JPH03206880A - 酵母およびアスタキサンチン生産におけるその使用 - Google Patents
酵母およびアスタキサンチン生産におけるその使用Info
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- JPH03206880A JPH03206880A JP2277590A JP27759090A JPH03206880A JP H03206880 A JPH03206880 A JP H03206880A JP 2277590 A JP2277590 A JP 2277590A JP 27759090 A JP27759090 A JP 27759090A JP H03206880 A JPH03206880 A JP H03206880A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungi isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
隼町座分野
本発明は酵母およびアスタキサンチン
（ａｓｔａｘａｎＬｈｉｎ）生産におけるそれらの使用
に関する。
に関する。
発明の背景
Ｎ殖のサケ、マスおよびテナガエピが、野性で見られ、
かつ消費者に好まれる赤色を示すように、”アスクキサ
ンチンかそれらの飼料に加えられている。水産養殖は極
めて急速に成長している市場である。
かつ消費者に好まれる赤色を示すように、”アスクキサ
ンチンかそれらの飼料に加えられている。水産養殖は極
めて急速に成長している市場である。
十合成アスタキサンチンかロノンエ（Ｒｏｃｈｃ）から
商業的に人手司能である。しかしながら、天然源（藻類
、酵母等）から生産されるアスタキサンチンか、取締当
局および同様に消費前によりかなり好まれている。
商業的に人手司能である。しかしながら、天然源（藻類
、酵母等）から生産されるアスタキサンチンか、取締当
局および同様に消費前によりかなり好まれている。
基本的には、４種
オキアミおよびザリガニの殻、藻類、花類（アトニス・
アンヌア（Ａｄｏｎｉｓ−ａｎｎｕａ） ）および酵母
ファフィア・ロドザイマ（ｐｈａｆｒｉａ ｒｈｏｄｏ
ｚｙｍａ）のアスタキサンチン天然源がある。アスタキ
サンチンはオキアミおよびザリカ二の殻から抽出するこ
とができるか、かかる天然の単離物は非常に高価であり
、１トン当たり、５２ｍと、Ｃ９ｍの間のコストを要す
る。アスタキサンチンの藻源においては、色素量か高い
ため、かなり興味がある。しかしながら、藻類の大規模
生産には、測り知れない理論上の問題があり、それが十
分に解決されていないことは明らかである。アスタキサ
ンチンをファフィアから単離するには大きな研究課題が
ある。
アンヌア（Ａｄｏｎｉｓ−ａｎｎｕａ） ）および酵母
ファフィア・ロドザイマ（ｐｈａｆｒｉａ ｒｈｏｄｏ
ｚｙｍａ）のアスタキサンチン天然源がある。アスタキ
サンチンはオキアミおよびザリカ二の殻から抽出するこ
とができるか、かかる天然の単離物は非常に高価であり
、１トン当たり、５２ｍと、Ｃ９ｍの間のコストを要す
る。アスタキサンチンの藻源においては、色素量か高い
ため、かなり興味がある。しかしながら、藻類の大規模
生産には、測り知れない理論上の問題があり、それが十
分に解決されていないことは明らかである。アスタキサ
ンチンをファフィアから単離するには大きな研究課題が
ある。
アスクキサンチンは、１９７０年代の初期にファフィア
にて最初に同定された。野性型ファフィアは少量の色素
（約１５０μｇ／ｇｕ母）しか蓄積しないため、そこで
このルートを経済的に存立させるには、アスタキサンチ
ンを過剰生産する株を開発する必要かある。
にて最初に同定された。野性型ファフィアは少量の色素
（約１５０μｇ／ｇｕ母）しか蓄積しないため、そこで
このルートを経済的に存立させるには、アスタキサンチ
ンを過剰生産する株を開発する必要かある。
すへての野性型ファフィア株の遺伝分析により、倍数性
（染色体の重複）の程度が変化していることが明らかに
なった。倍数性が大きければ大きいほど、一部位突然変
異によってその表現型に影響を及ぼし、代謝のいずれか
の部分の有意な統制解除（ｄｅｒｅｇｕｌａｔ １ｏｎ
）を得ることはますます困難となる。さらに、この酵母
に関して、性サイクルは知られておらず、今まで胞子形
成について報告されたことはなく、酵母成長におけるい
ずれの期から生じる個々のハプロイド細胞も報告されて
いない。
（染色体の重複）の程度が変化していることが明らかに
なった。倍数性が大きければ大きいほど、一部位突然変
異によってその表現型に影響を及ぼし、代謝のいずれか
の部分の有意な統制解除（ｄｅｒｅｇｕｌａｔ １ｏｎ
）を得ることはますます困難となる。さらに、この酵母
に関して、性サイクルは知られておらず、今まで胞子形
成について報告されたことはなく、酵母成長におけるい
ずれの期から生じる個々のハプロイド細胞も報告されて
いない。
ファフィア・ロドサイマの遺伝研究に付随する主な問題
は、高倍数性細胞の異種集団としての酵ｆすの共同生存
にある。本発明者らは、指数関数的に増殖するファフィ
ア細胞の大部分が、ある非常に高いＤＮＡ含量であるこ
とを報告した。これは、多くの突然変異誘発性選択レジ
メに対する応答の欠如、通常の突然変異誘発性剤との長
期間生存および振盪フラスコよりも実質的に大きなスケ
ールにて高レベルのアスタキサンチンを生産する試みに
て観察される不安定性を説明している。
は、高倍数性細胞の異種集団としての酵ｆすの共同生存
にある。本発明者らは、指数関数的に増殖するファフィ
ア細胞の大部分が、ある非常に高いＤＮＡ含量であるこ
とを報告した。これは、多くの突然変異誘発性選択レジ
メに対する応答の欠如、通常の突然変異誘発性剤との長
期間生存および振盪フラスコよりも実質的に大きなスケ
ールにて高レベルのアスタキサンチンを生産する試みに
て観察される不安定性を説明している。
ＷＯ−Ａ−８８０８０２５は、明らかに高レベルのアス
クキサンチンを生産するファフィア・ロドザイマ株を記
載している。実際に得られるよりも、ずっと高（ルベル
かタレートされており、最高値は低バイオマスである。
クキサンチンを生産するファフィア・ロドザイマ株を記
載している。実際に得られるよりも、ずっと高（ルベル
かタレートされており、最高値は低バイオマスである。
指示はハプロイド株に対してなされているが、これにつ
いて与えられている証拠、すなわち、細胞当たり１個の
核があるだけでは、十分ではなく；試験した利用可能な
ファフィア・ロドザイマ株はずっと高い倍数性を有する
。さらに、ＷＯ−Ａ−８８０８０２５は、酵母により生
産されるエタ／−ルのレベルを調整しなければならない
と示しており、２０ｇ／Ｑ、の糖蜜（約ｌＯｇ／（ｌの
ショ糖に相当する）の使用を開示している。
いて与えられている証拠、すなわち、細胞当たり１個の
核があるだけでは、十分ではなく；試験した利用可能な
ファフィア・ロドザイマ株はずっと高い倍数性を有する
。さらに、ＷＯ−Ａ−８８０８０２５は、酵母により生
産されるエタ／−ルのレベルを調整しなければならない
と示しており、２０ｇ／Ｑ、の糖蜜（約ｌＯｇ／（ｌの
ショ糖に相当する）の使用を開示している。
本発明の目的は、高収量の赤色素アスタキサンチン生産
能を有する、酵母ファフィア・ロドザイマで独特の発酵
プロセスを開発することである。
能を有する、酵母ファフィア・ロドザイマで独特の発酵
プロセスを開発することである。
発明の要約
本発明によれば、
（１）酵母１ｇ当たり、少なくとも３０００μｇ、好ま
しくは、少なくとも５０００μｇ、ｔｏｏ。
しくは、少なくとも５０００μｇ、ｔｏｏ。
Ｏμｇまで、１５０００μｇ以上のアスタキサンチンを
蓄積し； （２）高バイオマス濃度、例えば、２ｇ／Ｃまたは好ま
しくは、２５ｇ／（以」二、例えば、４０〜５０ｇ／ρ
にて高色素レベル（５０００μｇ／ｇ以上）を生産し； （３Ｈ２Ｏ時間以下、例えば、７０時間以下の発酵にて
、高色素および高バイオマス濃度ルを生産する能力を有
する酵母株を産出することができる。
蓄積し； （２）高バイオマス濃度、例えば、２ｇ／Ｃまたは好ま
しくは、２５ｇ／（以」二、例えば、４０〜５０ｇ／ρ
にて高色素レベル（５０００μｇ／ｇ以上）を生産し； （３Ｈ２Ｏ時間以下、例えば、７０時間以下の発酵にて
、高色素および高バイオマス濃度ルを生産する能力を有
する酵母株を産出することができる。
本発明のさらなる態様は、エタノール非生産の、光感受
性のハプロイドおよびティプロイトファフィア・ロドザ
イマ株にある。かかる株か、酵母系を活発にさせ、実質
的収量敗訴を可能とする、遺伝的および生物学的な両方
の操作に容易に従うことは明らかである。
性のハプロイドおよびティプロイトファフィア・ロドザ
イマ株にある。かかる株か、酵母系を活発にさせ、実質
的収量敗訴を可能とする、遺伝的および生物学的な両方
の操作に容易に従うことは明らかである。
図面の記載
第１図〜第３図は、公知および新規な株のＤＮＡに対す
る細胞数（ＣＮ）のグラフであり：第４図は、公知およ
び新規な株の細胞体積（ＣＶ）に対する細胞数（ＣＮ）
のグラフであり第５図および第６図は、新規なファフィ
ア・ロドザイマ株の照射（Ｅ ｘｐ、、分）に対する生
存細胞総数（ＶＣＣ１／Ｍ１）の死滅曲線である。
る細胞数（ＣＮ）のグラフであり：第４図は、公知およ
び新規な株の細胞体積（ＣＶ）に対する細胞数（ＣＮ）
のグラフであり第５図および第６図は、新規なファフィ
ア・ロドザイマ株の照射（Ｅ ｘｐ、、分）に対する生
存細胞総数（ＶＣＣ１／Ｍ１）の死滅曲線である。
年明の記載
３つの与えられたいずれかまたはすべての目的に合致す
る有効なアスタキサンチン生産微生物の供給は、アスタ
キサンチン合成の生物学的および生化学的制御に依存し
ているかもしれない。可能性のある鍵となる領域は、中
心炭素、アセチルＣｏΔ、脂質、ステロールおよびカロ
チノイド代謝である。例えば、アセチル−ＣｏＡ代謝に
は少なくとも４つの鍵となる酵素がある。アスタキサン
チン合成のアセテート単位の供給において、ファフィア
におけるＡＴＰ：ントレート・リアーセの存在が、アセ
チル−カルニチン・トランスフェラーゼまたはヒドロラ
ーゼの存在よりもより重要であると思われる。
る有効なアスタキサンチン生産微生物の供給は、アスタ
キサンチン合成の生物学的および生化学的制御に依存し
ているかもしれない。可能性のある鍵となる領域は、中
心炭素、アセチルＣｏΔ、脂質、ステロールおよびカロ
チノイド代謝である。例えば、アセチル−ＣｏＡ代謝に
は少なくとも４つの鍵となる酵素がある。アスタキサン
チン合成のアセテート単位の供給において、ファフィア
におけるＡＴＰ：ントレート・リアーセの存在が、アセ
チル−カルニチン・トランスフェラーゼまたはヒドロラ
ーゼの存在よりもより重要であると思われる。
所望のファフィア・ロドザイマ株を得るに種々の方法が
ある。例えば、ゲノムの分離、真性ハプロイド化および
胞子形成を誘発するに、多くの公知方法がある。さらに
は、ディプロイド株を用いてハプロイドを製造してもよ
い。
ある。例えば、ゲノムの分離、真性ハプロイド化および
胞子形成を誘発するに、多くの公知方法がある。さらに
は、ディプロイド株を用いてハプロイドを製造してもよ
い。
ファフィア・ロドザイマでは限定された性−無性サイク
ルかないことは明らかである。これは稀なことではなく
、今まで種々の（特に、色素化された）酵母および真菌
での多（のケースにて直面している。べ／ミル（ｂｅｎ
ｏｍｙｌ）およびその誘導体、パラ−フルオロフェニル
アラニンおよびバラフルオロフェニルアセテートのよう
な公知試薬力、ハプロイドクローンへの分離を誘発する
のに好適であるかもしれない。高アセテート低窒素培地
、高または低温、高金属イオン濃度を包含する極端な環
境を用いることが、また、問題のある酵母との胞子形成
の誘発に成功するかもしれない。紫外線処理と１以上の
前記条件との併用が、また、真菌および酵母系における
胞子形成／ノ＼プロイト化を可能とするかもしれない。
ルかないことは明らかである。これは稀なことではなく
、今まで種々の（特に、色素化された）酵母および真菌
での多（のケースにて直面している。べ／ミル（ｂｅｎ
ｏｍｙｌ）およびその誘導体、パラ−フルオロフェニル
アラニンおよびバラフルオロフェニルアセテートのよう
な公知試薬力、ハプロイドクローンへの分離を誘発する
のに好適であるかもしれない。高アセテート低窒素培地
、高または低温、高金属イオン濃度を包含する極端な環
境を用いることが、また、問題のある酵母との胞子形成
の誘発に成功するかもしれない。紫外線処理と１以上の
前記条件との併用が、また、真菌および酵母系における
胞子形成／ノ＼プロイト化を可能とするかもしれない。
また、ディプロイドまたは他の低倍数性株を突然変異誘
発に付し、つづいて（推定）ノ＼プロイドまたはディプ
ロイド細胞を単離してもよい。
発に付し、つづいて（推定）ノ＼プロイドまたはディプ
ロイド細胞を単離してもよい。
ハプロイドまたはディプロイドを選択する１つの方法は
、ジアミノフェノールインドールで染色体を染色するこ
とを基礎とし、それは細胞死を引き起こすことなく、蛍
光−活性化細胞ソータ−（ＦΔＣＳ ｏｒｔｅｒ）を用
いてそのＤＮＡ含量に基づき細胞を分離することである
。第２の方法は小細胞の単離を包含し、それはＦ Ａ
ＣＳ ｏｒｔｅｒまたは遠心分離機を用いて行なっても
よい。ついで、これらの細胞を蛍光−活性化スキャンニ
ング（ＦＡＣ５ｃａｎ）装置を用いて分析し、例えば、
サツカロミセス（Ｓ ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から
の７１プロイドおよびディプロイド対照細胞と比較して
細胞のＤＮＡ含量を測定してもよい。第３の方法は、栄
養素プレート（例えば、ＹＭ寒天）からコロニーをラン
ダムに単離し、つついてＦＡＣ３ｃａｎ装置を用いて分
析することを包含する。
、ジアミノフェノールインドールで染色体を染色するこ
とを基礎とし、それは細胞死を引き起こすことなく、蛍
光−活性化細胞ソータ−（ＦΔＣＳ ｏｒｔｅｒ）を用
いてそのＤＮＡ含量に基づき細胞を分離することである
。第２の方法は小細胞の単離を包含し、それはＦ Ａ
ＣＳ ｏｒｔｅｒまたは遠心分離機を用いて行なっても
よい。ついで、これらの細胞を蛍光−活性化スキャンニ
ング（ＦＡＣ５ｃａｎ）装置を用いて分析し、例えば、
サツカロミセス（Ｓ ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から
の７１プロイドおよびディプロイド対照細胞と比較して
細胞のＤＮＡ含量を測定してもよい。第３の方法は、栄
養素プレート（例えば、ＹＭ寒天）からコロニーをラン
ダムに単離し、つついてＦＡＣ３ｃａｎ装置を用いて分
析することを包含する。
推定ハプロイドまたはディプロイドは、ｔ Ｘ＋ルスフ
ィールド電気泳動または種々の化学技法を用いて確認す
ることができる。
ィールド電気泳動または種々の化学技法を用いて確認す
ることができる。
本発明に従って製造されたハプロイドおよびディプロイ
ド株は、それ自体でアスタキサンチン生産者として有用
であるか、また、改良された特性を有するかもしれない
他の株の製造における中間体としても有用性を有する。
ド株は、それ自体でアスタキサンチン生産者として有用
であるか、また、改良された特性を有するかもしれない
他の株の製造における中間体としても有用性を有する。
例えば、所望の変異株は、自体公知な技法および突然変
異原を用いる突然変異誘発により！２造することができ
る。例えば、ＮＴＧまたは紫外線を用いるランダムまた
は特異的突然変異誘発および選択か変異体を付与し、そ
の代謝経路を遮断または統制解除することができる。
異原を用いる突然変異誘発により！２造することができ
る。例えば、ＮＴＧまたは紫外線を用いるランダムまた
は特異的突然変異誘発および選択か変異体を付与し、そ
の代謝経路を遮断または統制解除することができる。
例として、ハプロイドまたはディプロイド株を、多くの
突然変異原を介して突然変異を起こさせ、高度にアスタ
キサンチンを産する変異体く〉２０００μｇ／ｇ）川の
新規な選択操作を用いてスクノーニングしてもよい。こ
れらは、突然変異誘発および選択を繰り返すことによっ
て得られる。
突然変異原を介して突然変異を起こさせ、高度にアスタ
キサンチンを産する変異体く〉２０００μｇ／ｇ）川の
新規な選択操作を用いてスクノーニングしてもよい。こ
れらは、突然変異誘発および選択を繰り返すことによっ
て得られる。
ついて、最も好ましい変異体（類）を発酵槽中にて部分
的に最も効果的にし、その真性特性および種々の培地お
よび環境エフェクターに対するそれらの応答を検定して
もよい。ついで、該最も好ましい変異体を多数回の突然
変異誘発および選択に付し、発酵系にて５０００μｇ／
ｇ以上の生産能を有する新規な変異株を産出させてもよ
い。
的に最も効果的にし、その真性特性および種々の培地お
よび環境エフェクターに対するそれらの応答を検定して
もよい。ついで、該最も好ましい変異体を多数回の突然
変異誘発および選択に付し、発酵系にて５０００μｇ／
ｇ以上の生産能を有する新規な変異株を産出させてもよ
い。
繰返し突然変異誘発および（試薬を組合せて用いる）
１１２合選択法を用いること、それか、敏感な細胞株が
非常に高いレベル（７０００〜９０００１１ｇ／ｇ）の
アスタキサンチンを生産する変異体を産出するのに適し
ている。その段階にて、可能な最も好ましい発酵時間（
４０〜７５時間）にて細胞当たり非常に高レベル（１０
０００μｇ／ｇ）のアスタキサンチンを蓄積させること
必要ならば、再生的に高レベルの生存能力のあるバイオ
マスを生成するのに欠くことができない培養培地および
発酵系を修飾することができる。
１１２合選択法を用いること、それか、敏感な細胞株が
非常に高いレベル（７０００〜９０００１１ｇ／ｇ）の
アスタキサンチンを生産する変異体を産出するのに適し
ている。その段階にて、可能な最も好ましい発酵時間（
４０〜７５時間）にて細胞当たり非常に高レベル（１０
０００μｇ／ｇ）のアスタキサンチンを蓄積させること
必要ならば、再生的に高レベルの生存能力のあるバイオ
マスを生成するのに欠くことができない培養培地および
発酵系を修飾することができる。
安定なハプロイドおよび安定なディプロイド株か得られ
た。ある一定の場合、倍数性が低ければ低いほど、貯蔵
中に高倍数性に変換する可能性が大きくなるのは明らか
である。しかしながら、例えば、ハプロイドからディプ
ロイドに変換した株の培養は、しばしば、ハプロイドへ
の逆戻りが生じる。その理由は解らないが、この程度の
不安定性を有する株が高アスタキサンチン生産変異体の
産出に好ましいとすることができる。
た。ある一定の場合、倍数性が低ければ低いほど、貯蔵
中に高倍数性に変換する可能性が大きくなるのは明らか
である。しかしながら、例えば、ハプロイドからディプ
ロイドに変換した株の培養は、しばしば、ハプロイドへ
の逆戻りが生じる。その理由は解らないが、この程度の
不安定性を有する株が高アスタキサンチン生産変異体の
産出に好ましいとすることができる。
前記のように、ファフイア・ロドザイマの／＼プロイド
またはディプロイド株、例えば、寄託株（実施例１〜３
参照）を用い、標準的突然変異誘発および選択技法によ
ってアスタキサンチン過剰生産変異体を生成してもよい
。それらは、培養させて直接用いるか、または培養させ
、ついでＦＡ Ｃ３ｏｒｔｅｒを用いる細胞選別に付し
、最小細胞（０〜５０％の集団）を選択するかのいずれ
でもよい。
またはディプロイド株、例えば、寄託株（実施例１〜３
参照）を用い、標準的突然変異誘発および選択技法によ
ってアスタキサンチン過剰生産変異体を生成してもよい
。それらは、培養させて直接用いるか、または培養させ
、ついでＦＡ Ｃ３ｏｒｔｅｒを用いる細胞選別に付し
、最小細胞（０〜５０％の集団）を選択するかのいずれ
でもよい。
ＦＡＣ３ｃａｎ分析は、ファフイア株か一連の異なる倍
数性を有することを示しているため、ｌ？ΔＣ３ｏｒｔ
ｅｒの使用か望ましい。これは、偽菌糸体の形成をもた
らす不完全な細胞分裂および倍数性を変化させるファフ
ィア株の傾向の結果であると考えられる。一般に、Ｆ
Ａ ＣＳ ｃａｎ分析から、小さい細胞が低ＤＮＡａｆ
ｆｉ（すなわち、低倍数性）を有することが判明した。
数性を有することを示しているため、ｌ？ΔＣ３ｏｒｔ
ｅｒの使用か望ましい。これは、偽菌糸体の形成をもた
らす不完全な細胞分裂および倍数性を変化させるファフ
ィア株の傾向の結果であると考えられる。一般に、Ｆ
Ａ ＣＳ ｃａｎ分析から、小さい細胞が低ＤＮＡａｆ
ｆｉ（すなわち、低倍数性）を有することが判明した。
したがって、ＦＡＣ３ｏｒｄｅｒを使用することにより
、突然変異誘発がハプロイドまたはディプロイド／ハプ
ロイド集団だけを用いて実施されることが確実となる。
、突然変異誘発がハプロイドまたはディプロイド／ハプ
ロイド集団だけを用いて実施されることが確実となる。
例として、該株をデイフコ・ＹＭ・ブロス（Ｄ １ｒｃ
ｏ 、Ｙ Ｍ ｂｒｏｔｈ）中、２２〜２４°Ｃにて培
養する。中間の対数（ｍｉｄ−１ｏｇ）培養期にて、細
胞を振盪フラスコから取り出し、５〜３０分間、室温に
て、５０〜１０００μｇ／−の間の濃度にてＮ−メチル
−Ｎｏ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を
用いて突然変異誘発に付す。突然変異誘発後、該細胞を
ＹＭ寒寒天−ておよびカロチノイド形成を抑制する化合
物（ゲラニオール（ｇｅｒ３ｎｉｏｌ）のような化合物
、ｌＯ〜ｌＯＯμＱ／Ｑ、の濃度にて）を含有するＹＭ
寒寒天−て培養する。
ｏ 、Ｙ Ｍ ｂｒｏｔｈ）中、２２〜２４°Ｃにて培
養する。中間の対数（ｍｉｄ−１ｏｇ）培養期にて、細
胞を振盪フラスコから取り出し、５〜３０分間、室温に
て、５０〜１０００μｇ／−の間の濃度にてＮ−メチル
−Ｎｏ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を
用いて突然変異誘発に付す。突然変異誘発後、該細胞を
ＹＭ寒寒天−ておよびカロチノイド形成を抑制する化合
物（ゲラニオール（ｇｅｒ３ｎｉｏｌ）のような化合物
、ｌＯ〜ｌＯＯμＱ／Ｑ、の濃度にて）を含有するＹＭ
寒寒天−て培養する。
培養後、過剰生産変異体は、寒天上、赤色コロニーとし
て視覚的に選択することができる。ついて、アスタキサ
ンチン過剰生産度を、ｐＨ，９度および溶解酸素圧を正
確に調整した発酵槽中、選択された変異体をスクリーニ
ングすることにより決定する。（以下の）実施例４に記
載されている操作を用いてよい。
て視覚的に選択することができる。ついて、アスタキサ
ンチン過剰生産度を、ｐＨ，９度および溶解酸素圧を正
確に調整した発酵槽中、選択された変異体をスクリーニ
ングすることにより決定する。（以下の）実施例４に記
載されている操作を用いてよい。
ファフィア細胞によって蓄積したアスタキサンチンのレ
ベルは、また蓄積したステロールおよび脂質のレベルと
正比例の関係にあるかもしれない。
ベルは、また蓄積したステロールおよび脂質のレベルと
正比例の関係にあるかもしれない。
異なる生合成経路がアセチル単位の同一のシトツル給原
（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｐｏｏｌ）にて競合する。した
がって、該方法は、アスタキサンチン含量の変化に関し
て、になる培養条件間のファフィア・ロドザイマにより
生産される細胞内および細胞外脂質およびステロイドの
レベルを調整することにより修飾してもよい。
（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｐｏｏｌ）にて競合する。した
がって、該方法は、アスタキサンチン含量の変化に関し
て、になる培養条件間のファフィア・ロドザイマにより
生産される細胞内および細胞外脂質およびステロイドの
レベルを調整することにより修飾してもよい。
窒素に対する炭素の高比率は、脂質およびステロール生
産と同様にアスタキサンチン合成にｆ＋３ｆｌを及ばす
かもしれない。アスタキサンチン合或は脂質生産と正比
例の関係にまたは反比例の関係にあるかもしれない；例
えば、炭素か脂質に向けられた場合、アスタキサンチン
には利用されない。
産と同様にアスタキサンチン合成にｆ＋３ｆｌを及ばす
かもしれない。アスタキサンチン合或は脂質生産と正比
例の関係にまたは反比例の関係にあるかもしれない；例
えば、炭素か脂質に向けられた場合、アスタキサンチン
には利用されない。
ファフィア・ロドザイマ株が、はとんとまたは全くエタ
ノールを生産しない、例えば、０．５ｇ／Ｑ以下である
ことが判明した。公知の株は、高レベルのエタノールを
生産シ、該アルコールハ培養の間に存在すると毒性であ
ることが知られている。そのため、以前は、要求に応じ
てショ糖を加えることが必要であり、特にショ糖の対数
的添加（ｌｏｇ ａｄｄｉｔｉｏｎ）は実用的でない。
ノールを生産しない、例えば、０．５ｇ／Ｑ以下である
ことが判明した。公知の株は、高レベルのエタノールを
生産シ、該アルコールハ培養の間に存在すると毒性であ
ることが知られている。そのため、以前は、要求に応じ
てショ糖を加えることが必要であり、特にショ糖の対数
的添加（ｌｏｇ ａｄｄｉｔｉｏｎ）は実用的でない。
比べてみると、本発明の株は、比較的多量のショ糖を用
い、それを特に何ら高度に調整した方法にて供給する必
要はなく、比較的に高アスタキサンチン生産の利点を有
しながら、高バイオマスの条件下にて培養することがで
きる。本発明の株は、例えば、５０〜１００ｇ／１２の
ショ糖の存在下にて培養することができる。
い、それを特に何ら高度に調整した方法にて供給する必
要はなく、比較的に高アスタキサンチン生産の利点を有
しながら、高バイオマスの条件下にて培養することがで
きる。本発明の株は、例えば、５０〜１００ｇ／１２の
ショ糖の存在下にて培養することができる。
ゆえに、突然変異誘発に加えて、例えば、カロチノイド
およびステロイドの生産を抑制するように変異体を選択
することが望ましいかもしれない。
およびステロイドの生産を抑制するように変異体を選択
することが望ましいかもしれない。
この目的のために、該株を好適な（着色もまた抑制する
）抑制剤と一緒に培養する。ついで、着色抑制のレベル
を決定する。突然変異誘発に付し、ついで決定した濃度
の抑制剤での培養を行う。その際、着色を引き起こすそ
れらの株を選択することができ、さらにアスタキサンチ
ンのレベル増加か得られる。
）抑制剤と一緒に培養する。ついで、着色抑制のレベル
を決定する。突然変異誘発に付し、ついで決定した濃度
の抑制剤での培養を行う。その際、着色を引き起こすそ
れらの株を選択することができ、さらにアスタキサンチ
ンのレベル増加か得られる。
また、本発明の株を用い、例えば、プロトプラスト融合
、強化特性を有する酵母を遺伝的に１−交配する」 （
特に、醸造業において）十分に確立された技法により新
規なハイブリッドを生産してもよい。該技法は、胃なる
酵母株から細胞壁を静かに除去しく酵素方法を用いる）
、高浸透性培地中、デリケートなプロトプラストを混合
し、ポリエチレングリコールを用いて細胞膜を融合しく
その後、細胞ＤＮＡ念墳を混合し、組込み等できる）、
細胞壁の再生のため、高浸透性寒天中にて融合物をイン
キュベートし、安定したハイブリ、トを選択することを
包含する。新規なハイブリッドは、谷親株の種々の特性
（またはマーカー）特徴を組み合わすことにより同定さ
れる。ハイブリットの安定性を試験し、現型への逆戻り
と新規株を意味する真性な安定ハイブリット型への分離
を調へるのに用いることができる多くの方法がある。
、強化特性を有する酵母を遺伝的に１−交配する」 （
特に、醸造業において）十分に確立された技法により新
規なハイブリッドを生産してもよい。該技法は、胃なる
酵母株から細胞壁を静かに除去しく酵素方法を用いる）
、高浸透性培地中、デリケートなプロトプラストを混合
し、ポリエチレングリコールを用いて細胞膜を融合しく
その後、細胞ＤＮＡ念墳を混合し、組込み等できる）、
細胞壁の再生のため、高浸透性寒天中にて融合物をイン
キュベートし、安定したハイブリ、トを選択することを
包含する。新規なハイブリッドは、谷親株の種々の特性
（またはマーカー）特徴を組み合わすことにより同定さ
れる。ハイブリットの安定性を試験し、現型への逆戻り
と新規株を意味する真性な安定ハイブリット型への分離
を調へるのに用いることができる多くの方法がある。
特に：
（ａ）アスタキサンチンの過剰生産用の１遺伝子屯」増
加の安定した同−柱内のハイプリ、ドの産出の場合； （ｂ）アスタキサンチン生産の強化、高速培養、異なる
炭素源（例えば、アセテート）の利用性等を有する新規
な倍数性株を得るための、他の類および種の酵母（例え
ば、カンシタ・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉ
ｓ） ）とファフィアーｏドザイマとの融合において； ４１１質酵母の高ステロールまたは高脂質生産株とファ
フィアとの融合は、該ハイブリッドに、アスクキサンチ
ンの合成に利用しうる多重のシトツル会アセチル単位を
蓄積させる能力を付与する。クエン酸生産酵母（カンシ
タ・リポリチカ（Ｃａｎｄｉｄａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ
） ）との融合は、ファフィア・ロドザイマがＡＴＰニ
ジトレード・リアーゼを有し、合成されたクエン酸塩を
分裂させる場合、アセチル単位の多くの７トソル給原を
産出するかもしれない。ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒ
ｕｌａ） 、ロドスボリシア（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄ
ｉａ） 、クリプトコツカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ）および他のカロチノイド生産酵母の高色素化株との
新規な融合は、また、これらの酵母は十分に確立された
カロチノイド経路を有するか、０２単位かカロチノイド
様代謝のいくつかの異なる給原（例えば、ロドトルリン
（ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌｉｎ）、牛サントフィル（ｘａ
ｎｔｈｏｐｈｙ ｌ ｌ）、β−カロチン（ｂｅｔａ−
ｃａｒｏｔｅｎｅ） ）を介するように方向付けるため
、実質的なアスタキサンチン合成をもたらずかもしなれ
い。ファフィアたけか、アスタキサンチン合成の分岐経
路を有する。
加の安定した同−柱内のハイプリ、ドの産出の場合； （ｂ）アスタキサンチン生産の強化、高速培養、異なる
炭素源（例えば、アセテート）の利用性等を有する新規
な倍数性株を得るための、他の類および種の酵母（例え
ば、カンシタ・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉ
ｓ） ）とファフィアーｏドザイマとの融合において； ４１１質酵母の高ステロールまたは高脂質生産株とファ
フィアとの融合は、該ハイブリッドに、アスクキサンチ
ンの合成に利用しうる多重のシトツル会アセチル単位を
蓄積させる能力を付与する。クエン酸生産酵母（カンシ
タ・リポリチカ（Ｃａｎｄｉｄａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ
） ）との融合は、ファフィア・ロドザイマがＡＴＰニ
ジトレード・リアーゼを有し、合成されたクエン酸塩を
分裂させる場合、アセチル単位の多くの７トソル給原を
産出するかもしれない。ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒ
ｕｌａ） 、ロドスボリシア（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄ
ｉａ） 、クリプトコツカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ）および他のカロチノイド生産酵母の高色素化株との
新規な融合は、また、これらの酵母は十分に確立された
カロチノイド経路を有するか、０２単位かカロチノイド
様代謝のいくつかの異なる給原（例えば、ロドトルリン
（ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌｉｎ）、牛サントフィル（ｘａ
ｎｔｈｏｐｈｙ ｌ ｌ）、β−カロチン（ｂｅｔａ−
ｃａｒｏｔｅｎｅ） ）を介するように方向付けるため
、実質的なアスタキサンチン合成をもたらずかもしなれ
い。ファフィアたけか、アスタキサンチン合成の分岐経
路を有する。
（Ｃ）ハブロイトファフィア株の突然変ソシ誘発か、ハ
プロイド♀１１株から安定した高倍数性株を産出するに
生産的でない場合； プロ！・プラスト法を用いてもよい。
プロイド♀１１株から安定した高倍数性株を産出するに
生産的でない場合； プロ！・プラスト法を用いてもよい。
小細胞型か高頻度で９１Δ数性細胞を産出しない限りは
、倍数性にかかわらず、また、異種集団から単離した小
細胞型の融合を試みることができる。
、倍数性にかかわらず、また、異種集団から単離した小
細胞型の融合を試みることができる。
次に実施例を用いて本発明を説明する。グラフにおいて
、１（は該株か公知ハプロイドであることを意味し、Ｉ
−１／ Ｄは公知ハプロイド／ディプロイドを意味し、
Ｄは公知ディプロイドを意味し、Ｔは公知トリプロイド
を意味し、Ｅは各実施例の新規株を意味する。
、１（は該株か公知ハプロイドであることを意味し、Ｉ
−１／ Ｄは公知ハプロイド／ディプロイドを意味し、
Ｄは公知ディプロイドを意味し、Ｔは公知トリプロイド
を意味し、Ｅは各実施例の新規株を意味する。
実施例１
ファフィア・ロドサイマ株を単離し、ファフィア・ロト
ザイマＥＮＺＡ−ＭＩＯと称した。これは、スコツトラ
ンド、アバディーンのＮＣＩＭＢに寄託されている（１
９８９年ＩＯ月２６日）。その受入れ番号は４０２２０
である。
ザイマＥＮＺＡ−ＭＩＯと称した。これは、スコツトラ
ンド、アバディーンのＮＣＩＭＢに寄託されている（１
９８９年ＩＯ月２６日）。その受入れ番号は４０２２０
である。
実施例２および５３
ファフィア・ロドザイマＥＮＺＡ−ＭＩＯを、７Ｍブロ
スにおいて、３日間、２４°Ｃにて培養した。
スにおいて、３日間、２４°Ｃにて培養した。
ついで、該細胞を、所定の時間、Ｎ−メチル−Ｎニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニンンで処理Ｌ、０．１〜１％の生
存率を得た。該生存体を適宜希釈し、ＹＭ寒天上に培養
した。
−Ｎ−ニトロソグアニンンで処理Ｌ、０．１〜１％の生
存率を得た。該生存体を適宜希釈し、ＹＭ寒天上に培養
した。
特定の変異体をファフィア・ロドザイマＥＮＺＡ−Ｍ１
０６（実施例２）およびＥＮＺＡ−Ａ１６９（実施例３
）として同定し、アバディーンのＮＣＩＭＢに寄託した
（各々、１９８９年ＩＯ月１９日および１９９０年、６
月２８日）。受入れ番号は、各々、４０２１４および４
０３０１である。
０６（実施例２）およびＥＮＺＡ−Ａ１６９（実施例３
）として同定し、アバディーンのＮＣＩＭＢに寄託した
（各々、１９８９年ＩＯ月１９日および１９９０年、６
月２８日）。受入れ番号は、各々、４０２１４および４
０３０１である。
該細胞は高レベルのアスタキサンチンを生産する。
該変ソシ体細胞を、ＹＭジブロス中２４℃にて培養し、
ヨウ化プロピンウム（Ｐｌ）を用いる公知技法（細胞を
７０％エタノールに固定し、ＰＩで染色する前にＲＮＡ
ａｓｅおよびペプシンで処理した）により染色した。
ヨウ化プロピンウム（Ｐｌ）を用いる公知技法（細胞を
７０％エタノールに固定し、ＰＩで染色する前にＲＮＡ
ａｓｅおよびペプシンで処理した）により染色した。
該新規変異体のある一定の特性を研究した。ヘクトンー
ディノキンソン（Ｂ ｅｃｔｏｎ−Ｄ １ｃｋｉｎｓｏ
ｎ）Ｆ Ａ ＣＳ ｃａｎ機器を用い、添付図面の第１
図〜第４図に示すグラフを作成した。
ディノキンソン（Ｂ ｅｃｔｏｎ−Ｄ １ｃｋｉｎｓｏ
ｎ）Ｆ Ａ ＣＳ ｃａｎ機器を用い、添付図面の第１
図〜第４図に示すグラフを作成した。
細胞ＤＮＡ含量
ＤＮＡ；”Ｒｆｔは細胞をＲＮＡ５ｅて処理し、臭化エ
チジウムで、またはある場合には、Ｐ Ｉで染色し、蛍
光活性化細胞スキャナー（Ｆ Ａ ＣＳ ｃａｎｎｅｒ
）を用いて蛍光を測定することにより決定することかで
きる。この技法を用い、ファフィア酵母細胞のＤＮＡ含
量を、対照のサツカロミセス株（Ｓ ａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ５ｔｒａｉｎ）のＤＮＡ含量と比較すること
ができる。
チジウムで、またはある場合には、Ｐ Ｉで染色し、蛍
光活性化細胞スキャナー（Ｆ Ａ ＣＳ ｃａｎｎｅｒ
）を用いて蛍光を測定することにより決定することかで
きる。この技法を用い、ファフィア酵母細胞のＤＮＡ含
量を、対照のサツカロミセス株（Ｓ ａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ５ｔｒａｉｎ）のＤＮＡ含量と比較すること
ができる。
第１図は、以下の４つの標準体を示す：ＩＩ／Ｄｉ
サツカロミセス・ウバラ１．ＡＴｃｃ２８０９８ （Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍＡＴＣＣ２
８０９８） １） ｌ ニス・ラバラムＡＴＣＣ２８０９９Ｔ
ｌ ｘス−ラバラムＡＴＣＣ２８１０１Ｈｌ
サツカロミセス・ニス・ピーＮＣＹＣ４１ 該曲線は所定の倍数性と一致する。
サツカロミセス・ウバラ１．ＡＴｃｃ２８０９８ （Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍＡＴＣＣ２
８０９８） １） ｌ ニス・ラバラムＡＴＣＣ２８０９９Ｔ
ｌ ｘス−ラバラムＡＴＣＣ２８１０１Ｈｌ
サツカロミセス・ニス・ピーＮＣＹＣ４１ 該曲線は所定の倍数性と一致する。
第２図は、（ハプロイド）標準体Ｈ，Ｉおよびまた
Ｅｌ ファフィア・ロドザイマ ＥＮＺＡｌ０
Ｅ２ ファフィア・ロドザイマ ＥＮＺＡ１０６
を示す。
第３図は、標準体１−１１およびＴＩおよびまた（デイ
ブロイド標準体を示す）： １）２ ニス・ラバラムＡ”ＦＣＣ２８１００１
ミ３ ファフイア・ロドサイマ ＥＮＺＡ１６９ を示す。
ブロイド標準体を示す）： １）２ ニス・ラバラムＡ”ＦＣＣ２８１００１
ミ３ ファフイア・ロドサイマ ＥＮＺＡ１６９ を示す。
該曲線は、新規な親株Ｅ１かディプロイドであり、新規
な変異体Ｅ２およびＥ ３がノープロイドであることを
示す。
な変異体Ｅ２およびＥ ３がノープロイドであることを
示す。
細胞体積
細胞体積は、サツカロミセス・セレビ７アエ（Ｓ ａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｃ）の倍数
ｆ′１（こ比例する（グンケお５上びナノ月・ミ、／不
テイノクス（Ｇｕｎｇ（！およびＮａｋａｔｏｍｉ、
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）−７０−／１４〜５Ｂ（１９７２
））。細胞体積は、前方散乱光をモニター観察すること
によＩＪ Ｆ Ａ ＣＳ ｃａｎ装置にて測定した。
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｃ）の倍数
ｆ′１（こ比例する（グンケお５上びナノ月・ミ、／不
テイノクス（Ｇｕｎｇ（！およびＮａｋａｔｏｍｉ、
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）−７０−／１４〜５Ｂ（１９７２
））。細胞体積は、前方散乱光をモニター観察すること
によＩＪ Ｆ Ａ ＣＳ ｃａｎ装置にて測定した。
この技法を用いて、第４図に示された結果は、株Ｅ Ｎ
ＺΔ−Δ１６９（Ｉシ３）か、ノープロイト標準体Ｉ
Ｉ ｌと同じ大きさのｍｍの細胞をイエすることを示す
。
ＺΔ−Δ１６９（Ｉシ３）か、ノープロイト標準体Ｉ
Ｉ ｌと同じ大きさのｍｍの細胞をイエすることを示す
。
突然変異原での死滅−１囮
死滅曲線は、２つの情報ラインを付与する。低倍数性細
胞は、一定の突然変異原濃度にて高倍数性の細胞よりも
迅速に死滅した。第２は、ハプロイド細胞は、残ってい
る生存集団に比例した一定の死減速度（−次速度論）に
て死んだ。他方、ディプロイドまたは高倍数性細胞は、
照射の増加により死減速度か変化した。すなわち、照射
時間に対してｌｏｇ＋ｏ （細胞）をプロットすると、
この速度変化として特徴的な「隆起」か見られる。
胞は、一定の突然変異原濃度にて高倍数性の細胞よりも
迅速に死滅した。第２は、ハプロイド細胞は、残ってい
る生存集団に比例した一定の死減速度（−次速度論）に
て死んだ。他方、ディプロイドまたは高倍数性細胞は、
照射の増加により死減速度か変化した。すなわち、照射
時間に対してｌｏｇ＋ｏ （細胞）をプロットすると、
この速度変化として特徴的な「隆起」か見られる。
Ｎ′ＦＧ（Ｎ−メチル−Ｎ“−ニトロ−Ｎ−二トロング
アニ／ン）およびＤＭＳ （ジメチルスルフィド）に対
する死滅曲線を、品々、第５図および第６図に示す。い
ずれの場合においても、Ｅ３はＥｌよりもずっと迅速に
死滅し、その「死滅」は−次速度論に従う。Ｅｌは明確
な「隆起」を有する。
アニ／ン）およびＤＭＳ （ジメチルスルフィド）に対
する死滅曲線を、品々、第５図および第６図に示す。い
ずれの場合においても、Ｅ３はＥｌよりもずっと迅速に
死滅し、その「死滅」は−次速度論に従う。Ｅｌは明確
な「隆起」を有する。
１０個の個々のＥ３のコロニーを培養してデータを得た
。８個のコロニーは第４図〜第６図に示したと同様のデ
ータを示した（すなわち、大きなハプロイド集団を有し
た）。２個のコロニーは明白なティプロイド結果を付与
した。さらに、これら２個のコロニーを液体培地にて培
養させると、それらはへフロイド集団を有する細胞株に
変性することを示した。
。８個のコロニーは第４図〜第６図に示したと同様のデ
ータを示した（すなわち、大きなハプロイド集団を有し
た）。２個のコロニーは明白なティプロイド結果を付与
した。さらに、これら２個のコロニーを液体培地にて培
養させると、それらはへフロイド集団を有する細胞株に
変性することを示した。
実施例４
ファフィア・ロドサイマＥＮＺＡ−Ｍｌ ０６ （Ｅ２
）の細胞を、ＹＭジブロス中２４℃にて培養した。中間
の対数（ｍｉｄ−１ｏｇ）培養期にて、９ｍ＆を取り出
し、２ ｍｇ／ ｍｌのＮＴＧ！−に加えた。該細胞を
振借することなく１５分間室温にてインキュベートし、
２５μＱ／Ｑゲラニオール（ｇｅｒａｎｉｏｌ）を加え
たＹＭ上にて培養した。この時間後の生／ｊ−全１は３
１％であった。白色コロニーの背景上に、変５゛シ体（
Ｅ４）か桃色コロニーよして認められた。
）の細胞を、ＹＭジブロス中２４℃にて培養した。中間
の対数（ｍｉｄ−１ｏｇ）培養期にて、９ｍ＆を取り出
し、２ ｍｇ／ ｍｌのＮＴＧ！−に加えた。該細胞を
振借することなく１５分間室温にてインキュベートし、
２５μＱ／Ｑゲラニオール（ｇｅｒａｎｉｏｌ）を加え
たＹＭ上にて培養した。この時間後の生／ｊ−全１は３
１％であった。白色コロニーの背景上に、変５゛シ体（
Ｅ４）か桃色コロニーよして認められた。
ついて、゛ｒスタキサンチン過剰生産の含量を測定する
。この１］的のために、以下の組成を何するスクリーニ
ング培地を用いる ／ニークロース １０ ｇ＃Ｋ
１１ｌ）０． ０．５ ｇ
／（ＭｇＳＯ，，７Ｎ２０ ０．２５
ｇ／Ｑ（Ｎ１１．）、Ｓｏ、
０．８ ｇ／（ＩＣａＣＱ２．２ＨｙＯＯ，１ｇ／Ｑ 酵母抽出物 １ ｇ／ρバ
クテリアペプトン（オキソイド）ｌ ｇ／Ｑ（Ｏ
ｘｏｉｄ） （ペプトン以外）これらの成分を、ｐ１１５゜０に調整
し、ついで１２ピＣにて２０分間オートクレーブ処理に
付す。ペプトンは１０％溶液として滅菌ＩＱ過し、オー
トクレーブ処理後に加える。シードフラスコの場合、２
ｇ／（！フタル酸カリウムを加えてｐ Ｈの緩衝を得る
。
。この１］的のために、以下の組成を何するスクリーニ
ング培地を用いる ／ニークロース １０ ｇ＃Ｋ
１１ｌ）０． ０．５ ｇ
／（ＭｇＳＯ，，７Ｎ２０ ０．２５
ｇ／Ｑ（Ｎ１１．）、Ｓｏ、
０．８ ｇ／（ＩＣａＣＱ２．２ＨｙＯＯ，１ｇ／Ｑ 酵母抽出物 １ ｇ／ρバ
クテリアペプトン（オキソイド）ｌ ｇ／Ｑ（Ｏ
ｘｏｉｄ） （ペプトン以外）これらの成分を、ｐ１１５゜０に調整
し、ついで１２ピＣにて２０分間オートクレーブ処理に
付す。ペプトンは１０％溶液として滅菌ＩＱ過し、オー
トクレーブ処理後に加える。シードフラスコの場合、２
ｇ／（！フタル酸カリウムを加えてｐ Ｈの緩衝を得る
。
スクリーニングを、選択された変異体Ｅ４をＹＭプレー
トからスクリーニング培地７５ｄを含有する５００ｍ＆
！の振盪フラスコに接種することによって開始する。乾
燥型ｆｆｉ ｌ−１，５ｇ／ｆ２が得られるまで、２２
〜２３°Ｃにて３日間振盪する。ついで、それをスクリ
ーニング培地１５ｇを有する発酵槽に移す。これを２２
．５°Ｃの温度に維持し、要すれば、０．８８０Ｍアン
モニアの２５％溶液を自動添加することによりｐＨを５
．０に調整する。
トからスクリーニング培地７５ｄを含有する５００ｍ＆
！の振盪フラスコに接種することによって開始する。乾
燥型ｆｆｉ ｌ−１，５ｇ／ｆ２が得られるまで、２２
〜２３°Ｃにて３日間振盪する。ついで、それをスクリ
ーニング培地１５ｇを有する発酵槽に移す。これを２２
．５°Ｃの温度に維持し、要すれば、０．８８０Ｍアン
モニアの２５％溶液を自動添加することによりｐＨを５
．０に調整する。
溶解酸素圧は、発酵の間と通して、空気飽和の５０％以
上を維持する。
上を維持する。
前記操作に従い、変異体Ｅ４を、発酵槽中にて培養した
場合、細胞乾燥型ｆ１ｇ／ρにて、９５時間後に１５０
０μｇ／ｇのアスタキサンチンおよび１６０時間後に２
１００μｇ／ｇのアスタキサンチンか得られた。この変
異体の安定性を試験ｔル（７）ニ、発ＮＮ４５に接種す
る前のシードフラスコにおいて、余分の１２の世代を介
して行った。こノ発酵で、２ｇ／ρの乾燥バイオマスに
て９０時間後に１５００μｇ／ｇおよび１６０時間後に
２０００μｇ／ｇのアスタキサンチンか７Ｈ７られた。
場合、細胞乾燥型ｆ１ｇ／ρにて、９５時間後に１５０
０μｇ／ｇのアスタキサンチンおよび１６０時間後に２
１００μｇ／ｇのアスタキサンチンか得られた。この変
異体の安定性を試験ｔル（７）ニ、発ＮＮ４５に接種す
る前のシードフラスコにおいて、余分の１２の世代を介
して行った。こノ発酵で、２ｇ／ρの乾燥バイオマスに
て９０時間後に１５００μｇ／ｇおよび１６０時間後に
２０００μｇ／ｇのアスタキサンチンか７Ｈ７られた。
これは、寄託株を用いて安定した変ソシ体か得られるこ
とを示している。
とを示している。
アスタキサンチン収量は、以前は、ロツ／工（Ｒｏｃｈ
ｅ）により記載されている標準操作により、すなわち、
スペクトロフォトメーターを用い、ｌｃｎ＋の経路に沿
って、４７０ｎＩ１１にてヘキサンの１％溶液の吸収を
測定することにより決定した。この方法は、同波長での
吸収を示す他の物質とアスタキサンチンを識別せず、従
って、記録された結果は実際のアスタキサンチンｍより
も１．５〜２倍高いかもしれない。本願明細書に報告さ
れている結果は、アスタキサンチン自体に関するもので
あり、１１１） Ｌ Ｃを用いて測定した。時間に対す
る４７０ｎｍでの吸光度をプロットし、単一ピークとし
て明らかにアスタキサンチンを同定した。
ｅ）により記載されている標準操作により、すなわち、
スペクトロフォトメーターを用い、ｌｃｎ＋の経路に沿
って、４７０ｎＩ１１にてヘキサンの１％溶液の吸収を
測定することにより決定した。この方法は、同波長での
吸収を示す他の物質とアスタキサンチンを識別せず、従
って、記録された結果は実際のアスタキサンチンｍより
も１．５〜２倍高いかもしれない。本願明細書に報告さ
れている結果は、アスタキサンチン自体に関するもので
あり、１１１） Ｌ Ｃを用いて測定した。時間に対す
る４７０ｎｍでの吸光度をプロットし、単一ピークとし
て明らかにアスタキサンチンを同定した。
アスタキサンチン生産の増加についての前記いずれかの
技法により、アスタキサンチン収量を２５００ｐｐｍ（
すなわち、μｇアスタキサンチン／ｇ細胞）に、例えば
、細胞乾燥重量２ ｇ／＋２で１５０時間以内に５００
０ ｐｐｍまで、またはそれ以上に増加させることかで
きる。これらの方法は、前記の株／変異体が低量のエタ
／−ル、すなわち、０、５ ｇ／ｉ！以下のエタノール
を生産するということにより促進される。無制限培養を
回避することか望ましい場合、窒素または池の必須成分
の濃度を制限し、それによって（エタノールよりも一層
高レベルにて、細胞により許容される）乳酸を蓄積させ
るために、条件を変えてもよい。
技法により、アスタキサンチン収量を２５００ｐｐｍ（
すなわち、μｇアスタキサンチン／ｇ細胞）に、例えば
、細胞乾燥重量２ ｇ／＋２で１５０時間以内に５００
０ ｐｐｍまで、またはそれ以上に増加させることかで
きる。これらの方法は、前記の株／変異体が低量のエタ
／−ル、すなわち、０、５ ｇ／ｉ！以下のエタノール
を生産するということにより促進される。無制限培養を
回避することか望ましい場合、窒素または池の必須成分
の濃度を制限し、それによって（エタノールよりも一層
高レベルにて、細胞により許容される）乳酸を蓄積させ
るために、条件を変えてもよい。
Ｅ４を、明所および暗所にて、各２回の比較実験におい
て、他の点では同一条件下にて１２０時間培養した。結
果を以下の表にて示す（ＯＤ−光学濃度、収量はＨＰＬ
Ｃによって測定したアスタキサンチン量を意味する）： 実験 ＯＤ 収量（μｇ＃）１ （明るい
） ＋８．２ ８．８５１ （暗い）
１８．１ ４．８２（明るい） １Ｂ、６
８．０２（暗い） １５．７
４．５したがって、光の存在下にて培養した場合、Ｅ４
は少なくとも実質的に収量増加を示し；言い換えれば、
暗かりは抑制剤として作用する。この特徴は、寒天プレ
ートにおけるファフィア・ロドザイマの強度の光の照射
が、着色抑制剤の不在下、培養抑制およびカロチノイド
合成の減少をもたらすという、アンおよびジョンソン、
アントニー・ノユーベンホーク（ＡｎおよびＪ ｏｈｎ
ｓｏｎ、 Ａ ｎｔｏｎｉｅＬｅｅｕｖｅｎｈｏｅｋ
） ５７ （４） （１９９０） １９ ］〜２０
４によって報告されている観察と金（逆である。抑制剤
アンチマイシンの存在下、培養抑制は光によって緩和さ
れた。
て、他の点では同一条件下にて１２０時間培養した。結
果を以下の表にて示す（ＯＤ−光学濃度、収量はＨＰＬ
Ｃによって測定したアスタキサンチン量を意味する）： 実験 ＯＤ 収量（μｇ＃）１ （明るい
） ＋８．２ ８．８５１ （暗い）
１８．１ ４．８２（明るい） １Ｂ、６
８．０２（暗い） １５．７
４．５したがって、光の存在下にて培養した場合、Ｅ４
は少なくとも実質的に収量増加を示し；言い換えれば、
暗かりは抑制剤として作用する。この特徴は、寒天プレ
ートにおけるファフィア・ロドザイマの強度の光の照射
が、着色抑制剤の不在下、培養抑制およびカロチノイド
合成の減少をもたらすという、アンおよびジョンソン、
アントニー・ノユーベンホーク（ＡｎおよびＪ ｏｈｎ
ｓｏｎ、 Ａ ｎｔｏｎｉｅＬｅｅｕｖｅｎｈｏｅｋ
） ５７ （４） （１９９０） １９ ］〜２０
４によって報告されている観察と金（逆である。抑制剤
アンチマイシンの存在下、培養抑制は光によって緩和さ
れた。
光−感受性は、さらに、好適な株でのアスタキサンチン
収■を増加させる別の手段を提供する。
収■を増加させる別の手段を提供する。
それはまた、周囲の光度を調整することによって制限解
除される好適な株および構造性変異体を選択する手段を
提供する。
除される好適な株および構造性変異体を選択する手段を
提供する。
第１図〜第３図は、公知および新規な株のＤＮＡに対す
る細胞数（ＣＮ）のグラフであり；第４図は、公知およ
び新規な株の細胞体積（ＣＶ）に対する細胞数（ＣＮ）
のグラフであり第５図および第６図は、新規なファフィ
ア・ロドサイマ株の照射（Ｅｘｐ、、分）に対する生存
細胞総数（ＶＣＣ１／ｆｆ＋１）の死滅曲線である。 以下のグラフ中、記号は以下を意味する。 １（／Ｉ）１；サツカロミセス・ラバラムＡＴＣＣ８０
９８ Ｄｌ； ニス・ラバラムへＴＣ０２８０９９′Ｆ１．
ニス・ウハラムＡＴＣＣ２８１ｏ１１１１： サ
ツカロミセス・ニス・ビーＮＣＹＣ８４１
る細胞数（ＣＮ）のグラフであり；第４図は、公知およ
び新規な株の細胞体積（ＣＶ）に対する細胞数（ＣＮ）
のグラフであり第５図および第６図は、新規なファフィ
ア・ロドサイマ株の照射（Ｅｘｐ、、分）に対する生存
細胞総数（ＶＣＣ１／ｆｆ＋１）の死滅曲線である。 以下のグラフ中、記号は以下を意味する。 １（／Ｉ）１；サツカロミセス・ラバラムＡＴＣＣ８０
９８ Ｄｌ； ニス・ラバラムへＴＣ０２８０９９′Ｆ１．
ニス・ウハラムＡＴＣＣ２８１ｏ１１１１： サ
ツカロミセス・ニス・ビーＮＣＹＣ８４１
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、細胞乾燥重量２ｇ／ｌにて、少なくとも１０００μ
ｇ／ｇのレベルでアスタキサンチンを生産する能力を有
する酵母株。 ２、該レベルが２０００〜１００００μｇ／ｇである請
求項１記載の酵母株。 ３、該レベルが２５００〜１００００μｇ／ｇである請
求項１記載の酵母株。 ４、該レベルが５０００μｇ／ｇまでである請求項１〜
請求項３記載のいずれか１つの酵母株。 ５、ファフィア・ロドザイマ （Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）のハプロイド
株。 ６、ファフィア・ロドザイマのディプロイド株。 ７、ショ糖の存在下にて培養した場合に、実質的にエタ
ノールを生産しないことにより特徴付けられるファフィ
ア・ロドザイマ株。 ８、着色抑制剤の不在下、暗所にて培養した場合よりも
明所にて培養した場合の方が、実質的によりアスタキサ
ンチンを生産することにより特徴付けられるファフィア
・ロドザイマ株。 ９、ショ糖の存在下にて培養した場合に、実質的にエタ
ノールを生産しないことにより、さらに特徴付けられる
請求項８記載の株。 １０、ＮＣＩＭＢ４０２１４、ＮＣＩＭＢ４０２２０ま
たはＮＣＩＭＢ４０３０１で寄託されている株またはそ
の変異株のいずれかの特性を有する請求項１〜請求項９
記載のいずれかの１つの株。 １１、請求項１〜請求項１０記載のいずれかのファフィ
ア株と別の微生物または適合性遺伝情報の融合産物。 １２、請求項５〜請求項１１のいずれかの株を突然変異
誘発に付し、少なくとも他の細胞産物の抑制剤の存在下
にて該変異体を培養し、色素抑制度を測定し、該産物を
突然変異誘発に付し、所定の抑制剤濃度の存在下にて培
養した場合にアスタキサンチンを生産する株を選択する
ことからなることを特徴とする、高レベルのアスタキサ
ンチンを生産することにより特徴付けられる酵母株の製
造方法。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB898924211A GB8924211D0 (en) | 1989-10-27 | 1989-10-27 | Yeasts |
| GB8924211.9 | 1989-10-27 | ||
| GB8924212.7 | 1989-10-27 | ||
| GB898924212A GB8924212D0 (en) | 1989-10-27 | 1989-10-27 | Yeasts |
| GB9015162.2 | 1990-07-10 | ||
| GB909015162A GB9015162D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-07-10 | Yeasts |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03206880A true JPH03206880A (ja) | 1991-09-10 |
Family
ID=27264762
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2277590A Pending JPH03206880A (ja) | 1989-10-27 | 1990-10-15 | 酵母およびアスタキサンチン生産におけるその使用 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0427405A1 (ja) |
| JP (1) | JPH03206880A (ja) |
| NO (1) | NO904447L (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04228064A (ja) * | 1990-04-23 | 1992-08-18 | Phillips Petroleum Co | ファフィア・ロドジーマによるアスタキサンチン製造方法 |
| WO1992021764A1 (en) | 1991-06-06 | 1992-12-10 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing astaxanthin by fermentation |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5212088A (en) * | 1990-10-23 | 1993-05-18 | Phillips Petroleum Company | Spheroplast fusions of phaffia rhodozyma cells |
| DK115191D0 (da) * | 1991-06-14 | 1991-06-14 | Ingrid Stampe Villadsen | Fremgangsmaade til frembringelse af carotenoidproducerende, isaer astaxanthinproducerende, mikroorganismer, mikroorganismer opnaaet ved fremgangsmaaden og fremgangsmaade til fremstilling af carotenoidholdige mikroorganismeceller eller -celledele eller oprenset carotenoid |
| US5648261A (en) * | 1991-12-17 | 1997-07-15 | Gist-Brocades, N.V. | Strains of Phaffia rhodozyma containing high levels of astaxanthin and low levels of 3-hydroxy-3',4'-didehydro-β, Ψ-caroten-4-one (HDCO) |
| AU657593B2 (en) * | 1992-01-29 | 1995-03-16 | Burns Philp Food Inc. | Treatment of phaffia rhodozyma |
| US5466599A (en) * | 1993-04-19 | 1995-11-14 | Universal Foods Corporation | Astaxanthin over-producing strains of phaffia rhodozyma |
| EP1866428A2 (en) | 2005-03-18 | 2007-12-19 | Microbia, Inc. | Production of carotenoids in oleaginous yeast and fungi |
| EP2078092A2 (en) | 2006-09-28 | 2009-07-15 | Microbia, Inc. | Production of carotenoids in oleaginous yeast and fungi |
| CN108866139A (zh) * | 2018-07-19 | 2018-11-23 | 威海利达生物科技有限公司 | 一种可提高虾青素产量的红法夫酵母培养方法 |
| CN116445303A (zh) * | 2023-03-20 | 2023-07-18 | 淮阴师范学院 | 一株利用生物质糖化液发酵生产虾青素的菌株及其应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK199887D0 (da) * | 1987-04-15 | 1987-04-15 | Danisco Bioteknologi As | Gaerstamme |
-
1990
- 1990-10-15 EP EP90311254A patent/EP0427405A1/en not_active Withdrawn
- 1990-10-15 JP JP2277590A patent/JPH03206880A/ja active Pending
- 1990-10-15 NO NO90904447A patent/NO904447L/no unknown
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04228064A (ja) * | 1990-04-23 | 1992-08-18 | Phillips Petroleum Co | ファフィア・ロドジーマによるアスタキサンチン製造方法 |
| WO1992021764A1 (en) | 1991-06-06 | 1992-12-10 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing astaxanthin by fermentation |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO904447D0 (no) | 1990-10-15 |
| NO904447L (no) | 1991-04-29 |
| EP0427405A1 (en) | 1991-05-15 |
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