JPH03190895A - 修飾ヌクレオチド化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の概要コ 相補的ＲＮＡとハイブリクイズし得るヌクレアーゼ耐性
ヌクレオチド化合物を開示する。

その様式はこれがその機能を阻害するものであり、この
修飾ヌクレオチド化合物は、１ ２ ＭＮ３Ｍ、Ｂ　（Ｎ）　ＸＭ、並びに Ｍ（Ｎ）　　Ｂよりなる群から選択される少なくとも１
つの成分を含む（式中、Ｎは、ホスホジエステル結合修
飾または未修飾２−−デオキシヌクレオシド部分であり
、Ｍは、前記成分にエンドヌクレアーゼ耐性を与え、少
なくとも１つの修飾または未修飾核酸塩基を含有する部
分であり、Ｂは、付着する末端にエキソヌクレアーゼ耐
性を与える部分であり、Ｘは、少なくとも２の整数であ
る）。

［産業上の利用分野］ 本発明は、オリゴおよびポリヌクレオチドの分野に関し
、更に詳しくは、治療およびイメージング方法に適切な
修飾オリゴおよびポリヌクレオチドに関し、この種のオ
リゴおよびポリヌクレオチドの細胞または細胞表面への
配送を必要とするものを含む。

［従来の技術と課題］ ヒト、動物、植物、微生物並びにウィルス染色体により
コードされるメツセンジャーＲＮＡに相補的なオリゴヌ
クレオチドおよびオリゴヌクレオチドアナログは、例え
は翻訳のハイブリッドアレストにより、遺伝子発現を阻
害または制御するのに有効であることが示されている。

これは幾つかの研究者グループの試みを刺激し、種々の
種類の治療的「アンチセンス」オリゴおよびポリヌクレ
オチドが開発された。最近の総説として、ファン・デル
・クロールら、「相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ配列による
真核遺伝子発現の調整」、Ｂ＋ｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
、　６：　９５８−９７６　（１９８８）を参照するこ
とができる。

ホスホジエステルオリゴデオキシヌクレオチドか翻訳の
ハイブリッドアレス１〜を促進することが認められた１
つの機構は、ＲＮＡ、：オリゴデオキシヌクレオチドデ
ュープレックスのＲＮＮアーゼ間裂を介するものである
。

ミンシュルとフン１へ、［網赤血球溶解物無細胞翻訳に
おけるｍ　ＲＮ　Ａ　／　Ｄ　Ｎ　Ａハイブリッドの定
量的ハイブリッドアレストを促進する３ ４ なめの−本ｇＤＮＡおよびＲＮＮアーゼの使用」、Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１４：　
６４３３−６４５１　ｆ１９８６）　、カゼナベら、「
内位添加剤に共有結合したアンチメツセンジャーオリゴ
デオキシヌクレオチドにより媒介されたウサギβ−グロ
ビンｍＲＮＡの翻訳阻害の酵素的増幅Ｊ　、　Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１５：　４７
１７−４７３６　（１９８７）　、並びにタラシュら、
［生体内におけるｍＲＮＡの選択的除去：相補的オリゴ
ヌクレオチドは、ＲＮアーゼ１１様活性によりＲＮＡＪ
Ａ−解を促進するＪ　、　Ｐｒｏｃ、　ＮａｔＡｃａｄ
、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４：　７８９６−７９００　
（１９８７）を参照することができる。

この観点では、ＲＮＮアーゼに対する感受性は、有効な
治療的アンチセンスオリゴヌクレオチドを開発するに際
して考慮すべき特性の１つである。ホスホジエステル結
合を有する未修飾オリゴヌクレオチドはＲＮＡと複合し
てＲＮＮアーゼ基質を形成することかできるが、ヌクレ
アーゼ耐性ではない。翻訳阻害の高度の効率を達成する
１つの方法は、オリゴヌクレオチドを化学的に改変し、
細胞内へのその侵入を促進すると共にその半減期の増加
を図るものであるが、同時に挿入物の特異的なＲＮＡに
対する親和性を維持するものとする。よって、この企て
の他の観点には、修飾を有するアンチセンスオリゴヌク
レオチドまたはポリヌクレオチドの開発か含まれ、結果
として、その有効性を低減させるかこれらを不活性とす
るヌクレフアーゼに対するこれらの薬剤の感受性の低減
が企図される。

イノウニら、［修飾されたオリゴヌクレオチドスプリン
トおよびＲＮＮアーゼを使用するＲＮＡの配列依存性加
水分解Ｊ　、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　５ｙｎｐｏｓ
ｉｕｌＩＳｅｒｉｅｓ、　１８：　２２１−２２４（１
９８７）には、修飾オリゴヌクレオチドおよびＲＮＮア
ーゼを使用し、部位特異的様式で試験管内でＲＮＡを開
裂する方法が記載されている。

一部または完全に置換されたホスホロチ第５ ６ エートについても、アンチセンス機能か試験されている
。マルクスーセクラら、［アルキルホスホトリエステル
メチルホスホネートおよびホスホロチオエート結合を有
するアンチセンスオリゴヌクレオチドアナログによるタ
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子
発現の比較阻害Ｊ　、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ、　１５：　５７４９−５７６３　（１９
８７）、並びにアグラワルら「ヒト免疫疾患ウィルスの
阻害剤としてのオリゴデオキシヌクレオチドホスホルア
ミデー１〜およびホスホロチオエート　Ｊ　　、　Ｐｒ
ｏｃ、　　Ｎａｔ、　　八ｃａｄ、　　ｓｃ＋、　ＵＳ
Ａ、　　８５７０７９−７０８３　（１９８８）を参照
することができる。

これらは、種々のヌクレアーゼに対して種々の程度の耐
性を示す。スティンら、「ホスホロチオエートオリゴヌ
クレオチドの生理化学的特性Ｊ　、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１６３２０９−３２２
１　（１９８８）に報告されたように、十分に置換され
たホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドは、
Ｒ，ＮアーゼＨ感受性ハイブリッドを形成する。

これに対し、十分に置換されたヌクレアーゼ耐性糖リン
酸骨格を含有する多くのオリゴヌクレオチド、５は、標
的ＤＮＡとＲＮＮアーゼ感受性ハイブリッドを形成する
ことはできない。例えば、サンら、［オリゴ−α−チミ
ジレートフエナンスロリン共役物による核酸の配列標的
開裂：平行および逆平行二本鎖へリックスは、それぞれ
ＤＮＡおよびＲＮＡにより形成されるＪ　、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ、　２７：　６０３９−６０４５　（１
９８８）を参照することができる。α−ホスホジエステ
ルは相補的ＲＮＡと逆平行へリックスを形成するが、Ｄ
ＮＡとは形成しない。しかしながら、α−結合はヌクレ
アーゼ耐性であるにも拘らず、αＤＮＡ−ＲＮＡハイブ
リッドはＲＮアーゼ）］の基質ではない。

アミノホスホネートまたは１−ジエステルは、水素−ホ
スホネート合成の酸化工程を改変することにより形成す
ることができる。これらの無荷電結合は、ＲＮＮアーゼ
感受性パイプ７ リッドを形成する能力を妨害すべきものである。

メチルホスホネート結合を含有するオリゴデオキシヌク
レオチドアナログは、試験管内でアンチセンス効果を有
することが示された。

ミラーら、［オリゴヌクレオシドメチルホスボネートに
よるリボ核酸機能の調節Ｊ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、　６
７：　７６９−７７６　（１９８５）並びにマーバーと
ドルニック、「無細胞系におけるタンデムアンチセンス
オリゴデオキシリボヌクレオチドまたはオリゴチオキシ
リボヌクレオシドメチルホスホネートによる比較ハイブ
リッド安定性ｌ−Ｊ　、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ、　１６：３３４１−３３５８　（１９
８８）を参照することができる。

生体内でアンチセンス効果が示されている。

ザリンら、「オリゴデオシヌクレオチドメチルホスホネ
−１〜による後天性免疫疾患症候群ウィルスの阻害Ｊ　
、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、八ｃａｄ、　５ｃ１１ｓＡ、　
８５：　７４４８−７４５１　（１９８８）　、スミス
ら、「ヘルペスシンプレックスウィルスタイプ１直後初
期プレｍＲＮＡ４および５のスプライス連結部に相補的
なオリゴデオキシヌクレオチドメチルホスボネートの抗
ウイルス効果」、Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔ、　　八ｃａｄ
、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ　　　８３：　　２７８９−
２７９１（１９８６）　、並びにアクリスら、「配列特
異的オリゴチオ六シヌクレオシドメチルポスポネー１−
による小胞口内炎ウィルス蛋白質合成および感染の阻害
Ｊ　、Ｂｉｏｃｈｅｌｌｉｓｔｒｙ、　２５：　１８７
４−１８８０　（１９８１）を参照することができる。

メチルホスホンアミタイトヌクレオシドは、ホスホルア
ミツ４１〜合成に際して組み込まれることができ、マル
クスーセクラ、前記文献に報告されたように部分的に置
換された構造を与える６多数のメチルホスホネート結合
の還元により、より大きいハイブリッド安定性が与えら
れるが、これはクアルチンとウニ）ヘムル、「メチルホ
スホネート結合による低減した荷電を有するオリゴデオ
キシヌクレオチドと相補的配列を含有する未修飾オリゴ
チオキシヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対
１つ ０ するイオン強度の効果Ｊ　、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
。

２８、：１０４０−１０４７　ｆ１９８９）に報告され
ている。

無細胞翻訳系では、ＲＮアーゼＨの作用は、十分にメチ
ルホスポネー）−Ｗ換されたオリゴデオキシヌクレオチ
ドに見られるアンチセンス効果に関与せず、この種の化
合物は相補的ＲＮＡとＲＮアーゼＨ感受性ハイブリッド
を形成しないことが決定された。マーバーとドルニック
、前記文献を参照することができる。

修飾端部を有するオリゴデオキシヌクレオチドは、エキ
ソヌクレアーゼに対する相対的な耐性を有することが示
された。例えば、アグラワルとグツドチャイルド、「オ
リゴデオキシヌクレオチドメチルホスホネート二合成お
よび酵素的分解Ｊ　、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　１ｅｔ
ｔｅｒｓ。

２８：　３５３９−３５４２　（１９８７）を参照する
ことができる。

前記したような進歩がなされ報告されているにも拘らず
、これらの努力は、本発明の結果として今回可能となっ
たような、安定で治療的に有効なオリゴおよびポリヌク
レオチドの合理的な設計を可能とすることに十分には成
功していない。特に、アンチセンス機能を至適化する因
子としてのＲＮアーゼＨ感受性基質を形成する混合オリ
ゴデオキシヌクレオチドの能力を試験した者はいない。

更に、従来、ヌクレアーゼ耐性を有するＲＮアーゼＨ感
受性基質を形成する能力を相関さぜな者はいない。

［課題を解決するだめの手段］ 本発明は、投与する生物または外来生物またはそのウィ
ルスのＲＮＡの機能に対して有効に阻害し少なくともそ
の一部と相補的なオリゴおよびポリヌクレオチドアナロ
グ構成物を提供するものである。この発明は、オリゴデ
オキシヌクレオチドにおけるメチルホスホネートまたは
他の置換体の位置とこれらのエキソおよびエンドヌクレ
アーゼに対する感受性並びにこれらのＲＮアーゼＨ基質
を形成する能力との間の相関を検討することにより可１ ２ 能となったものである。

１つの観点では、この発明によれば、２以上のホスホジ
エステル結合ヌクレオシドの配列であってこの内部でヌ
クレアーゼ耐性であるものを有する化合物が提供される
。他の観点では、この発明によれば、ＭＮ３Ｍ、Ｂ（Ｎ
）　　Ｍ、並びにＭ（Ｎ）　　Ｂよりなるｘ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　ｘ群から選択され
る少なくとも１つの成分を含む修飾ヌクレアーゼ耐性ヌ
クレオチド化合物（式中、Ｎは、ホスホジエステル結合
修飾または未修飾２−−デオキシヌクレオシド部分であ
り、Ｍは、ヌクレオチド成分にエンドヌクレアーゼ耐性
を与え、少なくとも１つの修飾または未修飾核酸塩基を
含有する部分であり、Ｂは、付着する末端にエキソヌク
レアーゼ耐性を与える部分であり、Ｘは、少なくとも２
の整数である）が提供される。

他の観点では、この発明によれば、ＲＮＡの機能を阻害
するに際し、ハイブリタイス可能な条件下で、ＲＮＡと
、ＭＮ、Ｍ、 Ｂ　（Ｎ）　　並びにＭ（Ｎ）　　Ｂよりなる群かｘ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　ｘら選択される少
なくとも１つの成分を含む相補的修飾ヌクレオチド化合
物とを接触させる（式中、Ｎは、ホスホジエステル結合
修飾または未修飾２−−デオキシヌクレオシド部分であ
り、Ｍは、ヌクレオチド成分にエンドヌクレアーゼ耐性
を与え、少なくとも１つの修飾または未修飾核酸塩基を
含有する部分であり、Ｂは、付着する末端にエキソヌク
レアーゼ耐性を与える部分であり、Ｘは、少なくとも２
の整数である）ことからなるＲＮＡの機能を阻害する方
法が提供される。前記した好適な態様は、特にこの化合
物の使用の方法に関する。

またこの発明によれば、ＲＮＡと複合した場合、増加し
たヌクレアーゼ耐性とＲＮアーゼＨ基質を形成する能力
との組合せを有するオリゴまたはポリヌクレオチドを同
定する方法が提供される。

この発明の更なる観点によれば、生体内に３ ４ 導入することかでき、治療または診断応用に有効な薬剤
として作用し得る前に分解され得ないヌクレオチド化合
物か提供される。この化合物には、ＭＮ３Ｍ、Ｂ　（Ｎ
）　ＸＭ、並びにＭ（Ｎ）　　Ｂよりなる群から選択さ
れる少なくとも１つの成分が含まれる（式中、Ｎは、ホ
スホジエステル結合修飾または未修飾２デオキシヌクレ
オシド部分であり、Ｍは、ヌクレオチド成分にエンドヌ
クレアーゼ耐性を与え、少なくとも１つの修飾または未
修飾核酸塩基を含有する部分であり、Ｂは、付着する末
端にエキソヌクレアーゼ耐性を与える部分であり、Ｘは
、少なくとも２の整数である）。

この発明で記載する化合物は、治療的またはイメージ用
途の「アンチセンス」オリゴまたはポリヌクレオチドと
して有用であり、エンドおよびエキソヌクレアーゼに対
する組合せ改良された耐性の特性、並びにＲＮアーゼＨ
感受性ハイブリッドを形成する能力を有する。これらの
化合物を合成する特に有利な化学手段が、その使用の方
法として提供される。

先に銘記したように、本発明によれは、２以上のホスホ
ジエステル結合ヌクレオシドの配列であってヌクレアー
ゼ耐性であるものを有するオリゴヌクレオチドまたはポ
リヌクレオチド化合物の層成物が提供される。またこの
発明によれば、ＲＮＡの発現、スプライシング並びに翻
訳に関する機能を含むＲＮＡの機能を阻害する方法が提
供される。この発明の化合物は、多数の価値ある用途を
有し、これには、この配列により、有害な蛋白質生成物
の発現または病原体の複製または生存の阻害または回避
が可能となる治療的使用が包含される。よって、この発
明の治療的に有効量の化合物を投与することにより、外
来生物またはウィルスによる感染に対して生体を処置す
る方法が提供される。この化合物は、その治療的効果を
発揮することを意図する細胞、生体またはウィルスとこ
れとを接触させる経５ ６ 路により投与する。

前記したように、Ｎはホスホジエステル結合未修飾また
は修飾２−−デオキシヌクレオシド部分である。好まし
くは、これは未修飾２−−デオキシヌクレオチド部分と
する。修飾する場合、典型的な修飾された形態には、２
．６−ジアミノプリン、ウラシル、イノシン、５−ハロ
ゲン化ウラシルまたはシトシン、置換または未置換７−
デアザグアニン、７デアサアデニン、７−デアザイノシ
ン、またはメチル化アデニン、チミン、シトシンまたは
グアニンか包含される。

Ｍは、ヌクレオチド成分にエンドヌクレアーゼ耐性を与
え、少なくとも１つの修飾または未修飾核酸塩基を含有
する部分である。好ましくは、これはメチルホスホネー
トのようなＣ〜Ｃ４アルキルホスホネー１・とするが、
またはα−ホスホジエステル結合とする。Ｍの他の例に
は、アミノホスホネート、ホスホトリエステル、ホスポ
ルアミテート、カーバメートまたはモルホリノ置換ヌク
レオチドよりなる群から選択されるものが包含される。

またＭはエキソヌクレアーゼ耐性を与えることもできる
。

Ｂは、付着する末端にエキソヌクレアーゼ耐性を与える
部分であり、好ましくは少なくとも１つの３−−および
５゛末端ヌクレオチドのデオキシリボース部分に対して
直接的または間接的なものとする６Ｂの例には、内位添
加剤、メチルチオホスフェート、カーポジイミド並びに
Ｎ−ヒドロキシベンゾ１へリアゾールが包含される。ま
なりは、イソウレア、ポリペプチドまたは蛋白質とする
こともできる。付加的な例として、修飾ヌクレオチドが
式Ｍ（Ｎ）　　Ｂを有する場合、Ｂは修飾または未修飾
２−．３−−ジテオキシリボースヌクレオチドとするこ
とができる。

ここで使用するように、Ｘは少なくとも２、好ましくは
２または３の整数である。

「ヌクレアーゼ耐性」という用語は、エン７ ドまたはエキソヌクレアーゼについての基質として作用
する化合物の能力の減少に言及するものであり、例えば
、これらの酵素と接触した場合、化合物が分解されない
が、未修飾ホスホジエステル結合ヌクレオシドと比較し
てゆっくりと分解されるものである。

特に好適な態様は、式ＭＮ３Ｍの少なくとも１つの配列
を含むヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド化合物である（式
中、Ｎは、アデニン、グアニン、チミン並びにシトシン
の群から選択される未修飾ホスホジエステル結合ヌクレ
オシド部分であり、Ｍは２−−デオキシヌクレオシドメ
チルホスホネートである）にの態様では、Ｍはエンドヌ
クレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ耐性を与え、これ
によりＢの機能が付加的に行われる。

またこの発明によれば、ＲＮＡの機能を阻害するに際し
、ハイブリダイズ可能な条件下で、ＲＮＡと、ＭＮ３Ｍ
，Ｂ　（Ｎ）　ｘ並びにＭ（Ｎ）ＸＢよりなる群から選
択される少なくとも１つの成分を含む相補的修飾ヌクレ
オチド化合物とを接触させる（式中、Ｎは、ホスホジエ
ステル結合修飾または未修飾２−デオキシヌクレオシド
部分であり、Ｍは、ヌクレオチド成分にエンドヌクレア
ーゼ耐性を与え、少なくとも１つの修＃または未修飾核
酸塩基を含有する部分であり、Ｂは、付着する末端にエ
キソヌクレアーゼ耐性を与える部分であり、Ｘは、少な
くとも２の整数である）ことからなるＲＮＡの機能を阻
害する方法が提供される。前記した好適な態様は、特に
この化合物の使用のこの方法に関する。

またこの発明によれば、ＲＮＡ：オリゴまたはポリヌク
レオチド複合体の場合にヌクレアーゼ耐性とＲＮアーゼ
Ｈ基質を形成する能力との組合せを有するオリゴまたは
ポリヌクレオチド化合物を同定する方法が提供される。

この方法は、（１）修飾オリゴまたはポリヌクレオチド
化合物を調製し、（１１）エキソおよびエンドヌクレア
ーゼ消化により、相補的ヌク９ ０ レオチド化合物とデユープレックスを形成することがで
き電気泳動的に移動し得ることにより示されるヌクレア
ーゼ耐性である（１）のオリゴまたはポリヌクレオチド
のものを選択し、（ｉｉｉ）　ＲＮＡアーゼＨ消化によ
り、相補的ＲＮＡとの複合体の場合にＲＮアー七トＩの
基質として作用する（ｉｉ）のヌクレアーゼ耐性ヌクレ
オチド化合物のものを選択することからなる。

割立■ニ アブライド・バイオシステムズ・モデル３８０Ｂ　　Ｄ
ＮＡ合成装置によりオリゴデオキシヌクレオチドを合成
した。標準的ホスホルアミタイト化学手段によりホスホ
ジエステル結合を生成し、メチルホスホンアミダイト単
量体の共役によりメチルホスホネート結合を導入した。

塩基保護基の加水分解およびホスホジエステルオリゴチ
オキシヌクレオチドについての支持体からの開裂は、Ｎ
　Ｈ４０Ｈ処理により行い、その後エタノール沈殿を行
った。混合ホスホジエステルおよびメチルホスボネート
結合を含有するオリゴデオキシヌクレオチドを脱保護し
、エチレンジアミン：エタノール（１：１）中で７時間
室温にて放出させた。また、この処理に加えて、支持材
料をＮ　Ｈ４，ＯＨ中で２時間室温にて処理した。

サリンら、前記文献を参照することができる。

これらのオリゴデオキシヌクレオチドを、ＮＡＣＳプレ
パックカラム（ベセスタ・リザーチ・ラボラ１〜リイス
、ベセスタ、ＭＤ＞からの４Ｍ酢酸アンモニウム溶出に
よって精製した。

後記する検討において使用したオリゴデオキシヌクレオ
チドを第１表に示すが、ここでは、センスまたはアンチ
センスとして示した相補的群にこれらをグループ化した
。

３　］ ２ 第１表 １刀 ＧＧＡＴＧＣＡＧＣＴＡＡＧＴＣＡＡＧＡＴＧＣＡＧＣ
ＴＡＡＧＴＣＡ ＡＴΩＣＡＱＣＴＡＡＱＴＣＡ Ａ工ＧＣＡＧＣ工ＡＡＧ工ＣＡ ＡＴＧΩＡＧΩＴＡ／ｌＧＴΩＡ ＡＴＧＣＡＧＣＴＡＡＧ工ΩＡ ＣＧＣＣＡＴＧＣＡＧＣＣＣＣＡＧＴＣ各称 １８・Ｐ・４ ４−Ｐ−４ ４−Ｇ−４ ４７−４ １４・Ｃ−４ １４−Ｃバー４ 配且　　　　　■ ＣＴＴＧＡＣＴＴＡＧＣＴＧＣＡＴＣＣ１８−Ｐ・３Ｔ
ＧＡＣｎＡＧＣＴＧＣＡＴ　　　　　　　＋４・Ｐ・３
ＴＧＡＣＴＴΔＧＣＴＧＣ△Ｔ　　　　　　　　＋４−
八−３ＴＧＫｔｎＡＧＱＴＧΩＡＴ　　　　　　＋４−
Ｃ，３Ｔ１３ＡＣＴＩＡＧＣ工ＧΩＡＴ　　　　　１４
．Ｍｅ”ａ−３ＴΩＡＱＴＩＡＧΩＴＧＣ△Ｔ　　　　
１４−Ｍｅ６ｂ−３Ｔ、Ｑ鳩ＴＩＡＧＣＩＧＣＡＴ　　
　　１４−Ｍｅ”ａ・３ＴΩＫＬＴＩＡ（３ＣＴＧＣ△
Ｔ　　　　１４−Ｍｅ”ｂ−３ＴＧＧＧＧＣＴＧＣＡＴ
Ｇ　　　　　　　１２．Ｐ、ＩＴＱＧＧＧΩＴ％ΔＴＧ
　　　　　１２−１／、ｅ’−ｊＣＴＱＱＧＧΩＴｉ：
ｉＣΔＴ　　　　　１２−Ｍｅ５ａ−ＩＴΩＧＧＧＩＪ
ＧΩＡＩＧ　　　　　＋２−Ｍｅ５・ＭＴＧＧＧＧΩＴ
ΩＣＡＴＧ　　　　　　２−Ｍｅ５・ｊＴ二Ｇ　　　　
　’　１２−Ｍｅｌｏ−１１下線を付した塩基は、３−
メチルホスホホー１〜結合を有するものである。

マーカーのホスホ・ジエステルオリゴデオキシヌクレオ
チドは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して３２
Ｐにより５−ラベルし、水中にてセファデックスＧ−５
０のスノにンカラムを使用して′Ｍｔ製した。マニアテ
イスら、「分子クローン化」、コールド・スプリング・
ハーバ−・ラボラトリイ、ニューヨーク（１９８２）を
参照することができる。

乞ｋｕ憇透皿 前記したゲル移動分析により全てのメチルホスホネート
置換オリゴチオキシヌクレオチドを定量し、これらそれ
ぞれの５−　３２Ｐラベル相補的ホスホジエステルオリ
ゴヌクレオチドを用いた。カーチンとウニ１−ムル、前
記文献を参照することがてきる。概説すれは、アッセイ
手順は次通っである。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを
使用し３２Ｐによりマーカーのホスホジエステルオリゴ
チオキシヌクレオチドを５−−ラベルし、水中でセファ
テックスＧ−５０のスパンカラム（マニフテイ３ ４ スら、１９８２）を使用して精製した。ヌクレアーゼ処
理相補的オリゴデオキシヌクレオチドに対するアニーリ
ングは、電気泳動の前に室温で１５分間行った。対照の
アニーリング反応は、適当な酵素Ｍ街液中で行った。２
．５％フィコール４００中で２０％アクリルアミドゲル
にサンプルを装填しな。ゲル電気泳動は、４°Ｃで４０
０ポルｌ〜、５〜１５ミリアンペアにて、ＴＢＥｇ街液
（８９ｍＭトリスＣＩ、８９ｍＭボレート、１ｍＭＥＤ
ＴＡ）中で２〜４時間行った。ゲルを乾燥させ、オート
ラジオクラフィにより試験した。

置換されたオリゴチオキシヌクレオチドに対する所定量
の酵素によるヌクレアーゼ作用を、等量の対照ホスホジ
エステルアナログによる結果と比較した。

ラベルした１８−Ｐ−４は、マーカーのオリゴチオキシ
ヌクレオチドとして働き、１４−Ｐ−３または１４−　
Ｍ　ｅ　６ａ　−３のようないずれかのその相補的配列
に対してハイブリクイズした場合、より低い移動度を有
する。

酵素処理したオリゴチオキシヌクレオチドが１８−Ｐ−
４の移動度を減少させない場合、これはもはやデユープ
レックスを形成するものてはなく、試験したヌクレアー
ゼに対する感受性を示す。

ヌクレアーゼ感受性の分析は、オリゴデオキシヌクレオ
チドがチュープレックスを形成２ し、　　Ｐラベルした相補的オリゴチオキシヌクレオチ
ドのゲルを介する移動に影響を与える能力に基く６所定
量の酵素による置換されたオリゴデオキシヌクレオチド
に対するヌクレアーゼ作用を、対照ホスホジエステルア
ナログによる結果と比較する。

ＤＮアーゼ■およびＤＮアーゼ■エンドヌクレアーゼ感
受性について、主としてカーチンとウェトムル（１９８
９）、前記文献に記載さ５ ６ れなようにして行い、ゲルシフトアッセイによりこれを
決定した。１−５隣接ホスホジ工ステル結合を有するメ
チルホスボネート含有オリゴデオキシヌクレオチドを次
のように試験した。

オリゴチオキシヌクレオチドのヌクレアーセ消化を、そ
れぞれの酵素について後記する条件下で１０μｍ容量に
て行った。ウシ膵臓Ｄ　Ｎアーゼエ（１μｇ）（３，１
，４，，５）（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリイス、
ベセスタ、ＭＤ）を、５０ｍＭ酢酸すｌ−リウム（ｐ　
Ｈ６，５）　、１０　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　２並びに
２ｍＭＣａＣｌ　２を含有する溶液中て３７°Ｃで使用
した。ウシ牌臓ＤＮアーゼ■（２０単位）（３，１，４
，６＞（ベセスタ・リサーチ・ラボラトリイス、前記）
を、０．８ｍＭＭ　ｇ　Ｓ　Ｏ４および８３　、３　ｍ
　Ｉ’Ａ　ＨＯＡ　ｃ（ｐＴ（４６）を含有する溶液中
で２５°Ｃで使用した。消化反応についての酵素量は、
ホスホジエステルオリゴテオキシヌクレオチドを用いる
滴定により決定した。

２５ｍＭまでＥＤＴＡを添加し、７０°Ｃで１０分間イ
ンキュベーｌ〜することによりＤＮアーゼエ反応を停止
さぜな。２１ｍＭまでのＥＤＴＡおよびｐＨ６，０まで
の１−リスＯＨを添加し、その後７０℃で３０分間イン
キュベーｌ〜することによりＤＮアーゼ■反応を停止さ
ぜな。両者の反応溶液を、オリゴデオキシヌクレオチド
のアニーリングのため、少なくとも１００ｍＭＮａＣＩ
まで至らしめた。

第２表に、エンドヌクレアーゼＤＮアーゼエおよびＤＮ
アーセ■によるオリゴデオキシヌクレオチドの消化につ
いての相対的半減期を示す。メチルホスホホー１〜結合
を有するオリゴヌクレオチドの半減期は、対照オリゴヌ
クレオチド、１４−Ｐ−３に対するものとして示す。Ｄ
Ｎアーゼ■による１　４−Ｐ〜３の消化についての半減
期は、１０分のオーターであった。１４．−、！−３は
、５つのホスホン　７ ８ エステル結合の内部スパンを有し、対照１４Ｐ−３と同
様にＤＮＮアーゼ−感受性である。１４−Ｍｅ６ａ−３
は交番ジエステルおよびメチルホスホネー１〜結合を有
し、１４Ｐ−３よりＤＮアーゼ１に対して６００倍附１
性であった。−船釣傾向として、ポスポジエステルスパ
ンが減少するにつれ、オリゴデオキシヌクレオチドはエ
ンドヌクレアーゼ活性に対してより耐性となる。ＤＮア
ーゼ■反応は、ＤＮアー七工についてのものより非常に
遅かった（１４−１”３消化についての半減期１０時間
）。実験の時間的枠組みの中で、最も耐性のメチルホス
ポネーｌ−についての相対的半減期は、５を越えるもの
として示され得るのみである。

第２表 相対的半減期 ｉ　４−Ｐ−３ ４−Ａ−３ 〉５ １４−Ｃ−３ １４−Ｍｅ５ｂ−３ １４−Ｍｅ５ａ−３ １４−Ｍｅ６ｂ−３ １４−Ｍｅ６ａ、３ ２ ００ 〉６００ 〉６００ ９ ０ 大ＪＩ殊ユ オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を、５−−およ
び３−−エキソヌクレアーゼを用いる次の消化により、
相補的ホスホジエステル結合オリゴデオキシヌクレオチ
ドの電気泳動移動度（「ゲルシフト」）の変化を引き起
こす能力によって検出した。

オリゴデオキシヌクレオチドのヌクレアーセ消化は、そ
れぞれの酵素について後記する条件下で１０μｍ容量中
で行った。ウシ牌臓ホスホジェステラーゼ（３，１，４
，１８）（シグマ、セン１〜ルイス、ＭＯ）を、０１Ｍ
クエン酸ナトリウム（ｐＨ６，０）および５ｍＭＥＤＴ
Ａを含有する溶液中で３７°Ｃで使用しな。Ｃｒｏｔａ
ｌｕｓ　ａｄａｍａｎｔｅｕｓ由来のヘビ毒ホスホジェ
ステラーゼ（３，１，４，］、）（シグマ、前記）を、
０．２Ｍ１〜リス−ＣＩ（ｐＨ９，０＞を含有する溶液
中で３７°Ｃで使用した。消化反応についての酵素量は
、ホスホジエステルオリゴデオキシヌクレオチドを用い
る滴定によって決定した。

ヘビ毒ホスホジェステラーゼ反応は、２５ｍＭまでＥＤ
ＴＡを添加し７０℃で１０分間インキュベートすること
により停止した。胛臓ホスポジエステラーゼ反応は、７
０°Ｃで１０分間インキュベー１・することにより停止
した。オリゴデオキシヌクレオチドのアニーリングの前
に、両者の反応液を少なくとも１００ｍＭＮａｃｌに至
らしめた。

牌臓およびヘビ毒エキソヌクレアーゼの検討結果を第３
表にまとめる。それぞれのオリゴヌクレオチドの半減期
は、そのそれぞれの対照、未修飾オリゴヌクレオチド配
列、］４Ｐ−３または１４．−　Ｐ−４のものに対する
ものとして示す。

対照オリゴチオキシヌクレオチドの牌朦エキソヌクレア
ーセ消化についての半減期は、使用した酵素濃度につい
て約３０分であった。

１ ２ 胛臓エキソヌクレアーゼを用いて試験した部分修飾オリ
ゴデオキシヌクレオチドの全ては、適切に増加させた酵
素濃度による一夜消化の後に検出し得る開裂の不存在に
基き、そのそれぞれの対照より２００倍以上耐性であっ
た。

オリゴヌクレオチド、１４−Ｃ−４，１４Ｇ−４並びに
１４−Ｔ−４は、ハイブリッドの電気泳動移動度におけ
る僅かな増加により示されるように、明らかに短くなっ
ていた。

対照オリゴチオキシヌクレオチドの毒エキソヌクレアー
ゼ消化についての半減期は、使用した酵素（シグマ）濃
度について約１２分であった。最も短い相対的半減期を
有する修飾オリゴチオキシヌクレオチド（１４−Ｇ−４
）は、３−−末端から３つ目の結合としてその最初のメ
チルホスホネート結合を有していたが、試験した他のオ
リゴチオキシヌクレオチドは、３−−末端から１つ目ま
たは２つ目の結合としてメチルホスホネートを有してい
た。

他の検討では、ワージンクトンの毒エキソヌクレアーゼ
を使用し、３−−末端における２つの連続的なメチルホ
スホネート結合（１４Ｃ／Ｔ−４）の存在により、３−
−末端に１つのみのメチルホスホネート結合を有する１
　４−Ｃ−４と比教して、オリゴチオキシヌクレオチド
の半減期の約２倍の増加を与えた。

３ ４ 第」し光 寒」自吐ユ ’＋４−Ｐ−３ ”１４−Ｐ−４ １４−Ｃ−３ ＋４−Ｇ−４ ４−Ａ−３ ４−Ｔ−４ １４−Ｍｅ６ａ−３ １ １ ＞＞２００　　　　　　　　　　　　　＞５００＞＞２
００　　　　　　　　　　　　　　１００＞＞２００　
　　　　　　　　　　　　　　ン〉５００＞＞２００　
　　　　　　　　　　　＞５００＞＞２００　　　　　
　　　　　　　＞＞５００上記のデータは、末端付近の
単一ヌクレアーゼ耐性インターヌクレオチド結合は、オ
リゴデオキシヌクレオチドのエキソヌクレオ分解酵素に
対する耐性を大きく増強するよう働くことを示す。

ＲＮアーゼＨ基質として作用する、すなわち相補的ＲＮ
ＡのＲＮＮアーゼ間裂を指向する能力を、プラスミドｐ
ＳＰ６５−ＡＬＡＤを使用して次のように試験した。

プラスミドｐＳＰ６５−ＡＬＡ−Ｄは、メルトンら、［
バクテリオファージＳＰ６プロモーターを含有するプラ
スミドからの生物的に活性なＲＮＡおよびＲＮＡハイブ
リタイゼーショングローブの効率的な試験管内合成」、
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｔ＋、　
１２：　７０３５−７０５６（１９８４）に記載された
ＳＰ６クローン化ベクタｐＳＰ６５の誘導体である。こ
れは、ポリリンカのＰｓｔＩ部位にセンス方向に挿入さ
れたデルタ−アミルプリン酸テヒドロゲナーゼ（ＡＬＡ
−Ｄ）　、ヘム生合成酵素のｃＤＮＡ配列を含有する。

ＡＬＡ−Ｄについては、ウェトムルら、［ヒトα−アミ
ルリプリン酸ヒドラターゼ：全長ｃＤＮＡクローン５ ６ のヌクレオチド配列Ｊ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃ
ａｄＳｃｉ、　ＵＳ＾、　８３：　７７０３−７７０７
　（１９８６）を参照することかできる。部分補遺は、
一般に次の通りである： （１２マー）　　（１４マー） 一／ ／−− ＰＮ　　　　　　　　　　　Ｈ ここで、１２マーおよび１４マーのラベルはオリゴヌク
レオチド結合部位上の中心に位置し、ランオフ転写につ
いての制限エンドヌクレアーゼ部位は次の通りである：
Ｐ− Ｐｖｕ　Ｉ［、Ｎ＝ＮｃｏＩ、Ｈ＝Ｈｉ　ｎｄｌＩ［、
並びにＳ−転写開始。

プラスミドｐＳＰ６５−ＡＬＡ−Ｄ　（１μｇ）をＨｉ
ｎｄＩＩ［、ＮｃｏＩまたはＰｖｕ■の１つにより消化
した後、フェノールにより抽出し、クロロホルム：イソ
アミルアルコール（２４：１）により抽出し、エタノー
ル沈殿した。７０％エタノールを用いてペレッ）・を洗
浄し、乾燥し、水中に再懸濁した（２００ｎｇ／μ］）
。試験管内転写反応物は、約２００ｎｇの線状化ｐＳＰ
６５−ＡＬＡ−Ｄ、全ての４つのりボヌクレオシドトリ
リン酸（０，４ｍＭ、冷却）、２０μＣｉα−３２Ｐ−
ＣＴＰ（比活性８００Ｃｉ　７ｍｌｌ１ｏｌ）　、１　
ｍＭＤＴＴ、４０ｍＭ）リス−ＭＣＩ　（ｐＨ７，９）
、６ｍＭ Ｍ　ｇ　Ｃ］　２　、□　２　ｍ　Ｍスペルミジン−［
ＭＣＩ］並びに１５単位の５Ｐ６ＲＮＡポリメラーゼを
含有し、３７゛Ｃで１時間インキュベートした。サンプ
ルを抽出し、沈殿させて乾燥し、その往水（１０〜２０
μｌ）中に再懸濁した。

再懸濁した転写物（１μｌ）を、１０単位のインヒビタ
ーＲＮアシン（９μｌ全量）（プロメカ・コープ、マデ
ィソン、ＷＩ）の存在下に、２０ｍＭトリス−ＭＣＩ（
ｐＨ７，５）、１０ｍＭＭｇＣ１１００ｍＭ２゛ ＫＣＩ、１０ｍＭＤＴＴ並びに５％（Ｗ／Ｖ）ショ糖中
にてアンチセンスオリゴチオキシヌクレオチド（２Ｏｎ
、　ｇ　）とアニールさせた。

７ ８ ６０℃での１分間のインキュベートの後、アニール混合
物を室温（２２°Ｃ）で３０分間インキュベートした。

その後、イー・コリＲＮアーゼＨ（１μｌ−２単位、３
．１．．２６４　；　ＢＲＬ）を添加し、反応物を３７
°Ｃで６０分間インキュベー１へした。ＥＤＴＡ（１μ
Ｉ、Ｏ，ＩＭ）を添加して反応を停止した。

サンプルを抽出し、エタノール沈殿し、乾燥し、ＲＮＡ
装填緩衝液（１０ＪＬｌ、６７％ホルムアミドおよび２
０％ホルムアミド）に再懸濁した。６０°Ｃでの５分間
のインキュベートの後、３５０ホルト、４５ミリアンペ
アで室温にて１時間、６％変性＜８Ｍ尿素）アクリルア
ミドゲルにサンプルを供した。オートラジオグラフィに
より結果を視覚化した。

ｐｓＰ−６−ＡＬＡ−Ｄから３２ラベルしたランオフ転
写物を作成し、ＲＮアーゼＨの存在下に種々のオリゴデ
オキシヌクレオチドとインキュベートした。対照オリゴ
デオキシヌクレオチド１４−Ｐ−３およびメチルホスホ
ネート置換オリゴデオキシヌクレオチド１４−Ａ−３お
よび１４−Ｃ−３はＲ，ＮアーゼＨ基質を形成したが、
１０μｇ　／　ｍ　＋の濃度に至るまで１４−Ｍｅ６ａ
−３は形成しなかっな。また、１４−Ｍｅ５ａ−３およ
び１４−Ｍｅ”ｂ−３は、ＲＮアーゼＨ基質を形成する
ことができた。しかしながら、１４マ一結合部位は、Ｒ
ＮアーゼＨ消化には適さない部位と考えられた。ＲＮＡ
の完全な開裂が全く認められなかったためである。恐ら
くこの領域におけるＲＮＡ中の二次ｖｉ造によると考え
られる。

対照ホスホジエステルオリゴデオキシヌクレオチド、１
２−Ｐ’−１を含む一群の１２マーのオリゴデオキシヌ
クレオチドを試験した。

ＮｃｏＩランオフ転写物を使用しくこれは１２−Ｐ’−
１の存在下でＲＮアーゼＨにより完全に開裂される）、
１２−Ｍｅ４−１およ９ ０ び１２−Ｍｅ５ａ−１については大部分のＲＮＡの開裂
か可能であるが、１２ ５　　　　　　　　５− Ｍｅｂ−１，１２−Ｍｅｌ並びに１２ −Ｍｅｌｏ−１はＲＮアーゼＨ基質を形成しないことが
認められた。

作 Ｂ９５−８細胞の懸濁培養物、ニブスティン・バールウ
ィルス陽性リンパ球セルラインを、１０％熱失活ウシつ
児血清（Ｆｅ２）およびペニシリンおよびストレプトマ
イシン（全てギブコより）を含有するＲＰＭ　１１６４
０中で３７°Ｃにて湿潤５％ＣＯ２インキユベータ中で
維持した。細胞は、４×１０５〜２×１０６／ｍｌの濃
度で維持した。

安定性の検討のため、２００μｌの ＲＰＭ１１６４０（のみ＞、２００μｌの完全培地並び
に２００ＪＪ、ｌの細胞懸濁物を、９６六組織培養プレ
ートの別々の穴に移した。

終濃度的０．２μＭで穴にオリゴヌクレオチドを添加し
、３７°Ｃで種々の時間の間インキュベートした。ザン
プル（２５μｌ）を除去し、７０°Ｃで５〜１０分間イ
ンキュベートして更なる分解を軽減し、その後ゲル移動
分析の前に一２０℃で保存した。細胞懸濁物における安
定性試験の結果を第４表に示す。

第４表 １４−Ｐ−３安定　　、　　　　１ １４−Ｍｅ５ｂ−３安定　　。。　　　　３゜１４−１
φｅ５ａ−３安定　　３０３０１４−Ｍｅ６ｂ−３安定
　　３０３０ １４−Ｍｅ６ａ−３安定　　３０　　　　３０試験した
オリゴヌクレオチドの全ては、血清を含有しない培地中
のインキュベート、その後の３７℃での２４時間のイン
キュベ−１・に対して安定であった。個々のオリゴヌク
レ１ ２ オチドの安定性は、完全培地および細胞懸濁物の両者に
おいて分解が類似するため、血清の存在により変化した
。

これらの結果は、ホスホジエステルオリゴヌクレオチド
は、細胞懸濁物（または完全培地）中で６０分未満の半
減期を有することを示しな。短時間増強を使用する血清
補填またはコンディショニング培地における同様の実験
の結果は、約１５分の半減期を示唆しな。

メチルホスホネート置換を有するオリゴデオキシヌクレ
オチドは、それらのホスホジエステルアナログより顕著
に安定であり、メチルホスホネート結合の配置によらず
、約７．５時間の相対的に類似した半減期を示した。

３−−エキソヌクレオ分解活性は、オリゴチオキシヌク
レオチド１．４−Ｍ　ｅ　６ａ−２および１４−Ｍｅ５
ａ−２（このそれぞれは３末端−ホスホジエステル結合
チミジン残基を含有する）の単独の段階的開裂により示
され、またオリゴデオキシヌクレオチド１４Ｍｅ’ｂ−
２および１４−Ｍｅ’　ｂ−２（このそれぞれは３−−
末端一メチルホスホネート結合チミジン残基を含有する
）の不存在により示された。

３ ４

Claims (50)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＭＮ＿３Ｍ、Ｂ（Ｎ）＿ＸＭ、並びにＭ（Ｎ）＿
   ＸＢよりなる群から選択される少なくとも１つの成分を
   含む修飾ヌクレオチド化合物（式中、 Ｎは、ホスホジエステル結合修飾または未 修飾２＾−−デオキシヌクレオシド部分であり、Ｍは、
   前記成分にエンドヌクレアーゼ耐性 を与え、少なくとも１つの修飾または未修飾核酸塩基を
   含有する部分であり、 Ｂは、付着する末端にエキソヌクレアーゼ 耐性を与える部分であり、 Ｘは、少なくとも２の整数である）。
2. （２）ＭおよびＢが同一部分である請求項１記載の修飾
   ヌクレオチド化合物。
3. （３）相補的ＲＮＡと複合する場合、ＲＮＡに対してＲ
   ＮアーゼＨ感受性を与える請求項１記載の修飾ヌクレオ
   チド化合物。
4. （４）Ｎが少なくとも１つのアデニン、グアニン、チミ
   ンまたはシトシン部分を含有する請求項１記載の修飾ヌ
   クレオチド化合物。
5. （５）Ｎが少なくとも１つのウラシル、イノシンまたは
   ２，６−ジアミノプリン部分を含有する請求項１記載の
   修飾ヌクレオチド化合物。
6. （６）Ｎが少なくとも１つの５−ハロゲン化ウラシルま
   たはシトシンまたは置換または未置換７−デアザグアニ
   ン、７−デアザアデニンまたは７−デアザイノシン部分
   を含有する請求項１記載の修飾ヌクレオチド化合物。
7. （７）Ｎが少なくとも１つのメチル化アデニン、グアニ
   ン、チミンまたはシトシン部分を含有する請求項１記載
   の修飾ヌクレオチド化合物。
8. （８）ＭがＣ＿１〜Ｃ＿４アルキルホスホネートデオキ
   シヌクレオチドである請求項１記載の修飾ヌクレオチド
   化合物。
9. （９）Ｍがメチルホスホネートデオキシヌクレオチドで
   ある請求項８記載の修飾ヌクレオチド化合物。
10. （１０）Ｍがα−ホスホジエステル２＾−−デオキシヌ
    クレオシドである請求項１記載の修飾ヌクレオチド化合
    物。
11. （１１）Ｍが、アミノホスホネート、ホスホトリエステ
    ル、ホスホルアミデート、カーバメートまたはモルホリ
    ノ置換ヌクレオチドよりなる群から選択される請求項１
    記載の修飾ヌクレオチド化合物。
12. （１２）Ｂが、少なくとも１つの３＾−−および５＾−
    −末端ヌクレオチドのデオキシリボース部分に直接的ま
    たは間接的に付着する請求項１記載の修飾ヌクレオチド
    化合物。
13. （１３）Ｂが、少なくとも１つの３＾−−および５＾−
    −末端ヌクレオチドのデオキシリボースの水酸基に直接
    的または間接的に付着する請求項１２記載の修飾ヌクレ
    オチド化合物。
14. （１４）Ｂが、少なくとも１つの３＾−−および５＾−
    −末端ヌクレオチドのデオキシリボース部分に付着した
    リン酸部分に直接的または間接的に付着する請求項１記
    載の修飾ヌクレオチド化合物。
15. （１５）Ｂが、内位添加剤、イソウレア、カルボジイミ
    ド並びにＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールよりなる群
    から選択される請求項１３または１４記載の修飾ヌクレ
    オチド化合物。
16. （１６）Ｂがメチルチオホスホネートである請求項１３
    記載の修飾ヌクレオチド化合物。
17. （１７）Ｂがポリペプチドまたは蛋白質である請求項１
    ３または１４記載の修飾ヌクレオチド化合物。
18. （１８）式Ｍ（Ｎ）＿ＸＢ（式中、Ｂは修飾または未修
    飾２＾−、３＾−−ジデオキシリボースヌクレオチドで
    ある）の少なくとも１つの配列を含む請求項１記載の修
    飾ヌクレオチド化合物。
19. （１９）Ｘが２または３よりなる群から選択される整数
    である請求項１記載の修飾ヌクレオチド化合物。
20. （２０）式ＭＮ＿３Ｍ（式中、Ｎは少なくとも１つのグ
    アニン、アデニン、シトシンまたはチミン部分を含有す
    るホスホジエステル結合未修飾２＾−−デオキシヌクレ
    オシド部分であり、Ｍはメチルホスホネート含有デオキ
    シヌクレオチドである）を有する少なくとも１つの配列
    を含有する修飾ヌクレオチド化合物。
21. （２１）ＲＮＡの機能を阻害するに際し、ハイブリダイ
    ズ可能な条件下で、前記ＲＮＡと、 ＭＮ＿３Ｍ、Ｂ（Ｎ）＿Ｘ並びにＭ（Ｎ）＿ＸＢよりな
    る群から選択される少なくとも１つの相補的成分を含む
    修飾ヌクレオチド化合物とを接触させる（式中、 Ｎは、ホスホジエステル結合修飾または未 修飾２＾−−デオキシヌクレオシド部分であり、Ｍは、
    その存在により前記成分にエンドヌ クレアーゼ耐性を与え、少なくとも１つの修飾または未
    修飾核酸塩基を含有する部分であり、 Ｂは、その存在により付着する末端にエキ ソヌクレアーゼ耐性を与える部分であり、 Ｘは、少なくとも２の整数である）ことか らなるＲＮＡの機能を阻害する方法。
22. （２２）ＲＮＡを、ＭおよびＢが同一部分である化合物
    と接触させる請求項２１記載の方法。
23. （２３）ＲＮＡを、Ｎが少なくとも１つのアデニン、グ
    アニン、チミンまたはシトシン部分を含有する化合物と
    接触させる請求項２１記載の方法。
24. （２４）ＲＮＡを、Ｎが少なくとも１つのウラシル、イ
    ノシンまたは２，６−ジアミノプリン部分を含有する化
    合物と接触させる請求項２１記載の方法。
25. （２５）ＲＮＡを、Ｎが少なくとも１つの５−ハロゲン
    化ウラシルまたはシトシンまたは置換または未置換７−
    デアザグアニン、７−デアザアデニンまたは７−デアザ
    イノシン部分を含有する化合物と接触させる請求項２１
    記載の方法。
26. （２６）ＲＮＡを、Ｎが少なくとも１つのメチル化アデ
    ニン、グアニン、チミンまたはシトシン部分を含有する
    化合物と接触させる請求項 ２１記載の方法。
27. （２７）ＲＮＡを、ＭがＣ＿１〜Ｃ＿４アルキルホスフ
    ェートである化合物と接触させる請求項２１記載の方法
    。
28. （２８）ＲＮＡを、Ｍがメチルホスホネートである化合
    物と接触させる請求項２７記載の方法。
29. （２９）ＲＮＡを、Ｍがα−ホスホジエステル２＾−−
    デオキシヌクレオシドである化合物と接触させる請求項
    ２１記載の方法。
30. （３０）ＲＮＡを、Ｍがアミノホスホネート、ホスホト
    リエステル、ホスホルアミデート、カーバメートまたは
    モルホリノ置換ヌクレオチドよりなる群から選択される
    化合物と接触させる請求項２１記載の方法。
31. （３１）ＲＮＡを、Ｂが少なくとも１つの３＾−−およ
    び５＾−−末端ヌクレオチドのデオキシリボース部分に
    直接的または間接的に付着した化合物と接触させる請求
    項２１記載の方法。
32. （３２）ＲＮＡを、Ｂが少なくとも１つの３＾−−およ
    び５＾−−末端ヌクレオチドのデオキシリボースの水酸
    基に直接的または間接的に付着した化合物と接触させる
    請求項３１記載の方法。
33. （３３）ＲＮＡを、Ｂが少なくとも１つの３＾−−およ
    び５＾−−末端ヌクレオチドのデオキシリボース部分に
    付着したリン酸基に直接的または間接的に付着した化合
    物と接触させる請求項３１記載の方法。
34. （３４）ＲＮＡを、Ｂが内位添加剤、イソウレア、カル
    ボジイミド並びにＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールよ
    りなる群から選択される化合物と接触させる請求項３２
    または３３記載の方法。
35. （３５）ＲＮＡを、Ｂがメチルチオホスホネートである
    化合物と接触させる請求項３２記載の方法。
36. （３６）ＲＮＡを、Ｂがポリペプチドまたは蛋白質であ
    る化合物と接触させる請求項３２または３３記載の方法
    。
37. （３７）ＲＮＡを、式Ｍ（Ｎ）＿ＸＢ（式中、Ｂは修飾
    または未修飾２＾−、３＾−−ジデオキシリボースヌク
    レオチドである）を有する少なくとも１つの配列を含む
    化合物と接触させる請求項２１記載の方法。
38. （３８）ＲＮＡを、Ｘが２または３よりなる群から選択
    される化合物と接触させる請求項２１記載の方法。
39. （３９）ＲＮＡを、式ＭＮ＿３Ｍ（式中、Ｎは少なくと
    も１つのグアニン、アデニン、シトシンまたはチミン部
    分を含有するホスホジエステル結合未修飾２＾−−デオ
    キシヌクレオシド部分であり、Ｍはメチルホスホネート
    含有デオキシヌクレオシドである）を有する少なくとも
    １つの配列を含む修飾ヌクレオチド化合物と接触させる
    請求項２１記載の方法。
40. （４０）ＲＮＡと複合した場合にヌクレアーゼ耐性とＲ
    ＮアーゼＨ基質を形成する能力との組合せを有するヌク
    レオチド化合物を同定する方法であって、 （ｉ）修飾ヌクレオチド化合物を調製し、 （ｉｉ）エキソおよびエンドヌクレアーゼ消化により、
    相補的ヌクレオチド化合物とデュープレックスを形成す
    ることができ電気泳動的に移動し得ることにより示され
    るヌクレアーゼ耐性である（ｉ）の修飾ヌクレオチド化
    合物のものを選択し、 （ｉｉｉ）ＲＮＡアーゼＨ消化により、相補的ＲＮＡと
    ハイブリダイズする場合にＲＮアーゼＨの基質として作
    用する（ｉｉ）のヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド化合物
    のものを選択することからなる方法。
41. （４１）標的ＲＮＡの機能を阻害するためにヒトまたは
    動物を処置する方法であって、治療的に有効量の修飾ヌ
    クレオチド化合物を投与して標的ＲＮＡの機能を阻害し
    、この修飾ヌクレオチド化合物は、ＭＮ＿３Ｍ、Ｂ（Ｎ
    ）＿ＸＭ並びにＭ（Ｎ）＿ＸＢよりなる群から選択され
    る少なくとも１つの成分を含むことからなる方法（式中
    、Ｎは、ホスホジエステル結合修飾または未修飾２＾−
    −デオキシヌクレオシド部分であり、Ｍは、前記成分に
    エンドヌクレアーゼ耐性を与え、少なくとも１つの修飾
    または未修飾核酸塩基を含有する部分であり、Ｂは、付
    着する末端にエキソヌクレアーゼ耐性を与える部分であ
    り、Ｘは、少なくとも２の整数である）。
42. （４２）２以上の隣接ホスホジエステル結合２＾−−デ
    オキシヌクレオシドよりなる少なくとも１つのエキソヌ
    クレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ耐性成分を含有す
    る化合物。
43. （４３）挿入物の核酸配列と特異的に結合してその機能
    を阻害し得る請求項４２記載の化合物。
44. （４４）相補的ＲＮＡと複合した場合、ＲＮＡに対しＲ
    ＮアーゼＨ感受性を与える請求項４２記載の化合物。
45. （４５）オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドか
    らなる請求項４２記載の化合物。
46. （４６）オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが
    修飾された請求項４５記載の化合物。
47. （４７）修飾オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチ
    ドがエンドヌクレアーゼ耐性を与える少なくとも１つの
    部分およびエキソヌクレアーゼ耐性を与える少なくとも
    １つの部分よりなる請求項４６記載の化合物。
48. （４８）エンドヌクレアーゼ耐性付与部分が、修飾ヌク
    レオチド成分にエキソヌクレアーゼ耐性をも与える請求
    項４７記載の化合物。
49. （４９）ＲＮアーゼＨ基質として機能し得る化合物の部
    分が、エキソヌクレアーゼ耐性を与える部分とエンドヌ
    クレアーゼ耐性を与える部分との間に位置する請求項４
    ７記載の化合物。
50. （５０）２または３の隣接ホスホジエステル結合２＾−
    −デオキシヌクレオシドよりなるエンドおよびエキソヌ
    クレアーゼ耐性配列を含有する化合物。