JPH03195500A - ヒトパピロマウイルスの検出方法およびそれに用いるオリゴヌクレオチド - Google Patents
ヒトパピロマウイルスの検出方法およびそれに用いるオリゴヌクレオチドInfo
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- JPH03195500A JPH03195500A JP2298710A JP29871090A JPH03195500A JP H03195500 A JPH03195500 A JP H03195500A JP 2298710 A JP2298710 A JP 2298710A JP 29871090 A JP29871090 A JP 29871090A JP H03195500 A JPH03195500 A JP H03195500A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、ヒトパピロマウイルスの検出方法およびそれ
に用いるオリゴヌクレオチドに関する。
に用いるオリゴヌクレオチドに関する。
（従来の技術および発明が解決しようとする課題）ヒト
パピロマウイルス（ＨＰＶ）による肛門生殖路感染は、
現在、性交により伝染する疾患として認められており、
しばしば癌および癌の前駆病変の病原体と関連している
。現在知られている５０種以上のＨＰ Ｖ型のうち、少
なくとも２１種が肛門生殖路感染する。これらの自活膜
性ウィルスは、非常にしばしば良性のコンジロームまた
は潜伏感染を伴う。しかしながら、とりわけ頚部の、前
癌性病変および侵潤性の癌中にＨＰ Ｖが存在すること
は、これらウィルスか腫瘍原となる可能性を反映してい
る［ハウリー（ｐ ＪＪ、Ｈｏｗｌｅｙ）のＩ ｍｐｏ
ｒｔａｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇ
ｙ、 ド０ビタ（Ｄ、Ｔ、ＤｅＶ ｉｔａ、 Ｊ ｒ
、）ら編、リッピンコット（Ｊ、Ｂ、ＬｉｐＰｉｎｃｏ
ｔｔ）、フィラデルフィア、ＰＡ（１９８７）、５５〜
７３頁参照］。
パピロマウイルス（ＨＰＶ）による肛門生殖路感染は、
現在、性交により伝染する疾患として認められており、
しばしば癌および癌の前駆病変の病原体と関連している
。現在知られている５０種以上のＨＰ Ｖ型のうち、少
なくとも２１種が肛門生殖路感染する。これらの自活膜
性ウィルスは、非常にしばしば良性のコンジロームまた
は潜伏感染を伴う。しかしながら、とりわけ頚部の、前
癌性病変および侵潤性の癌中にＨＰ Ｖが存在すること
は、これらウィルスか腫瘍原となる可能性を反映してい
る［ハウリー（ｐ ＪＪ、Ｈｏｗｌｅｙ）のＩ ｍｐｏ
ｒｔａｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇ
ｙ、 ド０ビタ（Ｄ、Ｔ、ＤｅＶ ｉｔａ、 Ｊ ｒ
、）ら編、リッピンコット（Ｊ、Ｂ、ＬｉｐＰｉｎｃｏ
ｔｔ）、フィラデルフィア、ＰＡ（１９８７）、５５〜
７３頁参照］。
ある種のウィルス型、すなわちＨＰＶＩ６および１８、
および程度は低いがＩ−［’Ｖ ３１．３３および３
５は、侵潤性頚部癌およびその転移部位で高比率で見つ
かっている。しかしながら、ＨＰＶ ６や１１などの
肛門生殖路に感染する多く）ＨＰ Ｖは、最も一般的に
は良性コンジローム中で見つかっており、侵潤性の癌で
は希にしか見つかっていない。それゆえ、肛門生殖路中
で検出される）ｆＰＶは、その悪性度に関連して低リス
クウィルス（’ＩＩＰＶ ６および１１）、中間リス
クウィルス（１１１）Ｖ３１．３３および３５）および
高リスクウィルス（１−ＩＰＶ１６および１Ｂ）に大き
く分類することができる［ロリンツ（Ａ、Ｔ、Ｌ、ｏｒ
ｉｎｃｚ）ら、 Ｊ、Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ Ｉ
ｎｓｔ、、７９．６７１（１９８７）］。最近の研究
によると、ＨＰＶ１８は前癌性の病変部では検出されな
かったが、１７％の侵潤性の頚部癌で見つかった。この
ことは、このウィルスが急速な疾患経過と関連している
ことを示唆している［カーマン（Ｒ，Ｊ 、Ｋｕｒｍａ
ｎ）ら、Ａｍ、 Ｊ 、０ｂｓｔｅｔ、Ｇｙｎｅｃｏｌ
、、 ｌ ５９．２９３（１９８８）］。加えて、ＨＰ
ＶＩ８は、ＨＰＶ１６に比べて若年の患者における高度
の腫瘍および転移部位と一層しばしば関連している傾向
があった［バーンズ（Ｗ 、 Ｂ ａｒｎｅｓ）ら、Ｇ
ｙｎｅｃｏｌ 、 Ｏｎｃｏｌ 、 、 ２９．２６
９（１９８Ｂ）］。
および程度は低いがＩ−［’Ｖ ３１．３３および３
５は、侵潤性頚部癌およびその転移部位で高比率で見つ
かっている。しかしながら、ＨＰＶ ６や１１などの
肛門生殖路に感染する多く）ＨＰ Ｖは、最も一般的に
は良性コンジローム中で見つかっており、侵潤性の癌で
は希にしか見つかっていない。それゆえ、肛門生殖路中
で検出される）ｆＰＶは、その悪性度に関連して低リス
クウィルス（’ＩＩＰＶ ６および１１）、中間リス
クウィルス（１１１）Ｖ３１．３３および３５）および
高リスクウィルス（１−ＩＰＶ１６および１Ｂ）に大き
く分類することができる［ロリンツ（Ａ、Ｔ、Ｌ、ｏｒ
ｉｎｃｚ）ら、 Ｊ、Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ Ｉ
ｎｓｔ、、７９．６７１（１９８７）］。最近の研究
によると、ＨＰＶ１８は前癌性の病変部では検出されな
かったが、１７％の侵潤性の頚部癌で見つかった。この
ことは、このウィルスが急速な疾患経過と関連している
ことを示唆している［カーマン（Ｒ，Ｊ 、Ｋｕｒｍａ
ｎ）ら、Ａｍ、 Ｊ 、０ｂｓｔｅｔ、Ｇｙｎｅｃｏｌ
、、 ｌ ５９．２９３（１９８８）］。加えて、ＨＰ
ＶＩ８は、ＨＰＶ１６に比べて若年の患者における高度
の腫瘍および転移部位と一層しばしば関連している傾向
があった［バーンズ（Ｗ 、 Ｂ ａｒｎｅｓ）ら、Ｇ
ｙｎｅｃｏｌ 、 Ｏｎｃｏｌ 、 、 ２９．２６
９（１９８Ｂ）］。
以上の理由から、臨床試料においてＨＰ Ｖを同定し型
分けする方法が必要とされている。破砕ウィルス粒子で
動物を免疫して調製した広交差反応性ポリクローナル抗
血清は、約３０〜７０％の皮膚および粘膜ゆうぜい中の
Ｉ（Ｐ Ｖ抗原を検出し得ることがわかっている。免疫
学的試験は、２つの主要な困難を有する。充分に分化し
た細胞のみが、ウィルス抗原を発現し得るように思われ
る。それゆえ、癌発生部位などの高度の組織異常増殖を
示すＴ−Ｉ Ｐ Ｖ感染組織は、まれにしかＨＰＶ抗原
を含有しない。第二に、そのような試験は特定のウィル
ス型を同定することはできない。
分けする方法が必要とされている。破砕ウィルス粒子で
動物を免疫して調製した広交差反応性ポリクローナル抗
血清は、約３０〜７０％の皮膚および粘膜ゆうぜい中の
Ｉ（Ｐ Ｖ抗原を検出し得ることがわかっている。免疫
学的試験は、２つの主要な困難を有する。充分に分化し
た細胞のみが、ウィルス抗原を発現し得るように思われ
る。それゆえ、癌発生部位などの高度の組織異常増殖を
示すＴ−Ｉ Ｐ Ｖ感染組織は、まれにしかＨＰＶ抗原
を含有しない。第二に、そのような試験は特定のウィル
ス型を同定することはできない。
現在では免疫学的試験をウィルスの型分けに利用ずろこ
とはできないので、臨床試料中のＩ−Ｉ Ｐ ＶＤＮＡ
およびＲＮＡを検出し型分けするために分子ハイブリッ
ド形成法が用いられている［ロリンツの０ｂｓＬｅｔｒ
ｉｃｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏｌ、Ｃ１１ｎｉｃｓ ｏ
ｆＮ、Ａｍｅｒ、ｌ ４．４５１（＋９８７）参照］。
とはできないので、臨床試料中のＩ−Ｉ Ｐ ＶＤＮＡ
およびＲＮＡを検出し型分けするために分子ハイブリッ
ド形成法が用いられている［ロリンツの０ｂｓＬｅｔｒ
ｉｃｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏｌ、Ｃ１１ｎｉｃｓ ｏ
ｆＮ、Ａｍｅｒ、ｌ ４．４５１（＋９８７）参照］。
これらの方法の多くは、ウィルスゲノムの既知領域に相
捕的であり、従って該領域と結合することのできる標識
−末鎖ＤＮＡプローブを用いている３サザーンブロツテ
イング法では、ウィルスＤＮＡを溶解細胞から単離し、
精製し、制限酵素で消化することにより既知分子量の断
片に破砕する。これら断片を変性させ、ゲル電気泳動で
物理的に分離する。ついで、これら一本鎖断片を標識Ｈ
Ｐ Ｖプローブの混合物と接触させるか（感染を診断す
るため）、またはＨＰ Ｖ型持異的プローブのパネルと
接触させる。プローブと反応したＨＰＶ断片は、結合し
ている標識を検出することにより同定することができる
。
捕的であり、従って該領域と結合することのできる標識
−末鎖ＤＮＡプローブを用いている３サザーンブロツテ
イング法では、ウィルスＤＮＡを溶解細胞から単離し、
精製し、制限酵素で消化することにより既知分子量の断
片に破砕する。これら断片を変性させ、ゲル電気泳動で
物理的に分離する。ついで、これら一本鎖断片を標識Ｈ
Ｐ Ｖプローブの混合物と接触させるか（感染を診断す
るため）、またはＨＰ Ｖ型持異的プローブのパネルと
接触させる。プローブと反応したＨＰＶ断片は、結合し
ている標識を検出することにより同定することができる
。
相同ＤＮＡ配列を検出するためにそのような分子ハイブ
リッド形成法を用いることは感度がよく、特定のＨＰ
Ｖ型にのみ認められる核酸配列と結合するプローブを用
いた場合には高度に特異的となり得る。しかしながら、
ウィルスＤＮＡの単離精製に要する工程は技術的に厄介
であり、所定の臨床試料中の全ウィルスＤＮＡの濃度は
試験感度の限界を下回っているかもしれない。たとえば
、異形酸類部病変では、ウィルスＤＮＡの虫は異形成が
増大するにつれて減少する。インシヂュ（ｉｎ ５ｉｔ
ｕ）ＲＮＡプローブは頚部偏平上皮細胞癌中のＨＰＶを
検出および型分けすることができるが、結合したプロー
ブを検出するためのオートラジオグラフィーが４週間か
かる。
リッド形成法を用いることは感度がよく、特定のＨＰ
Ｖ型にのみ認められる核酸配列と結合するプローブを用
いた場合には高度に特異的となり得る。しかしながら、
ウィルスＤＮＡの単離精製に要する工程は技術的に厄介
であり、所定の臨床試料中の全ウィルスＤＮＡの濃度は
試験感度の限界を下回っているかもしれない。たとえば
、異形酸類部病変では、ウィルスＤＮＡの虫は異形成が
増大するにつれて減少する。インシヂュ（ｉｎ ５ｉｔ
ｕ）ＲＮＡプローブは頚部偏平上皮細胞癌中のＨＰＶを
検出および型分けすることができるが、結合したプロー
ブを検出するためのオートラジオグラフィーが４週間か
かる。
この問題を回避するため、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）法を用いてウィルスＤＮＡ配列を増幅し、得られた
生成物はサザーンブロツティングなどのウィルス型同定
のための通常のハイブリダイゼーション法を用いて同定
することができる［オスト（Ｃ，０ｓｔｅ）のＢ １ｏ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、 ６．１６３（１９８８）お
よびマリス（Ｋ、Ｉ３．Ｍｕｌｌｉｓ）の米国特許第４
．６８３，２０２号明細書参照］。ＨＰ Ｖゲノムの目
的領域の５゛末端に相捕的なヌクレオチドストレッヂお
よび該領域の３゛末端に相捕的な第二のヌクレオヂドス
トレッチをまず合成する。これらのオリゴヌクレオチド
は「プライマー」と称する。これらの増幅プライマーを
臨床試料中の全変性細胞ＤＮＡとアニールさせたとき、
もしそのようなりＮＡが存在するならば該−重鎖Ｈｒ’
ＶＤＮＡと二本鎖を形成するであろう。ＤＮＡポリメラ
ーゼおよびデオキシヌクレオチド三リン酸混合物が存在
するなら、各鎖は第１図に示すように伸長していくであ
ろう。このような変性、プライマーのアニーリングおよ
び鎖伸長のサイクルが繰り返されると、Ｉ−ＴＰＶＤＮ
Ａの目的領域は指数関数的に蓄積してゆき、３０サイク
ル後には約１１ｉ＋のＩ）ＮＡとなるであろう。この生
成物はアガロースゲル上で容易に目で見ることができ、
それゆえ、その組織にはＨＰ Ｖ配列が存在したことが
示唆される。この診断は、該ＤＮＡをニトロセルロース
に移し、存在していると思われるＨＰＶ型に特異的なプ
ローブを用いてプローブすることにより確認することが
できる。
Ｒ）法を用いてウィルスＤＮＡ配列を増幅し、得られた
生成物はサザーンブロツティングなどのウィルス型同定
のための通常のハイブリダイゼーション法を用いて同定
することができる［オスト（Ｃ，０ｓｔｅ）のＢ １ｏ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、 ６．１６３（１９８８）お
よびマリス（Ｋ、Ｉ３．Ｍｕｌｌｉｓ）の米国特許第４
．６８３，２０２号明細書参照］。ＨＰ Ｖゲノムの目
的領域の５゛末端に相捕的なヌクレオチドストレッヂお
よび該領域の３゛末端に相捕的な第二のヌクレオヂドス
トレッチをまず合成する。これらのオリゴヌクレオチド
は「プライマー」と称する。これらの増幅プライマーを
臨床試料中の全変性細胞ＤＮＡとアニールさせたとき、
もしそのようなりＮＡが存在するならば該−重鎖Ｈｒ’
ＶＤＮＡと二本鎖を形成するであろう。ＤＮＡポリメラ
ーゼおよびデオキシヌクレオチド三リン酸混合物が存在
するなら、各鎖は第１図に示すように伸長していくであ
ろう。このような変性、プライマーのアニーリングおよ
び鎖伸長のサイクルが繰り返されると、Ｉ−ＴＰＶＤＮ
Ａの目的領域は指数関数的に蓄積してゆき、３０サイク
ル後には約１１ｉ＋のＩ）ＮＡとなるであろう。この生
成物はアガロースゲル上で容易に目で見ることができ、
それゆえ、その組織にはＨＰ Ｖ配列が存在したことが
示唆される。この診断は、該ＤＮＡをニトロセルロース
に移し、存在していると思われるＨＰＶ型に特異的なプ
ローブを用いてプローブすることにより確認することが
できる。
別法として、ＨＰＶＤＮＡ内の既知の制限酵素部位を利
用して、１種または２種以上の制限エンドヌクレアーゼ
により生じた開裂パターンを調べることにより、増幅後
のＤＮＡが期待される配列を含んでいるかどうかを示す
ことができる。増幅された配列の信頼性を確認すること
は、２つの理由から必要である。すなわち、（ｉ）増幅
プライマーに相捕的な配列が、ＨＰＶ ＤＮＡを含まな
い細胞ＤＮＡ中にたまたま存在することがないことを確
実にするため、および（ｉｉ）ＨＰ Ｖ型を確認するた
めである。もしも増幅用に選択した配列が）−Ｉ Ｉ）
Ｖ型間で保存されているものであるならば、増幅生成
物の発見は特定のＨＰ Ｖ型を意味することにはならな
い。また、２つのプライマーの結合部位に基づいて増幅
生成物のサイズを予測することら可能である。それゆえ
、そのような生成物が発見されたときは、ＨＩ） Ｖが
存在するということを正当に確信することができる。し
かしながら、２つの異なるＩＩ Ｐ Ｖ型が同じサイズ
の生成物を与えるからしれず、また所定のＩＩ Ｐ Ｖ
の亜型が異なるサイズの生成物を与えろかもしれない。
用して、１種または２種以上の制限エンドヌクレアーゼ
により生じた開裂パターンを調べることにより、増幅後
のＤＮＡが期待される配列を含んでいるかどうかを示す
ことができる。増幅された配列の信頼性を確認すること
は、２つの理由から必要である。すなわち、（ｉ）増幅
プライマーに相捕的な配列が、ＨＰＶ ＤＮＡを含まな
い細胞ＤＮＡ中にたまたま存在することがないことを確
実にするため、および（ｉｉ）ＨＰ Ｖ型を確認するた
めである。もしも増幅用に選択した配列が）−Ｉ Ｉ）
Ｖ型間で保存されているものであるならば、増幅生成
物の発見は特定のＨＰ Ｖ型を意味することにはならな
い。また、２つのプライマーの結合部位に基づいて増幅
生成物のサイズを予測することら可能である。それゆえ
、そのような生成物が発見されたときは、ＨＩ） Ｖが
存在するということを正当に確信することができる。し
かしながら、２つの異なるＩＩ Ｐ Ｖ型が同じサイズ
の生成物を与えるからしれず、また所定のＩＩ Ｐ Ｖ
の亜型が異なるサイズの生成物を与えろかもしれない。
それゆえ、結果の解釈をそのまま採用することができる
という確信が得られるまで、増幅配列の同一性を確認す
るためハイブリダイゼーシヨンを用いるべきである。ゲ
ノムのごく一部しか分析されていないので、［普遍的（
ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）ｊプライマーの不在下では、ＰＣ
Ｒ法は密接に関連した配列、または型特異的な配列しか
同定できないことを指摘しておかなければならない。
という確信が得られるまで、増幅配列の同一性を確認す
るためハイブリダイゼーシヨンを用いるべきである。ゲ
ノムのごく一部しか分析されていないので、［普遍的（
ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）ｊプライマーの不在下では、ＰＣ
Ｒ法は密接に関連した配列、または型特異的な配列しか
同定できないことを指摘しておかなければならない。
ＰＣＲ法の利点は、（ｉ）試料中のＤＮＡの検出を該Ｄ
ＮＡを抽出せずに行えること、および（ｉｉ）病変中に
存在するＤＮＡを増幅することにより感度が増大するこ
とである。ＰＣＲ法によりＨＰ ＶＤＮＡ配列を増幅し
た後に分子ハイブリッド形成を行うことは、適度のレベ
ルの増幅後にＨＰ ＶＤＮＡの単一分子または「コピー
」を理論的には検出することができるという点で最も感
度の良い方法である。実際には、感度レベルは試料当た
り約５０〜１００コピーである。つぎに感度の良い方法
はドツトブロッティング法であり、この方法は約１０，
０００分子を検出することができ、またザザーンブロッ
ティング法はＤＮＡの約１００゜０００コピーを信頼性
をもって検出することができる。
ＮＡを抽出せずに行えること、および（ｉｉ）病変中に
存在するＤＮＡを増幅することにより感度が増大するこ
とである。ＰＣＲ法によりＨＰ ＶＤＮＡ配列を増幅し
た後に分子ハイブリッド形成を行うことは、適度のレベ
ルの増幅後にＨＰ ＶＤＮＡの単一分子または「コピー
」を理論的には検出することができるという点で最も感
度の良い方法である。実際には、感度レベルは試料当た
り約５０〜１００コピーである。つぎに感度の良い方法
はドツトブロッティング法であり、この方法は約１０，
０００分子を検出することができ、またザザーンブロッ
ティング法はＤＮＡの約１００゜０００コピーを信頼性
をもって検出することができる。
にもかかわらず、ＰＣＲ法は新鮮な臨床試料中のＨＰＶ
の検出に用いられており［ヤング（Ｌ、、Ｓ。
の検出に用いられており［ヤング（Ｌ、、Ｓ。
Ｙ ｏｕｎｇ）ら、Ｂ ｒｉｔ、Ｍｅｄ、 Ｊ 、 、
２９８．１４（１９８９）］、またホルマリン固定し
パラフィン包埋した頚部上皮的組織異常増殖および侵潤
性層の切片中のＨＰＶ配列の検出にも適用されてきてい
る。
２９８．１４（１９８９）］、またホルマリン固定し
パラフィン包埋した頚部上皮的組織異常増殖および侵潤
性層の切片中のＨＰＶ配列の検出にも適用されてきてい
る。
ＨＰＶ配列は、固定組織中で４０年にもわたって検出さ
れてきた［シバタ（Ｄ 、 Ｓ ｈｉｂａｔａ）ら、Ｃ
ａｎｃｅｒＲｅｓ、、４Ｂ、４５６６（１９８８）］。
れてきた［シバタ（Ｄ 、 Ｓ ｈｉｂａｔａ）ら、Ｃ
ａｎｃｅｒＲｅｓ、、４Ｂ、４５６６（１９８８）］。
明らかな欠点は、試料の交差汚染（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｎ
ｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）または増幅物質による試料の汚
染により偽陽性の結果の生じる可能性があることである
。
ｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）または増幅物質による試料の汚
染により偽陽性の結果の生じる可能性があることである
。
ウィルス型特異的プライマーは、ＨＰＶｌｌ、１６およ
び１８配列の増幅に用いられている［シバタら、Ｊ 、
Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、 ｌ ６７．２２５（１９８８）１
゜しかしながら、肛門生殖路に感染する各ウィルス型か
らのＤＮＡを増幅するために多数のプライマーが必要で
あるため、診断または臨床試料中のＩＩ Ｐ Ｖの型分
けのためにはＰ ＣＩＩ法は実用的でない。また、現在
のところ型分けされていないＩＩ Ｐ Ｖ株をＰＣｒＬ
法により検出することができるかどうかは、すべてのｔ
Ｉ Ｐ Ｖ型の間で保存されている領域を検出すること
のできる普遍的な一対のプライマーが存在するかどうか
にかかっている。
び１８配列の増幅に用いられている［シバタら、Ｊ 、
Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、 ｌ ６７．２２５（１９８８）１
゜しかしながら、肛門生殖路に感染する各ウィルス型か
らのＤＮＡを増幅するために多数のプライマーが必要で
あるため、診断または臨床試料中のＩＩ Ｐ Ｖの型分
けのためにはＰ ＣＩＩ法は実用的でない。また、現在
のところ型分けされていないＩＩ Ｐ Ｖ株をＰＣｒＬ
法により検出することができるかどうかは、すべてのｔ
Ｉ Ｐ Ｖ型の間で保存されている領域を検出すること
のできる普遍的な一対のプライマーが存在するかどうか
にかかっている。
それゆえ、１セツトの「普遍的な」プライマーのみを用
いた、肛門生殖路に感染する多数のＨＰＶからのＤＮＡ
の増幅方法が必要とされている。ついで、各ウィルス型
に特異的な増幅領域中の配列に相補的なオリゴヌクレオ
ヂドブローブを用いた分子ハイブリッド形成法により、
所定のウィルス型を同定することができる。
いた、肛門生殖路に感染する多数のＨＰＶからのＤＮＡ
の増幅方法が必要とされている。ついで、各ウィルス型
に特異的な増幅領域中の配列に相補的なオリゴヌクレオ
ヂドブローブを用いた分子ハイブリッド形成法により、
所定のウィルス型を同定することができる。
（課題を解決するための手段）
本発明は、ＰＣＲ法において縦一列に用いたときに増幅
プライマーとして働く２種のオリゴヌクレオヂドに関す
る。これら２種のプライマー（略号「！Ｕ」およびｒｌ
ＷＤＯＪで表す）は下記式：： ％式％ ： （式中、Ｎ、はＡまたはＧ、ＮｔはＣまたは’ｒ、Ｎ３
はＡまたはＴである）で示される。１０およびＩＷ、Ｄ
Ｏ中の成分ヌクレオチドは、対応ヌクレオチド塩基に対
して単一のアルファベットコードで表してあり、Ａはア
デニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、およびＴはチミ
ンであり、またＩはデオキシイノシン−５−０−ホスフ
ェートである。このデオキシイノシン残基はいずれの塩
基ともペアを形成することができ、それゆえ二本鎖を安
定化させる。上記式に示すように、ＩＵおよびＩＷＤＯ
の構造は、それぞれヌクレオチドＴまたはＮ。
プライマーとして働く２種のオリゴヌクレオヂドに関す
る。これら２種のプライマー（略号「！Ｕ」およびｒｌ
ＷＤＯＪで表す）は下記式：： ％式％ ： （式中、Ｎ、はＡまたはＧ、ＮｔはＣまたは’ｒ、Ｎ３
はＡまたはＴである）で示される。１０およびＩＷ、Ｄ
Ｏ中の成分ヌクレオチドは、対応ヌクレオチド塩基に対
して単一のアルファベットコードで表してあり、Ａはア
デニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、およびＴはチミ
ンであり、またＩはデオキシイノシン−５−０−ホスフ
ェートである。このデオキシイノシン残基はいずれの塩
基ともペアを形成することができ、それゆえ二本鎖を安
定化させる。上記式に示すように、ＩＵおよびＩＷＤＯ
の構造は、それぞれヌクレオチドＴまたはＮ。
のデオキシリボース環上の５゛−ヒドロキシメチル基か
ら３°−ヒドロキシ基の方に向かって読み取られ、また
３゛−ヒドロキシ基は隣接するヌクレオチド糖残基上の
５°−ヒドロキシメチル基とリン酸結合で連結している
。
ら３°−ヒドロキシ基の方に向かって読み取られ、また
３゛−ヒドロキシ基は隣接するヌクレオチド糖残基上の
５°−ヒドロキシメチル基とリン酸結合で連結している
。
Ｎ１、Ｎ、およびＮ３で表されろ部位で変動が許されて
いるので、本発明のプライマーの好ましい態様は、個々
の可能なオリゴヌクレオチドのほぼ等モル量の混合物で
ある。たとえば、実際上、それぞれ一定の配列を有する
８種のオリゴヌクレオチドのほぼ等モル量の混合物とし
て調製および使用され、ＩＷＤＯは１６種のヌクレオチ
ドの混合物として調製および使用される。しかしながら
、これら個々のオリゴヌクレオチドのいずれもそれ自体
でＨＰＶＰＲｃプライマーとして有用であることか期待
され、いずれの場合もＩＵまたはＩＷＤＯの成分として
有用である。それゆえ、式１０およびＩＷＤＯの範囲内
に含まれるオリゴヌクレオチドはいずれも本発明の範囲
内に包含されるものである。
いるので、本発明のプライマーの好ましい態様は、個々
の可能なオリゴヌクレオチドのほぼ等モル量の混合物で
ある。たとえば、実際上、それぞれ一定の配列を有する
８種のオリゴヌクレオチドのほぼ等モル量の混合物とし
て調製および使用され、ＩＷＤＯは１６種のヌクレオチ
ドの混合物として調製および使用される。しかしながら
、これら個々のオリゴヌクレオチドのいずれもそれ自体
でＨＰＶＰＲｃプライマーとして有用であることか期待
され、いずれの場合もＩＵまたはＩＷＤＯの成分として
有用である。それゆえ、式１０およびＩＷＤＯの範囲内
に含まれるオリゴヌクレオチドはいずれも本発明の範囲
内に包含されるものである。
本発明の「コンセンサス配列」プライマーはＨＰＶのＥ
Ｉ ＯＲＦの５゛半分中のＤＮＡ配列に相補的であり
、広範囲のヒトおよび動物パピロマウイルスＤＮＡとア
ニールする。本発明のコンセンサスプライマーは、ＨＰ
Ｖ ６．１１．１６．１８および３３ＤＮＡの増幅に
用いられており、通常のハイブリダイゼーション法によ
り検出可能な債を生成することができる。加えて、本発
明のプライマーを用い、配列がまだ知られていないヒト
および動物両方の皮膚および粘膜のウィルスＤＮＡのゲ
ノムを検出可能な量まで増幅することができた。臨床試
料中のウィルスゲノムもまた本発明のプライマーを用い
て増幅することが可能で、トＩＰＶ感染の総合アッセイ
が可能である。
Ｉ ＯＲＦの５゛半分中のＤＮＡ配列に相補的であり
、広範囲のヒトおよび動物パピロマウイルスＤＮＡとア
ニールする。本発明のコンセンサスプライマーは、ＨＰ
Ｖ ６．１１．１６．１８および３３ＤＮＡの増幅に
用いられており、通常のハイブリダイゼーション法によ
り検出可能な債を生成することができる。加えて、本発
明のプライマーを用い、配列がまだ知られていないヒト
および動物両方の皮膚および粘膜のウィルスＤＮＡのゲ
ノムを検出可能な量まで増幅することができた。臨床試
料中のウィルスゲノムもまた本発明のプライマーを用い
て増幅することが可能で、トＩＰＶ感染の総合アッセイ
が可能である。
それゆえ、縦一列に用いた場合に、プライマーＩＵおよ
びＩＷＤＯは、生理学的試料中のＨＰＶ感染の診断法で
あって、 （ａ）該試料中の二本鎖ＨＰＶＤＮＡを変性して第一の
一本鎖ＨＰＶ ＤＮＡおよび第二の一本鎖１−ＩＰＶ
ＤＮＡを生成し、 （ｂ）該第一の一本鎖ＨＰＶ ＤＮＡをモル過剰のオリ
ゴデオキシヌクレオチドプライマーＩＵ（該第一の鎖に
対する相補領域）と反応させ、該第二の一本鎖１ＰＶＤ
ＮＡをモル過剰のオリゴデオキシヌクレオチドプライマ
ーＩＷＤＯ（該第二の鎖に対する相補領域）と反応させ
、その際の反応条件を、各プライマーが各相補領域とア
ニールし、かつ各プライマーがアニールしている鎖に相
補的な各プライマーの伸長生成物が合成されるようなも
のとし、 （ｃ）その上にプライマー伸長生成物が合成されている
鎖から該プライマー伸長生成物を分離して一本鎖分子を
生成し、ついで （ｄ）工程（ｃ）で生成した一本鎖分子を工程（ｂ）の
２種のプライマーとプライマー（相補領域）のモル過剰
にて反応させ、その際の反応条件を、各一本鎖分子を鋳
型として用いて各プライマーの伸長生成物が合成される
ようなものとする ことを特徴とする方法を提供する。
びＩＷＤＯは、生理学的試料中のＨＰＶ感染の診断法で
あって、 （ａ）該試料中の二本鎖ＨＰＶＤＮＡを変性して第一の
一本鎖ＨＰＶ ＤＮＡおよび第二の一本鎖１−ＩＰＶ
ＤＮＡを生成し、 （ｂ）該第一の一本鎖ＨＰＶ ＤＮＡをモル過剰のオリ
ゴデオキシヌクレオチドプライマーＩＵ（該第一の鎖に
対する相補領域）と反応させ、該第二の一本鎖１ＰＶＤ
ＮＡをモル過剰のオリゴデオキシヌクレオチドプライマ
ーＩＷＤＯ（該第二の鎖に対する相補領域）と反応させ
、その際の反応条件を、各プライマーが各相補領域とア
ニールし、かつ各プライマーがアニールしている鎖に相
補的な各プライマーの伸長生成物が合成されるようなも
のとし、 （ｃ）その上にプライマー伸長生成物が合成されている
鎖から該プライマー伸長生成物を分離して一本鎖分子を
生成し、ついで （ｄ）工程（ｃ）で生成した一本鎖分子を工程（ｂ）の
２種のプライマーとプライマー（相補領域）のモル過剰
にて反応させ、その際の反応条件を、各一本鎖分子を鋳
型として用いて各プライマーの伸長生成物が合成される
ようなものとする ことを特徴とする方法を提供する。
好ましくは、工程（ｃ）〜（ｄ）は少なくとも１回、さ
らに好ましくは約１０〜５０回繰り返して、２つのプラ
イマーの結合部位と重複しかつ該結合部位の間にある二
本ＩＨＰＶＤＮＡに対応するＤＮＡ配列を検出可能な量
まで合成せしめる。。ついで、この合成二本鎖ＨＰＶ
ＤＮＡを標識し、変性し、相補的な一本！！’ｌＤＮＡ
からなるプローブとの結合能についてアッセイする。別
法としては、標識していない増幅ＨＰＶ ＤＮＡを変性
し、既知の配列を有する標識プローブと反応させること
もできる。いずれの場合も、合成一本鎖ＨＰ ＶＤＮＡ
へのプローブのハイブリダイゼーションにより標識を含
む二本鎖ＨＰＶ ＤＮＡ分子が生成し、標識の検出によ
り臨床試料中のＨＰＶの存在を確認することができる。
らに好ましくは約１０〜５０回繰り返して、２つのプラ
イマーの結合部位と重複しかつ該結合部位の間にある二
本ＩＨＰＶＤＮＡに対応するＤＮＡ配列を検出可能な量
まで合成せしめる。。ついで、この合成二本鎖ＨＰＶ
ＤＮＡを標識し、変性し、相補的な一本！！’ｌＤＮＡ
からなるプローブとの結合能についてアッセイする。別
法としては、標識していない増幅ＨＰＶ ＤＮＡを変性
し、既知の配列を有する標識プローブと反応させること
もできる。いずれの場合も、合成一本鎖ＨＰ ＶＤＮＡ
へのプローブのハイブリダイゼーションにより標識を含
む二本鎖ＨＰＶ ＤＮＡ分子が生成し、標識の検出によ
り臨床試料中のＨＰＶの存在を確認することができる。
本明細書において「標識」とは、放射性同位元素や酵素
などの直接検出可能な標識、および検出可能な標識の結
合部位（たとえば、ビオチン化酵素に結合することので
きるアビジン分子など）などの間接的に検出可能な標識
の両方を含む。好ましくは、合成二本鎖ＨＰＶＤＮＡは
開裂部位を含んでいるであろうから、変性する前に１種
または２種以上の制限エンドヌクレアーゼで断片化する
こともできる。変性後、これら断片をクロマトグラフィ
ー法により分離し、既知の配列を有する検出可能な一重
鎖プローブを用いて個々の断片を同定する。型特異的プ
ローブは、たとえば、ヨーロッパ特許出願公開３０１９
６８号明細書およびクラバドール（Ａ 、 Ｃｒａｖａ
ｄ。
などの直接検出可能な標識、および検出可能な標識の結
合部位（たとえば、ビオチン化酵素に結合することので
きるアビジン分子など）などの間接的に検出可能な標識
の両方を含む。好ましくは、合成二本鎖ＨＰＶＤＮＡは
開裂部位を含んでいるであろうから、変性する前に１種
または２種以上の制限エンドヌクレアーゼで断片化する
こともできる。変性後、これら断片をクロマトグラフィ
ー法により分離し、既知の配列を有する検出可能な一重
鎖プローブを用いて個々の断片を同定する。型特異的プ
ローブは、たとえば、ヨーロッパ特許出願公開３０１９
６８号明細書およびクラバドール（Ａ 、 Ｃｒａｖａ
ｄ。
「）らのＭｏ１ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅ１ｌｕｌａ
ｒ Ｐｒｏｂｅｓ、 ３、＋４３（１９８９）に開示
されている（該文献を参考のため本明細書中に引用する
）。らちろん、そのようなプローブはＩＵの代わりにＩ
ＷＤＯとともに用いて型特異的増幅およびＩ−Ｉ Ｐ
Ｖ株の同定を行うこともできる。
ｒ Ｐｒｏｂｅｓ、 ３、＋４３（１９８９）に開示
されている（該文献を参考のため本明細書中に引用する
）。らちろん、そのようなプローブはＩＵの代わりにＩ
ＷＤＯとともに用いて型特異的増幅およびＩ−Ｉ Ｐ
Ｖ株の同定を行うこともできる。
他の態様において、本発明は、ＨＰ Ｖに感染している
と思われる試料中のＨＰＶ ＤＮＡの検出用診断キット
に関し、該キットは、包装形態のマルチコンテナーユニ
ットからなり、該マルチコンテナーユニットは、 （ａ） Ｉ ＵおよびＩＷＤＯの各プライマーのそれぞ
れ１つのコンテナー（各プライマーはＨＰＶ ＤＮＡ鎖
に実質的に相補的であり、一方のプライマーから合成し
た伸長生成物はその相補体から分離したときに他のプラ
イマーの伸長生成物の合成のための鋳型として働く）； （ｂ）ヌクレオチド三リン酸の重合剤を入れたコンテナ
ー： （ｃ）４種の異なるヌクレオチド三リン酸のそれぞれ■
つのコンテナー； （ｄ）該試料中の該ＤＮＡの存在を検出し得るプローブ
などの手段を入れたコンテナー：および任意に （ｅ）該プローブと該配列とのハイブリッドを検出する
ための手段を入れたコンテナー を有する。
と思われる試料中のＨＰＶ ＤＮＡの検出用診断キット
に関し、該キットは、包装形態のマルチコンテナーユニ
ットからなり、該マルチコンテナーユニットは、 （ａ） Ｉ ＵおよびＩＷＤＯの各プライマーのそれぞ
れ１つのコンテナー（各プライマーはＨＰＶ ＤＮＡ鎖
に実質的に相補的であり、一方のプライマーから合成し
た伸長生成物はその相補体から分離したときに他のプラ
イマーの伸長生成物の合成のための鋳型として働く）； （ｂ）ヌクレオチド三リン酸の重合剤を入れたコンテナ
ー： （ｃ）４種の異なるヌクレオチド三リン酸のそれぞれ■
つのコンテナー； （ｄ）該試料中の該ＤＮＡの存在を検出し得るプローブ
などの手段を入れたコンテナー：および任意に （ｅ）該プローブと該配列とのハイブリッドを検出する
ための手段を入れたコンテナー を有する。
本発明はまた、Ｅｌオープンリーディングフレーム（Ｏ
ＲＦ）の一部に対応するＨＰＶゲノムのセグメントを合
成する方法をも提供する。このＤＮＡ断片は、配列決定
をし従来は未知であったＨＰＶ型を特徴付けることがで
きる。この領域からの知られたＤＮＡを比較的多量に合
成することは、免疫学的研究材料（たとえば、サブユニ
ットワクチンまたはＨＰＶに対するモノクローナル抗体
の調製）を提供するために有用である。下記第Ａ表には
、ＰＣＲ法においてＩＵおよびＩＷＤＯを用いて合成す
ることができる代表的なりＮＡ配列をまとめて示す。
ＲＦ）の一部に対応するＨＰＶゲノムのセグメントを合
成する方法をも提供する。このＤＮＡ断片は、配列決定
をし従来は未知であったＨＰＶ型を特徴付けることがで
きる。この領域からの知られたＤＮＡを比較的多量に合
成することは、免疫学的研究材料（たとえば、サブユニ
ットワクチンまたはＨＰＶに対するモノクローナル抗体
の調製）を提供するために有用である。下記第Ａ表には
、ＰＣＲ法においてＩＵおよびＩＷＤＯを用いて合成す
ることができる代表的なりＮＡ配列をまとめて示す。
第Ａ表（１−Ｉ Ｐ ＶのＥＩ ０ＲＦ（ａ）中での
プライマーＩＵおよびＩＷＤＯの最初のアニーリング部
位のヌクレオヂド位置） ウィルス型 ＩＵ ＩＷＤＯ配列データ１
−ＩＰＶＩａ １０１９（９０Ｘｂ） １７７８
（１００）（ｂ） ＩＨＰ Ｖ ５
１１８０（８６） １９０９（
１００） ２ＨＰ Ｖ ６
ｂ １０６６（８６）
１９１２（１００） ３ＨＰ
Ｖ ８ １１６４（８６）
１８９Ｇ（１００）
４ＨＰ Ｖ Ｉ Ｉ １１６６（８６） １９
１２（１００） ５ＨＰ Ｖ １６ １１１１
（８６） １９４２（１００） ６ＨＰ Ｖ
１８ １１６７（９０） ２０１２（１００）
７ＨＰ Ｖ ３３ １１２２（７７）
１９３５（１００） ８（注Ｘａ）：第２図参照
。ＨＰＶ−６ｂＥ１ ０ＲＦは、ヌクレオチド７１５〜
２２７８を包含する。
プライマーＩＵおよびＩＷＤＯの最初のアニーリング部
位のヌクレオヂド位置） ウィルス型 ＩＵ ＩＷＤＯ配列データ１
−ＩＰＶＩａ １０１９（９０Ｘｂ） １７７８
（１００）（ｂ） ＩＨＰ Ｖ ５
１１８０（８６） １９０９（
１００） ２ＨＰ Ｖ ６
ｂ １０６６（８６）
１９１２（１００） ３ＨＰ
Ｖ ８ １１６４（８６）
１８９Ｇ（１００）
４ＨＰ Ｖ Ｉ Ｉ １１６６（８６） １９
１２（１００） ５ＨＰ Ｖ １６ １１１１
（８６） １９４２（１００） ６ＨＰ Ｖ
１８ １１６７（９０） ２０１２（１００）
７ＨＰ Ｖ ３３ １１２２（７７）
１９３５（１００） ８（注Ｘａ）：第２図参照
。ＨＰＶ−６ｂＥ１ ０ＲＦは、ヌクレオチド７１５〜
２２７８を包含する。
（ｂ）：相同性の％
Ｉ：ヂャド（Ａ 、 Ｌ 、 Ｃｈａｄ）ら、Ｖ ｉｒ
ｏｌｏｇｙＳｌ １８．２５４（１９Ｂ２）；ダノ（Ｑ
、 Ｄ ａｎｏｓ）ら、ＥＭＢＯＪ、、ｌ、２３１（
１９８２） ２：ザチョウ（Ｋ 、ｌ（、Ｚ ａｃｈｏｗ）ら、Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙｓ １５８．２５１（１９８７） ３：シュバルツ（Ｅ 、 Ｓ ｃｈｗａｒｚ）ら、ＥＭ
ＢＯＪ、。
ｏｌｏｇｙＳｌ １８．２５４（１９Ｂ２）；ダノ（Ｑ
、 Ｄ ａｎｏｓ）ら、ＥＭＢＯＪ、、ｌ、２３１（
１９８２） ２：ザチョウ（Ｋ 、ｌ（、Ｚ ａｃｈｏｗ）ら、Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙｓ １５８．２５１（１９８７） ３：シュバルツ（Ｅ 、 Ｓ ｃｈｗａｒｚ）ら、ＥＭ
ＢＯＪ、。
２．２３４１（＋ ９８３）
４：フックス（Ｐ 、 Ｇ 、 Ｆ ｕｃｈｓ）ら、Ｊ
、Ｖ １ｒｏ１．、５８．６２６（＋９８６） ５：ダートマン（Ｋ 、 Ｄ ａｒｔｍａｎ）ら、Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ％１５１．１２４（１９８６） ６：ベーカー（Ｃ，Ｃ，Ｂａｋｅｒ）ら、Ｊ 、Ｖ １
ｒｏ１．、６１．９６２（１９８７）；チャドら、同上 ７：コール（Ｓ、Ｔ、Ｃｏ１ｅ）ら、Ｊ 、Ｍｏ１．
Ｂ ｉｏｌ、、 １９３．５９９（１９８７） ８：コールら、Ｊ 、Ｖ １ｒｏ１．、５８．９９１（
１９８６） 一般に本発明の方法は、ＰＣＲ法を用い、使用した反応
工程数に関する指数関数量にて、少なくとも一つの特定
ＨＰＶ ＤＮＡ配列を製造する。
、Ｖ １ｒｏ１．、５８．６２６（＋９８６） ５：ダートマン（Ｋ 、 Ｄ ａｒｔｍａｎ）ら、Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ％１５１．１２４（１９８６） ６：ベーカー（Ｃ，Ｃ，Ｂａｋｅｒ）ら、Ｊ 、Ｖ １
ｒｏ１．、６１．９６２（１９８７）；チャドら、同上 ７：コール（Ｓ、Ｔ、Ｃｏ１ｅ）ら、Ｊ 、Ｍｏ１．
Ｂ ｉｏｌ、、 １９３．５９９（１９８７） ８：コールら、Ｊ 、Ｖ １ｒｏ１．、５８．９９１（
１９８６） 一般に本発明の方法は、ＰＣＲ法を用い、使用した反応
工程数に関する指数関数量にて、少なくとも一つの特定
ＨＰＶ ＤＮＡ配列を製造する。
連鎖反応の生成物は、使用したプライマーの末端に対応
した末端を有する二本鎖ＤＮＡの別々の一団である。
した末端を有する二本鎖ＤＮＡの別々の一団である。
精製形または非精製形でのあらゆるＨＰＶＤＮＡ源を増
幅用の出発物質として用いることができる。ただし、Ｈ
ＰＶＤＮＡを含んでいるかまたは含んでいると思われな
ければならない。
幅用の出発物質として用いることができる。ただし、Ｈ
ＰＶＤＮＡを含んでいるかまたは含んでいると思われな
ければならない。
オリゴヌクレオチドプライマーは、あらゆる適当な方法
、たとえばホスホトリエステル法、ホスホノエステル法
またはそれらの自動化した態様を用いて調製することが
できろ。そのような自動化した態様の一つでは、ジエチ
ルホスホールアミダイトを出発物質として用い、ポーケ
ージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）らのＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔｅｒｓ、 ２２．１８５９（１９８＋）の
記載に従って合成する。修飾した固体支持体」二でオリ
ゴヌクレオチドを合成ずろ一つの方法が、米国特許第４
，４５８，０６６号明細書に記載されている。
、たとえばホスホトリエステル法、ホスホノエステル法
またはそれらの自動化した態様を用いて調製することが
できろ。そのような自動化した態様の一つでは、ジエチ
ルホスホールアミダイトを出発物質として用い、ポーケ
ージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）らのＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔｅｒｓ、 ２２．１８５９（１９８＋）の
記載に従って合成する。修飾した固体支持体」二でオリ
ゴヌクレオチドを合成ずろ一つの方法が、米国特許第４
，４５８，０６６号明細書に記載されている。
ＨＰＶＤＮＡの鎖は、鋳型として用いる前に、別の工程
としてかまたはプライマー伸長生成物の合成と同時に分
離する必要がある。この鎖分離は、物理的手段、化学的
手段または酵素的手段を含むあらゆる適当な方法により
行うことができる。核酸の鎖を分離する物理的方法の一
つは、完全に（〉９９％）変性するまで核酸を加熱する
ことである。
としてかまたはプライマー伸長生成物の合成と同時に分
離する必要がある。この鎖分離は、物理的手段、化学的
手段または酵素的手段を含むあらゆる適当な方法により
行うことができる。核酸の鎖を分離する物理的方法の一
つは、完全に（〉９９％）変性するまで核酸を加熱する
ことである。
典型的な熱変性は、約８０〜１０５℃の温度で約１〜１
０分間行う。鎖分離はまたヘリカーゼとして知られる酵
素群からの酵素により引き起こすことができ、また酵素
ＲｅｃＡ（へりカーゼ活性を有する）はｒｉｂｏＡ Ｔ
Ｐの存在下でＤＮＡを変性させることが知られている
。ヘリカーゼを用いた核酸の鎖分離に適した反応条件は
、コールド・スプリング・ハーバ−・シンボジア・オン
・クオンティタティブ・バイオロジー（Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＳｙｍｐｏｓｉａ ｏｎ Ｑｕ
ａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｖｏｌ。
０分間行う。鎖分離はまたヘリカーゼとして知られる酵
素群からの酵素により引き起こすことができ、また酵素
ＲｅｃＡ（へりカーゼ活性を有する）はｒｉｂｏＡ Ｔ
Ｐの存在下でＤＮＡを変性させることが知られている
。ヘリカーゼを用いた核酸の鎖分離に適した反応条件は
、コールド・スプリング・ハーバ−・シンボジア・オン
・クオンティタティブ・バイオロジー（Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＳｙｍｐｏｓｉａ ｏｎ Ｑｕ
ａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｖｏｌ。
ＸＬｎｌｒＤＮＡ：レプリケーション・アンド・リコン
ビネーション（Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅ
ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）Ｊにューヨーク、コールド・
スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−１１９７Ｂ）、ク
ーン（Ｂ。
ビネーション（Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅ
ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）Ｊにューヨーク、コールド・
スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−１１９７Ｂ）、ク
ーン（Ｂ。
Ｋ ｕｈｎ）ら、ｒＤＮＡＤＮＡポリメーゼ６３〜６７
頁に記載されており、ＲｅｃＡを用いる方法はラッディ
ング（Ｃ、Ｒａｄｄｉｎｇ）ら、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ、 １６．４０５（１９８２）に概説さ
れている。
頁に記載されており、ＲｅｃＡを用いる方法はラッディ
ング（Ｃ、Ｒａｄｄｉｎｇ）ら、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ、 １６．４０５（１９８２）に概説さ
れている。
ＰＣＲ法は、あらゆる適当な方法を用いて行うことがで
きる。一般に、好ましくはｐＨ７〜９、最も好ましくは
ｐＨ約８にて緩衝水溶液中で行う。
きる。一般に、好ましくはｐＨ７〜９、最も好ましくは
ｐＨ約８にて緩衝水溶液中で行う。
好ましくは、２種のオリゴヌクレオチドプライマーをモ
ル過剰（クローン化ＤＮＡでは通常的１０００：Ｉ（プ
ライマー二鋳型）、ゲノム核酸では通常的１０’：１（
プライマー二鋳型））にて、分離した■４ＰＶ ＤＮＡ
鎖を含有する緩衝液中に加える。しかしながら、この方
法を診断用に用いるときには相補鎖の亀はわかっておら
ず、それゆえ相補鎖の量に対するプライマーの相対量は
確実には決定できないことが理解されるであろう。しか
しながら、実際問題としては、増幅しようとする配列が
長鎖核酸鎖の複合混合物中に含まれているときには、添
加するプライマーの量はその相補鎖（鋳型）の量のモル
過剰であるのが一般的であろう。本方法の効率を良くす
るため、大モル過剰が好ましい。
ル過剰（クローン化ＤＮＡでは通常的１０００：Ｉ（プ
ライマー二鋳型）、ゲノム核酸では通常的１０’：１（
プライマー二鋳型））にて、分離した■４ＰＶ ＤＮＡ
鎖を含有する緩衝液中に加える。しかしながら、この方
法を診断用に用いるときには相補鎖の亀はわかっておら
ず、それゆえ相補鎖の量に対するプライマーの相対量は
確実には決定できないことが理解されるであろう。しか
しながら、実際問題としては、増幅しようとする配列が
長鎖核酸鎖の複合混合物中に含まれているときには、添
加するプライマーの量はその相補鎖（鋳型）の量のモル
過剰であるのが一般的であろう。本方法の効率を良くす
るため、大モル過剰が好ましい。
デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ。
ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）もまた適量ニテ合
成混合物中に加え、得られた溶液を約９０〜１００℃で
約１−１０分間、好ましくは約１〜４分間加熱する。こ
の加熱工程の後、溶液を冷却し、プライマーハイブリダ
イゼーションを約３５〜５５℃にて行う。この冷却混合
物にプライマー伸長反応を誘引または触媒する適当な試
薬を加え、当該技術分野で知られた条件下で反応を行う
。この合成反応は、室温から、それを越えると上記誘引
試薬がもはや有効に機能しなくなる温度までの温度で行
うことができる。それゆえ、たとえばＴａｑＤＮＡポリ
メラーゼを誘引試薬として用いた場合には、温度は一般
に約５０〜７５℃の範囲である。
成混合物中に加え、得られた溶液を約９０〜１００℃で
約１−１０分間、好ましくは約１〜４分間加熱する。こ
の加熱工程の後、溶液を冷却し、プライマーハイブリダ
イゼーションを約３５〜５５℃にて行う。この冷却混合
物にプライマー伸長反応を誘引または触媒する適当な試
薬を加え、当該技術分野で知られた条件下で反応を行う
。この合成反応は、室温から、それを越えると上記誘引
試薬がもはや有効に機能しなくなる温度までの温度で行
うことができる。それゆえ、たとえばＴａｑＤＮＡポリ
メラーゼを誘引試薬として用いた場合には、温度は一般
に約５０〜７５℃の範囲である。
誘引試薬は、プライマー伸長生成物の合成を行うべく機
能するあらゆる化合物または系であってよく、酵素も含
まれる。この目的のための適当な酵素としては、たとえ
ば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼｌ、大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼＩのクレノー断片、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ
、およびサーマス・アクアチフス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａ
ｑｕａｔｒｃｕｓ）から精製した熱安定ＤＮＡポリメラ
ーゼ（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ）などの他の利用でき
るＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。ＴａｑＤＮＡポリ
メラーゼを用いれば各熱変性工程の後に新たに酵素を添
加する必要がないので好ましい。一般に合成は各プライ
マーの３°末端から開始され、合成が終了するまで鋳型
鎖に沿って５°方向に進行してゆき、異なる長さの分子
が製造される。新たに合成された３鎖とその相補核酸鎖
とは二本鎖分子を形成し、この二本鎖分子は本方法の次
工程で用いられる。
能するあらゆる化合物または系であってよく、酵素も含
まれる。この目的のための適当な酵素としては、たとえ
ば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼｌ、大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼＩのクレノー断片、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ
、およびサーマス・アクアチフス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａ
ｑｕａｔｒｃｕｓ）から精製した熱安定ＤＮＡポリメラ
ーゼ（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ）などの他の利用でき
るＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。ＴａｑＤＮＡポリ
メラーゼを用いれば各熱変性工程の後に新たに酵素を添
加する必要がないので好ましい。一般に合成は各プライ
マーの３°末端から開始され、合成が終了するまで鋳型
鎖に沿って５°方向に進行してゆき、異なる長さの分子
が製造される。新たに合成された３鎖とその相補核酸鎖
とは二本鎖分子を形成し、この二本鎖分子は本方法の次
工程で用いられる。
次の工程では、上記２つの二本鎖分子を分離して４つの
一本鎖分子を生成する。
一本鎖分子を生成する。
新たな核酸が上記一本鎖分子上で合成される。
上記条件下で反応を進行さ仕るのに必要とあらば、誘引
試薬、ヌクレオチドおよびプライマーを添加してよい。
試薬、ヌクレオチドおよびプライマーを添加してよい。
再び、オリゴヌクレオチドプライマーの一端で合成が開
始され、鋳型の一本鎖に沿って合成が進行してさらに核
酸が製造される。この工程後、伸長生成物の半分は、２
種のプライマーが結合した特定核酸配列からなっている
であろう。
始され、鋳型の一本鎖に沿って合成が進行してさらに核
酸が製造される。この工程後、伸長生成物の半分は、２
種のプライマーが結合した特定核酸配列からなっている
であろう。
この工程は無限に繰り返すことができ、存在するプライ
マー、誘引試薬およびヌクレオチドの量にのみ制限され
るにすぎない。最初の核酸は複製されないの−で、その
量は全工程を通じて一定のままである。長い生成物は最
初の核酸からのみ製造されるので、その量は直線的に増
えていく。特定配列の量は指数関数的に増えていく。そ
れゆえ、特定配列が主要な分子種となっていくであろう
。
マー、誘引試薬およびヌクレオチドの量にのみ制限され
るにすぎない。最初の核酸は複製されないの−で、その
量は全工程を通じて一定のままである。長い生成物は最
初の核酸からのみ製造されるので、その量は直線的に増
えていく。特定配列の量は指数関数的に増えていく。そ
れゆえ、特定配列が主要な分子種となっていくであろう
。
本発明の方法は、段階的方法（各工程の後に新たに試薬
を加える）か、または同時方法（最初の工程ですべての
試薬を加える）により、または部分的に段階的方法で部
分的に同時方法（所定数の工程後に新たな試薬を加える
）で行うことができる。
を加える）か、または同時方法（最初の工程ですべての
試薬を加える）により、または部分的に段階的方法で部
分的に同時方法（所定数の工程後に新たな試薬を加える
）で行うことができる。
熱に不安定な酵素の場合のように、誘引試薬を不活化す
る鎖分離法（熱など）を用いるときは、各鎖分離工程の
後に誘引試薬を再補充する必要がある。
る鎖分離法（熱など）を用いるときは、各鎖分離工程の
後に誘引試薬を再補充する必要がある。
同時方法は、鎖分離工程に酵素手段を用いる場合に利用
することができる。同時方法においては、反応混合物は
、所望の配列を含む核酸鎖に加えて、鎖分離用酵素（た
とえば、へりカーゼ）、鎖分離用酵素のための適当なエ
ネルギー源（ｆＡ Ｔ Ｐなど）、５種のヌクレオチド
、モル過剰のオリゴヌクレオチドプライマー、および誘
引試薬（たとえば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレ
ノー断片など）を含んでいる。同時方法において熱を用
いて変性を行うときは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼなど
の熱安定誘引試薬を用いることができる。該試薬は、高
められた温度、好ましくは誘引試薬に依存して６５〜９
０℃で作用し、この温度でＤＮＡは一本鎖と二本鎖とが
平衡状態にある。温度の上限は、酵素が分解する温度、
またはそれ以上ではプライマーハイブリダイゼーション
が不充分なレベルでしか起こらない温度に依存するであ
ろう。すべての試薬が最初に存在しているにもかかわら
ず、この方法の各工程は順番に行なわれるであろう。必
要に応じて材料をさらに添加することができる。
することができる。同時方法においては、反応混合物は
、所望の配列を含む核酸鎖に加えて、鎖分離用酵素（た
とえば、へりカーゼ）、鎖分離用酵素のための適当なエ
ネルギー源（ｆＡ Ｔ Ｐなど）、５種のヌクレオチド
、モル過剰のオリゴヌクレオチドプライマー、および誘
引試薬（たとえば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレ
ノー断片など）を含んでいる。同時方法において熱を用
いて変性を行うときは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼなど
の熱安定誘引試薬を用いることができる。該試薬は、高
められた温度、好ましくは誘引試薬に依存して６５〜９
０℃で作用し、この温度でＤＮＡは一本鎖と二本鎖とが
平衡状態にある。温度の上限は、酵素が分解する温度、
またはそれ以上ではプライマーハイブリダイゼーション
が不充分なレベルでしか起こらない温度に依存するであ
ろう。すべての試薬が最初に存在しているにもかかわら
ず、この方法の各工程は順番に行なわれるであろう。必
要に応じて材料をさらに添加することができる。
適当な長さの時間が経過して所望量の特定核酸配列が得
られたら、公知方法で酵素を不活化するか、または反応
成分を分離することにより反応を停止させる。本発明の
方法は連続的に行うことができる。自動化法の一態様に
おいては、変性工程、添加工程、および反応工程の間で
反応を循環させることができる。
られたら、公知方法で酵素を不活化するか、または反応
成分を分離することにより反応を停止させる。本発明の
方法は連続的に行うことができる。自動化法の一態様に
おいては、変性工程、添加工程、および反応工程の間で
反応を循環させることができる。
オリゴヌクレオチドの蛍光誘導体の迅速な合成手段が開
発されている。この方法により、特定ＤＮＡ断片の検出
のための非放射性手段がさらに得られる。各遺伝子特異
的プローブの一部の合成コピーを合成し、蛍光的に誘導
体化する。各ＨＰＶ亜型について、それぞれ別々の分光
特性を有する異なる染料−オリゴヌクレオチド結合体を
合成する。これらの蛍光プローブは、放射性プローブに
ついて記載したのと全く同じようにして用いることがで
き、ハイブリダイゼーシぢンは分光分析により検出する
。しかしながら、単一のＤＮＡ断片混合物をプローブす
るのにプローブの混合物を用いることができる。という
のは、こうすることにより、各プローブのハイブリダイ
ゼーションを別々の波長の蛍光バンドで視覚化すること
ができるからである。
発されている。この方法により、特定ＤＮＡ断片の検出
のための非放射性手段がさらに得られる。各遺伝子特異
的プローブの一部の合成コピーを合成し、蛍光的に誘導
体化する。各ＨＰＶ亜型について、それぞれ別々の分光
特性を有する異なる染料−オリゴヌクレオチド結合体を
合成する。これらの蛍光プローブは、放射性プローブに
ついて記載したのと全く同じようにして用いることがで
き、ハイブリダイゼーシぢンは分光分析により検出する
。しかしながら、単一のＤＮＡ断片混合物をプローブす
るのにプローブの混合物を用いることができる。という
のは、こうすることにより、各プローブのハイブリダイ
ゼーションを別々の波長の蛍光バンドで視覚化すること
ができるからである。
ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーション分析にプローブ
として用いるため、水性媒体中で上昇温度に暴露するな
どして標識ＤＮＡを変性させる、すなわち一本鎖ＤＮＡ
にする。得られた一本鎖ＤＮＡ断片を、ＰＣＲ反応混合
物からの変性ＤＮＡ断片と接触させる。標識プローブは
、相捕的塩基対配列を含むＤＮＡ鎖とのみハイブリダイ
ズまたは結合し、かくしてＩ−Ｉ Ｐ Ｖに由来するＤ
ＮＡ断片を同定することができる。
として用いるため、水性媒体中で上昇温度に暴露するな
どして標識ＤＮＡを変性させる、すなわち一本鎖ＤＮＡ
にする。得られた一本鎖ＤＮＡ断片を、ＰＣＲ反応混合
物からの変性ＤＮＡ断片と接触させる。標識プローブは
、相捕的塩基対配列を含むＤＮＡ鎖とのみハイブリダイ
ズまたは結合し、かくしてＩ−Ｉ Ｐ Ｖに由来するＤ
ＮＡ断片を同定することができる。
放射性標識ＤＮＡプローブを有するゲノムＤＮＡ断片の
混合物をアッセイするために、数多くの実験法が開発さ
れている。好ましいアッセイ法は、サザーン（ＥｏＭ、
５ｏｕｔｈｅｒｎ）のＪ 、Ｍｏ１．ｌ３ｉｏ１．．９
８．５０３（＋９７５）に開示されている。「ザザーン
ブロッティング」においては、スクリーニングしようと
するＤＮＡ断片をアガロースゲルから二ｌ・ロセルロー
スまたはナイロン膜なとの固体支持体に移す。この膜に
より、結合ＤＮＡをＤＮＡＤＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡ
ハイブリダイゼーション法により分析するのが可能にな
る。第一の工程においては、１種または２種以上の制限
エンドヌクレアーゼてゲノムＩ） Ｎ Ａを消化するこ
とにより生成した断片を、そのサイズに従い、アガロー
スゲル中で電気泳動によりクロマトグラフィー分離する
。ゲル中の断片を室温、酸水溶液中で処理し、ついで塩
基性条件下で変性さＵる。最後に、ゲルを中性にし、緩
衝液で飽和した濾紙の上に置く。
混合物をアッセイするために、数多くの実験法が開発さ
れている。好ましいアッセイ法は、サザーン（ＥｏＭ、
５ｏｕｔｈｅｒｎ）のＪ 、Ｍｏ１．ｌ３ｉｏ１．．９
８．５０３（＋９７５）に開示されている。「ザザーン
ブロッティング」においては、スクリーニングしようと
するＤＮＡ断片をアガロースゲルから二ｌ・ロセルロー
スまたはナイロン膜なとの固体支持体に移す。この膜に
より、結合ＤＮＡをＤＮＡＤＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡ
ハイブリダイゼーション法により分析するのが可能にな
る。第一の工程においては、１種または２種以上の制限
エンドヌクレアーゼてゲノムＩ） Ｎ Ａを消化するこ
とにより生成した断片を、そのサイズに従い、アガロー
スゲル中で電気泳動によりクロマトグラフィー分離する
。ゲル中の断片を室温、酸水溶液中で処理し、ついで塩
基性条件下で変性さＵる。最後に、ゲルを中性にし、緩
衝液で飽和した濾紙の上に置く。
濾紙の末端は、緩衝液を含有する貯蔵器中に延びている
。ゲルの上面は膜で覆われ、この膜にＩ）ＮＡが吸収ま
たは「プロット」される。ついで、この膜の上に乾燥濾
紙および−積みの（ａ ５ｔａｃｋ ｏｆ）乾燥吸取紙
タオルを被せる。この−積みの紙の上に膜とゲルとの接
触が均一になるように重しを置く。
。ゲルの上面は膜で覆われ、この膜にＩ）ＮＡが吸収ま
たは「プロット」される。ついで、この膜の上に乾燥濾
紙および−積みの（ａ ５ｔａｃｋ ｏｆ）乾燥吸取紙
タオルを被せる。この−積みの紙の上に膜とゲルとの接
触が均一になるように重しを置く。
一本鎖ＤＮＡを含む緩衝液は、ゲルを通って上部へ移動
するにつれて乾燥紙に吸収される。ついで、このＤＮＡ
は膜に結合する。プロッティング法は、すべてのＤＮＡ
をゲルから膜に移動させるのに通常約４〜１６時間かか
る。移動後、膜を加熱してＤＮＡを膜にしっかり付着さ
せる。ついで、膜に固定したゲノムＤＮＡ断片に放射性
標識プローブを含有する溶液を接触させる。ハイブリダ
イゼーションの検出は、オートラジオグラフィーにより
（たとえば、膜をＸ線フィルムに感光させることにより
）行う。
するにつれて乾燥紙に吸収される。ついで、このＤＮＡ
は膜に結合する。プロッティング法は、すべてのＤＮＡ
をゲルから膜に移動させるのに通常約４〜１６時間かか
る。移動後、膜を加熱してＤＮＡを膜にしっかり付着さ
せる。ついで、膜に固定したゲノムＤＮＡ断片に放射性
標識プローブを含有する溶液を接触させる。ハイブリダ
イゼーションの検出は、オートラジオグラフィーにより
（たとえば、膜をＸ線フィルムに感光させることにより
）行う。
目的ＨＰＶ ＤＮＡ配列の存不は、既知配列の標識一本
鎖）ＩＶＤＮＡプローブを用いて決定することができる
。これらのプローブは、Ｉ（ＰＶゲノムの部分断片を含
む公知の組換えプラスミドベクターからＥＩ ＯＲＦ
の部分断片を切り出したものから得ることができる。
鎖）ＩＶＤＮＡプローブを用いて決定することができる
。これらのプローブは、Ｉ（ＰＶゲノムの部分断片を含
む公知の組換えプラスミドベクターからＥＩ ＯＲＦ
の部分断片を切り出したものから得ることができる。
本発明のプローブの合成を完成させるため、検出可能な
標識、たとえば放射性標識または蛍光分子を導入する。
標識、たとえば放射性標識または蛍光分子を導入する。
たとえば、プローブはニックトランスレーション法を用
いて放射性とすることができる。酵素Ｄ Ｎ ａｓｅ
Ｉを用いた限られた消化により、二本鎖ＤＮＡ中に広間
隔をあけて一本鎖切断部、すなわち「ニック」が導入さ
れる。この各切断部において、大腸菌のＤＮＡポリメラ
ーゼＩを用い、ｌ）遊離の３°−ＯＨ基に放射性標識ヌ
クレオチドを導入し、２）ポリメラーゼ■の５’−３’
工クソヌクレアーゼ分解活性によりＤＮＡ二本鎖に沿っ
てニックを伸長していく。その最終結果は、各鎖中に放
射性標識ヌクレオチドがランダムに組み込まれた二本！
１ＩＤＮＡ分子となる。
いて放射性とすることができる。酵素Ｄ Ｎ ａｓｅ
Ｉを用いた限られた消化により、二本鎖ＤＮＡ中に広間
隔をあけて一本鎖切断部、すなわち「ニック」が導入さ
れる。この各切断部において、大腸菌のＤＮＡポリメラ
ーゼＩを用い、ｌ）遊離の３°−ＯＨ基に放射性標識ヌ
クレオチドを導入し、２）ポリメラーゼ■の５’−３’
工クソヌクレアーゼ分解活性によりＤＮＡ二本鎖に沿っ
てニックを伸長していく。その最終結果は、各鎖中に放
射性標識ヌクレオチドがランダムに組み込まれた二本！
１ＩＤＮＡ分子となる。
ビオチン（ビタミンＨ）と卵白の糖タンパク質であるア
ビジンとの間の強力で特異的な結合は、ＤＮＡ：ＤＮＡ
ハイブリダイゼーションの非放射性検出手段を提供する
［ウォード（Ｗａｒｄ）、ヨーロッパ特許出願６３，８
７９号明細書参照］。二本鎖ＤＮＡ中へのビオチン化ヌ
クレオチドのニックトランスレーションによる酵素的組
込みが開示されている。ついで、放射性標識プローブの
場合と同様にして、ビオチン化ＤＮＡを用いて目的ＤＮ
Ａ断片をプローブする。ついて、アビジンを含有する溶
液中にプロットを浸漬することにより、特定のＤＮＡ：
ＤＮＡハイブリダイゼーションを検出する。アビジンは
、該ＤＮＡプローブ上のビオチン基を介してＤＮＡ：Ｄ
ＮＡ複合体に結合する。アビジン：ビオチン：ＤＮＡ複
合体の検出は、アヒシンタンパク質に結合した指示酵素
を用いて行う。
ビジンとの間の強力で特異的な結合は、ＤＮＡ：ＤＮＡ
ハイブリダイゼーションの非放射性検出手段を提供する
［ウォード（Ｗａｒｄ）、ヨーロッパ特許出願６３，８
７９号明細書参照］。二本鎖ＤＮＡ中へのビオチン化ヌ
クレオチドのニックトランスレーションによる酵素的組
込みが開示されている。ついで、放射性標識プローブの
場合と同様にして、ビオチン化ＤＮＡを用いて目的ＤＮ
Ａ断片をプローブする。ついて、アビジンを含有する溶
液中にプロットを浸漬することにより、特定のＤＮＡ：
ＤＮＡハイブリダイゼーションを検出する。アビジンは
、該ＤＮＡプローブ上のビオチン基を介してＤＮＡ：Ｄ
ＮＡ複合体に結合する。アビジン：ビオチン：ＤＮＡ複
合体の検出は、アヒシンタンパク質に結合した指示酵素
を用いて行う。
この酵素は沈澱の生成を触媒し、該沈澱によりＤＮＡ：
ＤＮＡ複合体が発色物質のバンドとして視覚化される（
たとえば、米国特許第４，２２８，２３７号明細書参照
。該文献は参照のため本明細書中に引用する）。臭化エ
チジウムのような単純な非特異的ＤＮＡ染色による検出
を用いてＤＮＡ診断を直接行うことができるように、増
幅手順を利用して充分な量のＤＮＡを製造することらで
きる。
ＤＮＡ複合体が発色物質のバンドとして視覚化される（
たとえば、米国特許第４，２２８，２３７号明細書参照
。該文献は参照のため本明細書中に引用する）。臭化エ
チジウムのような単純な非特異的ＤＮＡ染色による検出
を用いてＤＮＡ診断を直接行うことができるように、増
幅手順を利用して充分な量のＤＮＡを製造することらで
きる。
本発明の方法は、生物体のゲノム中のＨＰ Ｖを検出す
ることに加えて、ＩＩＰ■に付随して認められる病的状
態を伴わないＤＮＡの多形を検出するために用いること
もてきる。
ることに加えて、ＩＩＰ■に付随して認められる病的状
態を伴わないＤＮＡの多形を検出するために用いること
もてきる。
つぎに、実施例に基づいて本発明をさらに詳しく説明す
るが、本発明はこれらに限られるものではない。
るが、本発明はこれらに限られるものではない。
実施例１
ＰＣＲ法によるＨＰＶの診断
（Ａ）臨床試料の調製：
ＨＰＶに生殖器感染していると思われる個体から頚部、
外陰部または陰茎部の切屑試料またはスワブ試料を集め
、リン酸−緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に懸濁した。＊ＯＯ
ｇ／ｚＱのブロテイナーゼＫを含有する０、６％ドデシ
ル硫酸ナトリウムおよび０．０１Ｍ ＥＤＴＡ中で細胞
を溶解することにより、全細胞ＤＮＡを精製した。試料
を３７℃で１８時間インキュベートした。フェノールで
２回抽出し、ついでクロロホルム：イソアミルアルコー
ル（２４： ｌ ｖ／ｖ）で２回抽出することにより
、タンパク質を除いた。核酸をエタノール沈澱させた。
外陰部または陰茎部の切屑試料またはスワブ試料を集め
、リン酸−緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に懸濁した。＊ＯＯ
ｇ／ｚＱのブロテイナーゼＫを含有する０、６％ドデシ
ル硫酸ナトリウムおよび０．０１Ｍ ＥＤＴＡ中で細胞
を溶解することにより、全細胞ＤＮＡを精製した。試料
を３７℃で１８時間インキュベートした。フェノールで
２回抽出し、ついでクロロホルム：イソアミルアルコー
ル（２４： ｌ ｖ／ｖ）で２回抽出することにより
、タンパク質を除いた。核酸をエタノール沈澱させた。
１１Ｎａｓｅで処理し、ついでブロテイナーゼに消化お
よび上記フェノール抽出およびクロロホルム抽出を行う
ことにより、ＲＮＡを除いた。ＤＮＡをエタノール沈澱
し、■］、０中に再懸濁し、ランカスター（Ｗ 、 Ｄ
、 Ｌ ａｎｃａｓｔｅｒ）らの「ザ・ヒユーマン・
オンコジェニック・パイラスイズ（Ｔｈｅ Ｔ−１ｕｍ
ａｎＯｎｃｏｇｅｎｉｃ Ｖ １ｒｕｓｅｓ）ｊ、ルダ
ラー（Ａ、Ａ、Ｌｕｄｅｒｅｒ）ら編、フマナ・ブレス
（夏（ｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、クリフトン、ＮＪ（
１９８６）、１５３〜１８３頁に記載の方法に従ってＩ
３ａｍＨＩおよびＨ４ｎｄｎｌで消化した。約０．Ｏ１
〜Ｏ，１ｇのＩ） Ｎ ＡをＰＣＲ法に用いた。
よび上記フェノール抽出およびクロロホルム抽出を行う
ことにより、ＲＮＡを除いた。ＤＮＡをエタノール沈澱
し、■］、０中に再懸濁し、ランカスター（Ｗ 、 Ｄ
、 Ｌ ａｎｃａｓｔｅｒ）らの「ザ・ヒユーマン・
オンコジェニック・パイラスイズ（Ｔｈｅ Ｔ−１ｕｍ
ａｎＯｎｃｏｇｅｎｉｃ Ｖ １ｒｕｓｅｓ）ｊ、ルダ
ラー（Ａ、Ａ、Ｌｕｄｅｒｅｒ）ら編、フマナ・ブレス
（夏（ｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、クリフトン、ＮＪ（
１９８６）、１５３〜１８３頁に記載の方法に従ってＩ
３ａｍＨＩおよびＨ４ｎｄｎｌで消化した。約０．Ｏ１
〜Ｏ，１ｇのＩ） Ｎ ＡをＰＣＲ法に用いた。
（Ｂ）既知ＨＰＶＤＮＡ配列の調製：
既知プラスミド中のＨＰ Ｖ配列を、挿入の独特の制限
酵素部位で開裂することにより両側のベクター配列から
放出させた。すべての開裂部位はＥｌ ０ＲＦの外側
にあった。Ｉ−Ｉ Ｐ Ｖ配列のプラスミド源を下記第
８表に示す。
酵素部位で開裂することにより両側のベクター配列から
放出させた。すべての開裂部位はＥｌ ０ＲＦの外側
にあった。Ｉ−Ｉ Ｐ Ｖ配列のプラスミド源を下記第
８表に示す。
（以下、余白）
第８表（１−Ｉ Ｐ Ｖプラスミド）
ＨＰＶ型 参照文献
２ｂ バイルマン（Ｃ，Ａ、）Ｉｅｉｌｍａｎ）ら、
Ｊ。
Ｊ。
Ｖｉｒｏｌ、、３６．３９５（１９８０）４ バイ
ルマンら、Ｊ 、Ｖ １ｒｏ１．、３６．３９５（１９
８０） ６ デウビリエール（Ｅ、Ｍ、ＤｅＶ １ｌｌｉｅ
ｒｓ）ら、Ｊ 、Ｖ １ｒｏ１．．４０．９３２（１９
８１） ！１ グリスマン（Ｌ 、 Ｇ ｒｉｓｓｍａｎ
）ら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、４４．３９３（１９Ｂ２） １６ ダースト（Ｍ 、 Ｄ ｕｒｓｔ）ら、ＰＮ
ＡＳ ＵＳＡ、８０．３８１２（１９８３） １８ ボスハート（Ｍ 、 Ｂ ｏｓｈａｒｔ）ら
、ＥＭＢＯＪ、、３．１１５１（１９，８４） ３１ ロリンツら、Ｊ 、Ｖ １ｒｏ１．、５８．
２２５（１９８６） ３３ ボーデノンら、Ｎａｔｕｒｅ、 ３２１．２
４６（１９８６） ３５ ロリンツら、Ｖ ｉｒｏｌｏｇｙ、１５９．
１８７（１９８７） ５２ シマダ（Ｋ 、 Ｓ ｈｉｍａｄａ）ら、Ｊ
、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、、６９．２９２５（１９８８）
（Ｃ）プライマｍ： マックプライド（Ｌｊ、ＭｃＢｒｉｄｅ）ら、Ｔｅｔｒ
ａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、 ２４．２４５（
１９８３）により改良されたマチューチ（Ｍ 、 Ｄ
、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔｅｒｓ、 ２１．７１９（１９８０）の−数的
な合成法に従い、プライマーＩＵおよびＩＷＤＯをＤＮ
Ａ自動合成機（モデル３８０、アプライド・バイオシス
テムズ、フォスターシティ、ＣＡ）上で合成した。簡単
に説明すると、まず２−デオキンヌクレオンドの３’−
ＯＨ基と固相支持体（カルボキシル化シリカゲルまたは
多孔質ガラスピーズなど）上のカルボン酸基との間でエ
ステル結合を生成することにより、該ヌクレオシドを該
固相支持体に結合させろ。その際、ヌクレオシドの５°
−０１１基は、たとえばジメトキシトリチル残基で保護
しておく。この反応は、縮合剤としてンシクロへキシル
カルボジイミドを用い、ピリジン中で行うことができる
。支持体上の残留するカルボキシル基をブロックした後
、５°−０Ｉ］保護基を開裂し、固定化ヌクレオシドの
ＯＨ基をホスホモノクロリグイト（ｐｈｏｓｐｈｏｍｏ
ｎｏｃｈｌｏｒｉｄｉｔｅ）ヌクレオシド［５’−０保
護ヌクレオシドを塩基の存在下、低温にてメチルポスポ
ロジクロリダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｃｈｌｏｒ
ｉｄｉｔｅ）と反応させることにより調製］と反応さ仕
る。別法として、保護ヌクレオシドを塩基の存在下でホ
スホラミダイトと反応させることによりホスホモノクロ
リグイトのクロロ脱離基を−Ｎ Ｉ−１（ｉＰ ｒ）を
残基で置換することができ、この場合はカップリング反
応は弱酸を用いて行う。得られた固定化ジヌクレオシド
ホスファイトを、たとえば水／ルヂジン／ＴＨＦ混合物
中のヨウ素を用いてホスフェートに酸化する。
ルマンら、Ｊ 、Ｖ １ｒｏ１．、３６．３９５（１９
８０） ６ デウビリエール（Ｅ、Ｍ、ＤｅＶ １ｌｌｉｅ
ｒｓ）ら、Ｊ 、Ｖ １ｒｏ１．．４０．９３２（１９
８１） ！１ グリスマン（Ｌ 、 Ｇ ｒｉｓｓｍａｎ
）ら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、４４．３９３（１９Ｂ２） １６ ダースト（Ｍ 、 Ｄ ｕｒｓｔ）ら、ＰＮ
ＡＳ ＵＳＡ、８０．３８１２（１９８３） １８ ボスハート（Ｍ 、 Ｂ ｏｓｈａｒｔ）ら
、ＥＭＢＯＪ、、３．１１５１（１９，８４） ３１ ロリンツら、Ｊ 、Ｖ １ｒｏ１．、５８．
２２５（１９８６） ３３ ボーデノンら、Ｎａｔｕｒｅ、 ３２１．２
４６（１９８６） ３５ ロリンツら、Ｖ ｉｒｏｌｏｇｙ、１５９．
１８７（１９８７） ５２ シマダ（Ｋ 、 Ｓ ｈｉｍａｄａ）ら、Ｊ
、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、、６９．２９２５（１９８８）
（Ｃ）プライマｍ： マックプライド（Ｌｊ、ＭｃＢｒｉｄｅ）ら、Ｔｅｔｒ
ａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、 ２４．２４５（
１９８３）により改良されたマチューチ（Ｍ 、 Ｄ
、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔｅｒｓ、 ２１．７１９（１９８０）の−数的
な合成法に従い、プライマーＩＵおよびＩＷＤＯをＤＮ
Ａ自動合成機（モデル３８０、アプライド・バイオシス
テムズ、フォスターシティ、ＣＡ）上で合成した。簡単
に説明すると、まず２−デオキンヌクレオンドの３’−
ＯＨ基と固相支持体（カルボキシル化シリカゲルまたは
多孔質ガラスピーズなど）上のカルボン酸基との間でエ
ステル結合を生成することにより、該ヌクレオシドを該
固相支持体に結合させろ。その際、ヌクレオシドの５°
−０１１基は、たとえばジメトキシトリチル残基で保護
しておく。この反応は、縮合剤としてンシクロへキシル
カルボジイミドを用い、ピリジン中で行うことができる
。支持体上の残留するカルボキシル基をブロックした後
、５°−０Ｉ］保護基を開裂し、固定化ヌクレオシドの
ＯＨ基をホスホモノクロリグイト（ｐｈｏｓｐｈｏｍｏ
ｎｏｃｈｌｏｒｉｄｉｔｅ）ヌクレオシド［５’−０保
護ヌクレオシドを塩基の存在下、低温にてメチルポスポ
ロジクロリダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｃｈｌｏｒ
ｉｄｉｔｅ）と反応させることにより調製］と反応さ仕
る。別法として、保護ヌクレオシドを塩基の存在下でホ
スホラミダイトと反応させることによりホスホモノクロ
リグイトのクロロ脱離基を−Ｎ Ｉ−１（ｉＰ ｒ）を
残基で置換することができ、この場合はカップリング反
応は弱酸を用いて行う。得られた固定化ジヌクレオシド
ホスファイトを、たとえば水／ルヂジン／ＴＨＦ混合物
中のヨウ素を用いてホスフェートに酸化する。
ＰＯＭｅ基をチオフェノキシトを用いて開裂してホスフ
ェート結合を生成し、塩基性アミノ基を脱保護し、完成
したオリゴヌクレオヂドは、たとえば希釈塩基を用いて
支持体から開裂する。Ｉ ｔＪおよびＩＷＤＯを構成す
る個々のオリゴヌクレオヂドを別々に合成し結合するこ
とができるし、または保護した２つのホスホモノクロリ
グイトヌクレオシドの混合物をいずれかのプライマーの
合成の適当な工程で加えることもできる。この合成経路
の詳細は、カルサーズ（Ｍ 、 Ｈ、Ｃａｒｕｔｈｅｒ
ｓ）らの米国特許第４．４５８，０６６号明細書に記載
されているので参照されたい。これらプライマーは下記
配列を有する２Ｉヌクレオチド残基からなる。
ェート結合を生成し、塩基性アミノ基を脱保護し、完成
したオリゴヌクレオヂドは、たとえば希釈塩基を用いて
支持体から開裂する。Ｉ ｔＪおよびＩＷＤＯを構成す
る個々のオリゴヌクレオヂドを別々に合成し結合するこ
とができるし、または保護した２つのホスホモノクロリ
グイトヌクレオシドの混合物をいずれかのプライマーの
合成の適当な工程で加えることもできる。この合成経路
の詳細は、カルサーズ（Ｍ 、 Ｈ、Ｃａｒｕｔｈｅｒ
ｓ）らの米国特許第４．４５８，０６６号明細書に記載
されているので参照されたい。これらプライマーは下記
配列を有する２Ｉヌクレオチド残基からなる。
Ｕ
５°−Ｔ Ｉ Ｉ（ＡＣ）Ｉ（ＡＣ）Ｉ Ｉ（ＣＴ）Ｔ
ＡＡＡＡＣＧＡＡＡＧＴ−３および ＩＷＤＯ ５’−（ＡＧ）ＴＣ（ＡＧＸＡＴ）ＡＩ ＧＣＣＣＡ（
ＣＴ）ＴＧＩＡＣＣＡＴ−３ ４つの塩基（Ａ、Ｃ，ＴＳＧ）順列の代わりにデオキシ
イノシン（Ｉ）残基を用いてアニーリング時の安定化を
容易にした［オーツカ（Ｅ 、 Ｏｈｔｓｕｋａ）ら１
．１ 、ｒ３ｉｏ１．Ｃｈｅｍ、、２ Ｇ ０１２６０
５０１９８５］。
ＡＡＡＡＣＧＡＡＡＧＴ−３および ＩＷＤＯ ５’−（ＡＧ）ＴＣ（ＡＧＸＡＴ）ＡＩ ＧＣＣＣＡ（
ＣＴ）ＴＧＩＡＣＣＡＴ−３ ４つの塩基（Ａ、Ｃ，ＴＳＧ）順列の代わりにデオキシ
イノシン（Ｉ）残基を用いてアニーリング時の安定化を
容易にした［オーツカ（Ｅ 、 Ｏｈｔｓｕｋａ）ら１
．１ 、ｒ３ｉｏ１．Ｃｈｅｍ、、２ Ｇ ０１２６０
５０１９８５］。
配列決定したＩＩ Ｐ Ｖゲノム七へのこれらプライマ
ーの結合部位については、第Ａ表に示しである。
ーの結合部位については、第Ａ表に示しである。
（Ｄ）ＩｊＣ１法
ＤＮＡ配列の増幅のためのＰＣＲ法を、サイキ（Ｓ ａ
ｉｋｉ）らの５ｃｉｅｎｃｅ、 ２３０、＋３５０（
１９８５）に記載のようにして行った。その概要は、第
２図にまとめである。簡単に説明すると、最終濃度が各
２００μＭのデオキシリボヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、ｄｃＴＰ、ｄＴＴＰ）および各１μＭのプライ
マーを用い、ｌ ＯｍＭ Ｔｒｉｓ−１−ＩＣＩ（ｐＩ
−１８、３）、１．５ｍＭ ＭｇＣＬ、５０ｍＭＫＣ
ｌを入れた０ 、 ５ ｘＱ容ミクロ遠心管中、１００
μｅの容量中で増幅反応を行った。２．５ＵのＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼ（パーキン−エルマー、シータス）を
加える前に、この増幅混合物（１００μａ）中のｌｎ９
の濃度の）ＩＰＶ ＤＮＡを９５℃で５分間変性させた
［エーリッヒ（Ｉｌ、Ａ、Ｅｒ１ｉｃｈ）ら、Ｎａｔｕ
ｒｅ１３３１．４６１（１９８８）コ。この増幅混合物
上に鉱油（１００μＱ、）を載せ、ＤＮＡ熱サイクラ−
（パーキン−エルマー、シータス）中で増幅を行った。
ｉｋｉ）らの５ｃｉｅｎｃｅ、 ２３０、＋３５０（
１９８５）に記載のようにして行った。その概要は、第
２図にまとめである。簡単に説明すると、最終濃度が各
２００μＭのデオキシリボヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、ｄｃＴＰ、ｄＴＴＰ）および各１μＭのプライ
マーを用い、ｌ ＯｍＭ Ｔｒｉｓ−１−ＩＣＩ（ｐＩ
−１８、３）、１．５ｍＭ ＭｇＣＬ、５０ｍＭＫＣ
ｌを入れた０ 、 ５ ｘＱ容ミクロ遠心管中、１００
μｅの容量中で増幅反応を行った。２．５ＵのＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼ（パーキン−エルマー、シータス）を
加える前に、この増幅混合物（１００μａ）中のｌｎ９
の濃度の）ＩＰＶ ＤＮＡを９５℃で５分間変性させた
［エーリッヒ（Ｉｌ、Ａ、Ｅｒ１ｉｃｈ）ら、Ｎａｔｕ
ｒｅ１３３１．４６１（１９８８）コ。この増幅混合物
上に鉱油（１００μＱ、）を載せ、ＤＮＡ熱サイクラ−
（パーキン−エルマー、シータス）中で増幅を行った。
温度を９０秒以上の間５５℃に上げながら、３７℃で２
分間ＤＮＡをアニールさせた。
分間ＤＮＡをアニールさせた。
第一の伸長は、５５℃で１分間の後、温度を７２℃に４
０〜６０秒上昇させ、３分間の伸長期間で行った。ＤＮ
Ａを９４℃で変性させ、特に断らない限り上記工程をさ
らに２４サイクル繰り返した。
０〜６０秒上昇させ、３分間の伸長期間で行った。ＤＮ
Ａを９４℃で変性させ、特に断らない限り上記工程をさ
らに２４サイクル繰り返した。
（Ｅ）ＨＰＶ ＤＮＡの標識：
組換えＨＰＶＤＮＡ鋳型に由来するＰＣＲ生酸物を、低
融点アガロースゲル中で電気泳動した。
融点アガロースゲル中で電気泳動した。
臭化エチジウム染色した８５０ｂｐ断片（期待される増
幅生成物とほぼ等しい分子量を有していた）を切り出し
、タレノーポリメラーゼを用いたランダムプライマー法
により、直接低融点アガロース内でα−３２Ｐ−ｄＡＴ
Ｐで標識した［ファインバーブ（Ａ 、 Ｐ 、 Ｆ
ｅｉｎｂｅｒｇ）ら、Ａ ｎａｌ、 Ｂ ｉｏｃｈｅｍ
、 、 Ｉ ３２．６（＋９８３）］。この方法により
、約１０８カウント／分／μ９ＤＮＡの比活性が通常通
り得られた。このｔ票識ＰＣＲ生成物を、既知ＨＰＶＤ
ＮＡのＰｓｔ［消化生成物と厳重な条件下でハイブリダ
イズさせた。
幅生成物とほぼ等しい分子量を有していた）を切り出し
、タレノーポリメラーゼを用いたランダムプライマー法
により、直接低融点アガロース内でα−３２Ｐ−ｄＡＴ
Ｐで標識した［ファインバーブ（Ａ 、 Ｐ 、 Ｆ
ｅｉｎｂｅｒｇ）ら、Ａ ｎａｌ、 Ｂ ｉｏｃｈｅｍ
、 、 Ｉ ３２．６（＋９８３）］。この方法により
、約１０８カウント／分／μ９ＤＮＡの比活性が通常通
り得られた。このｔ票識ＰＣＲ生成物を、既知ＨＰＶＤ
ＮＡのＰｓｔ［消化生成物と厳重な条件下でハイブリダ
イズさせた。
（Ｆ）結果ニ
ゲアニン＋ノドノン（Ｇ＋Ｃ）含量および普遍的プライ
マーＩＷＤＯおよびＩＵのザイズに基つき、２種のプラ
イマーの計算した解離温度（Ｔｄ）はそれぞれ５８℃お
よび４８℃であったしヘームズ（Ｂ。
マーＩＷＤＯおよびＩＵのザイズに基つき、２種のプラ
イマーの計算した解離温度（Ｔｄ）はそれぞれ５８℃お
よび４８℃であったしヘームズ（Ｂ。
１） 、 ｌ−［ａｍｅｓ）ら、ニュークレイツク・ア
ンラド・ハイブリダイゼーションーア・プラクティカル
・アプローチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ ｌ１ｙｂｒ
ｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ＡＰ ｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐ
ｒｏａｃｈ）、ＩＲＩ、プレス、オックスフォード、英
国（１９８５）］。これらプライマーのアニーリングは
、ＩＵの解離温度（Ｔｄ）よりも１１’Ｃ低い温度で行
った。
ンラド・ハイブリダイゼーションーア・プラクティカル
・アプローチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ ｌ１ｙｂｒ
ｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ＡＰ ｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐ
ｒｏａｃｈ）、ＩＲＩ、プレス、オックスフォード、英
国（１９８５）］。これらプライマーのアニーリングは
、ＩＵの解離温度（Ｔｄ）よりも１１’Ｃ低い温度で行
った。
予備研究においては、増幅反応をＴａｑポリメラーゼの
最適温度（７２℃）で行ったときには検出可能な生成物
を得ることができないことがわかった。
最適温度（７２℃）で行ったときには検出可能な生成物
を得ることができないことがわかった。
おそらく、伸長が開始される前にプライマーの一方また
は両方が解離してしまったのであろう。プライマーの鋳
型へのアニーリングを保持するため、第一の重合期間（
１分）に反応温度を３７℃から５５℃にゆっくりと上昇
させ、ついで第二の伸長期間を７２℃で３分とした。こ
れら条件下で増幅したＨＰＶＤＮＡはすへて、期待され
る８５０ヌクレオチド断片を含んでいた。期待したバン
ドに加えて、ＨＰＶＩ８は一貫して長さが約５５０ヌク
レオチドの断片の存在を示していた。
は両方が解離してしまったのであろう。プライマーの鋳
型へのアニーリングを保持するため、第一の重合期間（
１分）に反応温度を３７℃から５５℃にゆっくりと上昇
させ、ついで第二の伸長期間を７２℃で３分とした。こ
れら条件下で増幅したＨＰＶＤＮＡはすへて、期待され
る８５０ヌクレオチド断片を含んでいた。期待したバン
ドに加えて、ＨＰＶＩ８は一貫して長さが約５５０ヌク
レオチドの断片の存在を示していた。
この別の断片の出所源を決定するため、２種のプライマ
ーのうちの一方だけを用いてＰＣＲを行った。ＩＷＤＯ
をプライマーとして用いた場合は、ＨＰＶ６およびＨＰ
Ｖ １８ＤＮＡはそれぞれ約８５０ヌクレオチドおよ
び５５０ヌクレオチドの断片を示した。ＩＷＤＯを単独
のプライマーとして用いた場合、ＨＰＶ Ｉ Ｉ、［
−１ＰＶ ｌ Ｇ、またはＩ−（ＰＶ ３３ＤＮＡ
では増幅は観察されなかった。ＩＵをプライマーとして
用いた場合は、ＨＰＶ３３についてのみ約８５０ｂｐの
ところに非常にかすかなバンドが検出された。単独プラ
イマー増幅の後に観察されたＨｒ’Ｖ６およびＨＰＶ３
３の余分の断片は、期待される８５０ｂｐ断片と一緒に
移動する（ｃｏ−ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）ため相互プライ
マー反応では検出されなかった。
ーのうちの一方だけを用いてＰＣＲを行った。ＩＷＤＯ
をプライマーとして用いた場合は、ＨＰＶ６およびＨＰ
Ｖ １８ＤＮＡはそれぞれ約８５０ヌクレオチドおよ
び５５０ヌクレオチドの断片を示した。ＩＷＤＯを単独
のプライマーとして用いた場合、ＨＰＶ Ｉ Ｉ、［
−１ＰＶ ｌ Ｇ、またはＩ−（ＰＶ ３３ＤＮＡ
では増幅は観察されなかった。ＩＵをプライマーとして
用いた場合は、ＨＰＶ３３についてのみ約８５０ｂｐの
ところに非常にかすかなバンドが検出された。単独プラ
イマー増幅の後に観察されたＨｒ’Ｖ６およびＨＰＶ３
３の余分の断片は、期待される８５０ｂｐ断片と一緒に
移動する（ｃｏ−ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）ため相互プライ
マー反応では検出されなかった。
ウィルス配列を調へたところ、ＨＰＶ６およびＨＰＶ１
８についてのみＩＷＤＯと６９％の相同性を有する可能
な別のアニーリング部位がみつかった。この程度の不一
致は、プライマーのアニーリング条件下（３７℃）では
許容される乙のである。Ｉ−Ｈ’Ｖ Ｉ ８ＤＮＡ上
の［ＷＤＯに対するアニーリング（目的）部位は、コー
ド（陽）鏡上の２０１２位にある。正しい増幅方向にあ
るＩＷＤＯに対する可能な別の結合部位は、目的部位の
５４５塩基対（ｂｐ）上流に陰鏡上で検出された。他の
アニーリング部位もまた位置していたが、１セツトのみ
が正しい方向を向いているため増幅か可能であった。一
方の部位は陽鏡上の３７８３位にあり、他方の部位は陰
鏡上の５７５ヌクレオチド下流にあった。ＨＰＶ６につ
いては、別のアニーリング部位が１セツトだけ検出され
た。一方の部位は陽鏡上の３００６位にあり、他方の部
位は陰鏡上の８５９ｂｐ下流にあった。ＨＰＶ３３につ
いては、１０の目的結合部位はコード鎖上の１１２２位
にあった。しかしながら、正しい方向にあって約８５０
ｂｐの断片を生成し得る別の結合部位は非コード鎖上に
は検出されなかった。しかしながら、陽鏡上の９７６位
および陰鏡上に正しい方向で８４５ｂｐ下流に！セット
の別の結合部位があった。
８についてのみＩＷＤＯと６９％の相同性を有する可能
な別のアニーリング部位がみつかった。この程度の不一
致は、プライマーのアニーリング条件下（３７℃）では
許容される乙のである。Ｉ−Ｈ’Ｖ Ｉ ８ＤＮＡ上
の［ＷＤＯに対するアニーリング（目的）部位は、コー
ド（陽）鏡上の２０１２位にある。正しい増幅方向にあ
るＩＷＤＯに対する可能な別の結合部位は、目的部位の
５４５塩基対（ｂｐ）上流に陰鏡上で検出された。他の
アニーリング部位もまた位置していたが、１セツトのみ
が正しい方向を向いているため増幅か可能であった。一
方の部位は陽鏡上の３７８３位にあり、他方の部位は陰
鏡上の５７５ヌクレオチド下流にあった。ＨＰＶ６につ
いては、別のアニーリング部位が１セツトだけ検出され
た。一方の部位は陽鏡上の３００６位にあり、他方の部
位は陰鏡上の８５９ｂｐ下流にあった。ＨＰＶ３３につ
いては、１０の目的結合部位はコード鎖上の１１２２位
にあった。しかしながら、正しい方向にあって約８５０
ｂｐの断片を生成し得る別の結合部位は非コード鎖上に
は検出されなかった。しかしながら、陽鏡上の９７６位
および陰鏡上に正しい方向で８４５ｂｐ下流に！セット
の別の結合部位があった。
別のプライマー結合部位を除くため、アニーリング温度
を上昇させた。１種のプライマーのみを用い、アニーリ
ング温度を３７℃から４６℃に上昇させてＨＰＶ ６
、ＨＰＶ１８およびＨＰ Ｖ３３についてＰＣＲを繰り
返した。ＢＰＶ６およびＢＰＶ３３についてはこの温度
では増幅は認められなかったが、ＨＰＶＩ８では５５０
ｂｐのバンドが依然として存在していた。アニーリング
温度を４６℃から５２℃に上昇さ仕たときには、１−Ｉ
ＰＶＩ８は単独のプライマーを用いて増幅することがで
きなかった。５２℃のアニーリング温度では伸長時間が
含まれていなかったが、９０秒かけて温度を５２℃から
７２℃にゆっくりと上界さ仕た後に伸長を行ってサイク
ルを完成させた。
を上昇させた。１種のプライマーのみを用い、アニーリ
ング温度を３７℃から４６℃に上昇させてＨＰＶ ６
、ＨＰＶ１８およびＨＰ Ｖ３３についてＰＣＲを繰り
返した。ＢＰＶ６およびＢＰＶ３３についてはこの温度
では増幅は認められなかったが、ＨＰＶＩ８では５５０
ｂｐのバンドが依然として存在していた。アニーリング
温度を４６℃から５２℃に上昇さ仕たときには、１−Ｉ
ＰＶＩ８は単独のプライマーを用いて増幅することがで
きなかった。５２℃のアニーリング温度では伸長時間が
含まれていなかったが、９０秒かけて温度を５２℃から
７２℃にゆっくりと上界さ仕た後に伸長を行ってサイク
ルを完成させた。
温度を５２℃に上昇させることにより、第二の部位への
ＩＵまたはＩＷＤＯのアニーリングを防ぐことができた
。このことは、ＨＰＶ ６、ＢＰＶ１８およびＢＰＶ
３３においてこれら別のバンドが消失したことにより確
認された。これら２種のプライマーを用いた増幅は、Ｉ
Ｕについての最も低い’ｌ’ ｄよりら４℃低い温度で
アニーリングを行った場合でも首尾よく行うことができ
た。
ＩＵまたはＩＷＤＯのアニーリングを防ぐことができた
。このことは、ＨＰＶ ６、ＢＰＶ１８およびＢＰＶ
３３においてこれら別のバンドが消失したことにより確
認された。これら２種のプライマーを用いた増幅は、Ｉ
Ｕについての最も低い’ｌ’ ｄよりら４℃低い温度で
アニーリングを行った場合でも首尾よく行うことができ
た。
４６℃および５２℃でアニーリングして生成した臭化エ
チジウム染色断片の強度の間に違いは認められなかった
。しかしながら、ＨＰＶ ６鋳型の系列希釈によれば
、限定量の鋳型で増幅させる場合のＤＮＡ量が約２次数
異なることが示された。
チジウム染色断片の強度の間に違いは認められなかった
。しかしながら、ＨＰＶ ６鋳型の系列希釈によれば
、限定量の鋳型で増幅させる場合のＤＮＡ量が約２次数
異なることが示された。
４６℃ではｏ、ｏ＋ｐ９の増幅断片で検出できたが、５
２℃では４０サイクルの増幅後に１ 、０ ｐ９の増幅
断片でしか検出されなかった。ハイブリダイゼーション
によれば、４６℃ではわずかに０．００Ｉｒ９（１〜１
０分子）（７）ＨＰＶ ６ＤＮＡから増幅生成物を検
出できたが、５２℃ではｌＰ９すなわち２Ｘ１０’分子
から検出可能であることがわかった。
２℃では４０サイクルの増幅後に１ 、０ ｐ９の増幅
断片でしか検出されなかった。ハイブリダイゼーション
によれば、４６℃ではわずかに０．００Ｉｒ９（１〜１
０分子）（７）ＨＰＶ ６ＤＮＡから増幅生成物を検
出できたが、５２℃ではｌＰ９すなわち２Ｘ１０’分子
から検出可能であることがわかった。
本発明プライマーのＨＰ Ｖコンセンサスプライマーと
しての有用性を評価するため、配列がわかっていない種
々のヒトおよび動物パピロマウイルスＤＮＡの増幅を試
みた。クローン化ＨＰＶ２．１１ＰＶ４、ＨＰＶ ３
１．ＨＰＶ ３５およびＢＰＶ５２並びにウシパピロ
マウイルス７型（ＩＭＰＶ ７）およびイヌロ腔パピ
ロマウイルス（ＣＯＰＹ）ＤＮＡ配列を試験した。５２
℃のアニーリング温度にて、ＢＰＶ ７以外は、これ
らすべてのＤＮＡの増幅により長さが約８５０ｂｐの断
片が生成した。増幅用に等量（ｌ ｎｇ）のウィルスＤ
ＮＡを用いたにもかかわらず、ＢＰＶ２は検出可能では
あるが一層弱いシグナルを生成し、プライマーの一方ま
たは両方か鋳型に充分にアニールしなかったことを示唆
していた。
しての有用性を評価するため、配列がわかっていない種
々のヒトおよび動物パピロマウイルスＤＮＡの増幅を試
みた。クローン化ＨＰＶ２．１１ＰＶ４、ＨＰＶ ３
１．ＨＰＶ ３５およびＢＰＶ５２並びにウシパピロ
マウイルス７型（ＩＭＰＶ ７）およびイヌロ腔パピ
ロマウイルス（ＣＯＰＹ）ＤＮＡ配列を試験した。５２
℃のアニーリング温度にて、ＢＰＶ ７以外は、これ
らすべてのＤＮＡの増幅により長さが約８５０ｂｐの断
片が生成した。増幅用に等量（ｌ ｎｇ）のウィルスＤ
ＮＡを用いたにもかかわらず、ＢＰＶ２は検出可能では
あるが一層弱いシグナルを生成し、プライマーの一方ま
たは両方か鋳型に充分にアニールしなかったことを示唆
していた。
増幅した断片を標識し、既知１（ＰＶＤＮＡのＰｓｔｌ
消化生成物と標準（Ｔｍ−２５）条件下でハイブリダイ
ズさけた。各場合において、ｇＨＰＶのＰＣＲ生成物は
、それぞれ個々の鋳型ＤＮＡとのみハイブリダイズした
。さらに、プライマーに対する目的部位を含む断片のみ
がＰＣＲ生成物とハイブリダイズした（第Ａ表参照）。
消化生成物と標準（Ｔｍ−２５）条件下でハイブリダイ
ズさけた。各場合において、ｇＨＰＶのＰＣＲ生成物は
、それぞれ個々の鋳型ＤＮＡとのみハイブリダイズした
。さらに、プライマーに対する目的部位を含む断片のみ
がＰＣＲ生成物とハイブリダイズした（第Ａ表参照）。
従って、ウィルス型、およびウィルスＤＮＡの予想領域
に特異的なＰＣＲ生成物が生成された。
に特異的なＰＣＲ生成物が生成された。
実施例２
臨床試料からのＨＰＶＤＮＡの増幅：
本発明の普遍的プライマーを用いて増幅さ仕るために、
サザーンブロットハイブリダイゼーションにより前以て
型分けしておいた臨床試料からのＤＮ、Ａを選択した。
サザーンブロットハイブリダイゼーションにより前以て
型分けしておいた臨床試料からのＤＮ、Ａを選択した。
Ｉ３ａｍＨＩおよびＨｉｎｄｌｌｌで二重消化した後、
試料をＩＵおよびＩ Ｗ Ｄ Ｏ並びにＢ−グロビンプ
ライマーの存在下、４６℃のアニーリング温度での２５
サイクル増幅に供した。増幅混合物のアリコート（１５
μρ）を０．８％アガロースゲル中で電気泳動し、ナイ
ロン膜に移し、ついでＩＩＰＶ ６、ＨＰＶＩＩ、ＨＰ
ＶＩ６、ＨｐｖｔｓまたはＨｌ）Ｖ３１並びにＢ−グロ
ビンオリゴマーの標識増幅断片に標準条件下でハイブリ
ダイズした。陰性コントロールとして、サザーンプロッ
トで前以て陰性であった３つの試料、並びにヒト細胞株
２９３からのＤＮＡ（Ｉμｇ）を用いた。
試料をＩＵおよびＩ Ｗ Ｄ Ｏ並びにＢ−グロビンプ
ライマーの存在下、４６℃のアニーリング温度での２５
サイクル増幅に供した。増幅混合物のアリコート（１５
μρ）を０．８％アガロースゲル中で電気泳動し、ナイ
ロン膜に移し、ついでＩＩＰＶ ６、ＨＰＶＩＩ、ＨＰ
ＶＩ６、ＨｐｖｔｓまたはＨｌ）Ｖ３１並びにＢ−グロ
ビンオリゴマーの標識増幅断片に標準条件下でハイブリ
ダイズした。陰性コントロールとして、サザーンプロッ
トで前以て陰性であった３つの試料、並びにヒト細胞株
２９３からのＤＮＡ（Ｉμｇ）を用いた。
すべての試料がＢ−グロビンプローブにハイブリダイズ
したが、このことは試料中に充分な細胞ＤＮＡが存在す
ること、および増幅反応が抑制されなかったことを示し
ていた。増幅ＤＮＡについてのＨＰＶハイブリダイゼー
ションの結果は、前以て行ったサザーンプロットの結果
と相関関係を有していた。サザーンプロットで前以て陰
性であった試料のうち２つは、ＨＰＶ３１に関してはわ
ずかに陽性であった。これら試料は、正常外陰部の生検
および頚部の偏平細胞癌であった。陽性外陰部は潜伏感
染の結果であり、また偏平細胞癌はウィルスＤＮＡ濃度
が低いためにサザーンプロットでは陰性であったものと
思われる。別の考え方としては、これら２つの試料は、
ＤＮＡ抽出、制限酵素消化およびＰＣＲに含まれる数多
くの操作の間にコンタミネートされたと思われる。しか
しながら、他の陰性コントロール（正常頚部）およびヒ
ト細胞株２９３からのＤＮＡが陰性のままであったこと
を考慮すると、この後者の考えは蓋然性が薄い。さらに
、いずれの試料においても２種の異なる型から１−ＩＶ
ＤＮＡが検出されることは決してなかった。
したが、このことは試料中に充分な細胞ＤＮＡが存在す
ること、および増幅反応が抑制されなかったことを示し
ていた。増幅ＤＮＡについてのＨＰＶハイブリダイゼー
ションの結果は、前以て行ったサザーンプロットの結果
と相関関係を有していた。サザーンプロットで前以て陰
性であった試料のうち２つは、ＨＰＶ３１に関してはわ
ずかに陽性であった。これら試料は、正常外陰部の生検
および頚部の偏平細胞癌であった。陽性外陰部は潜伏感
染の結果であり、また偏平細胞癌はウィルスＤＮＡ濃度
が低いためにサザーンプロットでは陰性であったものと
思われる。別の考え方としては、これら２つの試料は、
ＤＮＡ抽出、制限酵素消化およびＰＣＲに含まれる数多
くの操作の間にコンタミネートされたと思われる。しか
しながら、他の陰性コントロール（正常頚部）およびヒ
ト細胞株２９３からのＤＮＡが陰性のままであったこと
を考慮すると、この後者の考えは蓋然性が薄い。さらに
、いずれの試料においても２種の異なる型から１−ＩＶ
ＤＮＡが検出されることは決してなかった。
以上の結果から、ＩｔＪとＩＷＤＯとは、生殖路感染を
伴うＨＰ Ｖの増幅のための普遍的プライマーとして組
み合わせて使用可能なことが確実である。本発明のプラ
イマーは、ＰＣＲ法において型特異的なプライマーの必
要性をなくするという意味において「普遍的」である。
伴うＨＰ Ｖの増幅のための普遍的プライマーとして組
み合わせて使用可能なことが確実である。本発明のプラ
イマーは、ＰＣＲ法において型特異的なプライマーの必
要性をなくするという意味において「普遍的」である。
これらプライマーは鋳型とは種々の程度の相同性を示す
ので、可能な最も低いＴｄに基づくアニーリング温度を
しばしば用いた。この温度での増幅では予期しないバン
ドが得られたが、これらバンドはアニーリング温度を上
げることにより消失さ仕た。しかしながら、この温度上
昇により、増幅の効率は２倍の次数で低下する結果とな
った。
ので、可能な最も低いＴｄに基づくアニーリング温度を
しばしば用いた。この温度での増幅では予期しないバン
ドが得られたが、これらバンドはアニーリング温度を上
げることにより消失さ仕た。しかしながら、この温度上
昇により、増幅の効率は２倍の次数で低下する結果とな
った。
このことは、全プライマーのごく一部のみが鋳型と熱安
定な二本鎖を生成するというプライマーの縮重（ｄｅｇ
ｅｎｅｒａｃｙ）によって説明することができる。
定な二本鎖を生成するというプライマーの縮重（ｄｅｇ
ｅｎｅｒａｃｙ）によって説明することができる。
デオキシイノシンは、４塩基重複のあり得るところに用
いてプライマーの熱安定性を高めた。これは、縮重位置
のあるときにプライマーの濃度が減少するのを防ぐとい
う別の利点も有する。本発明の普遍的プライマーを用い
て低アニーリング温度で正常細胞ＤＮＡを増幅さＵ゛て
も、ＨＰ Ｖプローブにハイブリダイズず・Ｓ ｌ）
Ｎ Ａ断片を生成させることはできなかった。
いてプライマーの熱安定性を高めた。これは、縮重位置
のあるときにプライマーの濃度が減少するのを防ぐとい
う別の利点も有する。本発明の普遍的プライマーを用い
て低アニーリング温度で正常細胞ＤＮＡを増幅さＵ゛て
も、ＨＰ Ｖプローブにハイブリダイズず・Ｓ ｌ）
Ｎ Ａ断片を生成させることはできなかった。
本発明のコンセンサスプライマーは、Ｉ−Ｉ Ｐ Ｖ６
、 ＨＰＶ Ｉ Ｉ Ｓ ＨＰＶ １ ６ 、
ＨＰＶ１８ およびＨＰＶ ３３ＤＮＡの増幅に有効
であることが期待されたが（これら配列のＤＮＡは知ら
れているので）、種々の組織源に由来する配列のわから
ない幾つかのＨＰＶＤＮＡを増幅することができた。本
発明の普遍的プライマーは被験ＨＰ Ｖの間で高度に保
存された配列とアニールするので、これら配列は全ウィ
ルス属に特徴的な配列であるように思われる。それゆえ
、本発明の普遍的プライマーは、未だ特徴付けられてい
ないウィルス型の検出にも用いることができる。本発明
の普遍的プライマーはまた、Ｉ−Ｉ Ｐ Ｖ感染には通
常伴わない病変中のＩ−Ｉ Ｐ Ｖを確認するためにも
用いろことができる。このような広い有用性は、Ｃ０Ｐ
Ｙ ＤＮＡは増幅されたけれどもＢＩ’Ｖ ７ＤＮＡ
は増幅することができなかったので、Ｉ−Ｉ Ｐ Ｖに
限られてよいかもしれない。［ＵはＢＰＶ−１およびＣ
０ＰＹ配列に対して殆ど相同性を示さなかったが、一方
、ＩＷＤＯは高い相同性を有していた。このことは、ア
ニーリング部位が２種のプライマーの一方にのみ存在す
ることを示していた。
、 ＨＰＶ Ｉ Ｉ Ｓ ＨＰＶ １ ６ 、
ＨＰＶ１８ およびＨＰＶ ３３ＤＮＡの増幅に有効
であることが期待されたが（これら配列のＤＮＡは知ら
れているので）、種々の組織源に由来する配列のわから
ない幾つかのＨＰＶＤＮＡを増幅することができた。本
発明の普遍的プライマーは被験ＨＰ Ｖの間で高度に保
存された配列とアニールするので、これら配列は全ウィ
ルス属に特徴的な配列であるように思われる。それゆえ
、本発明の普遍的プライマーは、未だ特徴付けられてい
ないウィルス型の検出にも用いることができる。本発明
の普遍的プライマーはまた、Ｉ−Ｉ Ｐ Ｖ感染には通
常伴わない病変中のＩ−Ｉ Ｐ Ｖを確認するためにも
用いろことができる。このような広い有用性は、Ｃ０Ｐ
Ｙ ＤＮＡは増幅されたけれどもＢＩ’Ｖ ７ＤＮＡ
は増幅することができなかったので、Ｉ−Ｉ Ｐ Ｖに
限られてよいかもしれない。［ＵはＢＰＶ−１およびＣ
０ＰＹ配列に対して殆ど相同性を示さなかったが、一方
、ＩＷＤＯは高い相同性を有していた。このことは、ア
ニーリング部位が２種のプライマーの一方にのみ存在す
ることを示していた。
良性お上び前癌性病変はエピソームＨＰＶ ＤＮＡ配列
を含んでいるので、これら普遍的プライマーを用いたＰ
ＣＲ法は、臨床試料中のウィルス配列の検出のための一
般的スクリーニング法として有用である。得られた増幅
断片は、ついで特定のオリゴヌクレオチドプローブを用
いて型分けすることができる。
を含んでいるので、これら普遍的プライマーを用いたＰ
ＣＲ法は、臨床試料中のウィルス配列の検出のための一
般的スクリーニング法として有用である。得られた増幅
断片は、ついで特定のオリゴヌクレオチドプローブを用
いて型分けすることができる。
以上、本発明を種々の特別の好ましい態様および技術に
関して記載した。しかしながら、本発明の範囲内で多く
の変更および修飾をすることができるが理解されるべき
である。
関して記載した。しかしながら、本発明の範囲内で多く
の変更および修飾をすることができるが理解されるべき
である。
第１図は、ＰＣＲ法によるＤＮＡの目的配列の増幅を示
す模式図である。実線枠および斑点を付けた枠は、それ
ぞれ目的の配列に近似した２種のオリゴヌクレオチド（
増幅プライマー）を表す。縦の線は多数の塩基対を表す
。変性ＤＮＡと混合しアニールさせたとき、これらプラ
イマーは該ＤＮＡ上の相補的配列とハイブリダイズする
。ついで、ＤＮＡポリメラーゼは、該ＤＮＡを鋳型とし
て用い該オリゴヌクレオヂドをプライマーとして用いて
新たなりＮＡ鎖を合成する。変性、アニーリング、およ
びプライマー伸長のサイクルを繰り返して増幅された目
的配列のプールが生成される。そのような配列の−っを
最下段に示しである。 第２Ａ図は、ＨＰＶ６ｂゲノムの模式図である。 ０−７９０２ヌクレオチドスケール上の記号ｒＡＪはポ
リアデニル化部位を示す。ＨＰＶＯＲＦを示す枠中の破
線は、Ａ Ｔ Ｇ開始コドンのおよその位置を示す。 第２Ｂ図は、本発明のプライマーを用いた、Ｉ！ＰＶの
ＥＩ ＯＲＦ中のＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲ
法を示す模式図である。
す模式図である。実線枠および斑点を付けた枠は、それ
ぞれ目的の配列に近似した２種のオリゴヌクレオチド（
増幅プライマー）を表す。縦の線は多数の塩基対を表す
。変性ＤＮＡと混合しアニールさせたとき、これらプラ
イマーは該ＤＮＡ上の相補的配列とハイブリダイズする
。ついで、ＤＮＡポリメラーゼは、該ＤＮＡを鋳型とし
て用い該オリゴヌクレオヂドをプライマーとして用いて
新たなりＮＡ鎖を合成する。変性、アニーリング、およ
びプライマー伸長のサイクルを繰り返して増幅された目
的配列のプールが生成される。そのような配列の−っを
最下段に示しである。 第２Ａ図は、ＨＰＶ６ｂゲノムの模式図である。 ０−７９０２ヌクレオチドスケール上の記号ｒＡＪはポ
リアデニル化部位を示す。ＨＰＶＯＲＦを示す枠中の破
線は、Ａ Ｔ Ｇ開始コドンのおよその位置を示す。 第２Ｂ図は、本発明のプライマーを用いた、Ｉ！ＰＶの
ＥＩ ＯＲＦ中のＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲ
法を示す模式図である。
Claims (9)
- （１）生理学的試料中のヒトパピロマウイルス（ＨＰＶ
）の検出方法であって、 （ａ）該試料中のＨＰＶのＥ１オープンリーディングフ
レームから二本鎖ＤＮＡを分離して第一の一本鎖ＨＰＶ
ＤＮＡおよび第二の一本鎖ＨＰＶＤＮＡを生成し、 （ｂ）該第一の一本鎖ＨＰＶＤＮＡをモル過剰のオリゴ
デオキシヌクレオチドプライマーＩＵ（該第一の鎖に対
する相補領域）と反応させ、該第二の一本鎖ＨＰＶＤＮ
Ａをモル過剰のオリゴデオキシヌクレオチドプライマー
ＩＷＤＯ（該第二の鎖に対する相補領域）と反応させ、
その際の反応条件を、各プライマーが各相補領域とアニ
ールし、かつ各プライマーがアニールしている鎖に相補
的な各プライマーの伸長生成物が合成されるようなもの
とし、 （ｃ）その上にプライマー伸長生成物が合成されている
鎖から該プライマー伸長生成物を分離して４つの一本鎖
分子を生成し、 （ｄ）工程（ｃ）で生成した４つの一本鎖分子を工程（
ｂ）の２種のプライマーとプライマーのモル過剰にて反
応させ、その際の反応条件を、各プライマーが各相補領
域とアニールし、かつ各一本鎖分子を鋳型として用いて
各プライマーの伸長生成物が合成されるようなものとし
、 （ｅ）工程（ｃ）〜（ｄ）を繰り返して、該２種のオリ
ゴデオキシヌクレオチドプライマーのＤＮＡ配列に相補
的なＨＰＶＤＮＡ配列間にあるＨＰＶＤＮＡに対応する
二本鎖ＤＮＡを検出可能な量まで蓄積させ、ついで （ｆ）該検出可能な量のＤＮＡを検出する ことを特徴とする方法。 - （２）検出可能な量のＤＮＡの検出を、該二本鎖ＨＰＶ
ＤＮＡを変性させて２つの一本鎖ＨＰＶＤＮＡとし、該
一本鎖ＤＮＡの少なくとも一方を標識オリゴヌクレオチ
ドプローブとアニールさせ、ついで該標識を検出するこ
とにより行う、請求項（１）に記載の方法。 - （３）標識オリゴヌクレオチドプローブが、検出可能な
標識との結合部位を用いて標識されている、請求項（２
）に記載の方法。 - （４）検出可能な量のＤＮＡの検出を、検出可能な標識
を該二本鎖ＨＰＶＤＮＡに結合させ、ついで該標識を検
出することにより行う、請求項（１）に記載の方法。 - （５）工程（ｃ）〜（ｄ）を約１０〜５０回繰り返す、
請求項（１）に記載の方法。 - （６）工程（ａ）および（ｃ）における分離を、該二本
鎖ＤＮＡを熱変性することにより行う、請求項（１）に
記載の方法。 - （７）工程（ｂ）および（ｄ）を、４種の異なるヌクレ
オチド三リン酸および重合剤で処理することにより行い
、その際、該ヌクレオチド三リン酸および重合剤をプラ
イマーＩＵおよびプライマーＩＷＤＯと一緒にまたは別
々に添加する、請求項（１）に記載の方法。 - （８）式： ５′−ＴＩＩＮ＿１ＩＮ、ＩＩＮ＿２ＴＡＡＡＡＣＧＡ
ＡＡＧＴ−３′（式中、Ｎ＿１はＡまたはＧ、Ｎ＿２は
ＣまたはＴである）で示されるオリゴヌクレオチドまた
はその相補配列。 - （９）式： ５′−Ｎ＿１ＴＣＮ＿１Ｎ＿３ＡＩＧＣＣＣＡＮ＿２Ｔ
ＧＩＡＣＣＡＴ−３′（式中、Ｎ＿１はＡまたはＧ、Ｎ
＿２はＣまたはＴ、Ｎ＿３はＡまたはＴである）で示さ
れるオリゴヌクレオチドまたはその相補配列。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/431,444 US5863717A (en) | 1989-11-03 | 1989-11-03 | Use of conserved oligonucleotide primers to amplify human papillomavirus DNA sequences |
| US431444 | 1989-11-03 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03195500A true JPH03195500A (ja) | 1991-08-27 |
| JP2905283B2 JP2905283B2 (ja) | 1999-06-14 |
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ID=23711964
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2298710A Expired - Fee Related JP2905283B2 (ja) | 1989-11-03 | 1990-11-02 | ヒトパピロマウイルスの検出方法およびそれに用いるオリゴヌクレオチド |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5863717A (ja) |
| EP (1) | EP0425995B1 (ja) |
| JP (1) | JP2905283B2 (ja) |
| CA (1) | CA2029126A1 (ja) |
| DE (1) | DE69032080T2 (ja) |
| ES (1) | ES2114525T3 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003528595A (ja) * | 2000-02-26 | 2003-09-30 | エーバーハルト−カルルス−ウニヴェルズィテート テュービンゲン ウニヴェルズィテートクリーニクム | ヒト乳頭腫ウイルスの検出 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5411857A (en) * | 1985-07-31 | 1995-05-02 | Institut Nationale De La Sante | Probes for papillomaviruses and an in vitro diagnostic procedure for papilloma infections |
| US5182377A (en) * | 1988-09-09 | 1993-01-26 | Hoffmann-La Roche Inc. | Probes for detection of human papillomavirus |
| US5447839A (en) * | 1988-09-09 | 1995-09-05 | Hoffmann-La Roche Inc. | Detection of human papillomavirus by the polymerase chain reaction |
| US5863717A (en) * | 1989-11-03 | 1999-01-26 | Abbott Laboratories | Use of conserved oligonucleotide primers to amplify human papillomavirus DNA sequences |
| CA2052413C (en) * | 1990-09-28 | 2004-07-13 | Jeffrey L. Joseph | Nucleotides sequences useful as type-specific probes, pcr primers and lcr probes for the amplifications and detection of human papilloma virus, and related kits and methods |
| IT1244462B (it) * | 1990-12-06 | 1994-07-15 | Sclavo Spa | Oligonucleotidi sintetici utili per la diagnosi di infezione da tipi diversi di virus del gruppo papilloma e loro utilizzazione |
| US6509149B2 (en) * | 1995-06-06 | 2003-01-21 | Hybridon, Inc. | HPV-specific oligonucleotides |
| DE60141205D1 (de) * | 2000-04-03 | 2010-03-18 | Cytyc Corp | Nachweis und typisierung des papillomavirus mittels pna-sonden |
| AU2001257604A1 (en) * | 2000-04-11 | 2001-10-23 | Micrologix Biotech Inc. | HPV-specific short-mers |
| DK1421200T3 (da) * | 2001-08-23 | 2007-04-10 | Merck & Co Inc | Fluoprescerende multiplex HPV PCR-assays under anvendelse af flere fluoroforer |
| JP4498357B2 (ja) | 2003-09-25 | 2010-07-07 | サード・ウェーブ・テクノロジーズ・インク | Ｈｐｖの検出法 |
| DE10357677A1 (de) * | 2003-12-10 | 2005-07-14 | Greiner Bio-One Gmbh | Primer und Sonden zum Nachweis genitaler HPV-Genotypen |
| KR100663992B1 (ko) * | 2004-07-05 | 2007-01-02 | (주)바이오메드랩 | 인유두종 바이러스의 유전형을 분석하기 위한 특이도 높은 프로브 선택방법 및 그 선택된 프로브 |
| EP1877585A2 (en) * | 2005-04-28 | 2008-01-16 | Merck & Co., Inc. | Real-time hpv pcr assays |
| US20070031826A1 (en) * | 2005-08-05 | 2007-02-08 | My Gene | Diagnostic kit for determining the genotype of a human papilloma virus and method of using thereof |
| DE102006041970A1 (de) * | 2006-08-28 | 2008-03-06 | Genome Identification Diagnostics Gmbh | Verfahren und Mittel zum Nachweis von humanen Papillomaviren |
| US8080643B2 (en) * | 2006-09-05 | 2011-12-20 | Third Wave Technologies, Inc. | HPV primers |
| WO2009035177A1 (en) * | 2007-09-14 | 2009-03-19 | Seegene, Inc. | Genotyping of human papilloma viruses by multiplex amplification and size differentiation |
| CA2799205A1 (en) | 2010-05-25 | 2011-12-01 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Fast results hybrid capture assay and associated strategically-truncated probes |
| CN117737311B (zh) * | 2024-02-20 | 2024-04-19 | 湖南派智生物科技有限公司 | 检测犬乳头瘤病毒的通用引物对、试剂、试剂盒及应用 |
Family Cites Families (10)
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|---|---|---|---|---|
| US5176995A (en) * | 1985-03-28 | 1993-01-05 | Hoffmann-La Roche Inc. | Detection of viruses by amplification and hybridization |
| US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| WO1988006634A1 (en) * | 1987-02-26 | 1988-09-07 | The University Of Sydney | A method of detection of carcinogenic human papillomavirus |
| FR2629458B2 (fr) * | 1987-07-31 | 1991-08-09 | Ire Celltarg Sa | Nouvelles sondes d'acides nucleiques specifiques de differents types de virus de papillome humain |
| AU2785589A (en) * | 1987-10-02 | 1989-04-18 | Microprobe Corporation | Human papillomavirus type diagnosis with nucleotide probes |
| FR2627590A1 (fr) * | 1988-02-24 | 1989-08-25 | Ire Celltarg Sa | Sonde d'acides nucleiques comportant un nucleotide terminal modifie chimiquement en 5(prime) (oh) en vue de son marquage non radioactif et procedes de preparation |
| US5182377A (en) * | 1988-09-09 | 1993-01-26 | Hoffmann-La Roche Inc. | Probes for detection of human papillomavirus |
| US5447839A (en) * | 1988-09-09 | 1995-09-05 | Hoffmann-La Roche Inc. | Detection of human papillomavirus by the polymerase chain reaction |
| US5863717A (en) * | 1989-11-03 | 1999-01-26 | Abbott Laboratories | Use of conserved oligonucleotide primers to amplify human papillomavirus DNA sequences |
-
1989
- 1989-11-03 US US07/431,444 patent/US5863717A/en not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-10-24 ES ES90120403T patent/ES2114525T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-24 EP EP90120403A patent/EP0425995B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-24 DE DE69032080T patent/DE69032080T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-11-01 CA CA002029126A patent/CA2029126A1/en not_active Abandoned
- 1990-11-02 JP JP2298710A patent/JP2905283B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003528595A (ja) * | 2000-02-26 | 2003-09-30 | エーバーハルト−カルルス−ウニヴェルズィテート テュービンゲン ウニヴェルズィテートクリーニクム | ヒト乳頭腫ウイルスの検出 |
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|---|---|
| EP0425995B1 (en) | 1998-03-04 |
| JP2905283B2 (ja) | 1999-06-14 |
| ES2114525T3 (es) | 1998-06-01 |
| DE69032080T2 (de) | 1998-10-01 |
| DE69032080D1 (de) | 1998-04-09 |
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| US5863717A (en) | 1999-01-26 |
| EP0425995A3 (en) | 1993-06-16 |
| EP0425995A2 (en) | 1991-05-08 |
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