JPH0320279A - 新規免疫抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （Ｓｔｒａｐｔｏｍｙｃｅｓｓ　　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐ
ｉｃｕｓ　　ｓｕｂｓｐ．ａｓｅｏ−ｍ　ｃａｔｉｃｕ
ｓ）　　（Ｍ　Ａ　６　４　７　５　）、ＡＴＣＣＮｏ
．１４８９１の変異化菌株ストレプトマイセスヒグロス
コピクス亜種アスコマイセテイクス（Ｓｔｒａｐｔｏｍ
ｙｃａｓ　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ　ｓｕｂａｐ．
ａｓｃｏＩｌｙｃａｔｉｃｕｓ）　（ＭＡ　６　６　４
　６　，　Ａ　Ｔ　Ｃ　ＣＮｏ．５３８５５）の醗酵に
より生産される新規免疫抑制剤Ｌ−６８７，８１９に関
連する．本方法は窒素栄養含有の炭水化物培養液中、好
気的条件下、新規微生物を培養するものである． １９８３年、米国ＦＤＡは、臓器移植手術の分野で革命
を起こした非常に効果のある抗拒否剤であるシクロスボ
リンを認可した．本薬剤の作用は、移植外部タンパク質
を拒否するために体免疫系が天然の防御因子の貯蔵を用
意するのを阻害するものである． 本薬剤は移植拒否と戦うのに効果的であるが、腎疾患、
肝損傷及び潰瘍を引き起こし、多くの場合，重篤な状態
となる欠点を有する． 本出願に参考文献として引用するフジサワ（　Ｆ　ｕｊ
ｉｓａｗａ）のＥ　Ｐ　Ｏ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　
Ｎ　ｏ　．０１８４１６２において、シクロスポリンよ
りも１００倍活性があると云われる新規マクロライド免
疫抑制剤ＦＫ−５０６についての記載がある．構造的に
関連したＦＫ−５２５のみならず、本マクロライドは特
定菌株ｘｔ−レプトマイセスツクバエンシス（］ ｔｍ　ｃａｓ　ｔａｕｋｕｂａａｎｓｉｓ）の醗酵によ
り生産される，更に又，Ｓ．ヒグロスコピクス亜種１Ｌ
シマエンシス（Ｓ．ｈ　　ｒｏｓｃｏ　ｉｃｕｓ　ｓｕ
ｂｓｕｐ．巨眩吐鎌短吐困）の生産する関連マクロライ
ド免疫抑制剤ＦＫ−５２０及びＦＫ−５２３についての
記載もある． Ｔ．アライ（Ｔ．　Ａｒａｉ）に対するＵＳＰ３，２４
４，５９２においては、抗真菌剤「アスコマイシン』を
生産するストレプトマイｇは生匡吐）の培養についての
記載がある． Ｓ．Ｔ．Ｃｈｅｎ，Ｅ，Ｓ．Ｉｎａｍｉｎｓ，Ｂ．Ｈ．
Ａｒｌｓｏｎ，　Ｌ．　Ｓ　．　Ｗｉｃｋｅｒ　（Ｍｅ
ｒｋ　＆　Ｇ　ｏ　，Ｉｎｃ．）等による、本出願で参
考文献として引用する米国特許出願番号２１３，０２５
Ｄ　ｏｃｋａｔ　１７７６７）において、Ｌ−６　８　
３　，　５９０の存在下、菌株アクチノブラナセテ　Ｓ
ｐ．（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎａｃａｔａ　Ｓｐ．）　（
Ｍ　Ａ　６　５　５　９　）ｓＡＴＣＣ　　Ｎｏ．　５
　３　７　７　１の培養によりＬ−６８３，５９０を微
生物変換させて生産した新規免疫抑制剤である『デメト
イムノマイシンＪ　（　ｒｄａｍｅｔｈｉｍａｕｎｏａ
＋ｙｃｉｎＪ　）　Ｌ　一６８３、Ｔ４２　（Ｌ−６８
３，５９０のＣ一３１脱メチル化同族体）について記載
されている． しかしながら、免疫抑制剤Ｌ−６８７，８１９の製造文
献中、Ｌ−６８３，７９５　（ＦＫ−５２３）のＣ−３
１脱メチル化誘導体であるとの記述はされていない． 本分野において．ＦＫ−５０６に構造関連した新規マク
ロライド免疫抑制剤が探し求められている． 本免疫抑制剤Ｌ−６８７，８１９はＡＴＣＣＮｏ．１４
８９１　（ＭＡ６４７５）をＮ−メチル−Ｎ′一二トロ
ーＮ−二トロソグアニジンで変異化処理して得た変異株
、ストレプトｓｕｂｓｐ．　ａｓｃｏｍ　ｃｅｔｉｃｕ
ｓ）　（Ｍ　Ａ　６　６　４　６　）の醗酵により直接
得られる．醗酵はマクロライド免疫抑制剤Ｌ−６８３、
Ｔ９５　（ＦＫ−５２３）の存在を必要とせず，窒素栄
養含有の炭水化物培養液中、深部好気的培養条件下で行
なう．本培養は、ＰＨ８．０以下，例えば約７でＬ−６
８３，７９５　（ＦＫ−５２３）のモノ一〇−３１脱メ
チル化物であるＬ−６　８　７，８　１　９を生産せし
めるのに十分な時間かけて行なう． 得られたＬ−６　８　７，８　１　９は免疫抑制活性を
有する．すなわち本出願において、『Ｔ細胞増殖検定』
として言及されている、カルシウムイオノホア（イオノ
マイシン〉及びホルボールミリステートアセテート（Ｐ
ＭＡ）併用誘発のＴ細胞刺激検定により示された如く、
Ｔ細胞活性化の阻害が陽性である．本検定の原理は、イ
オノマイシン及びＰＭＡを併用して刺激したマウスＴリ
ンパ球の増殖を測定するものである．本検室において陽
性試料は、トリチウム標識チミジンの取り込みの減少で
明らかなようにＴ一細胞増殖を阻害する． 本発明において、菌株ストレプトマイセスｍ■互ｕヨ視
）（ＭＡ６　６　４　６）ＡＴＣＣ　　Ｎｏ．５３８５
５を、窒素栄養含有水性炭水化物培養液中、深部好気的
培養条件下で十分な時間培養して生産された新規免疫抑
制剤Ｌ−６８７．８１９を提供する．Ｌ−６８７，８１
９は電子衝撃マススペクトル法により決定された分子式
Ｃａ１Ｈｓｓ　Ｎ　Ｃｈ＊　（　Ｃ４Ｌ　Ｈａｓ　Ｎ　
Ｏｔ＊＋Ｔ４，Ｔ＝ＳｉＣ，Ｈ．として、計算値１０５
１．６０８８．実測値１０５１．６０８９）を有し，図
１に示す如きプロトン核磁気共鳴スペクトルを有する． 本発明はＬ−８　８　７，８　１　９を製造するためＮ
ｏ．５３８５５の醗酵を含む．本微生物は米国メリーラ
ンド州ロックビル市パークローン通り１２３０１のＡ　
ｍａｒｉｃａｎ　Ｔ　ｙｐａ　Ｃ　ｕｌｔｕｒａＣ　ｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎに１９８９年１月１２日、ＡＴＣＣ　
　Ｎｏ．５３８５５として記録された制限寄託物であり
，ニュージャージー州ローウェイ市のＭａｒｋ　Ｃｕｌ
ｔｕｒａ　ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎにＭＡ６６４６として
現在記録されている．本微生物の形態学的，培養学的，
生物学的及び生理学的特性を含む物理的特性及びタキソ
ノミーを以下に示す． 菫（Ｊノ．６８４生 Ｗ一　　枝分れフィラメント様菌体． 直径０．６ミクロン、胞子体は短く，密集したラセン形
． オートミール亀天斐里 栄養増殖：裏面：灰〜白色 気生集団：豊富で鈍い灰色〜黒色 可溶性色素：なし グリセロールーアスパラギン 栄養増殖：裏面：灰白色、半透明 前面：灰白色、半透明 へりは，でこぼこ 気生菌糸：希薄な灰白色、粉状 可溶性色素：なし 一デンブン　天 栄養増殖：裏面：クリーム色〜黄色 気生集団：豊富でベルベット状，淡灰色〜黒色 気生菌糸：白色、ベルベット状 可溶性色素：なし イースト　　　ーモルト　　物 栄養増殖：裏面：灰色〜黄色 気生集団二豊富で明〜中灰色、鈍く綿状可溶性色素：な
し ヒ　　」　パターン ｄ−グノレコース＋＋　　ｄ−マノレトース中　　シュ
ークロースーｄ−アラビノース◆／−　　ｄ−マンニト
ール＋◆ｄ−キシロース料トアラビノース◆／−　　ｄ
−マンノース◆十　トキシロース　ーｄ−フルクトース
＋十　トマンノースー　　アルファｔラクトース奸トグ
ルコース−　　　ｄ−ラフィノースー　ベータトラクト
ースＨイノシトール◆／−　　　ＩＩ−ラムノーＸ＋＋
◆◆は実質的増殖；　＋は緩和な増殖；＋／一は僅かに
増殖；　一は増殖しないことを示す．多くのｒＬ−６　
８　７，８　１　９一生産』変異株ストレプトマイセス
ヒグロスコピクス亜種ヱスコマイセ“イクス（Ｓｔｒａ
　ｔｏｗ　ａｓｓ　ｈ　　ｒｏ−本発明の工程を実施で
きるが，特にＡＴＣＣＮｏ．５３８５５菌株が望ましい
． 一般には、Ｌ−６８７，８１９は上述のｒＬ−６８７，
８１９生産菌株』を、同化できる炭素及び窒素源を含む
栄養培養液中、深部好気的条件下（例えば、振盪培養，
深部培養等）で培養（醗酵）して製造することができる
．培養液は醗酵工程の開始時及び終了時（採取時）にｐ
Ｈを約７に保つことが望ましい．ｐＨが高いと，実質的
及び／又は全体的な生成物の損失につながる．望ましい
ｐＨは、モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、モル
ホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）等の如き緩衝剤
を用いて保持させるか，又は以下に示す生産培地の如き
緩衝性を本来から持つ栄養物を選んで望ましいｐＨを保
つ．栄養培地中の所望な炭素源は、グルコース、キシロ
ース，ガラクトース、グリセリン、デンプン，デキスト
リン等の如き炭水化物である，使用できる他の炭素源は
、マルトース，ラムノース，ラフィノース，アラビノー
ス、マンノース、サリチン、スクシン酸ナトリウム等で
ある． 好ましい窒素源は，イースト抽出物、肉抽出物，ペプト
ン、グルテンミール，綿実ミール、大豆ミール、及び他
の野菜ミール（部分的又は全体に脱脂），カゼイン加水
分解物、大豆加水分解物，イースト加水分解物，トウモ
ロコシ浸出液、乾燥イースト、麦芽、羽毛ミール，ピー
ナツ粉，醸造家の可溶成分のみならず、アンモニウム塩
（例えば，硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン
酸アンモニウム等）、尿素，アミノ酸等の如き無機及び
有機窒素化合物である． 炭素及び窒素源は併用するのが好ましいものであるが，
その純粋なものを使用する必要はない．これは微量の増
殖因子，適量のミネラルを含む不純物を使用するのが望
ましいためである．必要ならば、培養液中に炭酸ナトリ
ウム又はカルシウム、リン酸ナトリウム又はカリウム、
塩化ナトリウム又はカリウム、ヨウ化ナトリウム又はカ
リウム、マグネシウム塩，銅塩、コバルト塩の如きミネ
ラルの塩を加えることができる．もし必要ならば、特に
培地がはげしく泡立つ場合、流動バラフィン、脂油、植
物油、鉱油、又はシリコンの如き消泡剤を加えることが
できる． 大量のＬ−８　８　７，８　１　９を生産させるための
条件として深部好気的培養条件が望ましい．少量の生産
にはフラスコ，ビン，又は培養皿にて振盪又は表面培養
を用いる．更に、増殖を大きいタンク中で行なう場合は
Ｌ−６８７．８１９の生産工程で増殖の遅れを防ぐため
、生産用タンク中に接種する微生物の発育形（ｖｅｇａ
ｔａｔｉｖｅ　ｆｏｒｍ）を用いることが望ましい．し
たがって，スラント中に生成した微生物の胞子又は菌糸
を比較的少量の培養液に接種することにより最初に発育
接種物、いわゆるｒ種培地』を作り，次に培養した発育
接種物を無菌的にタンク中に移すことが望ましい．接種
物を作る醗酵培地はＬ−６８７，８１９の製造で用いる
培地と実質的に同じか、又は異なるものであり，一般に
は接種前に培地を滅菌するのにオートクレープを用いる
．培地のｐＨは一般にオートクレープ工程の前に、酸又
は塩基を加えて約７．０に調節するが緩衝液の形が望ま
しい． 培養混合物の撹拌及び通気は種々の方法で行なうことが
できる．撹拌はプロペラ又は類似の機械的撹拌，ファー
メンターの回転又は振盪、種々のポンプ装作又は培地八
の無菌的な通気により行なうことができる．通気は醗酵
混合物中に無菌空気を通ずると効果的に行なえる． 醗酵は，一般に，約２０℃〜４０℃（２５〜３５℃が望
ましい）で、４８時間〜９６時間行なうが、醗酵条件及
び用いたスケールにより変化させることができる．生産
培地は回転振盪機上、５２７℃で９６時間インキユベー
トし、醗酵培地のＰＨを採取するまで７．０に保つこと
が望ましい． 実施のための好ましい培養／生産培地は以下の培地であ
る． 盈豊里表　　　　　　　　　　工Ｚユヱ上上グルコース
　　　　　　　　　２０．０Ｄｉｆｅｏイースト抽出物
　　　２０．０ハイカーゼＳ　Ｆ　　　　　　　　２　
０．ＯＫＮＯ．　　　　　　　　　　　　２．ＯＦｅＳ
Ｏ．・７Ｈ，Ｏ　　　　　　　Ｏ．０２５ＮａＣＩｌ　
　　　　　　　　　　　Ｏ．５Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ
．Ｏ　　　　　　　Ｏ．５Ｍ　ｎ　Ｓ　Ｏ　４　・７　
Ｈ　＊　Ｏ　　　　　　　Ｏ　−　０　０　５Ｚ　ｎ　
Ｓ　Ｏ　４　・７　Ｈ　ｓ　Ｏ　　　　　　　Ｏ　−　
０　１ＣａＣｉ，・２ＨｓＯ　　　　　　　Ｏ．０２星
（１リ４友　　　　　　　　　　工Ｚ己し仁ヒ上グルコ
ース　　　　　　　　　２２ グリセリン　　　　　　　　　２５ トウモロコシ浸出液　　　　　１０ Ｄｉｆｃｏイースト抽出物　　　２５ 乳　　　　酸　　　　　　　　　　　　　２Ｌ−チロシ
ン　　　　　　　　４ ＭＯＰＳ　　　　　　　　　　　１０ ＣａＣ０．　　　　　　　　　　　０．２５ｐＨを６．
８に調節 生産されたＬ−６　８　７，８　１　９は、他の既知の
生物活性物質を取るのに一般に用いられている従来の方
法を用いて培地中から単離できる．生産されたＬ−６８
７，８１９物質は，培養菌体及び伊液中に発見される．
したがって培養培地の伊過又は遠心により得られる菌体
及び伊液の減圧濃縮、凍結乾燥，メタノールの如き従来
から用いている溶媒での抽出、ｐＨ調節，従来の樹脂処
理（例えば、アニオン又はカチオン樹脂、非イオン性吸
着樹脂等）、従来の吸着剤（例えば、活性炭、ケイ酸、
シリカゲル、セルロース，アルミナ等）、結晶化，再結
晶等の方法により単？精製できる．望ましい方法は溶媒
、特にメタノールを用いた抽出法である． 醗酵により生産されたＬ−６　８　７，８　１　９はＴ
細胞増殖検定で調べた結果、陽性の免疫抑制作用を有し
、これに基づく利用性がある．Ｌ−６８７，８１９は以
下の物性を持つ．１．白色無定形粉末 ２．メタノールに可溶 ３．電子衝撃マススペクトル法で決定した分子式Ｃ４１
Ｈ■ＮＯｓｘｅ　Ｃ４ｔＨｓｓＮＯｔ＊＋’ｒ４（Ｔ４
＝ＳｉＣ，Ｈ，）として計算値，１０５１．６０８８　
：実測値、１０５１．６０８９．これは図３に示す分子
構造に一致．上述の如く醗酵工程で得られるＬ−６　８
　７，８　１　９は例えば、抽出、沈澱，分別結晶化、
再結晶、クロマトグラフィー等により単離精製できる． 例えばアセテートの如き分子の水酸基を用いて形成した
，従来の医薬として望ましい、Ｌ−６　８　７，８　１
　９の生物体内不安定エステルも本物質の望ましい形で
ある． 前述の醗酵反応及び醗酵混合物の後処理におけるＬ−６
　８　７，８　１　９の互変異性体及び構造異性体も本
発明の態様内にあることに注意されたい． 本発明のＬ−６　８　７，８　１　９は免疫抑制活性、
抗菌活性の如き薬理活性を有する．したがって、心臓、
腎臓、肝臓、骨髄、皮膚等の臓器及び組織移植の拒否反
応、骨髄移植による移植一対一宿主疾患，リュウマチ関
節炎、全身性紅斑性狼癒，橋本甲状腺炎、多発性硬化症
、重症性筋無力症、タイプエ糖尿病，葡萄膜炎等の自己
免疫病の治療及び予防に有益である． 本発明の薬剤組或物は、本発明のＬ− ６８７，８１９を活性成分として含有し，外用，内服用
又は注射用に用いるのに望ましい有機又は無機担体又は
賦形剤と混合した固形、半固形又は液剤の如き薬剤形で
用いることができる．活性成分は，例えば錠剤，ペレッ
ト，カプセル，坐薬、溶液，乳剤、懸濁剤、及びその他
の使用に望ましい形態のための、一般に用いられる無毒
性の医薬として望ましい担体と混合できる．使用できる
担体は、水，グルコース，乳糖，アラビアゴム、ゼラチ
ン，マンニトール、デンプンペースト、三ケイ酸マグネ
シウム、タルク、トウモロコシデンプン、ケラチン，コ
ロイド状シリカ、ポテトデンプン、尿素、工業製品に用
いるのに望ましいその他の担体であり、固形、半固形，
又は液体形の担体である．加えて，補助剤として安定剤
、濃厚化剤及び着色剤、香料を用いることができる．活
性の、本目的化合物は疾病の状況又は症状に対して望ま
しい効果が得られるよう十分な量の薬剤組或物中に含有
される． 本組成物をヒトに投与する場合、注射又は内服投与が望
ましい．Ｌ−６８７，８１９の治療効果が得られるため
の量は、年令、治療をほどこす患者の症状に依存して変
化するが、一日の投与量は（７０ｋｇの人に基づいて計
算すると）活性威分が約０．０１−１０００ｍｇであり
、Ｑ．１−５００ｍｇが望ましく、Ｑ，５−１００ｍｇ
を治療する疾病に与えるのが一般には最良である．一般
に１回の平均投与量はＱ．５ｍｇ，ｌｍｇ，５ｍｇ，Ｉ
Ｑｍｇ，５０ｍｇ，１００ｍｇ．２５０ｍｇ及び５００
ｍｇを投与する． 以下の実施例は本発明を例示する目的で示したものであ
り、本発明の態様又は精神を限定するものと解釈すべき
ではない． ＫＮＯ．、０．２％；ハイカーゼＳＦ，２％；ｄ　ｉｆ
ｅｏイースト抽出物，２％；グルコース、２％；　Ｆａ
ＳＯ，・７Ｈ，Ｏ％０．００２５％；ＮａＣＱ．０．０
５％；ＭｇＳＯ４−７Ｈ，Ｏ、０．０５％；ＭｎＳ０，
７Ｈ，０，０．０００５％；　　ＺｎＳＯ４−７Ｈ，０
．０．００１％；ＣａＣＱ，　・２Ｈ，０，０．００２
％からなる４４ｍＡのオートクレープ滅菌種培地を入れ
た２５０ｍｆｉバッフルエーレンメイヤーフラスコにＭ
Ａ６６４６を接種して醗酵を行なった＠　Ｂｅｎｎｅｔ
ｔ培地からＭＡ６６４６（ＡＴＣＣＮｏ，５３８５５）
の胞子を取り種培地に接種し、回転振盪機上２２０ｒｐ
ｍにて４２−４８時間２７℃でインキユベートした．オ
ートクレープ前にＮａＯＨでｐＨ６．８に調節した、グ
リセリン２．５％：グルコース２．２％；トウモロコシ
浸出液１％：　Ｄｉｆｃｏイースト抽出物１．５％；乳
酸０．２％（ｖ／ｖ）；Ｌ−チロシン０．４％：ＭＯＰ
３　　１％：ＣａＣ０，０．０　２　５％からなる製造
培地の入ったバッフルしてないエーレンメイヤーフラス
コ中に上述で出来た種培養菌を１．０園党ずつ加えて接
種した．製造培地を回転振盪機上２２０ｒｐｍにて２７
℃で９６時間インキユベートした．培養液と同量のメタ
ノールを加え，二一バーバッハ（　Ｅ　ｂａｒｂａｃｈ
）往復振盪機上高速で３０分間撹拌し、次に遠心してメ
タノール抽出を行なった．水性メタノール性抽出液をＴ
ＬＣ及びＨＰＬＣで分析した． 逆相Ｈ　Ｐ　Ｌ　Ｃ　（Ｗｈａｔｍａｎ　Ｐａｒｔｉｓ
ｉｌ　５　０ＤＳ−３、０．１％水性Ｈ．ＰＯ４：　Ｃ
Ｈ，ＣＮ，４０　：　６０、１　ｍ　Ｑ　／分）により
全抽出物の主要成分の保持時間は７、Ｔ９分であり，ど
れもＨＰＬＣの保持時間とＴＬＣのＲｆが同一であり，
３１−デスメチルーＬ−６８３−５９０　（Ｌ−６８７
，８１９）であった．保持時間　６．９８分に副成分を
認めた．副或分は半プレパラティブ逆相オクタデシル（
Ｃ．。）ＨＰＬＣ力ラム（ＲＡ　Ｉ　Ｎ　Ｉ　Ｎ″″Ｄ
ｙｎａｍａｘ　Ｃ　−　１　８カラム）にて単離した．
６本の，変異株振盪フラスコ培養物を同量のメタノール
で抽出し，遠心し、上清を留去してメタノールを除いた
．得られた水相を酢酸エチルで２回抽出し，窒素気流下
留去した．残渣をメタノールに再懸濁させ，５０マイク
ロリットルずつ半プレパラテイブカラムに注入した．溶
媒系は０．１％水性Ｈ３ＰＯ４＝ＣＨ３ＣＮ　（５０：
５０）であり、流速は４ｍＱｌ分であった．１２．５分
に流出した巾広ビークを１ｍＱずつのフラクションに取
り、ＭＯＰＳ緩衝液でｐＨ６．０にした。試料をＴ細胞
増殖（ＩＬ−２）検定を用い、免疫抑制活性を有するこ
とが判明した． 多量の物質を生産せしめるため，実施例１の醗酵法を大
規模で行なった．遠心して，培養固形物を４５リットル
の培養液から除去した．得られた固形物をメタノールで
２回（１回１リットル）抽出した．培養液は１八量の酢
酸エチル（２０リットル）で抽出し、得られた酢酸エチ
ル抽出液を培養固形物抽出液と合併し、フラッシュエバ
ボレーターにて減圧下，有機溶媒を除去し水性懸濁液を
得た．水性懸濁液を蒸留水で最終容量１．５リットルに
希釈し，同量の酢酸エチルで抽出した．次に酢酸エチル
抽出物を蒸留水で洗浄し，水溶性不純物を除去した．洗
浄した酢酸エチル抽出液をフラッシュエバボレーターで
減圧下溶媒留去し、５５．３　グラムの粗活性抽出物を
得た． 粗活性抽出物をシリカゲル（　Ａ　ｌｄ　ｒ　ｉｃｈＣ
ｈｅｍｉｃａｌ，　＄　２　４　３　９　８−１、グレ
ード６２、６０−２００メッシュ）の５リットルカラム
により、ヘキサン：アセトン（３　：　１）でクロマト
グラフィーを行なった．試料をカラムに乗せた後、同じ
溶媒でベッド容積２回分でカラムを洗浄し、次にヘキサ
ン：アセトン（１　１　：　９）で流出させ、２リット
ルずつ分取りした．目的化合物含有の画分１０−１４を
合併し，減圧濃縮して４．０５　グラムの濃含有物を得
た．本品をシリカゲル−６０（Ｅ．Ｍａｒｋ、＄９３８
５．２３０−４００メッシュ）のｌリットルカラムにて
、ヘキサン：アセトン（１　１　：　９）を用いた再カ
ラムクロマトグラフィーにて精製した．試料をカラムに
乗せた後，同じ組成の溶媒で２５ｍｆｆｉ／分にて流出
させた．２４０ｍＱずつ分画し、流出画分２２−４０に
濃含有物を認めた．これらの画分を合併し、留去して２
．９１グラムの油状残渣を得た．プレバラテイブ逆相高
速液体クロマトグラフイー（ＨＰＬＣ）により，更に精
製を行なった．約１００ミリグラムの濃含有物をｌｍｊ
ｌのメタノールに溶かしＲａｉｎｉｎ　Ｄｙｎａｗ＊ａ
ｘ　−　Ｃ　１　８カラム、２１．４Ｘ２５０ｍｍを用
い，アセトニトリル：水（３：２）で１０ｍｆｉ／分に
て流出し，２０５ｎｍの吸光度で検出するクロマトグラ
フイーを６０℃で２回に分けて行なった．クロマトグラ
フィー分離では、１５ｍＱずつ分画した．画分９−１１
に目的化合物が含有し、これを合併して減圧濃縮した．
残渣について上述と同一のカラムを用い，アセトニトリ
ル：水（１　：　１）で１０ｍｍ／分にて流出するクロ
マトグラフイーを６０℃で再度行なった．この条件下、
４２〜４８分に目的化合物が流出した．このピークの中
心画分の留去により？的化合物を高純度で２、Ｔｍｇ得
た．白色無定形固形物． 本生成物のｃＤＣＱ．・中におけるプロトンＮＭＲスペ
クトルを図１に示す．ケミカルシフトはテトラメチルシ
ランを基準とするＰＰＭ（デルタ）で表わした（ＴＭＳ
＝Ｏ、ＰＰＭ）．残存の溶媒プロトンを内部標準として
用いた（７．２４　　ＰＰＭ），本生戒物のＣＤＣＱ．
中での炭素−１３ＮＭＲスペクトルを図２に示す６ケミ
カルシフトはテトラメチルシランを基準にしたＰＰＭ（
デルタ）で表わした（ＴＭＳ＝Ｏ　　ｐｐｍ）−溶媒の
炭素共鳴シグナルを内部標準として用いたＣ’ｉ’ｌ．
ＯＰＰＭ）．目的化合物のテトラー（トリメチルシリル
）一誘導体の高分解電子衝撃マススペクトルでは分子イ
オン１　０　５　１．６　０　８　９を与えた（　Ｃ　
４　１Ｈ　ｓ　ｓ　Ｎ　Ｏ　１■＋Ｔ４、Ｔ．＝ＳｉＣ
，Ｈ．とじて計算値１０５１．６０８８）．各フラグメ
ントは提唱構造に一致した．純品をＴ細胞増殖検定（Ｉ
Ｌ−２）に用いた．結果は実施例３に示す． １．然１む１艷 上述ＨＰＬＣにて得られた純Ｌ−　６８７，８１９を無
水エタノールに１■ｇ／ｔａｎで溶かした．２．検　定 Ｃ５７ＢＱ／６マウスの牌臓を無菌条件下で取り．１０
％熱不活化牛胎児血清（Ｇ　Ｉ　ＢＣＯ）を加えた氷冷
ＲＰＭＩ　　１６４０　培地（ＧＩＢＣＯ，ニューヨー
ク州グランドアイランド）中にて、ゆっくりと分離した
。細胞を１５０Ｏｒｐｍ．８分間遠心して、ペレットと
して取った．ペレットを塩化アンモニウム分解緩衝液（
ＧＩＢＣＯ）で４℃，２分間処理して混在する赤血球細
胞を除去した．冷却培地を加え，細胞を再び１　５　０
　０　ｒ　Ｐｍ％８分間遠心した６以下に示す如きナイ
ロンウールカラムを用いて細胞懸濁液を分離し、Ｔリン
パ球を単離した．ナイロンウールカラムは約４グラムの
洗浄、乾燥したナイロンウールを２０ｍ（Ｉのプラスチ
ックシリンジ中に充填して作製した．オートクレープで
３０分間２５０’Ｆにてカラムを滅菌した．ナイロンウ
ールカラムを加温（３７℃）培養液で湿潤させ、同培養
液でリンスした．洗浄した牌臓細胞を温培養液に懸濁さ
せ、ゆっくりナイロンウールカラムに乗せた．カラムを
垂直にして３７℃でｌ時間インキユベートした．非吸着
Ｔリンパ球は温培養液によりカラムから流出した．細胞
懸濁液を用い，上述の如き操作を繰り返した． １０％熱不活性化牛胎児血清．１００ｍＭグルタミン、
１ｍＭビルビン酸ナトリウム．２Ｘ１０−１Ｍ　２−メ
ルカプトエタノール及び５０μｇ　／　ｍ　Ｑゲンタマ
イシンを含むＲＰＭＩ　１６４０培地から或る完全培養
液中に２．５　Ｘ　１　０’細胞数／ｍ愈で精製Ｔリン
パ球を懸濁した．イオノマイシンを２５０ｎｇ／ｍｊｍ
．ＰＭＡをＬｏｎｇ／ｍ１加えた．直ちに９６穴平底微
量培養板（Ｃｏｓｔａｒ）中に細胞懸濁液を２００ｒｒ
１ｌ／穴ずつ分配した．検定試料のない培養液であるコ
ントロールと検定すべき以下に示す如き種々の試料希釈
物（上述のＬ−６８７，８１９）を３穴ずつ２０μ党／
穴で加えた．Ｌ−６７９，９３４　（ＦＫ−５０６）を
標準として用いた．次に培養板を５％ＣＯ，−９５％空
気の湿潤環境下　３７℃で４４時間インキユペートした
．Ｔリンバ球の増殖は、トリチウム標諏チミジンの取り
込みを測定して検定した．４４時間培養後、トリチウム
標識チミジシ（ＮＥＮ，ケンブリッジ．ＭＡ）を２μＣ
ｉ／穴用いて細胞をパルス標識した．さらに４時間イン
キュベート後，複数試料採取機を用いてグラスファイバ
ー伊紙上に培養物を採取した．個々の穴に対応する円形
フィルターの放射活性を標準の液体シンチレーションカ
ウンター（ベータカウンター）で測定した．各穴からの
複写物の１分間当りの平均カウント数を計算し、結果を
以下に示す如くトリチウム標識チミジン取り込み（増殖
）のパーセント阻害で表わした．Ｌ−６８７，８１９の
種々の濃度でのバーセント阻害の結果を以下の表に示す
． １００ １０ ６．６ ４．４ ２．９ １．３ ０．５８ ０．２６ ０．１　１ ９８．８ ７６．１ ５　ｌ．３ １　５．９ ０ ０ ０ ９．１ ９．５ 注＝１．マウスＴ細胞培養物を１Ｈ−チミジンで採取４
８時間前に４時間パルス 標識する． ２．標準Ｌ−６７９．９３４　（Ｌｏｎｇ／ｍＩ２）は
９９％阻害を示した． ３．Ｌ−６８７，８１９のＩＣ．．＝７．０ｎｇ／ｍｆ
ｉ＝９．１７ｎＭ ４．増殖阻害は５０単位／ｍＱの組変えトＩＬ−２を加
えると消滅した．

【図面の簡単な説明】

図１はＬ−６８７，８１９（７）ＣＤＣｊｌ．中におけ
る４００ＭＨｚでのプロトン（１Ｈ）核磁気共鳴（ＮＭ
Ｒ）スペクトルである．図２はＬ−６８７，８１９のＣ
Ｄ（１！，中における１　０　０　Ｍ　Ｈ　ｚでの炭素
−１３（”Ｃ）ＮＭＲスペクトルである． 図３はスペクトル及びマススペクトルの根拠に基づ＜Ｌ
−６８７，８１９の同定化学構造を示している． 手続補正書 （方式） 平成２年７月１０日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｔ細胞増殖検定により明らかとなったＴ細胞活性化
   阻害が陽性で、図１に示すプロトン核磁気共鳴スペクト
   ル、図２に示す炭素−１３核磁気共鳴スペクトルを有し
   、電子衝撃マススペクトル法で決定した分子式がＣ＿４
   ＿１Ｈ＿６＿５ＮＯ＿１＿２であるＬ−６８７，８１９
   と命名した免疫抑制剤。 ２、図３に示す如き分子構造を有する免疫抑制剤Ｌ−６
   ８７，８１９。 ３、医薬的に許容しうる実質的に無毒性担体又は賦形剤
   と併用した治療効果のある量のＬ−６８７，８１９を含
   有する薬剤組成物。 ４、治療効果のある量のＬ−６８７，８１９をヒト宿主
   に投与することを特徴とする、臓器移植拒否反応を予防
   し、自己免疫疾患感染症を治療するためのヒト宿主への
   使用法。