JPH03193121A - タンパク質の選択的分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、タンパク質の選択的分離方法に関し、より詳
しくは、等電点の異なるタンパク質を含む溶液を処理し
て、従来の分子サイズに基づく分離に加えて、電気的な
相互作用を利用し、異種成分系のタンパク質を選択的に
分離、精製する方法に関するものである。

〔従来の技術〕

タンパク質は脂肪、炭水化物、ビタミンなどと同様に重
要な栄養素であるばかりでなく、ホルモン類、抗生物質
、ヘモグロビン、酵素類といった生命現象に不可欠な物
質の構成要素でもある。さらに、これを分離、精製した
ものは、食品や医薬品として使用されるなどその用途は
広い。

工業的にタンパク質を分離、精製する手段としては、従
来、熱による方法、溶剤による抽出などがあったが、熱
や溶剤による方法では高い費用を要するばかりでなく、
タンパク質の変質による栄養価、生理活性の損失を招く
などの問題があった。

また、タンパク質を精度良く分離精製する方法として、
クロマトグラフィー法、電気泳動法などの手段もあるが
、これらは処理に要する時間や費用などの点で問題があ
る。一方、限外濾過膜による分離、精製法では、熱や溶
剤を必要とせず、また簡便な掻作で短時間で処理できる
など優れた点が多く、すでに工業的に広（用いられつつ
ある。

しかし、従来の限外濾過膜による方法は溶質分子の大小
に基づく分離、精製であり、同程度の大きさのタンパク
質を分離することはできなかった。

近年、限外濾過膜技術を用いて同程度の大きさのタンパ
ク質を分離できるものとして、荷電型限外濾過膜が注目
されている。荷電型限外濾過膜を用いてタンパク質を分
離する方法としては、例えばポリアクリロニトリルを幹
ポリマーとし、荷電基を有するモノマーを光グラフト重
合して合成した、荷電ポリマーを用いて製膜した荷電型
限外濾過膜を用いる方法（Ｉｌ、ＭＩＹＡＭＡ、　）１
．１ＩＯＳＩＤＡ、　Ｙ、Ｎ０５ＡＫＡ１（、ＴＡＮＺ
ＡＷＡ＋　　Ｍｏｋｒｏｍｏｌ　　ｃｈｅｖａ　Ｒａｐ
ｉｄ　　Ｃｏｍｍｕｎ、＋　　ＶＯＬ。

９、　Ｎｏ、２．５７−６１（１９８８））　、芳香族
ポリスルホンに荷電基を導入した荷電ポリマーを用いて
製膜した荷電型限外濾過膜を用いる方法（Ｓ、ＮＡＫＡ
Ｏ，Ｈ，０５ＡＤＡ、　　Ｈ，ＫＵＲＡＴＡ＋　　Ｔ、
ＴＳＵＲＵ、Ｓ、ＫＩＭＵＲＡ＋　　Ｄｅｓａｌｉｎａ
ｔｉｏｎｉｎ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９））などが提案さ
れており、膜に固定された荷電基とタンパク質との電気
的な相互作用により等電点の異るタンパク質を相互に分
離する事に成功している。

これらの方法において用いられている荷電型限外濾過膜
は、親水性のイオン交換基を導入した荷電ポリマーを製
膜して得られるため、一定量以上にイオン交換基を導入
すると水溶性が増し、膜としての形状を維持できなくな
るという問題が未だ残されており、また、これらの荷電
型限外濾過膜は平板形状であるため、濾過を行う際には
膜面における濃度分極を防ぐため特殊な方法を用いてタ
ンパク質溶液を攪拌する必要があるなどの問題があった
。

〔発明が解決しようとする課題］ 本発明は、従来の限外濾過膜においては不可能とされて
いた、同程度の大きさのタンパク質を選択的に分離する
方法について鋭意研究を重ねた結果、芳香族ポリスルホ
ンを素材とする中空糸状限外濾過膜の外表面及び細孔表
面に高密度に荷電基゛を導入し、且つ架橋構造化して得
られる中空糸状の荷電型限外濾過膜を用いてタンパク質
溶液を処理すると、溶液のｐＨの変化に伴なって発生す
るクンバク質の大きさ及び荷電状態の変化により、タン
パク質が膜を通過あるいは阻止されるとの知見を得た。

さらに本発明方法によると、従来の荷電型限外濾過膜に
おいては不可能とされていた高密度に荷電基を有する荷
電型限外濾過膜での処理が可能になる上、中空糸形状の
荷電型限外濾過膜を用いるため、膜面における濃度分極
を防ぐための有効な手段とされている中空糸内側に処理
液を通す内圧循環方式での処理が可能となるとの知見を
得た。この知見に基づき多面的な検討を加えて本発明を
完成するに至ったものである。その目的とするところは
タンパク質を他のタンパク質から選択的に分離する方法
を提供するにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、芳香族ポリスルホンを素材とし、外表面およ
び細孔表面に高密度に荷電基を導入し、且つ架橋構造化
して得られる中空糸状荷電型限外濾過膜を用いて、等電
点の異なる２種以上のタンパク質を含む混合溶液をｐＨ
ｔｌ！整したのち、濾過処理することを特徴とするタン
パク質の選択的分離方法である。

本発明において処理の対象となるタンパク質溶液は等電
点の異なるタンパク質を２種類以上含むもので、タンパ
ク質溶液のＰＨを変化させた際にタンパク質の大きさ及
び荷電状態が変化し、膜の孔及び荷電基との相互作用に
より、溶液のｐＨに等しい等電点を有するクンバク質は
膜を通過し、等電点が溶液のＰＨと隔たっているタンパ
ク質はど膜を通過し難く阻止されるという性質を利用し
て、タンパク質を選択的に分離するものである。

従って、予め濾過処理するタンパク質溶液の組成を把握
し、含まれている各タンパク質の等電点を考慮して溶液
のｐＨ値を決定する。等電点が大きく異なるタンパク質
相互の分離は比較的容易であるが、等電点の接近したタ
ンパク質同志の分離は難かしく、また、溶液中に含まれ
るタンパク質が互いに会合するような場合にはそれらを
分離する事は困難である。

また、圧力、温度などの処理条件は、使用する中空糸状
荷電型限外濾過膜の透水速度、阻止率などの性能や、溶
液の濃度、タンパク質の耐熱性を考慮して選定する。

本発明の方法において特に好適に用いられる中空糸状荷
電型限外濾過膜は、芳香族ポリスルホンを素材とし、そ
の外表面および細孔表面が架橋、および四級アミノ化さ
れている中空糸状荷電型限外濾過膜である。かかる中空
糸状荷電型限外濾過膜は、芳香族ポリスルホンを素材と
する中空糸状限外濾過膜の外表面および細孔表面を、ク
ロロアルキル化すると同時に架橋せしめ、さらに三級ア
ミンを用いて四級アンモニウム塩基を導入して製造され
る。より詳しくは、クロロアルキル化反応が芳香族ポリ
スルホンに対して貧溶媒であるような溶剤中で行われ、
さらにクロロアルキル化反応において架橋反応を伴って
いるものである。そのような溶媒としては、例えば、ｎ
−へキサン、シクロヘキサンなどが用いられ、また、ク
ロロアルキル化剤としてはクロルメチルメチルエーテル
が用いられる。触媒としてはフリーデルタラフト触媒と
して知られているものが用いられるが、好適には無水塩
化第二スズが用いられる。反応液の濃度、反応時間、反
応温度は所望により変えられるが、それにより得られる
荷電型分離膜のイオン交換容量、透水値などの膜の性能
を変化させることができる。さらに、クロロアルキル化
剤との比、あるいは濃度を変えることにより容易に制御
できる。このようにして得られたクロロアルキル化膜を
、次に三級アミン中に浸漬して四級アミノ化する。三級
アミンとしては、例えばトリメチルアミン、トリエチル
アミン等を用いることができる。

また、所望によりアルコール類、例えばメタノール、エ
タノールなどに溶解して用いることもできる。

本発明の方法において用いられる芳香族ポリスルホンは
、クロロアルキル化反応の可能な構造を有するものであ
り、そのような構造を有するものとしては、例えば次の
構造式をもつものを挙げることができる。

式（Ｉ）の構造式を持つもの以外に、次の構造式をもつ
ものも挙げることができる。

〔作　　用〕

本発明の方法によれば、特有構造の中空糸状荷電型限外
濾過膜とｐＨ調整の作用により種々のタンパク質混合液
から目的とするタンパク質を選択的に分離、あるいは濃
縮することができる。そのうえ、適用される中空糸状荷
電型限外濾過膜は外表面および細孔表面が架橋および四
級アミノ化されているため、耐溶剤性、耐熱性、性能安
定性などの点においても優れた性能付与が実現今れる。

しかも、中空糸形状であるため、平板状、スパイラル状
、管状等信の形状の膜に比べて単位容積当りの充填密度
が高く、濾過装置の小型、軽量化を図ることができ、ま
た膜面における濃度分極、ゲル層の生成を防ぐための有
効な手段とされている内圧循環方式での処理が可能とな
る。

以下に、実施例を挙げて本発明の詳細な説明する。なお
、本実施例において用いた中空糸状荷電型分離膜の阻止
率は、次式によって求めた。

実施例１ 式（１）の構造を有するニーデルポリスルホン（ユニオ
ンカーバイド社製）を素材とする中空糸状限外濾過膜（
分画分子量８０，０００）４００ｇ　（乾燥型Ｎ）を、
エタノールおよびｎ−ヘキサンで洗浄した後、ｎ−ヘキ
サン３８００ｄ、クロルメチルメチルエーテル４７．１
２　ｇ、無水塩化第二スズ７６ｇを混合した溶液中に、
室温で２４時間浸漬しクロルメチル化膜とした。これを
エタノールで洗浄した後、トリエチルアミン中に２４時
間浸漬して四級アンモニウム塩基を導入し、中空糸状荷
電型限外濾過膜を得た。

得られた中空糸状荷電型限外濾過膜の純水透過０ 流速は、水温２０°Ｃ１圧力１ｋｇ／ｃＪで８００１　
・ｍ””−ｈ　ｒ−’であった。また、ＥＳＣＡ（Ｅｌ
ｅｃｔｒｏｎ　５ｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ　ｆｏｒ　ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ　＾ｎａｌｙｓｉｓ）分析を行い膜表面
１００人までの元素分析を行った。その結果、膜表面１
００人までのイオン交換容量は１．５　ｍｅｑ／ｇ（ｄ
ｒｙ）となり、膜全体としてのイオン交換容量が０．１
　ｌ１ｌｅｑ／ｇ（ｄｒｙ）であることから、膜外表面
および細孔表面に高密度に荷電基が導入されていること
が確認できた。

このようにして得られた中空糸状荷電型限外濾過膜を用
いて有効膜面積８００ｄの内圧使用型モジュールを作製
した。

１２４００、等電点１０．１　）およびヰ→グロビン（
分子量１７８００、等電点６．８）をそれぞれ１１００
ｐｐづつ含有するリン酸緩衝溶液を、濾過圧（入口／出
口）　０．９　／　０．６　ｋｇ／ｃｍとし、内圧循環
方式のクロスフローにより濾過処理した。溶液のｐＨは
、塩酸およびあるいは水酸化ナトリウム水溶液を用いて
種りのＰＨに調整した。また、同１ 様に荷電を持たない中空糸状限外濾過膜モジューの阻止
率との関係を第１図に示す。ｐＨ領域が６以下において
ミオグロビンの阻止率がチトクロムＣの阻止率を上回り
、またｐＨｐｉ域が７．５以上においてチトクロムＣの
阻止率がミオグロビンの阻止率を上回っており、それぞ
れのｐＨ領域においてチトクロムとミオグロビンを相互
に分離できる事が理解できる。一方、荷電を持たない中
空糸状限外濾過膜においては、チトクロムＣ１ミオグロ
ビン共に低い阻止率であった。

〔発明の効果〕

本発明方法に従うと、等電点の異なるタンパク質を含有
する溶液から、異種成分系のタンパク質を簡単な操作に
よって選択的に分離することができる。そのうえ、適用
される中空糸状荷電型限外濾過膜は、従来の膜に比べて
耐熱性、耐溶剤性に優れており、且つ内圧循環方式での
処理が可能であるから、各種タンパク質の工業的分離方
法とし２ て好適であり、例えば食品、医薬品などの製造工程にお
けるタンパク質の分離、精製などに効果的に応用するこ
とができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はチトクロムＣとミオグロビンを含む濾過原液の
、ｐＨと阻止率の関係を示す図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）芳香族ポリスルホンを素材とし、外表面及び細孔
   表面に高密度に荷電基を導入し、且つ架橋構造化して得
   られる中空糸状荷電型限外濾過膜を用いて、等電点の異
   なる２種以上のタンパク質を含む混合溶液をｐＨ調整し
   たのち、濾過処理することを特徴とするタンパク質の選
   択的分離方法。