではない）で示される
   化合物からなることを特徴とするキット。
10. （１０）抗血清が、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、マウスまた
    はラットを式（II）においてＸ＿１が酸素原子であり、
    Ｑ＿２がウシ血清アルブミンおよびウシチログロブリン
    よりなる群から選ばれたものであり、Ｒ＿１が−ＣＨ（
    ＣＨ＿３）ＣＨ＿２（ＣＨ＿３）ＣＨ−、−（ＣＨ＿２
    ）＿２−、−（ＣＨ＿２）＿３（ＣＨ＿３）ＣＨ−、−
    （ＣＨ＿２）（（ＣＨ＿３）Ｃ＝ＣＨ）（ＣＨ＿２）−
    、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式
    、表等があります▼、 ▲数式、化学式、表等があります▼および、▲数式、化
    学式、表等があります▼； よりなる群から選ばれた基であり、ただし、Ｒ＿１が−
    ＣＨ（ＣＨ＿３）ＣＨ＿２（ＣＨ＿３）ＣＨ−であると
    きはＲ＿２は−ＣＨ＿２（ＣＨ＝ＣＨ＿２）であり、Ｒ
    ＿１が−（ＣＨ＿２）＿２−であるときはＲ＿２はシク
    ロペンチル基であり、Ｒ＿１が−（ＣＨ＿２）＿３（Ｃ
    Ｈ＿３）ＣＨ−であるときはＲ＿２はｎ−プロピル基お
    よびアリル基よりなる群から選ばれた基であり、Ｒ＿１
    がシクロペンチレン基であるときはＲ＿２はｎ−プロピ
    ル基であり、Ｒ＿１がシクロヘキシレン基であるときは
    Ｒ＿２はアリル基であり、Ｒ＿１が−ＣＨ＿２（（ＣＨ
    ＿３）Ｃ＝ＣＨ）ＣＨ＿２−であるときはＲ＿２はアリ
    ル基および２−ブロモアリル基よりなる群から選ばれた
    基であり、Ｒ＿１がシクロペンテニレン基であるときは
    Ｒ＿２は２−メチルアリル基であり、Ｒ＿１が ▲数式、化学式、表等があります▼、 であるときはＲ＿２は２−メチルアリル基である化合物
    で免疫することによって得られたものであり、式（ＸＸ
    I ）で示される化合物において、Ｘ＿２＿１が酸素原
    子であり、Ｑ＿２＿１が４′−アミノメチルフルオレセ
    インであり、Ｒ＿２＿１が−ＣＨ（ＣＨ＿３）ＣＨ＿２
    （ＣＨ＿３）ＣＨ−、−（ＣＨ＿２）＿２−、−（ＣＨ
    ＿２）＿３（ＣＨ＿３）ＣＨ−、−（ＣＨ＿２）（（Ｃ
    Ｈ＿３）Ｃ＝ＣＨ）（ＣＨ＿２）−、▲数式、化学式、
    表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼
    、 ▲数式、化学式、表等があります▼および、▲数式、化
    学式、表等があります▼； よりなる群から選ばれた基であり、ただし、Ｒ＿２＿１
    が−ＣＨ（ＣＨ＿３）ＣＨ＿２（ＣＨ＿３）ＣＨ−であ
    るときはＲ＿２＿２は−ＣＨ＿２（ＣＨ＝ＣＨ＿２）で
    あり、Ｒ＿２＿１が−（ＣＨ＿２）＿２−であるときは
    Ｒ＿２＿２はシクロペンチル基であり、Ｒ＿２＿１が−
    （ＣＨ＿２）＿３（ＣＨ＿３）ＣＨ−であるときはＲ＿
    ２＿２はｎ−プロピル基およびアリル基よりなる群から
    選ばれた基であり、Ｒ＿２＿１がシクロペンチレン基で
    あるときはＲ＿２＿２はｎ−プロピル基であり、Ｒ＿２
    ＿１がシクロヘキシレン基であるときはＲ＿２＿２はア
    リル基であり、Ｒ＿２＿１が−ＣＨ＿２（（ＣＨ＿３）
    Ｃ＝ＣＨ）ＣＨ＿２−であるときはＲ＿２＿２はアリル
    基および２−ブロモアリル基よりなる群から選ばれた基
    であり、Ｒ＿２＿１がシクロペンテニレン基であるとき
    はＲ＿２＿２は２−メチルアリル基であり、Ｒ＿２＿１
    が▲数式、化学式、表等があります▼、 であるときはＲ＿２＿２は２−メチルアリル基である、
    請求項（９）に記載のキット。