JPH03199966A

JPH03199966A - 遊離型ｌ鎖の測定方法

Info

Publication number: JPH03199966A
Application number: JP33670689A
Authority: JP
Inventors: Kazutomo Wakasugi; 若杉　和倫; Mitsuru Suzuki; 満鈴木
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1989-12-27
Filing date: 1989-12-27
Publication date: 1991-08-30

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、人の血液等の被検体中に存在する遊離型り鎖
（Ｆｒｅｅ　Ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ　（以下、ＦＬｃ
　）　）をｆｆ１ｌ＋定する方法に関する。

従　　来　　技　　術り鎖とは、Ｈ鎖（ｌｌｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ　）ととも
に免疫グロブリンを構成するものである。免疫グロブリ
ンは、Ｈ鎖及びＬ鎖をコードしたｍＲＮＡが細胞質に移
行し、Ｈ鎖とＬ鎖が核内で個々に構成され、４本領の免
疫グロブリン分子として産生されるものである。その後
、核外（細胞内）において各々がＳ−８結合で結びつい
て免疫グロブリンが生産される。

細胞の核中では、Ｌ鎖とＨ鎖は略々等量産生されること
が知られており、核外に放出された後、−時的に細胞内
に滞在してＨ鎖と結合する。そして、余剰のＬ鎖は細胞
外に放出される。なお、Ｌ鎖の滞在がＨ鎖の放出をコン
トロールしている可能性も示唆されている。

ＦＬｃは、慢性関節リウマチ患者、結核患者等の血液中
において、高濃度で存在することが知られており、この
ようなＦＬｃを測定することは、前ンの疾病の早期発見
の意義が大きい。また、ＦＬｃには腎毒性があり、腎不
全患者に多く認められることから、この種の患者にとっ
ても早期発見の意義は大きい。

従来の■、鎖の測定方法の代表的なものには、Ｓφｌｌ
ｉｎｇ法がある。この測定方法は、被検体をゲル濾過に
より免疫グロブリンＬ鎖（以下、ＩｇＬｃ）とＦＬｃと
を分離し、にＬ鎖及びλＬ鎖に対して各々特異性を有す
る抗体を用い、かつアイソトープを使用する方法である
。

発明が解決しようとする課題ｆ］Ｉｓφｆｌｉｎｇ法では、前処理としてのゲル濾過
の工程が不可欠である。この工程は濾過に長時間を費や
し、その時間は一般的に７時間程度である。また、濾過
を行うための装置（５ｅｐｈａｄｅｘＧ−１００）に磨
耗が発生するという問題もある。

（２）１検体当り１装置を必要とし、長時間を要する問
題のほかに処理量にも制限がある。

（３）また、アイソトープを使用するために汚染物質を
生成し、特別な場所も必要となる。

発　　明　　の　　目　　的本発明は、Ｌ鎖が細胞外に遊離した単体の形で放出され
、ＦＬｃのレセプター（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）が抗原性を
有することに着目した。そして、本発明の目的は、ある
種の抗体を使用して、このようなＬ鎖を比較的簡便で多
数検体を瞬時に測定できる方法を提供することである。

課題を解決するための手段本発明は、被検体に遊離型Ｌｔｔ４のヒドゥンエピトー
プに対する抗体を加え、ネフェロメトリック法により前
記り鎖を測定することにより、前記課題を解決した。

作　　　　　　　　用本発明の測定の対象とすることができる被検体には、血
液、血清、尿、胸水、腹水、涙、汗、分泌物等がある。

ヒドゥンエビトープとは、英語名をｈｉｄｄｅｎ　ｅｐ
ｉｔｏρｅで表され、免疫グロブリン中のＬ鎖が遊離し
たときのみ抗原性を発揮する抗原決定基をいう。使用抗
体は、ヒドゥンエピトープと相補的に反応するもので、
代表的なものに、Ｂｅｎｃｅ−Ｊｏｎｅｓ　Ｋａｐｐａ
　Ｌｉｇｈｔ　ｃｈｉａｎ　、　Ｂｅｎｃｅ−Ｊｏｎｅ
ｓＬａｍｄａ　Ｌｉｇｈｔ　ｃｈｉａｎ　　（Ｇｅｌｃ
ｏ、　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｉｎｃ、社ＩＩ）　、Ｒ
ａｂｂｉｔ−ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ　Ｆｒｅｅ　Ｋａｐ
ｐａ　ｃｈａｉｎ。

Ｒａｂｂｉｔ−ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ　　Ｆｒｅｅ　　
Ｌａｍｄａ　　ｃｈａｉｎ（ＤＡＫＯＰＡＴＴＳ社製）
がある。

被検体の中、特に、腎不全愚者等の被検体の中には、Ｆ
Ｌｃが存在することは前述のとおりである。

また、Ｌ鎖にはヒドゥンエピトープとして遊離したとき
に抗原性を発揮するレセプターの存在することも同様で
ある。このレセプターに対して上記のような抗体を使用
すると、被検体の溶液内沈降反応において抗原抗体複合
体が生成される。

次に、ネフェロメトリック法によって上記の抗原抗体複
合体を測定する。ネフエロメトリック法とは、発光ダイ
オードを光源とする波長的８４０ｎｍの近赤外線光を用
い、上記抗原抗体複合物による散乱光を測定する比ろう
法である。具体的には、ネフェロメトリックアナライザ
ー（ＢｅｈｒｉｎｇＮｅｐｈｅｒｏｍｅｔｅｒ　Ａｎａ
ｌｙｚｅｒ　　（以下、ＤＮＡ　）　）　が使用され、
一定時間の前後、例えば被検体への抗体の混和後１０秒
後と１２分後における散乱光の差（単位：　ｂｉｔ　）
からＬ鎖の濃度を算出する方法でちる。

以下、特に晰りがない限り、散乱光の差の測定時間は上
記の値に従うものとする。

実　　　験　　　例［試薬］抗血清試薬はウサギ抗ヒトＦＬｃ抗体（に：Ｌｏｔ。

Ｎｏ、　０５８．λ：　Ｌｏｔ　Ｎｏ、　０８７．　Ｄ
ａｋｏｐａｔｔｓ、　ＧｌｏｓｔｒｕｐＤｅｎｍａｒｋ
　）　をｎｏｒｍａｌ　ｒａｂｂｉｔ　ｓｅｒｕｍ　　
（Ｌｏｔ　Ｎｏ、８０４０１０２０、　Ｚｙｍｅｄ、　
Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ　ＣＡ　ＵＳＡ）でに：１
．８倍、λ：２．０倍に希釈調整した。標準蛋白はＢｅ
ｎｃｅ−Ｊｏｎｅｓ蛋白（ＢＪＰ）　　（ｇ　：　Ｌｏ
ｔ　Ｎｏ、　ＥＧＩ。

λ：　Ｌｏｔ　Ｎｏ、　Ｅ）ＩＩ、　Ｇｅ１ｃｏ　５ｈ
ｒｅｖｅｓｐｏｒｔ　ＬＡ　ＵＳＡ　）を用いた。検体
の希釈及び反応液は、ＢＮＡ専用試薬のＮ希釈液、Ｎ反
応緩衝液（Ｂｅｈｒｉｎｇ　Ｗｅｒｋｅ。

Ｍａｒｂｕｒｇ　ＦＲＧ　）を使用した。

［測定条件］ＦＬｃの測定条件は、被検血清希釈倍数５倍、検体量１
００μｍ、抗血清量４０μｍ、反応緩衝液量１６０μｌ
、反応時間１２分間、標準曲線は２倍階段希釈で４．０
−０．１２５■ｇ／ｄｉとした。

［被検血清］健常人血清及び透析患者血清、多発性骨１１腫患者血清
を使用した。血清は測定直線まで一２０℃に保存した。

［標準曲線］標準蛋白ＢＪＰの蛋白量はプロティンアッセイ試薬（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂ、、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ　ＣＡ　
ＵＳＡ　）により色素結合法で測定した。　　１０ｍｇ
／ｄｌに調整したにＢＪＰ及びλ［ｌＪＰによる標準曲
線（４，０−０，１２５■ｇ／ｄｌ）について５回測定
を行い、日差再現性を検討した。

表１及び表２は、にＢＪＰ及びλＢＪＰについて、各々
、平均値、標準偏差及び変動係数を示し、第１図はにＢ
ＪＰ標準曲線再現性、第２図はλＢＪＰ標準曲線再現性
を示している。表中、ｌ１ｅａｎは平均値、ＳＤは標準
偏差、Ｃｖは変動係数である、に型では、０．５ｍｇ／
ｄｌ、０．２５ｍｇ／ｄｌ　、及び０．１２５ｍｇ／ｄ
ｉで変動係数が大であった。λ型では最低濃度０．１２
５　ｍｇ／ｄｌで高い変動係数であった。他は良好な再
現性であった。

表　　　　　１ｎ＝５表ｎ＝５［希釈直線性］濃度の異なる血清３検体とＢＪＰ溶液を用いてＮ希釈液
で希釈系列を作り直線性を検討した。希釈直線性は、ｇ
　ＦＬｃでは１−１５ｍｇ／ｄｌの範囲でγ＝０．９９
８５±０．０００９　（平均±ＩＳＤ、ｎ：４）、λＦ
Ｌｃでは１．５−１０ｗ＋ｇ／ｄｉの範囲でγ＝　０．
９９８６±０．０００５　（平均±ＩＳＯ，ｎ＝４）と
良好であった。これらの結果を第３図及び第４図に示す
。

［再現性］同時及び日差再現性は、濃度の異なる血清を試料として
検討した。同時再現性の結果を表３及び表４に示す。同
時再現性について５検体の血清を５回測定した。ｓ：　
ＦＬｃ　ＬｔＣＶ；２．１−９．２％、λＦＬｃはＣＶ
；　３．２−１１．１％であった。

日差再現性については４種試料を５回測定した。

その結果を表５及び表６に示す。λＦＬｃが低濃度で高
い変動係数を示した。

表　　　　　３表に−ＦＬｃ表 λ−ＦＬｃ表［添加口取試験］濃度の異なる３検体の血清に、各種類の濃度のＢＪＰ溶
液を血清量の１／４量加えて、その回収率を求めた。そ
の結果を表７及び表８に示す。回収率は、ｐｃ　ＦＬｃ
が８４．４−１１５．２％、λＦＬｃが９４．２−１２
１．２％であった。

表７以下、本発明の方法により、２種の症状におけるＦＬｃ
を測定した。

［多発性骨髄腫症例における値］多発性骨髄腫症例において、ＩｇＧＫ型８例。

ＩｇＧλ型６ｆ！４、ＩｇＡＫ型２例、ＩｇＤλ型」例
、ＢＪＰに型１例の計１８例につき測定した結果を表１９に示す。ＩｇＬｃ濃度は■（鎖濃度を反映していると
考えられるが、Ｆｌｃはそれ以外の動態をも反映してい
る様子がうかがおれる。

表　　　　　９＋９Ｄ−λ ８８２２１７０．３３．２９．００．４［血液透析療法中の患者血清における値］慢性腎炎（Ｃ
ＲＦ　）で血液透析ＣＨＤ）　療法前の５人と、）１０
ｍ法中０患者４５人と、健常人４５人（男２０人、女２
５人）の合計９５人のＦＬｃを測定した。その結果を表
１０に示す。

健常人では、にＦＬｃｏ、７±０．４ｍｇ／ｄｉ　（平
均士　２１ＳＤ）、λＦＬｃ　Ｏ，Ｓ±０．３＋ｓｇ／ｄｉ、　
　ＦＬｃ−ｇ　／λ比２．１±０．４であった。ｇ　Ｉ
ｇＬｃは３５２±６１ｍｇ／ｄｌ、λＩｇＬｃは２０５
±４７ｍｇ／ｄｌ　、　ＩｇＬｃ　−ｐｃ　／λ比は１
．８±０．３であった。

ＣＲＦで無ＦＩＤ療法では、にＦＬｃは３．４±０．９
ｍｇ／ｄｌであったが、λＦＬｃは３．６±１．０ｍｇ
／ｄｉと健常人の約２倍値であった。ＨＤでは透析年数
に関係なく、にＦＬｃは約１．８倍濃度、λＦＬｃは４
倍濃度であった。

表　　　　　１０ＨＤＣＲＦ（４５）嬰竺旦旦３９５２１３１．９４５６　２．５　２．８　０．１　１１０　６１　　０
．３（、＋３５６　３．４　３．６　　Ｃｏ　　３３６
　１７４　２．０３３６　０．９　　ＣＤ　　０．１　
　８１　　５６　０．２［本発明とＳφｌｌｉｎｇとの
比較］標準蛋白量を測定した０本発明ではＢｒａｄｆｏｒｄの
ｄｊｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｊｎ　ａｓｓａｙ
で。

Ｓφｌｌｉｎｇではｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｆｏｌｉｎ　ｐ
ｒｏｃｅｄｕｒｅで測定した。

Ｆｏｌ　ｉｎ法による標準蛋白量と、ｄｉｅ−ｂｉｎｄ
ｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓａｙによる標！ｌＩ蛋白
量を２８０ｎｍにおける吸光度（Ｅ１％／１ｃｍ＝　１
２．４）とを対比した結果を表１１に示す。その結果、
Ｓφｌｌｉｎｇの標準蛋白量は本発明のによる標準蛋白
量のに２０．７倍、１２１．０倍であった。

表　　　　　１１ｄｉｅ−ｂｉｄｉｎｇ発　　明　　の　　効　　果（１）本発明によると、被検体の前処理が不要となる。

従って、この観点から操作が容易である。

（２）抗体の混和後１２分前後からＢＮＡによる測定が
開始され、１時間径度で測定が完了する。

１３）　ＢＮＡは２５０検体を一時に測定する能力があ
り、上記単位当りの測定時間も勘案すると、短時間のう
ちに大量の検体を測定することができる。また、従来の
ようにゲル濾過の手法を用いないことから操作も簡便で
ある。

（４）本発明は、腎不全患者のみならず、多発性骨１１
腫、血液透析患者例、さらには健常人も対象とすること
ができることを確認した。

（５１ＢＪ蛋白を用いた希釈直線性も、ｇ　ＦＬｃ（１
−１５ｍｇ／ｄｉ範囲）でｙ　＝　０．９９８５、λＦ
Ｌｃ（１，５−１０ｍｇ／ｄｌ範囲）でγ＝　０．９９
８６と良好であった。

（６）再現性について、同時ではｇ　ＦＬｃ　ＣＶ：２
．Ｉ−９，２％、λＦＬｃ　ＣＶ：３．２−１１．１％
、日差ではにＦＬｃＣＶ：２．７−１１．８％、Ｌ　Ｆ
Ｌｃ　ＣＶ：２．８−２０．８％であった。

（７）添加回収試験での口取率は、にＦＬｃ　８４．４
−１１５．２％、λＦＬｃ　９４．２−１２１．２％で
あった。

【図面の簡単な説明】

第１図はにＦＬｃ標準曲線再現性を示すグラフ、第２図
はλＦＬｃ標準曲線再現性を示すグラフ、第　５３図は種々の被検体におけるにＦＬｃの希釈直線性を示
すグラフ、第４図は種々の被検体におけるλＦＬｃの希
釈直線性を示すグラフである。６第３図希釈試験（ＫＦＬｃ）第図

Claims

【特許請求の範囲】

被検体に遊離型Ｌ鎖のヒドゥンエピトープに対する抗体
を加え、ネフェロメトリック法により前記Ｌ鎖を測定す
る方法。