JPH03201982A - 固定化トロンビン、その製法および止血用製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 し産業上の利用分野］ 本発明は、固定化トロンビン、特にトロンビンをアルギ
ン酸またはその塩に酵素固定化技術により固定化させて
なる固定化トロンビン、その製造方法およびこれを有効
成分として含有する止血用製剤および医療補助材料に関
する。

［従来の技術］ 外傷、または手術創面の創傷部に適用するためのトロン
ビンをモノフィラメント、繊維集合体、フィルム、スポ
ンジのような構造物に固定化した創傷部治療用材料は公
知であり（特公昭６１−５９７３７号）、またアルギン
酸を固定担体とし、トロンビン以外の酵素を包括法で固
定化した固定化０素は公知である（特公昭５９−２８４
７５号および特開昭５９−１０９１７７号）。一方、担
体をセファロース（ファルマシア社製）とした固定化ト
ロンビンは公知である（プロスタンド、Ｆら、ヘモスタ
シス（ＨａｅｍｏｓＬａｓｉｓ）第６巻第２２５−２３
５頁（１９７７年）およびマルシニアク、Ｅ、ら、スロ
ンボシス・アンド・ヘモスタシス（Ｔｈｒｏ＊ｂＨａｅ
ｍｏｓｔａｓ）第５１巻第２７−３１頁（１９８４年）
）。本発明の固定化トロンビンはトロンビンとアルギン
酸またはその塩を酵素が容易に脱離しない方法により固
定化することを特徴とするものであり、従来知られてい
ないものである。

［発明が解決しようとする課題］ トロンビン製剤は、古くからある臓器性止血剤であるが
、最近消化管出血に経口的に使用されている。トロンビ
ンは、至適ｐＨ７，５−７，８を有する酵素で、溶解時
、強酸強アルカリでは極めて不安定で失活する。胃中で
より適切な効果発現を期待するためには、胃液を物理的
に除去、Ｉ−１、受容体きっ抗剤による胃酸分泌の抑制
、制酸剤との併用が必要である。また、この局所用のト
【１ンビンは、従来の粘膜保護剤などに加えて投与され
ることが多いが、ｐＨ５以下では不活性化されるため常
に胃内のｐ　Ｈをチエツクする必要があった。

またトロンビンの凝血速度は濃度依存性であり、比較的
高価であるにもかかわらず、これを大量に授与する必要
があった。

一方、アルギン酸およびその塩類は褐藻類の細胞膜を構
成する主成分で、高分子量を有し水溶液は粘性が高く、
人体に対しての安全性が高いところから選択されたもの
である。

アルギン酸またはその塩は、それ自体、創面に強く粘着
することにより物理的な止血作用を呈し、また赤血球に
対して架橋構成を行い止血作用を促進するものとされて
いるが、その作用は緩和なものであり、緊急の止血には
向かない。

本発明は上記それぞれの欠点を改善するために行なわれ
たものであって、その要旨はトロンビンをアルギン酸お
よびその塩に酵素が容易に脱離しない方法によって結合
させることにより上記の欠点を改善しようとしたもので
ある。しかし、トロンビンはアルギン酸に比較して分子
量が小さく、これをアルギン酸のような大分子量のもの
に結合させた場合、果たしてその止血作用を維持できる
かどうか不明であった。しかるに、本願発明によって、
多少酵素活性が低下する傾向が認められるものの、本質
的な活性は充分に維持されるため、実用に支障のないこ
とが明らかになった。また、これによって、固定化トロ
ンビンとアルギン酸の相乗効果も期待できる ［課題を解決するための手段］ 本発明は上記の知見に基づいて完成されたものであり、
その要旨はトロンビンをアルギン酸またはその塩に酵素
固定化技術により固定化させてなる固定化トロンビン、
その製造法、固定化トロンビンを有効成分とする止血用
製剤および医療補助材料である。

本発明に使用されるトロンビンには市販品を利用するこ
とができ、−射的にヒトまたはウシの血漿から抽出して
製造するが、化学的合成またはバイオテクノロジーによ
るものであってもよい。

アルギン酸またはその塩は褐藻類を原料とする通常の市
販品を使用することができる。本発明のアルギン酸塩に
は、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、カル
シウム塩、マグネシウム塩などが含まれる。

本発明の酵素固定化技術には、担体結合法のうちの共有
結合法などの結合法、グルタルアルデヒドなどの架橋試
薬を使用してトロンビン間で架橋を起こさせ、不溶化し
て固定化する架橋法、お上びアルギン酸ナトリウムなど
の水溶液にトロンビンを加え、これを塩化カルシウムな
どの水溶液中に肩下してアルギン酸カルシウム内にトロ
ンビンを取り込ませる包括法も含まれるものとする。

具体的には、本発明のトロンビンをアルギン酸に固定化
する方法には、アルギン酸に含まれるＯ菖４基またはＣ
０ＯＨ基にトロンビンの官能基である、遊離のアミノ基
、カルボキシル基、スルフドリル基、イミダゾール基、
フェノール基、水酸基などを直接結合させる方法、およ
びこれらの官能基に別の官能基をもつ架橋成分を結合さ
せ、架橋成分の官能基にトロンビンの官能基を結合させ
る方法が含まれる。アルギン酸または架橋成分の官能基
とトロンビンの官能基との結合としては、イミノ結合（
シッフ塩基）、ジアゾ結合、アミド結合、ウレタン結合
、ウレイド結合、グアニジノ結合、エステル結合、エー
テル結合、エポキシチオ結合、エポキシチオ結合、チオ
カルボキシ結合、配位結合などが含まれる。これらの方
法は既知の方法により形成することができる。例えば、
共有結合法の一般的な例として、アルギン酸のＯＨ基を
臭化シアンで活性化し、これにトロンビンを結合させる
方法があるが、この方法は本発明ではかならずしも好ま
しくない。さらに、担体のカルボキシル基をアジド、ク
ロリド、カルボジイミド、イソシアン酸塩などの誘導体
とし、トロンビンの遊離アミノ基とでペブヂド結合を形
成させる方法、またはジシクロへキシルカルボジイミド
のようなカルボジイミド試薬もしくはウッドワード試薬
Ｋを利用することもできる。好ましいのは、アルギン酸
のカルボキシル基とトロンビンを水溶性カルボジイミド
で縮合する方法である。アルギン酸またはトロンビンの
官能基に別の官能基であるスペーサーを導入して結合さ
せる例としては、アルギン酸のカルボキシル基とベンジ
ジンを反応させて、アルギン酸に芳香族アミノ基を導入
して亜硝酸ナトリウムと反応させてジアゾニウム化合物
とし、これを酵素（チロンン残基、ヒスチジンのイミダ
ゾール基など）と結合させて固定化する方法、アルギン
酸のＯＨ基に２．４．６−ドリクロロトリアノンを反応
させて、トリアジニル誘導体に酵素を固定化する方法な
どがある。

本発明による固定化酵素を有効成分として含有する止血
製剤は局所投与および経口投与が可能であり、出血局所
に生理食塩水に溶解して（トロンビンとして、２０〜１
０００単位／ｍｌ）を噴霧もしくは潅注するかまたは粉
末のままで散布するか、もしくは軟膏を塗布する。上部
消化管出血の場合は適当な緩衝液に溶解した溶液（トロ
ンビンとして１００〜４００単位／ｍｌ）を経口投与す
る。

経口投与および局所投与に使用する剤型には、粉末剤、
顆粒剤、マイクロカプセル剤、錠剤、乳剤、カプセル剤
、展剤、懸濁剤、乳剤、軟膏が含まれる。製剤調製に当
たり、緩衝剤、等張化剤、賦形剤、安定剤、防腐剤、着
香料、着色料を添加してもよい。また本発明の固定化ト
ロンビンを綿、紙、不織布、フィルム、スポンジなどに
物理的に吸着させて止血用捕助材料として用いることが
できる。

本発明による固定化トロンビンは以下に述べるように散
多くの長所を有する。すなわち、トロンビンは胃酸によ
る分解に低抗性ができ、体内における滞留時間が長くな
る結果、作用時間が長期化し、さらに、製剤の安定性お
よび保存性が良くなる。この結果、トロンビンの止血効
果は、クロットの付着時間の延長、作用時間の延長によ
り一時的または完全止血が得られる。

次に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ トロンビン（３万単位、持田製薬製）７４ｍｇ、アルギ
ン酸ナトリウム（共成製薬社製、分子虫約１１万）２．
５％水溶液４９および水溶性カルボジイミド（ｌ−エヂ
ルー３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボッイ
ミド塩酸塩）２（１＋ｙを撹拌装置を具備した反応容器
に入れ、室温下、Ｎ／２００ＣＱでｐｏ４〜６に調整し
ながら１時間反応させる（最終的にはｐＨ約５）。さら
に続けて、４℃にて１８時間反応させた。

得られた反応混合物を０．１ＭＮａＨｃＯ３でｐ）（７
，２にした後、水で全１ｉｋ２０ｇとする。

このサンプルを下記のような条件下ゲル濾過クロマトグ
ラフィーにより分離した。

担体：中圧液体クロマトグラフ用担体トヨパールＨＷ−
５５Ｓ（排除限界分子量　蛋白質７×１０’） カラムサイズ：φ２．２ｃｘｘ５０ｃｍ溶出液：Ｍ／１
５　　リン酸緩衝液ｐＨ７，２流速：１．５１１２／分 検出：紫外分光光度計（２８０ｎｍ）による。

結果を第ｔＡ図に示す。

フラクション４５〜７５までの吸収はアルギン酸にトロ
ンビンが結合した固定化物を示し、７８〜９５の吸収は
未反応トロンビンを示す。（参考として、同一条件での
トロンビン単体のゲル濾過クロマトグラフィーのチャー
トおよびアルギン酸ナトリウムの同チャートを、第１Ｂ
図および第１Ｃ図として示す。ただし、アルギン酸ナト
リウムは２０５ｎ−にて測定） 得られたフラクションに関し、ポリアクリルアミドゲル
の電気泳動法により固定化トロンビンを確認した。結果
を第２図に示す。

第２図において、■はマーカー蛋白質であり、■、■、
■、■、■および■のレーンの下の数値は各々、第１Ａ
図のフラクション番号である、４５．５１，５７．６６
．８４および９０に対応する。■〜■（フラクション番
号４５〜６６）は使用ゲル内に入らない大きな分子量の
バンド、すなわち固定化トロンビンのバンドだけが認め
られる。

■および■は固定化しなかったα−トロンビンのバンド
である。■および■はゲルｔ！過前の混合物でゲル内に
入らなかった固定化トロンビン、固定化にあずからなか
ったα−トロンビンのバンド、自己分解を受けたβ−お
よびγ〜トロンビンのバンドである６（実施例−■こよ
り、アルギン酸にトロンビンが結合して、トロンビン固
定化物が得られることが証明される。） 実施例２ 実施例１と同様の反応条件で、反応混合物を得た後、得
られた反応混合物を０，１ＭＮａＨｃＯｓでｐＩＩ７．
２にした後、水で全ｆｆ１２０ｇとし、次の条件どゲル
濾過クロマトグラフィーにより、分離を行い、各フラク
ション毎に蛋白質量と合成基質に対する活性値を求め、
ｌμｇ当たりの比活性を算出した。

担体：中圧液体クロマトグラフ用担体トヨパールＨＷ−
５０Ｓ（排除限界分子量　蛋白質８×ｌＯ′） カラムザイズ：φ２．ＺｃｘＸ５０ｃｍ溶出液：Ｍ／１
５　　リン酸緩衝液ｐＨ７，２流速二１，５ｘｆｆ／分 活性測定法 ■　各フラクションを２０倍に希釈し、その１００μＱ
をプラスチック試験管に採取して３７℃で約５分間加温
する。

■　発色性基質液（テストデーム■Ｓ−２２３８，２５
Ｒ９を精製水４０ｘＱで溶解したもの）２５０μＱを加
え混和し、３７℃で正確に５分間加温する。

■　反応停止液（クエン酸２ｗ／ｖ％水溶液）ｌ」４Ｑ
を加え混和する。

■　分光光度計にてサンプルブランクを対照に波長４０
５ｎｍでの吸光度を測定する。

■　単位既知のトロンビンについて同機に操作して吸光
度を測定し、検量線とする。

実施例２の結果をより明確にするため、トロンビンにつ
いて実施例２と同様にして、比活性を求めた。

算出した比活性を第１表に示す。これらの結果よりアル
ギン酸にトロンビンが結合した固定化物が得られている
ことがわかる。

第１表 比活性 （総タンパク質量あたりの活性　単位／μ９）実施例３ 本発明による固定化トロンビンの散剤を調製するために
実施例１の反応に関し、１５倍にスケールアップして、
実施例１の反応条件で反応して、反応混合物を得た。

ｔ’Ｊられた反応混合物を、０．ＩＭ　ＮａＨＣＯ，で
ｐＨ７，２にした後、水で全１１３００９とした。この
ものを実施例１に示したゲル濾過クロマトグラフィーに
かけて分離した。

フラクンヨン番号５４からフラクンヨン番号６６に相当
するフラクションを一溶液にまとめた。

この溶液を脱塩した後、凍結乾燥により固定化トロンビ
ンＩ９を得た。次の処方により、混和して散剤を得た。

重量部 ・Ｌ配本発明周定化トロンビン　　　　７０．０・乳糖
　　　　　　　　　　　　　　　２９．９・メディカル
エツセンスＮｏ、５２５２３　　　　０　、１（三栄化
学社製） １　００．０ 実施例４ 実施例３と同様に反応、操作して得られた脱塩後の固定
化トロンビン溶液２，０１ｌｌを採取し、５０ＩＩＩｌ
に希釈した。

コノ溶液に外科用ガーゼ（１５ｃｍＸ　ｌ　５ｃｍ）を
１５℃、３０分浸漬して、その後真空乾燥（２５℃以下
）することにより、固定化トロンビンが吸着した外科用
ガーゼを得た。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ図は、固定化トロンビンのゲル濾過チャートであ
り、第１ＢおよびＩＣ図は、トロンビン水溶液およびア
ルギン酸ナトリウム水溶液のゲル濾過チャートである。 第２図は、第１Ａ図の各フラクションの電気泳動図であ
る。 第１Ａ図 第１Ｃ図 第１８図 第２図 ０ ５ Ｕ ｒコ リＵ １υ５ １４ノ 流（ｍ＋

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、トロンビンをアルギン酸またはその塩に酵素固定化
   技術により固定化させてなる固定化トロンビン。 ２、トロンビンをアルギン酸またはその塩に酵素固定化
   技術を用いて固定化することからなる、請求項１記載の
   固定化トロンビンの製造法。 ３、請求項１記載の固定化トロンビンを有効成分とする
   止血用製剤。 ４、請求項１記載の固定化トロンビンを有効成分とする
   医療補助材料。