JPH0319948B2 - - Google Patents

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SUKO PERU SUTAARU

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1982-07-06

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1991-03-18

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Description

請求の範囲１ヒスタミンを含有する可能性がある試料、と
くに体液、組織サンプルまたは食品中のヒスタミ
ンを検出または定量するにあたり、試料サンプル
をヒスタミン結合体に接触させ、結合量を検出も
しくは測定する方法において、ガラス微細繊維を
結合体とし、ヒスタミンの検出または定量可能量
が微細繊維に結合できるような割合でガラス微細
繊維と試料とを用い、結合したヒスタミンの量を
検出または測定する方法。

２ヒスタミンを含有する可能性がある試料のサ
ンプルに既知量の標識ヒスタミンを加え、ガラス
微細繊維に結合した標識ヒスタミンの量を検出も
しくは測定し、この検出もしくは測定量を既知量
の非標識ヒスタミンとの競合に基づいて作成した
標準曲線と比較する、ヒスタミンの検出または定
量に競合分析を用いる請求の範囲第１項記載の方
法。

３血漿および所望により赤血球をあらかじめ除
去した血液分画に試験アレルゲンを加え、放出す
る可能性のあるヒスタミンを繊維に直接または標
識ヒスタミンと競合的に結合させて、その量を検
出または測定して、アレルギー反応で放出された
ヒスタミンを検出する請求の範囲第１項および第
２項のいずれか一つに記載の方法。

４ガラス微細繊維は２〜20μmの範囲の大きさ
の微粒子の形で使用する請求の範囲第１項から第
３項までのいずれか一つに記載の方法。

５使用するガラス微細繊維は、望ましくは次の
酸化物含量： SiO₂ 57.9％ B₂O₃ 10.7％ Fe₂O₃ 5.9％ Al₂O₃ Na₂O 10.1％ K₂O 2.9％ CaO 2.6％ MgO 0.4％ BaO 5.0％ ZnO 3.9％Ｆ 0.6％を有するボロシリケート繊維またはそれに類似の
性質を有するものである請求の範囲第１項記載の
方法。

６使用する標識ヒスタミンは放射能標識、蛍光
標識もしくは酵素標識ヒスタミンまたはヒスタミ
ン誘導体である請求の範囲第２項および第３項の
いずれか一つに記載の方法。

７試験管、微量滴定板、フオイルおよびストリ
ツプから選ばれる担体に支持されている、破砕し
たガラス微細繊維を使用する、請求の範囲第１項
記載の方法。

８破砕したガラス微細繊維は２〜20μmの範囲
の大きさの粒子の形で使用する請求の範囲第７項
記載の方法。

９使用するガラス微細繊維は、次の酸化物含
量： SiO₂ 57.9％ B₂O₃ 10.7％ Fe₂O₃ 5.9％ Al₂O₃ Na₂O 10.1％ K₂O 2.9％ CaO 2.6％ MgO 0.4％ BaO 5.0％ ZnO 3.9％Ｆ 0.6％を有するボロシリケート繊維またはそれと類似の
性質を有するものである請求の範囲第７項記載の
方法。

１０さらに少なくとも１種の試験アレルゲンを
使用することからなる、アレルギー反応によつて
生じるヒスタミン放出の検出または定量のための
請求の範囲第７項記載の方法。

１１体液中のヒスタミンの検出または定量に使
用するための診断用試験デバイスであつて、望ま
しくは試験管、微量滴定板、フオイルおよびスト
リツプからなる群から選ばれる担体に支持されて
いる、破砕したガラス微細繊維からなる、診断用
試験デバイス。

１２少なくとも１種の試験アレルゲンをさらに
含む請求の範囲第１１項記載の診断用試験デバイ
ス。

明細書本発明はヒスタミン含有試料とくに血液または
血液分画中のヒスタミンの検出または定量方法に
関する。本発明はまた、この方法を実施するにあ
たつて使用される分析手段を包含する。

アレルギー性疾患の治療に際しての問題点のひ
とつは、十分に特異的、高感度でしかも患者に危
険を与えない診断技術を欠くことにある。適切な
治療を受けていない患者を確実に減らせるような
迅速、単純かつ安価な診断技術が求められてい
る。

ヒト血液や組織にはアレルギー反応に関与する
特殊な細胞（好塩基球および肥満細胞）が存在す
る。これらの細胞の表面には、特殊な抗体（IgE
抗体）がある。たとえば患者がネコアレルギーの
場合、このアレルギー反応はネコのふけタンパク
の構造を特異的に認識する、上記細胞表面上の抗
体によつて生じる。ネコのタンパクは吸入される
と肺組織の肥満細胞および好塩基球と接触する。
細胞表面上のこれらの抗体はネコのタンパクと反
応し、これが細胞内反応の引き金となつて、多く
の物質（アレルギー仲介物質）の放出が起こる。
これらのアレルギー仲介物質が患者の症状が原因
となる。

以前から、アレルギー反応のin vitroでの模倣
は可能であつた。アレルギー患者から血液を採取
し、この血液をたとえばネコのタンパク質に暴露
し、血液サンプル中の好塩基球からアレルギー仲
介物質を放出させる。これらの仲介物質のうち、
ひとつの物質は以前から定量可能であつた。ヒス
タミンである。したがつて、患者がネコに対して
アレルギーであれば、上記細胞からのヒスタミン
放出を測定できる。この原理に基づく方法が正し
い診断のための最善の評価を与える。以下に詳述
するとおりである。

この方法によれば、アレルギー疾患（たとえば
喘息、蕁麻疹、枯草熱）患者の原因抗原（たとえ
ば花粉、動物のふけ、薬剤、食物、十壌のかび、
バクテリア）を診断することができる。

この試験における一般的な問題は、臨床検査室
での実施が困難なことである。１日にわずかな試
験しかできないし、また高度の分析技術が要求さ
れる。したがつて、この試験を診療所の日常的診
断業務にできるような単純化が強く望まれてい
る。

上述のように液体中のヒスタミンの検出には多
くの方法がある。ヒスタミンの定量法はShoreら
によつてはじめて報告された。これは蛍光法によ
るものである（文献１参照）。

この方法の原理は、ヒスタミンを蛍光団（ｏ−
フタルアルデヒド）に結合させて環状構造を形成
させるものである。比色法で測定できるこの環状
構造の量がヒスタミンの量に対応する。この方法
はその後改良され、特異性と感度が高められた。
すなわち、Stahl SkovとNorm（文献２）は全血
に代えて0.5〜２％の好塩基球を含有するFicoll−
Hypaque単離細胞懸濁液のアレルゲン誘発によ
つてこの方法を単純化した。血液の分画により妨
害物質は除去され、長い抽出操作は不要になり、
好塩基球のヒスタミン含量は直接測定が可能にな
つた。しかしながら、妨害物質の除去に必要な分
画操作（濃度勾配遠心分離）は時間を要し、技術
的に難しい。したがつてSiraganianは自動分析
蛍光法を開発している（文献３）。この方法は診
療所でも利用できるが、技術的熟練、定常的な監
理、高価な装置が必要となり、その応用が限られ
てくる。

Taylorら（文献４）は生物学的試料中のヒス
タミンの定量に別の方法を開発した。きわめて感
度の高いこの特異的な方法は、Ｎ−メチルトラン
スフエラーゼによるヒスタミンのメチル化に基づ
く酵素同位元素法である。この方法によれば、組
織、血液、尿中の微量のヒスタミンも定量でき
る。しかしながら、１日に定量可能な量は少なく
（約30検体）、しかも定量に長時間を要し、診療所
で実施される定常的業務としての要求を満足する
ものではない。

さらにStahl Skovら（文献５）は、患者の好
塩基球に放射能標識ヒスタミンをin vitroで導入
する別の方法を発表している。疑われるアレルゲ
ンで誘発したのち、標識ヒスタミンの放出を測定
するものである。しかしながら、以下に述べるよ
うに、この方法で得られる値は蛍光的に測定した
ヒスタミンの放出と相関を示さない。

本発明の目的は、公知方法におけるたとえば高
価な装置を要す、時間がかかる、全血の前処置を
必要とする、などの欠点をもたないヒスタミンの
検出または定量方法を提供するものである。

とくに、迅速、操作が簡単、少量の試料を要す
るのみ、技術者に高度の熟練を求めない、単純で
特異性がさらに高い、ヒスタミン含有試料中のヒ
スタミンの検出および定量方法を提供するのが本
発明の目的である。

この目的は、試料サンプルとガラス微細繊維
を、検出または定量すべきヒスタミン量をガラス
微細繊維に結合させることが可能な両者の比率で
接触させ、ついでヒスタミンの結合量を記録また
は測定することを特徴とする本発明の方法に達成
された。上述のように、本発明はまた、この方法
の実施に用いられる手段も包含する。この手段
は、担体上に支持させたガラス微細繊維からなる
ことを特徴とする。

本発明の方法は、ヒスタミンがガラス微細繊維
に強固かつかなり選択的に結合し、くり返し洗浄
しても離脱しないという知見を利用したものであ
る。ガラス微細繊維は材として広く利用されて
いて、たとえばWhatman社（Springfield Mill，
Maidstone，Kent，England）のパンフレツト、
刊行番号630号の「ガラス微細繊維」に詳細に説
明されている。このパンフレツトでは、ガラス微
細繊維の吸着能は著しく低いが、高分子量物質と
くにアルブミンのようなタンパクやRNA分析に
おけるポリＵなど２，３の場合には吸着手段とし
て使用できる旨述べられている。しかし、ヒスタ
ミンの吸着についてはまつたく記載がない。

ヒスタミンのガラス表面への吸着については、
すでにBosseとWassermann（文献６）が検討し
ている。モルモツト回腸の収縮反応を利用する、
よく知られたヒスタミンの繁雑な検出法の精度が
低いことから、これが試験装置のガラス表面への
ヒスタミンの部分吸着によるものではないかが検
討されているのである。彼らは各種ガラスの粗大
粉末を各種既知濃度のヒスタミン溶液に加えた。
振盪後の溶液中に残つた遊離ヒスタミンをモルモ
ツト回腸試験で測定し、ガラス粉末を加えなかつ
た場合と比較した。結合したヒスタミンのガラス
表面からの遊離の可能性については検討されてい
ない。

BosseとWassermannはヒスタミンの濃度が低
い（10^-6m）場合、存在するヒスタミンの約75％
がガラス粉末に結合された。この結果に基づいて
彼らは、ヒスタミンの定量（濃度−反応曲線）の
研究に際し、低濃度（＜10^-6m）ではヒスタミン
のかなりの部分がガラス上に吸着されて失われる
ことを考慮すべきであると結論した。このような
マイナスの記述から、ヒスタミンの検出技術に熟
練した技術者ならば、このようなヒスタミンの望
ましくない結合性を、ヒスタミンの検出または定
量といつた定量性と再現性を求められる方法に利
用するなどということは到底想定し得ないところ
にある。逆にこの確認された結果は、アレルギー
反応で生じたヒスタミンのようなとくにヒスタミ
ンの低濃度の場合、ガラス表面との接触の回避を
考えさせるのが通常である。

これはたとえばMurrayとMcGillの報告（文献
７）からも証明できる。MurrayとMcGillは上述
のBosseらの所見を確認し、OPT法のような高感
度の分析法ではこの吸着効果が働くと誤差の危険
が著しく高くなると述べている。したがつて
MurrayとMcGillはポリエチレン容器の使用を推
薦し、ガラス容器を用いる場合は酸性条件で操作
すれば吸着を防止できると述べている。

ガラス微細繊維の使用は、セロトニン、また
１，４−および１，５−メチルイミダゾール酢酸
のような低分子化合物が以下に示すように吸着さ
れないので有利である。

ガラス微細繊維は市販品を容易に入手できる
し、毒性もなく、使用時に危険を伴わない。
“WhatmanＲ○GF／Ｂ”の商品名で市販されてい
るガラス微細繊維材は、本発明の方法を実施す
るのにきわめて適していることが明らかにされて
いる。“WhatmanＲ○GF／Ｃ”も使用できるが、
結合性の変動がより大である。

前述のパンフレツトによると、上記繊維はボロ
シリケート繊維で、通常の酸化物の含量は次のと
おりである。

％ SiO₂ 57.9％ B₂O₃ 10.7％ Fe₂O₃ 5.9％ Al₂O₃ Na₂O 10.1％ K₂O 2.9％ CaO 2.6％ MgO 0.4％ BaO 5.0％ ZnO 3.9％Ｆ 0.6％本発明はもちろん、上述のタイプのガラス微細
繊維の使用に限定されるものではなく、本発明の
技術分野熟練者であれば、例１に後述するような
簡単な結合性の試験によつて、市販のガラス微細
繊維の中から至適結合性をもつ繊維を発見するこ
とが可能であろう。

しかしながら、現時点では、最も適当なガラス
微細繊維は“WhatmanGF／Ｂ”型の繊維および
類似の性質をもつ、とくに結合性の類似した繊維
である。所望の感度を得るには、本発明の方法に
使用するに先立つて、ガラス微細繊維を２〜
20μm程度の微細粒子に分割するのが有利である。
この場合も、繊維の最も適当な大きさおよび分散
度は試験によつて決定することができるし、また
ヒスタミン含量を測定する試料の種類に応じて最
も便利な測定法を支えるために選ばれる繊維の支
持担体の種類によつても決まつてくる。

ガラス微細繊維とヒスタミン含有試料の量的関
係は、繊維への結合が期待されるヒスタミンの量
に依存し、同様に試験によつて決定できる。各種
の程度のアレルギーによつて放出されるヒスタミ
ンの量は文献によつて知られているので、既知量
のヒスタミンに対する標準曲線をプロツトしてお
けば、未知サンプル中のヒスタミン量の定量の基
準に、たとえば以下に述べるような競合定量法に
おいて利用できる。

適当な担体としては、プラスチツク製の小型試
験管のような形状の管が好ましいが、微量滴定
板、ホイルまたはストリツプも使用できる。アレ
ルギーの診断用にはガラス繊維を、たとえば適当
数のウエルをもつ微量滴定板など、適当な担体上
に支持させ、所望により試験アレルゲンと一緒に
して、適当なデバイスたとえば診断用キツトの形
にするのが有利である。

本発明の方法は、試験試料として血液サンプル
を用い、アレルギー反応の結果放出されるヒスタ
ミンの検出または定量にとくに有利である。前述
の一般的利点に加えて、本発明の方法の上記態様
においては従来法に比し大きな利点がある。妨害
物質たとえばスペルミジンの血中からの除去に
は、血漿の除去たとえば遠心分離と生理的緩衝液
による洗浄だけで十分である。所望により赤血球
を除去することもできるが、この場合も、血漿除
去の遠心分離前にデキストランを加えて沈降させ
るという単純の操作で除去できる。

本発明の方法は、ヒトおよび動物の他の体液、
たとえばリンパ液、脳脊髄液もしくは尿、または
組織サンプルまたは組織抽出液中のヒスタミンの
検出または定量にも使用できる。これに関連し
て、ヒスタミンを放出する疾患には、アレルギー
のほかにも、たとえば肥胖細胞症などがあること
も注意すべきである。

最後に、本発明の方法は、食品たとえばサバ等
のような魚類のヒスタミン含量の検出または定量
にも応用できる。

ヒスタミン含量を測定する試料の種類によつて
は、存在する可能性がある測定妨害物質の除去
も、サンプルとガラス繊維を接触させる前に必要
となる。

ガラス微細繊維に結合したヒスタミンの記録ま
たは測定には２種の方法が利用できる。すなわ
ち、１標識ヒスタミンを用いた競合分析と、２直
接定量である。

１競合定量この記録原理は、サンプル中に存在するヒスタ
ミンと既知量の添加標識ヒスタミンの間のガラス
微細繊維上の結合部位に対する競合に基づくもの
である。

非標識ヒスタミンの濃度を変え、これに一定量
の標識ヒスタミンを加えて標準曲線を作成し、そ
の場合に用いたと同量の標識ヒスタミンを加えれ
ば特定の未知サンプル中のヒスタミン量を容易に
定量できる。この方法は以下の例１において第３
図を参照しながら詳述する。

例１および例２においては、ヒスタミンの標識
に放射性同位元素³H（トリチウム）を用いている
が、他の放射性同位元素たとえば¹²⁵Iも使用でき
る。放射能標識ヒスタミンの結合量は、たとえば
シンチレーシヨンカウンターを用いる公知方法で
測定できる。

放射性物質の取り扱いが難しいため、標識剤と
して放射性同位元素以外の材料を使用する、多く
の新しい試験システムが、アレルギー診断用に開
発されている。たとえば遊離ラジカル、螢光性分
子（たとえば螢光イソチオシアネート、ローダミ
ン発色団）、ルミニセント分子、バクテリオフア
ージ、酵素、補酵素、酵素阻害剤などである。

ヒスタミンの繊維に対する結合性の再現性に影
響を与えない限り、標識化合物は限定されるもの
ではなく、それ自体公知の方法にしたがつてヒス
タミンに対して応用できる。本発明の特徴はガラ
ス微細繊維に対するヒスタミンの驚くべき選択的
結合性の利用にあり、結合ヒスタミンの定量につ
いては競合定量が可能でかつ適当なことが公知で
あるので、この慣用の標識方法の中から本発明の
方法での定量に最も適した特定の方法を試験によ
つて発見することは、本技術分野の熟練者にとつ
ては日常業務にすぎないからである。好ましい例
としては、２，５−³H−ヒスタミン二塩酸塩の
形にヒスタミンを同位元素標識する方法がある。
この方法は迅速かつ簡便で、また精度、再現性が
高い。

２直接定量ガラス微細繊維の選択的吸着性が、ヒスタミン
の直接結合、ついで結合ヒスタミンの常法による
定量を可能にすることはもちろんである。たとえ
ば螢光団化合物と結合させ、ついで螢光分析を行
うことができる。この方法は例３および例４に例
示する。

本発明に使用するガラス微細繊維を含むプラス
チツク管の製造は簡単で、安価につく（１日につ
き5000〜10000管）。本発明の方法は時間を要さ
ず、１名の臨床検査技術者が１日に約400検体を
処理できる（従来法での最高は150検体）。本発明
の方法では血液の節約も可能で、１名の患者に８
ないし10個のアレルゲン試験を行うとしても10ml
の血液を要するにすぎない（公知方法では50ml）。

本発明の方法は再現性および特異性が高く、ヒ
スタミンの螢光定量法と高い相関を示すので、疑
われるアレルゲンたとえばハウスダスト、動物の
ふけ、花粉、土壌のかび、薬剤、食品、バクテリ
ア、自家抗原についての正確な情報を得るのにと
くに有用である。次に本発明を以下の実施例によ
り図面を参照しながら詳細に説明する。

第１図はStahl Skovら（文献５）にしたがつ
たヒスタミンの定量と螢光分析法による結果の相
関を示すグラフである。

第２図は同一モル濃度のトリチウム化ヒスタミ
ン、ヒスチジンおよびセロトニンのガラス微細繊
維への結合率を示す図である。

第３図は既知量の非標識ヒスタミン添加後、２
種のガラス微細繊維に対する各種濃度のトリチウ
ム化ヒスタミンの結合についてのグラフであつ
て、２種のヒスタミン代謝物、１，４−および
１，５−メチルイミダゾール酢酸（MEIAA）に
よりトリチウム化ヒスタミンの置換が起こらない
ことを示している（例１参照）。

第４図は本発明の方法によるヒスタミンの定量
と螢光分析法との相関を示すグラフである（例２
後照）。

第５図は本発明の方法によるヒスタミンの直接
螢光分析に各種の洗浄操作を組み合わせた場合
と、ガラス繊維を用いない従来の定量（文献２）
との比較を示すグラフである（例３参照）。

第１図の測定結果は、文献５の方法と慣用の螢
光分析定量法との間に明らかに相関がないことを
示している。軸は花粉抗原の濃度低下（希釈）を
示す。

第２図からヒスタミンが、低分子化合物ヒスチ
ジンおよびセロトニン（５−ヒドロキシトリプタ
ミン）より著しく良好な結合性を示すことが明ら
かである。この両化合物は公知方法においてヒス
タミンを妨害するので、ヒスタミンの定量におい
ては、上記の事実が信頼性の高いことを示すもの
である。

第３図からは以下に述べるように、２種のヒス
タミン代謝物１，４−MEIAAおよび１，５−
MEIAAがヒスタミンと同程度の濃度ではいずれ
もガラス微細繊維に結合せず、競合定量において
結合標識ヒスタミンを置換できないことがわか
る。

例１ガラス繊維装着管の製造 “WhatmanGF／Ｂ”ガラス繊維材を約1/2
mmの長さに切断する。その3.4ｇを再蒸留水と混
合し、２分間“ULTRA TURRAX”混合器中
でホモジナイズする。破砕した繊維を２時間室温
に放置して沈降させる。重繊維（最長の繊維）は
沈降し、そしてこの重繊維からきれいに分離し、
約20μm〜2μmの長さの懸濁繊維を含有する上澄
液（計約100ml）を分離し、この上澄液100μを
プラスチツク管に移す。この管を150℃の乾燥器
中で乾燥する（１週間）。乾燥器からとり出して、
温度が約20℃になれば使用できる。この乾燥操作
により、ガラス繊維は管の底に固着する。このガ
ラス繊維装着管は永久に保存できる。

ヒスタミン定量用標準曲線の作成非標識ヒスタミンをTris−AMC緩衝液〔トリ
ス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン25mM、
PH7.6、NaCl0.12M、KCl5mM、CaCl₂0.6mM、
MgCl₂1.1mM、ヒト血清アルブミン0.3mg／mlお
よびグルコース１mg／ml〕中にとり、既知希釈系
列を作る。ヒスタミン含量はそれぞれ25nｇ、
50nｇ、100nｇ、200nｇ、400nｇおよび800／ml
であり、Ｏ−サンプルとしてはヒスタミンを含ま
ない緩衝液を用いる。以上の濃度を標準曲線のプ
ロツトに使用した。これらの希釈液100μlを各ガ
ラス繊維試験管にとり、それに放射能標識ヒスタ
ミン（２，５−³H−ヒスタミン二塩酸塩：
500nCi／ml、５／nCi／サンプルに相当、比活性
約53Ci／mole）10μlを加える。サンプルを37℃
で40分間インキユベートする。均一な結果を得る
には、各サンプルとも同一時間処理することが重
要である。サンプルを細胞収穫器（Tech、
Nunc，Roskilde，Denmark）中、再蒸留水で15
秒間洗浄する。残つた水分を捨て、1.2mlのFilter
Count（Packard）を加える。各サンプルを液体
シンチレーシヨンカウンター中で１分間カウント
し、β−線の放出をカウント／分（cpm）で記録
する。非標識ヒスタミンを含まないサンプル（Ｏ
−結合）は通常2000cpmの結合した標識ヒスタミ
ンを含有する。これはサンプルに加えた標識ヒス
タミン総量の約60％に相当する。非標識ヒスタミ
ン25nｇ／mlを含むサンプルではＯ−結合性の約
15％に相当する量が繊維に結合し、カウント数は
約1700cpmになる。ヒスタミンの量が増えると、
100μｇ／mlのヒスタミンまで直線的にcpmが低下
する。

第３図にGF／Ｂと印した２回の平行して行つ
た試験での標準曲線は、cpmで示した％結合量
（ｙ軸）とヒスタミン含量（ｘ軸、対数）との間
に半対数直線関係があることを示している。この
試験の感度は約25nｇヒスタミン／mlである。図
には、同様に調製した“WhatmanGF／Ｃ”繊維
による２回の対応する試験の結果も示してある。
この繊維では相関がやや低くなることがわかる。

例２喘息患者12例の花粉に対する特異的アレルギー
反応の、患者好塩基球の花粉によるin vitroでの
誘発による試験各患者から静脈穿刺により血液10mlを採取す
る。血液を0.2M−EDTA（PH7.2）0.5mlと混合す
る。サンプルを２分し、一方は文献２の方法で分
析し、本発明方法との間の相関を検討する。血液
５mlデキストラン（分子量500000ｇ／mol45mgを
0.9％NaCl1mlに溶解）１mlと混合し、赤血球を
除去する。このサンプルを注意深く逆さにし、30
分間室温に放置する。赤血球の沈降は白血球より
も早い。白血球を含む血漿層を他の試験管に移
し、Tris−AMC緩衝液（例１参照）20mlに懸濁
する。白血球懸濁液を10分間100×ｇ、16℃で遠
心分離する。上澄の血漿を除去して捨て、細胞を
再びTris−AMC緩衝液20mlに懸濁し、10分間、
60×ｇ、16℃で遠心分離する。上澄液を再び除去
し、細胞をTris−AMC緩衝液５mlに再懸濁す
る。この細胞懸濁液は好塩基球２〜４％を含有す
る。

この細胞懸濁液100μlを例１と同様にして調製
したガラス微細繊維管に移す。花粉標準プレパレ
ーシヨンの10倍希釈系列（10^-3，10^-4，10^-5v／
ｖ）で花粉10μlと、同位元素標識（トリチウム
化）ヒスタミン10μl（各サンプル5nCiに相当）を
管に加える。サンプルを37℃で40分間インキユベ
ートする。サンプルを細胞収穫器（Tech−
Nunc，Roskilde，Denmark）中、再蒸留水で15
秒間洗浄する。

残つた水分を捨て、Filter Count（Packard）
1.2mlを加える。サンプルを液体シンチレーシヨ
ンカウンターでカウントする。花粉に対するアレ
ルギーの場合、サンプル中の好塩基球は花粉濃度
の増加に応じて多量のヒスタミンを放出する。放
出されたヒスタミンは同位元素標識ヒスタミンと
競合してガラス微細繊維に結合し、したがつて同
位元素標識ヒスタミンの結合量は減少する。花粉
を加えない細胞サンプルに対して同位元素標識ヒ
スタミンの結合が10％低下すれば花粉に対するア
レルギー反応陽性と考えられる。

未知サンプル中のヒスタミン含量も、例１に述
べた標準曲線によつて計算できる。

第４図から明らかなように、ヒスタミンのガラ
ス微細繊維法と螢光分析法による放出測定法の間
には良好な相関が認められ、この両方法で測定し
たヒスタミンの放出は12例の患者で全く一致し
た。アレルゲンに対する患者の感受性を０の反応
なしから３の高度の反応に分類したところ、非ア
レルギー患者、３分類のアレルギーとも一致し
た。

例３前述の例２の方法を改良し、ヒスタミンはガラ
ス微細繊維に結合させたのち直接測定する。

ガラス微細繊維デイスク：GF／Ｂ材から径
６mmのデイスクを打ち抜く。

Ａ：Tris−AMC緩衝液（例１参照）に溶解した
非標識ヒスタミン溶液（ヒスタミン800nｇ−
400nｇ−200nｇ−100nｇ−50nｇおよびＯ／
Tris−AMC1ml）10μlを37℃で40分間インキユ
ベートし、ついで細胞収穫器中、水で15秒間洗
浄する。残つた水分をデイスクから除去する。
デイスクに結合したヒスタミンを螢光分析法に
よつて測定する。カツプリングは400μlの
NaOH／OPT〔ｏ−フタルアルデヒド
（Fluka）10mgをメタノール５mlに溶解し、
0.05M−NaOH18mlと混合する〕と室温で４分
間行う。螢光団を安定化するため、0.175M−
H₃PO₄400μlを加える。このサンプルを2800×
ｇで10分間遠心分離する。螢光の測定は
AMINCO螢光光度計を用いて行う（第５図の
曲線参照）。

Ｂ：以下の対照も包含する。Ａで用いたと同濃度
のヒスタミン10μlをデイスクと40分間、37℃で
インキユベートする。サンプルは細胞収穫器中
で洗浄せず、直ちにＡと同様にカツプリングさ
せた（第５図の曲線参照）。

Ｃ：以下の対照も包含する。Ａで用いたと同濃度
のヒスタミン10μlをデイスクを加えないで、40
分間、37℃においてインキユベートする。サン
プルは細胞収穫器中で洗浄せず、直ちにＡと同
様にカツプリングさせた（第３図の参照）。

この３つの曲線は、：試験管に加えた総ヒスタミン量：試験管中の材デイスクに加えたヒスタミン
の総量、：洗浄後、材デイスクに結合したヒスタミン
を示す。

上記例におけるこの操作は至適ではないが、曲
線はヒスタミン濃度と繊維への結合には良好な
直線的相関があることを示している。

例４直接ヒスタミン定量を行う場合の好ましい態様
においては微量滴定板が使用される。

例２の場合と同様にして、血液５mlから血漿と
赤血球を除去する。96個のウエルをもつガラス微
量滴定板の各ウエルに100μlのガラス繊維懸濁液
をとり、例１と同様に乾燥させ、これをアレルギ
ー反応の結果に生じたヒスタミン含量の検出に用
いる。

３種の濃度の試験アレルゲンサンプル10μlをウ
エルにとる。また血液サンプル100μlをウエルに
とり、滴定板を室温に20分間放置する。放出され
たインシユリンはインキユベーシヨンの間にガラ
ス微細繊維に結合する。微量滴定板を水で30秒間
洗浄し、ついで螢光分析に付す。

微量滴定板の各ウエルにNaOH／ｏ−フタル
アルデヒド100μlを加え、滴定板を室温に10分間
放置し、ついで各ウエルにH₃PO₄100μlを加えて
反応を止める。各サンプルについて螢光光度計の
値を読みとる。

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