JPH03206831A - トランスジェニックアニマルの生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産】」ＪＨＩＷ３Ｘ 本発明は、外来遺伝子を注入した受精卵もしくは外来遺
伝子をすでに存している個体との交配により得られた受
精卵より得られる胚より目的とする外来遺伝子を保有す
る胚のみを選別し該胚を疑妊娠動物に移植し、目的とす
る外来遺伝子を持ったトランスジェニックアニマルを高
率に得る方法に関する。

本発明は、動物の育種、品種改良および生理活性物質の
生産に有用な方法である。

従来技術 咄乳動物の受精卵や初期胚中にマイクロインジェクショ
ンやウィルス怒染法、胚性幹細胞を用いたキメラ法など
により外来遺伝子を導入し、この卵細胞や胚細胞を仮親
に移植し、個体にまで発生させる技術はトランスジェニ
ックアニマルの生産方法として近年開発された。この技
術により、本来の動物がもたない遺伝的形質を持った動
物を誕生させることが可能となり、現在、品種改良や、
物質生産を目的とした研究が続けられている。特に、ラ
ンド成長ホルモン遺伝子を持ったマウスはラット成長ホ
ルモンにより成長が通常のマウスと比較して著しく促進
されることからスーパーマウスと呼ばれている〔パルミ
ター他゛°不一チュアー”　Ｐａ１ｍ１ｔｅｒ他ｒ　Ｎ
ａｔｕｒｅ　Ｊ　３００巻６１１〜６１５頁（１９８２
））。又特開昭６１−８１７４３号公報にはヒト活性化
癌遺伝子を持つマウス、特開昭６３−２９１号公報には
希望する蛋白質をミルク中へ分泌するトランスジェニソ
クアニマル、特開昭６３−３０９１９２号公報には乳腺
中に分泌させるためのＤＮＡ配列とこれを持つ動物の作
製方法が開示されている。

又Ｗ、　０８７１０５３２５号公報には成長ホルモン遺
伝子を持つ動物の作製方法、Ｗ　０８７１０７２９８号
公報にはヒ１−インンヱリン遺伝子を持つマウスが開示
されている。

さらに最近では、これらの技術が牛や羊、豚などの大動
物に適用できることが明らかにされている〔クラーク他
°“トレンズ　バイオテクノロジーＣ１ａｒｋ　ｅｔ　
ａｌ、＋　　”Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、　”　
５巻、２０〜２４頁（１９８７）　）。

しかし目的とする遺伝子を持つ動物が得られる率は非常
に低い。

例えば羊においては、外来遺伝子を注入した胚から発生
し、生れた子どもの１．３％のみが、豚においては１０
％が目的とする遺伝子を持った個体として得られるとい
う報告がある。〔ハマー他“不−チュアー”　Ｈａｍｍ
ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　”Ｎａｔｕｒｅ”　３１５巻６
８０〜６８３頁（１９８５）　）。又牛においては５％
という発表がある［ビアリー他“セリオゲノロジー”　
Ｂｉｅｒｙ　ｅｔ　ａｌ。

”Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ”　２９巻、２２４頁
（１９８Ｂ）　）。

これは仮親となる母動物が大量に必要なことを意味して
いる。このためトランスジェニノクアニマルを得ること
は非常に高コストな方法であった。

従来、トランスジエニンクアニマルの取得法としては得
られた仔の生体の一部（尾、耳など）からＤＮＡを抽出
して、ドントあるいはサチン法によって、外来遺伝子の
動物個体への組み込みを検査している。

従って、目的とする外来遺伝子をもたない多数の動物も
、この検査が終了するまでの期間飼育管理する必要があ
る。

又、従来から行われている交配による育種についても、
生産仔が生育して形質をあられすまでは判定ができず、
目的とする種の固定までは多数の交配の繰り返しが必要
であった。

しよ°　　る 上述したように、トランスジェニックアニマル作製に当
っては、目的とする外来遺伝子を持った動物が得られる
率は低い。マイクロインジェクション法により外来遺伝
子を導入する場合、受精卵中の雄性前核に遺伝子を注入
するが、注入遺伝子が宿主の染色体に組みこまれている
か否かは、仮親への移植後に得られる胎仔あるいは新生
仔のＤＮＡを検査することによって判別される。本発明
によれば、移植前に注入遺伝子を有している胚のみを選
別できる。これまでの技術ではこのような胚もしくは胚
細胞中に注入した遺伝子の分析は困難であった。

遺伝子の分析法としてはドツトプロット法あるいはサザ
ーンプロット法による目的とする遺伝子のプローブを使
用した分析があげられる。しかし、移植前の胚や胚細胞
では分析に供するだけのＤＮＡｆｆ１が十分でないため
分析が不可能であった。これまでの報告でも胚を二分離
し、一方を培養し性染色体を分析し、雌雄鑑定を行った
例がある〔ボンデイオリ他“°セリオゲノロジー”　Ｂ
ｏｎｄｉｏｌｔ　ｅｔ　ａｌ、、　”ＴＨＥｔ？ｌ０Ｇ
ＥＮＯＬＯＧＹ”３１巻、９５〜１０４頁〕。しかし、
この例は性染色体の特異的な塩基配列のコピー数が多い
場合のみ有効で一般的でない。

本発明者等はトランスジェニックアニマルの（［方法に
ついて鋭意研究を行った結果、導入遺伝子の一部をプラ
イマーとして使用して、ＰＣＲ法により導入遺伝子を保
有している胚を確認し選別することができ、かつこの胚
を仮親に移植することにより、高率に外来遺伝子を持つ
トランスジエニソクアニマルを作製できることを見出し
本発明を完成するに至った。

したがって本発明は、受精卵中に導入された外来遺伝子
を保有する胚を選別し、該胚を用いて高率にトランスジ
ェニックアニマルを得る方法を提供することを課題とす
る。

１・　”°！ｔ・　の− 本発明は、上記課題を解決するために、目的とする外来
目的遺伝子を注入した受精卵もしくは交配により得られ
た受精卵を体外で培養して胚を形成せしめ、これを切断
二分離し、その二分離された胚の一方からＤＮＡを抽出
し、目的遺伝子の一部をプライマーとして使用してＰＣ
Ｒ法を行って増幅させて、この胚中に目的遺伝子の存在
することを確認することによって、分離した他の一方の
胚のなかからこの目的遺伝子の存在するもののみを分別
し、これを仮親に移植し、生産させることよりなるトラ
ンスジエニノクアニマルの生産方法である。

外来遺伝子を注入した受精卵もしくは交配して得られた
受精卵の培養は、胚の培養に使用する培養液であれば特
に制限はない。例えばマウスの場合はホイノトン（Ｗｈ
ｉＬｔｅｎ）培地を使用することが好ましく、培養は３
７°Ｃで５％ＣＯ，気相下で行い、受精卵の分割を列立
顕微鏡下で観察し、所望の状態に胚が分裂したところで
マイクロマニュピユレータ−を操作し、切断二分離する
。培養の時期はいつでもよいが、例えばマウスの場合は
特に好ましいのは桑実期胚まで培養したものである。切
断二分離した胚の一方は、そのまま培養液中に残し、他
の一方は注入遺伝子の検査に用いる。

検査を行う胚は、加熱溶解により、これからＤＮＡを溶
出し、溶解物中のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により目
的とする遺伝子を増幅させ、増幅された目的とする遺伝
子の一部を電気泳動により分離し、エチジウムブロマイ
ド染色法あるいはサザン法で検出し、目的遺伝子が存在
するか否かを確認する。

胚からのＤＮＡの溶出は、０．３％牛血清アルブミンを
含みＣａ”、Ｍｇ”を含まないダルベツコリン酸緩衝液
等の緩衝液で洗浄し、蒸留水中で加熱して細胞を溶解さ
せて行う、この液を試料としてＰＣＲ法により遺伝子の
増幅を行うとよい。

ＰＣＲ法は、目的遺伝子のＤＮＡの中央領域をはさんだ
（＋）鎖、（−）鎖に対応する２０〜３０ヌクレオチド
のＤＮＡプライマーを相補的に目的遺伝子のＤＮＡと結
合させ、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ合成を行わせ
、これを繰返し行うことによって元のＤＮＡの数万倍の
ＤＮＡを得る方法である。この方法自体は、例えばサイ
キ等の方法〔サイエンス誌、”５ｃｉｅｎｃｅ　”　２
３９．４８７〜４９１（１９８８）　：ｌのほか特開昭
６３−１０２６７７号公報、特開昭６２−２１４３５５
号公報、特開昭６２−２８１号公報、特開昭６１−２７
４６９７号公報等いくつかの変法が知られており、すで
に公知のものであり、また市販の耐熱性ポリメラーゼを
使用したＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓ
ｔｅｍ　　（パーキンエルマーシータス製）などの装置
を使用してＰＣＲ法を行うこともできる。

目的とする遺伝子を保有する胚の場合には、使用したプ
ライマーの組合せに対応した一部サイズの鎖長を持った
ＤＮＡが大量に復製される。このＤＮＡを、例えばＮｕ
Ｓｉｅｖｅ　Ａｇａｒｏｓｅ　　（Ｆ　Ｍ　Ｃ社製）を
使ったゲル電気泳動、目的遺伝子またはその一部をプロ
ーブとしたドットブロットハイブリダイゼーンヨン法、
塩基配列決定法などによって同定し、胚中に目的とした
遺伝子が存在するか否かを確認することができる。

このようにして上述した分離胚の中で移植すべき胚が決
定され、このような胚を培養液中に残した胚の中から分
別する。分別された胚は、できるだけ早く、分離後１〜
４８時間以内に仮親に移植することがその後の発育の面
からみて好ましい。

胚の移植は、必要によって性ホルモン投与により性周期
を調節した雌動物の子宮内に、分別された胚が着床する
ように動物の種類に応じた方法により移植を行う。この
方法として例えば全身麻酔による正中線切開法、局所麻
酔による謙部切開法、頚管迂回法、頚管経由法、腹腔内
移植法、腹腔鏡等の方法がある。牛においては、例えば
頚管経由法による移植が実用的な方法として一般的に用
いられており、この方法によって行うことが望ましい。

このようにして妊娠した動物は、そのまま出産させ出生
仔を得る。この出生仔の体組織の一部を切り取り、常法
によりＤＮＡを分析することによって目的遺伝子が染色
体内に組込まれたか否かを判定する。

本発明の方法では、目的とするトランスジェニソクアニ
マルを効率よく得ることができ、この方法は、マウス、
ラット等の実験動物ばかりではなく牛、豚等の大動物、
さらには胚を凍結保存のできない動物種にも適用できる
。

以下に実施例を示してさらに本発明を具体的に説明する
。

実施例１ 本寅施例においては、ヒトアデノウィルス由来ＥＩＡ領
域を持つ遺伝子を注入した受精卵より得た胚を選別し、
この遺伝子を持つマウス作出の例について示す。

（１）注入ＤＮＡの調製 ヒトアデノウィルス１２型由来のＥ　Ｉ　Ａ　％Ｈ域（
第１図）にＥｃｏＲＩリンカ−１ＢａｍＨｌリンカーを
つなぎ、プラスチックタ−ｐ　Ｓ　Ｖ　２　　ｇｐｔ（
Ｍｕｌｌｉｇａｎ　ｅｔａｌ、、　”５ｃｉｅｎｃｅ　
”　２０９巻、１４２２〜１４２７頁）のＥｃｏＲＩＢ
ａ…Ｈｌサイトに挿入したプラスミドｐＳＶ２ｇｐＬ−
ｇ　Ｅ　Ｉ　Ａを用いた。

このプラスミドの構造は第２図に示した。

このプラスミドをＥｃｏＲｌで消化して、直鎮状ＤＮＡ
とし、それを０，５μｇ／−のエチジウムブロマイドを
含む０．６％の調製用アガロース電気泳動で分離した。

直鎖状ｐ　Ｓ　Ｖ　２−ｇｐｔ−ｇ　Ｅ　Ｉ　Ａを含む
ゲル断片を切り取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ　”（ＢＩｏ
　１０１社製）を用いて精製した。さらにＤＮＡを０．
１ｆｆ＋Ｍ　ＥＤＴＡを含むｐＨ７，６の１０ｍＭ　！
−リス・塩酸緩衝液中に５μｇ／ｍになるように調製し
た。

（２）受精卵へのＤＮＡ注入及び胚の切断二分離Ｂ６Ｃ
３Ｆ１マウス（日本チャールースリバー）ヲ交配し、雌
マウスから前核期受精卵を採取した。

ゴートン等の方法［Ｇｏｒｄｏｎ　ｅｔ　ａｌ、＋　”
Ｐｒｏｃ、　ＮａｔｆＡｃａｄ、　Ｓｃｉ　、　”　７
７巻、７３８０〜７３８４頁（１９８０）　）に準じて
注入操作を行った。

上記、回収受精卵をヒアルロニダーゼをｌｌｌ１ｇ／Ｉ
Ｉｄｌの濃度で含むホイノトン（Ｗｈｉｔｔｅｎ）培地
中に静置し、卵丘細胞を除去し、得られた受精卵を新し
いホイットン培地中に移し、３７°Ｃ３５％ＣＯｔ気相
下で培養し、上記（１）で得られたＤＮＡを注入した。

ＤＮＡｌｔ人はノマルスキー微分干渉装置を取りつけた
倒立顕微鏡でマイクロマニピュレーターにとりつけたガ
ラスマイクロピペットでＤ　Ｎ　Ａ　？８液を受精卵の
雄性前核内に約２ｐｐ、注入した。その後新鮮ホイノト
ン培地中で約４８〜６４時間、上述の条件で桑実胚朋ま
で培養した。

桑実胚朋の胚は長端等の方法（Ｎａｇａｓｈｉｍａ　ｅ
ｔ　ａｔ。

“Ｊ、Ｒｅｐｒｏｄ、Ｆｅｒｔ、”　７０巻、３５７〜
３６２頁（１９８４）　）に従って切断分離を行った。

桑実胚を０．５％プロナーゼを含むダルベツコリン酸緩
衝液中で１〜２分間静置し、卵子透明帯を脆弱化し、次
いでホイットン培地に２回以上移し換えて洗浄を行った
後、Ｃａ”、Ｍｇ”不含のダルベツコリン酸緩衝液中に
３７°Ｃで２０分間静置し、牛脂児血／１１１２０％を
含むダルヘンコリン酸緩衝液に移し切断分離を行った。

倒立顕微鏡下に設置したガラス板上に、生胎児唾清２０
％を含むタルベラコリン酸緩衝液数滴をおき、この中に
上述の桑実胚を移した。この桑実胚をマイクロマニュピ
ユレータ−にとりつけたガラス針でほぼ等分に切断し、
得られた二分離桑実胚を、プラスチックシャーレ中にパ
ラフィンオイルで被覆したホイットン培地の２０μｌ液
滴中に移した。二個の内−方は注入遺伝子の検定を行い
、一方はそのまま３７°Ｃ１Ｃｏ、　５％気相下で２０
〜３６時間培養した。

（３）注入ＤＮＡの検出 上記（２）に示した胚の一方を５００　μ！のエンベン
ドルフチューブにとり、滅菌水を加えて４５μｌとした
。

チューブをサーマルサイクラ−（パーキンエルマーシー
クス社製）に設置し、９５°Ｃで１０分間加熱し、細胞
を溶解しテンプレートとした。４°Ｃまで冷却した後、
２０ｎｍｏ　ｌのデオキシＡ”ｒＰ、デオキシＧＴＰ、
デオキシＣＴＰおよびＴ　Ｔ　Ｐ　、　ｌｏｏｐｍｏ＋
のプライマーを加えた。ブライマーは第１図に示したＥ
ＩＡ遺伝子の配列を基準として選択決定し、合成した。

２種の配列、 を用いた。この両者を同時に用いることにより、ＥＩＡ
遺伝子の８８５→１２４０．３５６ｂＰの断片を増幅す
ることができる。サイキ等の方法　（Ｓａｉｋｉ　ｅｔ
　ａｌ、。

”５ｃｉｅｎｃｅ”　２３９巻、４８７〜４９１頁（１
９８５）　）に従い、５０ｍＭ　ＸＣＬ　ｌｏｍＭ　ト
リス・塩酸緩衝液（ｐＨ８，４）　、２．５−ＭＭｇＣ
＋、、２００μｇ／ｍゼラチンになるように全体量を１
００　μＰに調整した。チューブを再びサーマルサイク
ラ−中に設置し、９５°Ｃで５分間加熱し、４°Ｃまで
冷却した後２．５ユニツトのＴａｑ　　ＤＮＡポリメラ
ーゼ（パーキンエルマーシータス社製）を加工、１００
μｌのミネラルオイル（シグマ社製）を重層した。

９５°Ｃ１分間の変性反応、５５°Ｃ２分間のアニーリ
ング反応、７２°Ｃ２分間のプライマー伸長反応を１サ
イクルとして、サーマルサイクラ−にて３５サイクルの
反応を行った。最後のサイクルの後、７２°Ｃで８分間
伸長反応を行った後４°Ｃまで冷却した。下層の水層の
みを別の５００μｌ容量のエノベンドルフチューブにと
りその１５μｌを０．５μｇ７ｍβのエチジウムブロマ
イドを含む３％ＮｕＳｉｅｖｅ短フラグメント川アガロ
ースゲル用ＦＭＣ社製）中、５０Ｖで４時間電気泳動を
行った。泳動後光フィルターを用いて紫外線中で写真を
撮影し増幅された３５６ｂＰの断片がゲルｌではっきり
確認できるものをポジティブ（＋）と判定した。

実験を３回行い、二分離桑実胚８４例中３０例がゲル上
に３５６ｂ　ｐの明確なバンドを示した。４５例が（＝
）、また９例が判定不能（ＵＣ）であった。判定結果は
表１に示した。又第３図に電気泳動図の一部を示した。

この図かられかるように、７．１０．１２．２０．３０
．３１．３２．３３は陽性（＋Ｌ９．２３．２９の３例
は判定不能（ＵＣ）、その他は陰性（−）と判別した。

（４）ＰＣＲ検定胚の移植 （ｉ）胚受容雌の′ｅｊＡ備 動物は、ＣＤ−１系の成熟雌マウス（日本チャールズリ
バーから購入）で未経産のものを用いた。退会は８週令
以降のものでホルモン処理はせずに実験に用いた。予め
不妊であることが＆’ｆｔ　Ｌｕされている精管結紮雄
と、これら雌マウスを同居させ、膣栓の存在によって交
尾を確認し、その日を偽妊娠第１日目とした。

（１１）移植操作 偽妊娠第１日目に、これら雌マウスに体重１　ｋｇ当り
４０■に相当するベントパルビタールナトリウム（ネン
ブタール；大日本製薬）を腹腔的投与して濶麻酔状態に
した後、外科的にこれら雌マウスの卵管に１卵管当たり
１〜７個の初期胚をガラスキャピラリーを用いて実体顕
微鏡下で移植した。

移植の手段は、Ｉｌｏｇａｎ等の方法に従った（Ｈｏｇ
ａｎｅｔ　ａｌｌ　“Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　　ｔ
ｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｒｎｂｒｙｏ　　　−ＡＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　　”　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ
ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｙ、　ｐ
１３５〜１４５（１９８６）　）　、胚受容雌は、移植
後、切開部をオートクリップで閉じ、覚醒後、単独で飼
育した。

（ｉｉｉ）　　検定 １１〜１４日目に仮親を層殺し、着床数を記録した。

着床した胚は、子宮角から切り離し、ホーガン等のＤＮ
Ａ調整法（Ｈｏｇａｎ　ｅｔ　ａｌ、＋　　“Ｍａｎｉ
ｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅＭｏｕｓｅ　Ｅ＋ｎｂｒｙｏ
　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”　１７４
〜１７６頁Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ刊（１９８６）　）に従ってＤＮ
Ａを抽出した。抽出ＤＮＡ中のｐＳＶ２ｇｐｔ−ｇＥ　
Ｉ　Ａ遺伝子配列を、ニックトランスレーション法によ
り３Ｚｐでラベルしたヒトアデノウィルス１２型ＥＩＡ
領域をプローブとして使用したトンドブロットハイブリ
ダイゼーション法により検定（第４図）した。

以上の実施例方法の概念図を第６図に示す。

実施例２ 本実施例においては、ＥＩＡ遺伝子をすでに保持してい
るトランスジエニンクマウスの交配により得られた受精
卵を選別し、ＥＩＡｉｆｉ伝子を保有する胎児を発生さ
せた例を示す。

（１）胚の選別 実施例１に示したＥＩＡ遺伝子を相同染色体の一方にの
みもつマウス（ｈｅｍｉｚｙｇｏｔｅ）の雄（このマウ
スは本発明者等により八ｇｒｉ、Ｂｉｏ１．ｃｈｅｍ、
　５２巻、２５３７〜２５４６頁に開示されている）λ
ＥＩＡ／１　（ＥＩＡ遺伝子１３０コピーを含む）及び
λＥＩＡ／４（ＥＩＡ遺伝子２コピーを含む）とＥＩＡ
遺伝子を持たない８６Ｃ３Ｆ１　（日本チャールズリバ
ー）の雌との交配により受精卵を得た。

得られた受精卵は、実施例１と同様に操作し二分離桑実
胚を得た。

対照として、第１にＥＩＡ遺伝子を相同染色体の両方に
もつトランスジエニンクマウス（ｈｏｍｏｚｙｇｏ　ｔ
ｅ）の雄、λＥＩＡ／１あるいはλＥＩＡ／４、とＢ６
Ｃ３Ｆ１の雌との交配により得られた桑実胚、第２に８
６Ｃ３Ｆ１同士の交配により得られた桑実胚を同様に処
理して二分離胚をえた。この前者は必ずＥ１人遺伝子を
保有し、後者はＥＩＡ遺伝子を保有しない。

かくして得られた二分離桑実胚を実施例Ｉと同様に操作
をし、検査試料を調製した。この試料について次に示す
プライマーの内、Ｅ　Ｉ　ＡＯＯ２とＥＩＡＩＯ４、Ｅ
ＩＡ２０２とＥ　Ｉ　Ａ３０４　、Ｅ　Ｉ　Ａ２０４と
ＥＩＡ３０５のいずれかの組合せにより実施例１と同様
にＰＣＲを行わせた。

反応終了後、反応？＆１５ｕｌを３％ＮｕＳｉｅｖｅ短
フラグメント用アガロース、１％シーケムアガロースの
混合ゲル電気泳動に適用し、１００　Ｖで１．５時間電
気泳動の後、紫外線中赤フィルターを用いて写真撮影を
行った。

表２に示す通りλＥＩＡ／１（λ１　／＋）ｈｅｍｉｚ
ｙｇｏｔｅに由来する二分離桑実胚１３４例中６８例が
ＰＣＲ（＋）と判定された。又λＥＩＡ／４（λ４／＋
）ｈｅｍｉｚｙｇｏＬｅに由来する二分離桑実胚１９例
中４例がＰＣＲ（＋）と判定された。

第５図にＰＣＲ反応液の電気泳動図の一部を示した。こ
の図においては１〜９はｈｅ＋ｍｉｚｙｇｏｔｅ、　１
０〜１１はｈｏｍｏｚｙｇｏｔｅの例を示し、２〜４．
６〜９の７例が陽性（＋）と判定され、ｌ、５は陰性（
−）と判定された。

（２）陽性胚の移植と目的遺伝子保有の有無の判定実施
例１と同様にＰＣＲ法により分離胚の一方を（＋）、（
−）、（ｔＪ　Ｃ）の３分類とし、仮親に移植し、着床
後、解剖して胎児をとり出し、胎児中の目的遺伝子の保
有の有無を判定した。判定は実施例１に示したと同様に
ＥＩＡ遺伝子を用いたドツトプロット法により行った。

表２に示す通り、λ］／＋の場合６８例の移植により４
１例が着床し、内３６例がトランスジェニックであり、
（−）６１例の移植により２８例が着床し、２７例は遺
伝子を保有していなかった。

またλ４／＋の場合、（＋）４例の移植により、４例が
着床し内３例がトランスジェニックであった。

又（−Ｎ３例の移植により８例が着床し、金側ともＥＩ
Ａ遺伝子を保有していなかった。さらに（ＵＣ）中１例
はトランスジェニックであった。これらの結果は表２に
示した。

陽性胚の移植により高い比率で目的遺伝子を保有する胎
仔を得ることができた。

実施例３ 本実施例においては、マウス以外の動物種の受精卵にも
応用できる例として、ウシの２〜１６細胞期の１個の受
精卵中のウシα５１カゼイン遺伝子を検出できることを
示す。

（１）体外受精によるウシ受精卵の取得成熟未受精卵を
ｌＯ卵子ずつ５０μＰのＢＯ培地（Ｂｒａｃｋｅｔｔと
Ｏ１ｉｐｈａｎＬ、　　“Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｒｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ誌”１２巻、２６０〜２７４頁、
１９７５年）に加えた。これに２または４　Ｘ　１０’
ｃｃｌｌｓ／ｍｌになるように精子を添加し、３９°Ｃ
５％ＣＯ□気相下で３〜５時間媒精した。受精した卵子
をＴＣＭ１９９培地で２回洗浄した後、上記条件下で一
晩放置した。翌朝、ｌＯ卵子ずつをウサギの卵管上皮細
胞懸濁液５０μｌに加え、３９°Ｃ５％ＣＯ，気相下で
培養を続けた。４〜９日後にそれぞれの受精卵を洗浄後
、タンパク質分解酵素（アクチナーゼＥ）で５〜１０分
間処理して透明帯を除去し、割球数を実体顕微鏡下で計
測した後、実施例１と同様の操作を行いＰＣＲ用のサン
プルとした。

（２）ウシα５１カゼイン遺伝子の検出ウシα、１カゼ
インは第７図に示す塩基配列をその遺伝子構造中に有す
ることが知られている。この配列はα、１カゼイン遺伝
子の５′上流域、第１エクソン及び第１イントロンに相
当する。この塩基配列の中央付近の配列より、次に示す
ＢＡＣＯＯＩ　、　　ＢＡＣｌｏｔ　　ＢＡＣＯＯ３、
ＢＡＣ１０２をプライマーとして採用し、合成した。次
いで、得られた受精卵溶解液をテンプレイトとし、ＢＡ
ＣＯＯＩ　とＢ　Ａ　Ｃ１０１またはＢ　Ａ　ＣＯＯ３
とＢ　Ａ　Ｃ１０２のいずれかのプライマーの組み合わ
せにより実施例１と同様にＰＣＲを行った。

反応終了後、その１５μｌを実施例２と同様の操作でゲ
ル電気泳動し、写真逼影を行った。第８図に示したよう
に、ＢＡＣＯＯＩ　とＢ　Ａ　Ｃ１０１の組み合わせで
は１個の受精卵中に２割球以上あればα□カゼイン遺伝
子が検出された。また第９図に示したように、ＢＡＣＯ
Ｏ３とＢ　Ａ　Ｃ１０２の組み合わせでも３割球以上含
む受精卵であれば確実にαＳ１カゼイン遺伝子が検出さ
れた。

本発明の実施により、従来困難であった胚の段階での遺
伝子保有の判別が可能となり、トランスジェニックアニ
マルを得る確率を向上させることが可能となった。さら
に本発明においては、発生期に目的とする形質の保持さ
れた胚のみを選択的に移植することが可能なため受精卵
移植において、仮親を効率良く使用することが可能とな
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、アデノウィルス１２型由来のＥＩＡｉｆｉ仏
子の塩基配列を示す、　　ｌ−１５９５番目がＥＩＡ遺
伝子に相当する。 第２図はＥＩＡ遺伝子を組み込んだプラスミドρＳ　Ｖ
　２−ｇｌ）ｔ−ｇ　Ｅ　Ｉ　Ａの構造を示す。図中太
線−は組み込まれたＥＩＡ遺伝子の位置を示す。 第３図はＰ　ＣＩ？産物のＮｕＳｉｅｖｅアガロースゲ
ルによる電気泳動の結果を示す。図中→の位置が３５６
ｂＰのＤＮＡの泳動位置を示す。Ｍは分子量標準を示す
。 ３４はテンプレートを含まず増幅反応を行わせ、３５．
３６はＢ６Ｃ３Ｆｌマウス由来の二分離桑実胚を用いた
陰性対照例、３７．３８はテンプレートとしてＥＩＡ遺
伝子を保有するトランスジエニンクマウス由来の二分離
桑実胚を用いた反応液を用いた陽性対照を示す。 第４図は、マイクロインジェクションにより得た胚より
得られた着床胚由来のＤＮＡのドツトハイブリダイゼー
ションの結果得られたオートラジオグラフィーを示す。 ＮＭは正常マウスＤＮＡ、陽性コントロールの数値は二
倍体ゲノム当りのｐｓｖ２−ｇρｔ−ｇＥＩＡの分子数
を示す、ＮＭは正常マウスのＤＮＡ、陽性コントロール
の数値は、二倍体ゲノム当りのρＳＶ２ｇｐｔ−ｇＥｌ
への分子数を示す。 第５図はＥ　Ｉ　Ａ２０２とＥ　Ｉ　Ａ３０４をプライ
マーとして用いたＰＣＲの結果得た増幅ＤＮＡの電気泳
動図を示す０図中の→が目的遺伝子３３５ｂｐの泳動の
位置を示す。Ｍは分子量標ｉ−を示す。 １Ｏ２１１はＥＩＡ遺伝子をホモにもつ雄と８６Ｃ３Ｆ
１の雌との交配により得られた受精卵由来の陽性胚、１
２．１３はＢ６Ｃ３ＦＩ同士の交配により得られた陰性
胚を示す。 第６図は、本発明の方法を示す概念図である。 第７図はウシαｓ１カゼイン遺伝子の５°上流域、第１
エクソン及び第１イントロンの塩基配列を示す。 １〜６８６番目までが５′上流域、６８７〜７３９まで
が第１エクソン、７４０番目以降が第１イントロンに相
当する。 第８図はプライマーとしてＢＡＣＯＯＩ　とＢＡＣＩＯ
ｌを用いたＰＣＨのアガロースゲル電気泳動の結果を示
す。各レーンの上の数字は試料として用いた１個の受精
卵に含まれる制球数を示す。即ち０は試料を含まない陰
性対照を示す。Ｍは分子量標準として用いたφＸ　１７
４フアージＤＮＡのｌ１ｉｎｅ■分解産物を示す。図中
→の位置にＰＣＲによってα、１カゼイン遺伝子から増
幅される２２０ｂρのＤＮＡの泳動位置を示す。 第９図はプライマーとしてＢＡＣＯＯ３とＢＡＣＩＯ２
を用いたＰＣＲのアガロースゲル電気泳動の結果を示ず
。図中→の位置にＰＣＲによってαｓ１カゼイン遺伝子
から増幅される１５５ｂＰのＤＮＡの泳動位置を示す。 その他は第８図と同様である。 １８６− 第４図 第５図 第６図 ＢＡＣＯＯＩ ＋ ＡＣＩＯＩ 割球数 第８図 宋 図 ＢＡＣＯＯ３＋ＢＡＣ１０２ 割球数 ６ 第９図 手紛ε主甫正書 （方式） 事件の表示 平成２年特許願第８３７７０号 ２、発明の名称　トランスジェニソクアニマルの生産方
法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名 称 （６６９） 雪印乳業株式会社 ４゜ 代 理 人 住 所 東京都千代田区麹町５丁目４番 クロスサイド麹町ビル７階 ５、補正命令の日付　平成２年９　Ｊｌ　２５日（発送
口）６、補正の対象　図　面 第４図 第３図 第５図

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）外来目的遺伝子を注入した受精卵もしくは外来目
   的遺伝子をすでに有している個体との交配により得られ
   た受精卵から胚を形成せしめ、これを切断、二分離し、
   この二分離された胚の一方からＤＮＡを抽出し、目的遺
   伝子の一部をプライマーとして使用してＰＣＲ法（ポリ
   メラーゼチェーンリアクション）を行って増幅させるこ
   とによりこの中に目的遺伝子の存在することを確認し、
   二分離した他の一方の胚のなかからこの目的遺伝子の存
   在するもののみを選別し、これを仮親に移植し、生産さ
   せることよりなるトランスジェニックアニマルの生産方
   法。
2. （２）ＰＣＲ後の目的遺伝子の確認をアガロースゲルに
   よる電気泳動で行うかあるいは目的遺伝子またはその一
   部をプローブとするハイブリダイゼーションにより行う
   請求項（１）に記載のトランスジェニックアニマルの生
   産方法。