JPH03206884A - デアセトキシセファロスポリンｃヒドロキシラーゼ - Google Patents
デアセトキシセファロスポリンｃヒドロキシラーゼInfo
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- JPH03206884A JPH03206884A JP2260288A JP26028890A JPH03206884A JP H03206884 A JPH03206884 A JP H03206884A JP 2260288 A JP2260288 A JP 2260288A JP 26028890 A JP26028890 A JP 26028890A JP H03206884 A JPH03206884 A JP H03206884A
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- C12P35/06—Cephalosporin C; Derivatives thereof
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、デアセトキシセファロスポリンＣヒドロキシ
ラーゼとも呼ばれる酵素、デアセチルセファロスポリン
ＣシンテターゼＮ）ＡＣ３）に関するものである。特に
本発明は、ストレプトマイセス クラブリゲルス（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）か
ら得られたＤＡＣ５、および該酵素を純化した形で得る
方法に関する。
ラーゼとも呼ばれる酵素、デアセチルセファロスポリン
ＣシンテターゼＮ）ＡＣ３）に関するものである。特に
本発明は、ストレプトマイセス クラブリゲルス（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）か
ら得られたＤＡＣ５、および該酵素を純化した形で得る
方法に関する。
従来の技術
セファロスポリンＣ合成の生合成経路には数種の酵素作
用が含Ｊれる。ｒｆＪ単に説明すると、ＡＣＶシンテタ
ーゼがトリペプチド、Ｌ−α−アミノアンビル−し−ン
スティニルーＤ−バリンヲ合成シ、このトリペプチド（
ＡＣＶ）がイソベニンリンＮンンテダーゼ（Ｉ ＰＮＳ
）によってイソペニシリンＮへ変換される。イソペニシ
リンＮはエピメラーゼ酵素（ＩＰＮエピメラーゼまたは
Ｉ ＰＮＥ）によってペニシリンＮへ異性化され、デア
セトキシセフ１０スポリンＣＤＡＯＣシンテターゼ（「
エキスパンダーゼ」）がペニシリンＮをデアセトキシセ
ファロスポリンＣへ変換する。ヒドロキシラーゼ酵素で
あるデアセチルセファロスポリンＣシンテターゼ（ＤＡ
ＯＣヒドロキシラーゼ）は、ＤＡＯＣをデアセチルセフ
ァロスポリンＣ（ＤＡＣ）へ変換し、アセチルトランス
フェラーゼ（セファロスポリンＣシンテターゼ）のＤＡ
Ｃに対する作用によってセファロスポリンＣを生産する
。
用が含Ｊれる。ｒｆＪ単に説明すると、ＡＣＶシンテタ
ーゼがトリペプチド、Ｌ−α−アミノアンビル−し−ン
スティニルーＤ−バリンヲ合成シ、このトリペプチド（
ＡＣＶ）がイソベニンリンＮンンテダーゼ（Ｉ ＰＮＳ
）によってイソペニシリンＮへ変換される。イソペニシ
リンＮはエピメラーゼ酵素（ＩＰＮエピメラーゼまたは
Ｉ ＰＮＥ）によってペニシリンＮへ異性化され、デア
セトキシセフ１０スポリンＣＤＡＯＣシンテターゼ（「
エキスパンダーゼ」）がペニシリンＮをデアセトキシセ
ファロスポリンＣへ変換する。ヒドロキシラーゼ酵素で
あるデアセチルセファロスポリンＣシンテターゼ（ＤＡ
ＯＣヒドロキシラーゼ）は、ＤＡＯＣをデアセチルセフ
ァロスポリンＣ（ＤＡＣ）へ変換し、アセチルトランス
フェラーゼ（セファロスポリンＣシンテターゼ）のＤＡ
Ｃに対する作用によってセファロスポリンＣを生産する
。
セファロスポリンＣの生合成経路は広範な研究の対象で
あった。ジエンセン（Ｊｅｎｓｅｎ、 Ｓ、Ｅ、）ら［
１，９８５年、ジャーナル・オブ・アンチバイオティッ
クス（Ｊ、 Ａｎｔｉｂｉｏｔ、 ）、３８巻、２６３
〜２６５頁］はストレプトマイセス・クラブリゲルスで
、２つの別々の酵素、エキスパンダーゼおよびヒドロキ
シラーゼを報告した。コーテス（ＣｏｒｔｅｓＪ、）ら
［１９８７年、ジェネラル・マイクロバイオロジー（Ｇ
ｅｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）、１３３巻、３１６５
〜３１７４頁］はストレプトマイセス・ラクタムヅラン
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔａｍｄｕｒａ
ｎｓ）から得られたデアセトキシセファロスポリンＣシ
ンテターゼの純化および特性決定を報告した。ドララフ
（Ｄｏｔｚｌａｆ、 Ｊ、Ｅ、） 、イｘ −（Ｙｅｈ
、 Ｗ−に、 ） ［１９８７年、ジャーナル オブ
バクテリオロジ−（ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ、 ）、１６
９巻、１６１１〜１６１８頁］はセファロスポリウム・
アクレモニウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃ
ｒｅｍｏｎｉｕｍ） （米国特許第４７５３８８１号
）に由来する２元機能を備えたエキスパンダーゼ／ヒド
ロキシラーゼを報告した。ｄリンズ（Ｒｏｌｌｉｎｓ、
Ｍ、Ｊ、）ら［１９８８年、カナデイアン・ジャーナ
ル・オブ・マイクロバイオロジー（Ｃａｎ。
あった。ジエンセン（Ｊｅｎｓｅｎ、 Ｓ、Ｅ、）ら［
１，９８５年、ジャーナル・オブ・アンチバイオティッ
クス（Ｊ、 Ａｎｔｉｂｉｏｔ、 ）、３８巻、２６３
〜２６５頁］はストレプトマイセス・クラブリゲルスで
、２つの別々の酵素、エキスパンダーゼおよびヒドロキ
シラーゼを報告した。コーテス（ＣｏｒｔｅｓＪ、）ら
［１９８７年、ジェネラル・マイクロバイオロジー（Ｇ
ｅｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）、１３３巻、３１６５
〜３１７４頁］はストレプトマイセス・ラクタムヅラン
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔａｍｄｕｒａ
ｎｓ）から得られたデアセトキシセファロスポリンＣシ
ンテターゼの純化および特性決定を報告した。ドララフ
（Ｄｏｔｚｌａｆ、 Ｊ、Ｅ、） 、イｘ −（Ｙｅｈ
、 Ｗ−に、 ） ［１９８７年、ジャーナル オブ
バクテリオロジ−（ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ、 ）、１６
９巻、１６１１〜１６１８頁］はセファロスポリウム・
アクレモニウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃ
ｒｅｍｏｎｉｕｍ） （米国特許第４７５３８８１号
）に由来する２元機能を備えたエキスパンダーゼ／ヒド
ロキシラーゼを報告した。ｄリンズ（Ｒｏｌｌｉｎｓ、
Ｍ、Ｊ、）ら［１９８８年、カナデイアン・ジャーナ
ル・オブ・マイクロバイオロジー（Ｃａｎ。
Ｊ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、） 、３４巻、１１９６〜
１２０２頁］はストレプトマイセス・クラブリゲルスか
らＩ１１離されたＤＯＡＣシンテターゼの部分純化を報
告した。最近イエ−およびドララフはストレプトマイセ
ス・クラブリゲルスおよび組換え体エシェリキア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｔ ｉ）からのエキス
パンダーゼの純化を報告した。
１２０２頁］はストレプトマイセス・クラブリゲルスか
らＩ１１離されたＤＯＡＣシンテターゼの部分純化を報
告した。最近イエ−およびドララフはストレプトマイセ
ス・クラブリゲルスおよび組換え体エシェリキア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｔ ｉ）からのエキス
パンダーゼの純化を報告した。
セファロスポリンＣ生合成経路に関与する酵素の利用は
高い有用性がある。これらの酵素は、特許こ純化された
形で、逆向き遺伝学的にセファロスポリンＣ産生微生物
の遺伝子を研究するのに有用である。そのような遺伝子
を別の微生物でクローン化すると、−層高収量のセファ
ロスポリンＣが提供される。また草陰した酵素を使用し
て、例えばボールドウィン（Ｂａｌｄｗｉｎ）が置換ペ
ニシリンを生産するのに行なったように（米国特許第４
６６６８３５号）、構造的に修飾されたβ−ラクタム抗
生物質を生産する種々の基質の無細胞変換を研究するこ
とができる。したがってこの経路のこれらの酵素の草陰
および純化は、−層有効な抗微生物剤を探索し、またセ
ファロスポリンＣを組換え技術によって生産するために
現在進行しつつある重要な課題である。
高い有用性がある。これらの酵素は、特許こ純化された
形で、逆向き遺伝学的にセファロスポリンＣ産生微生物
の遺伝子を研究するのに有用である。そのような遺伝子
を別の微生物でクローン化すると、−層高収量のセファ
ロスポリンＣが提供される。また草陰した酵素を使用し
て、例えばボールドウィン（Ｂａｌｄｗｉｎ）が置換ペ
ニシリンを生産するのに行なったように（米国特許第４
６６６８３５号）、構造的に修飾されたβ−ラクタム抗
生物質を生産する種々の基質の無細胞変換を研究するこ
とができる。したがってこの経路のこれらの酵素の草陰
および純化は、−層有効な抗微生物剤を探索し、またセ
ファロスポリンＣを組換え技術によって生産するために
現在進行しつつある重要な課題である。
発明の態様
本発明のデアセトキシセファロスポリンＣヒドロキシラ
ーゼ（ＤＡＯＣヒドロキシラーゼ）は、ストレプトマイ
セス・クラブリゲルス株の細胞抽出物から入手可能であ
り、９０％以上の純度で得ることができる。高度に純化
された天然酵素（９２％純度）はウルトラゲル（Ｕｌｔ
ｒａｇｅｌ）Ａ ｃ Ａ ５４ゲルを使用したゲル濾過
法によって推定された３５０００ダルトンの分子量を示
す（第１Ａ図）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって測定した
最低分子量は３８０００ダルトンである（第１Ｂ図）。
ーゼ（ＤＡＯＣヒドロキシラーゼ）は、ストレプトマイ
セス・クラブリゲルス株の細胞抽出物から入手可能であ
り、９０％以上の純度で得ることができる。高度に純化
された天然酵素（９２％純度）はウルトラゲル（Ｕｌｔ
ｒａｇｅｌ）Ａ ｃ Ａ ５４ゲルを使用したゲル濾過
法によって推定された３５０００ダルトンの分子量を示
す（第１Ａ図）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって測定した
最低分子量は３８０００ダルトンである（第１Ｂ図）。
ヒドロキンラーゼは単量体酵素である。
ＤＡＯＣヒドロキシラーゼのアミノ酸組成を下記の第１
表に示す、この組成はドララフおよびイエ−［１９８７
年、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、１６９巻、
１６１１〜１６１８頁〕によって報告された方法により
測定した。
表に示す、この組成はドララフおよびイエ−［１９８７
年、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、１６９巻、
１６１１〜１６１８頁〕によって報告された方法により
測定した。
図上溝ストレプトマイセス クラブリゲルスから得たＤ
ＡＯＣヒドロキシラーゼのアミノ酸組成３５０００ダル
トン Ａｓｐ＋Ａｓｎ ２５ ｈ
ｒ ２６島 ｅｒ ２７” （第１表つづき） Ｇｌｕ＋ＧＩｎ Ｐｒ。
ＡＯＣヒドロキシラーゼのアミノ酸組成３５０００ダル
トン Ａｓｐ＋Ａｓｎ ２５ ｈ
ｒ ２６島 ｅｒ ２７” （第１表つづき） Ｇｌｕ＋ＧＩｎ Ｐｒ。
Ｇ１３／
Ａｌａ
Ｌｙｓ
Ｖａｌ
ｅｔ
ｉｅ
Ｌｅｕ
Ｔｙｒ
Ｐｈｅ
ｉｓ
Ｌｙｓ
Ａｒｇ
”加水分解の０時へ外挿することによって測定しシステ
ィン酸として測定 （チオグリコール酸の存在で加水分解することによって
測定 天然ヒドロキシラーゼタンパク質の２８残基アミノ末端
配列を測定し、その配列はＡｌａ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐ
ｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｉ １ｅＰｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｅ
ｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＬｅｕＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−
Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐ
ｈｅ−Ｇ！ｕ−ＨｉｓＶａ ｌ−Ｈｉ ５−Ｌｅｕであ
る。
ィン酸として測定 （チオグリコール酸の存在で加水分解することによって
測定 天然ヒドロキシラーゼタンパク質の２８残基アミノ末端
配列を測定し、その配列はＡｌａ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐ
ｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｉ １ｅＰｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｅ
ｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＬｅｕＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−
Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐ
ｈｅ−Ｇ！ｕ−ＨｉｓＶａ ｌ−Ｈｉ ５−Ｌｅｕであ
る。
天然ヒドロキシラーゼタンパク質の純化の際、その分解
によって９残基アミノ末端配列（内部配列）を得た。そ
の配列はＴｈ ｒ−Ｇ ｌ ｙ−３ｅ ｒＴｙｒ−Ｔｈ
ｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−丁゛ｈｒである。
によって９残基アミノ末端配列（内部配列）を得た。そ
の配列はＴｈ ｒ−Ｇ ｌ ｙ−３ｅ ｒＴｙｒ−Ｔｈ
ｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−丁゛ｈｒである。
天然タンパク質の３残基カルボキシ末端配列を測定し、
その配列はＰｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａであった。
その配列はＰｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａであった。
ＤＡＯＣヒドロキシラーゼは触媒活性のため、外部から
α−ケトグルタレート、第一鉄イオンおよび酸素を必要
とする。第一鉄イオンは最高の酵素活性を発現するため
に必要であり、外部からのＦｅ”＋がないと最高活性の
２％に低下する。第一鉄イオンは、Ｍｇ！＋、Ｍｎ２＋
、Ｃ０２＋、Ｃａ”Ｃｕ ”、Ｎｉ”、Ｚ ｎ ”、ナ
トリウムまたはカリウムのいずれのイオンとも置き換え
られなかった。
α−ケトグルタレート、第一鉄イオンおよび酸素を必要
とする。第一鉄イオンは最高の酵素活性を発現するため
に必要であり、外部からのＦｅ”＋がないと最高活性の
２％に低下する。第一鉄イオンは、Ｍｇ！＋、Ｍｎ２＋
、Ｃ０２＋、Ｃａ”Ｃｕ ”、Ｎｉ”、Ｚ ｎ ”、ナ
トリウムまたはカリウムのいずれのイオンとも置き換え
られなかった。
外部からの第二鉄イオンは、ジチオトレイトール（ＤＴ
Ｔ）またはアスコルベートのような好適な還元剤の存在
で最高活性を維持したまま第一鉄イオンと置き換えるこ
とができる。還元型グルタチオンはアスコルベートの存
在で酵素活性を刺激するのに効果がある。β−メルカプ
トエタノールはほとんど刺激効果を示さない。ＤＴＴま
たはアスコルベートの存在で、外部からの第一鉄イオン
によって観察された最高触媒活性は、ＤＴＴおよびアス
コルベートが存在しないと約８０％減少する。
Ｔ）またはアスコルベートのような好適な還元剤の存在
で最高活性を維持したまま第一鉄イオンと置き換えるこ
とができる。還元型グルタチオンはアスコルベートの存
在で酵素活性を刺激するのに効果がある。β−メルカプ
トエタノールはほとんど刺激効果を示さない。ＤＴＴま
たはアスコルベートの存在で、外部からの第一鉄イオン
によって観察された最高触媒活性は、ＤＴＴおよびアス
コルベートが存在しないと約８０％減少する。
必要とするＦ ｅ ”、ａ−ケトグルタレートおよび０
７の存在で酵素で観察される触媒活性は、ＤＴＴまたは
アスコルベートによって刺激されるが、ＡＴＰでは刺激
されない、ＤＴＴのような還元剤が全く存在しない場合
は、ヒドロキシラーゼ活性は約５倍減少する。
７の存在で酵素で観察される触媒活性は、ＤＴＴまたは
アスコルベートによって刺激されるが、ＡＴＰでは刺激
されない、ＤＴＴのような還元剤が全く存在しない場合
は、ヒドロキシラーゼ活性は約５倍減少する。
ＤＡＯＣをＤＡＣへ変換する酵素反応は、１５ｍＭ３−
（Ｎ−モルホリノ）プロバンスルホン酸緩衝液（ＭＯＰ
Ｓ緩衝液）で、ＰＨ７，０〜７．４、約２９℃の温度で
最適である。ＭＯＰＳ）Ｊｌｉｉ液の至適ｐＨで、これ
をＨＥＰＥＳ［衝液およびトリス−ＨＣＩＷＬ街液に１
き換えると、それぞれ７％および２７％の酵素活性の低
下を来たすので、ＭＯＰＳ！衝液はこの酵素に使用して
好ましい緩衝液である。
（Ｎ−モルホリノ）プロバンスルホン酸緩衝液（ＭＯＰ
Ｓ緩衝液）で、ＰＨ７，０〜７．４、約２９℃の温度で
最適である。ＭＯＰＳ）Ｊｌｉｉ液の至適ｐＨで、これ
をＨＥＰＥＳ［衝液およびトリス−ＨＣＩＷＬ街液に１
き換えると、それぞれ７％および２７％の酵素活性の低
下を来たすので、ＭＯＰＳ！衝液はこの酵素に使用して
好ましい緩衝液である。
金属キレート化剤およびスルフヒドリル試薬のＤＡＯＣ
ヒドロキシラーゼに対する効果を測定し、その結果を第
２表に示す。
ヒドロキシラーゼに対する効果を測定し、その結果を第
２表に示す。
匙λ濃金属キレート剤およびスルフヒドリル試薬のＤＡ
ＯＣヒドロキシラーゼに対する効果添加剤ｌ
濃度（ｍＭ） 相対活性（％）無添加
・・−・・−１０００−フェナントロリン ０．
０５ ８１０．５ ０ ＥＤＴＡ Ｏ，０５’ １６０．５
０ ＤＴＮＢ １ ０（第２表
つづき） ＮＥＭ ヨ ド酢酸 ’ＥＤＴＡ・・・・・エチレンジアミン四酢酸ＤＴＮＢ
・・・・・５．５−ジチオビス−２−二トロ安息香酸 ＮＥＭ ・・・・・Ｎ−エチルマレインイミドスルフ
ヒドリル試薬による阻害に対する感受性と結び付けられ
る上記のようなりＴＴによる触媒活性の刺ｆｆ１（第２
表）から、酵素のスルフヒドリル基の少なくとも１つが
活性のため不可欠であることが分かる０重要と推定され
るスルフヒドリル残基の数およびその位置は、これまで
のところ決定されなかった。
ＯＣヒドロキシラーゼに対する効果添加剤ｌ
濃度（ｍＭ） 相対活性（％）無添加
・・−・・−１０００−フェナントロリン ０．
０５ ８１０．５ ０ ＥＤＴＡ Ｏ，０５’ １６０．５
０ ＤＴＮＢ １ ０（第２表
つづき） ＮＥＭ ヨ ド酢酸 ’ＥＤＴＡ・・・・・エチレンジアミン四酢酸ＤＴＮＢ
・・・・・５．５−ジチオビス−２−二トロ安息香酸 ＮＥＭ ・・・・・Ｎ−エチルマレインイミドスルフ
ヒドリル試薬による阻害に対する感受性と結び付けられ
る上記のようなりＴＴによる触媒活性の刺ｆｆ１（第２
表）から、酵素のスルフヒドリル基の少なくとも１つが
活性のため不可欠であることが分かる０重要と推定され
るスルフヒドリル残基の数およびその位置は、これまで
のところ決定されなかった。
ＤＡＯＣヒドロキシラーゼの主な触媒活性、即ち、デア
セトキシセファロスポリンＣをデアセチルセファロスポ
リンＣ（ＤＡＣ）へ変換する活性に加えて、この酵素は
また３−エキソメチレンセファロスポリンＣ［７β−（
α−アミノアジポイルアミノ）−３−エキソメチレン−
セファム−４−カルボン酸、ＥＭＣＣ］のＤＡＣへのヒ
ドロキシル化をもたらすのに有効であった０本発明によ
って提供されたヒドロキシラーゼは、予想外にもペニシ
リンＮをＤＡＯＣへ環拡大する弱い触媒活性を示し、生
成したＤＡＯＣをＤＡＣへ変換した。この環拡大活性は
、同じくストレプトマイセス・クラブリゲルスによって
産生されるエキスパンダーゼ酵素に起因するものではな
く、ＤＡＯＣヒドロキシラーゼに固有の特性であるよう
である。
セトキシセファロスポリンＣをデアセチルセファロスポ
リンＣ（ＤＡＣ）へ変換する活性に加えて、この酵素は
また３−エキソメチレンセファロスポリンＣ［７β−（
α−アミノアジポイルアミノ）−３−エキソメチレン−
セファム−４−カルボン酸、ＥＭＣＣ］のＤＡＣへのヒ
ドロキシル化をもたらすのに有効であった０本発明によ
って提供されたヒドロキシラーゼは、予想外にもペニシ
リンＮをＤＡＯＣへ環拡大する弱い触媒活性を示し、生
成したＤＡＯＣをＤＡＣへ変換した。この環拡大活性は
、同じくストレプトマイセス・クラブリゲルスによって
産生されるエキスパンダーゼ酵素に起因するものではな
く、ＤＡＯＣヒドロキシラーゼに固有の特性であるよう
である。
ＤＡＯＣヒドロキシラーゼの３種の活性の相対Ｖｍａｘ
値を第３表に示す。
値を第３表に示す。
第３表ＤＡＯＣヒドロキシラーゼのパーセント触媒活性
反応 Ｖ ｍａｘペニシリ
ンＮからＤＡＯＣ１，４ ＤＡｏＣからＤＡＣ１００ １００ＥからＤＡＣ３７ 純化した酵素の基質として、数種の化合物の基質特異性
を測定して評価した。評価した化合物およびその成績を
第４表に示す、これらの成績は、ＨＰＬＣ分析によって
得たものである。
ンＮからＤＡＯＣ１，４ ＤＡｏＣからＤＡＣ１００ １００ＥからＤＡＣ３７ 純化した酵素の基質として、数種の化合物の基質特異性
を測定して評価した。評価した化合物およびその成績を
第４表に示す、これらの成績は、ＨＰＬＣ分析によって
得たものである。
第４表ＤＡＯＣヒドロキシラーゼの基質特異性比活性
相対活性 化合物 （ｍｕ／ｍｇ＞ （％）Ｄ
ＡＯＣ１５９，２１００ １００Ｅ鵞’５８，１３６．５ カルバ−ＤＡＯＣ’＋ ３．０ １．９
イソ−ＤＡＯＣ” １．３ ０．
８０７β−（Ｄ−α−アミノアジパミド）−３−エキソ
メチレン−セファム−４−カルボン酸 ２１１−カルバ（１−デチア）デアセトキシセファロス
ポリンＣ 】＋７β−（Ｌ−α−アミノアジパミド）−３−メチル
−３セフェム−４−カルボン酸（インデアセトキシセフ
ァロスポリンＣ） 表に示されたように、この酵素はＥＭＣＣのＤＡＣへの
変換にかなり有効であり、ＤＡＯＣからＤＡＣへの変換
と比較して３６．５％であった。
相対活性 化合物 （ｍｕ／ｍｇ＞ （％）Ｄ
ＡＯＣ１５９，２１００ １００Ｅ鵞’５８，１３６．５ カルバ−ＤＡＯＣ’＋ ３．０ １．９
イソ−ＤＡＯＣ” １．３ ０．
８０７β−（Ｄ−α−アミノアジパミド）−３−エキソ
メチレン−セファム−４−カルボン酸 ２１１−カルバ（１−デチア）デアセトキシセファロス
ポリンＣ 】＋７β−（Ｌ−α−アミノアジパミド）−３−メチル
−３セフェム−４−カルボン酸（インデアセトキシセフ
ァロスポリンＣ） 表に示されたように、この酵素はＥＭＣＣのＤＡＣへの
変換にかなり有効であり、ＤＡＯＣからＤＡＣへの変換
と比較して３６．５％であった。
１−カルバ−ＤＡＯＣおよびイソ−ＤＡＯＣは、上述の
ヒドロキシラーゼの至適触媒作用の条件下でヒ）ぐロキ
シラーゼの有効な基質として作用しなかった。
ヒドロキシラーゼの至適触媒作用の条件下でヒ）ぐロキ
シラーゼの有効な基質として作用しなかった。
この酵素の重要な反応速度論的なパラメーターを、上記
の至適反応条件下で測定した。ＤＡＯＣまたはα−ケト
グルタレートに対するヒドロキシラーゼのＫｍはいずれ
の基質とも飽和濃度（３００μＭ ＤＡＯＣまたはα−
ＫＧ）で得られた。ラインライ−バー−パーク法によっ
て測定した対応するＫｍ４．ｔ、それぞれ５Ｃ１ｃｚＭ
（ＤＡＯＣ） およびｌＯμＭ（α−ＫＧ）であった。
の至適反応条件下で測定した。ＤＡＯＣまたはα−ケト
グルタレートに対するヒドロキシラーゼのＫｍはいずれ
の基質とも飽和濃度（３００μＭ ＤＡＯＣまたはα−
ＫＧ）で得られた。ラインライ−バー−パーク法によっ
て測定した対応するＫｍ４．ｔ、それぞれ５Ｃ１ｃｚＭ
（ＤＡＯＣ） およびｌＯμＭ（α−ＫＧ）であった。
同様にヒドロキシラーゼの第一鉄イオシに対するＫａを
測定し、その値は２０μＭであった。
測定し、その値は２０μＭであった。
ヒドロキシラーゼの■、ｏは、タンパク質１ｍｇ当たり
１分間にＤＡＣｏ、４５μＭを生成する速度として測定
した。
１分間にＤＡＣｏ、４５μＭを生成する速度として測定
した。
ＤＡＯＣのＤＡＣへのヒドロキシラーゼ変換の化学量論
を検討した。３時間反応の間のＤＡＣ生成／ＤＡＯＣ消
失のモル比は、第２図にプロットで示したように０．９
１〜１．００の範囲に留まった。ＤＡＯＣのＤＡＣへの
変換は、反応条件下で部分的にのみ完全（５８％）であ
った。
を検討した。３時間反応の間のＤＡＣ生成／ＤＡＯＣ消
失のモル比は、第２図にプロットで示したように０．９
１〜１．００の範囲に留まった。ＤＡＯＣのＤＡＣへの
変換は、反応条件下で部分的にのみ完全（５８％）であ
った。
本発明は、この酵素の粗製無細胞抽出物からＤＡ゛ＯＣ
ヒドロキシラーゼを単離する方法をも提供する。
ヒドロキシラーゼを単離する方法をも提供する。
ＤＡＯＣヒドロキシラーゼは、ストレプトマイセス ク
ラブリゲルス（Ｓ クラブリゲルス）のセファロスポリ
ンＣおよびセファマイシンＣ産生様の抽出物から得るこ
とができる。この酵素はｔな、ストレプトマイセス・リ
プマニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏ〜ｍｙｃｅｓ ｌｉｐｍａｎ
ｉｉ）およびストレプトマイセス・ラクタムヅランスの
細胞からも得ることができる。
ラブリゲルス（Ｓ クラブリゲルス）のセファロスポリ
ンＣおよびセファマイシンＣ産生様の抽出物から得るこ
とができる。この酵素はｔな、ストレプトマイセス・リ
プマニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏ〜ｍｙｃｅｓ ｌｉｐｍａｎ
ｉｉ）およびストレプトマイセス・ラクタムヅランスの
細胞からも得ることができる。
米国特許第４７５３８８１号に記載されでいる２元機能
を備えた酵素、エキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼを
産生ずるセファロスポリウム・アクレモニウムとは対照
的に、Ｓ、クラブリゲルスはエキスパンダーゼ酵素およ
びヒドロキシラーゼを別々の酵素として産生ずる。多数
のＳ、クラブリゲルス株が、本発明方法で使用するのに
入手可能である。そのような株の１つは、アメリカン・
タイプ、カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ
ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ ＣｏＩＩｅｃｔｉｏｎ）に
寄託されたＡＴＣＣ２７０６４である。好ましい株は、
ノーザン・レジオナル・リサーチ・ラボラトリーズ・オ
ブ・ザ デパートメント・オブ・アグリカルチャー（Ｎ
ｏｒｔｈ−ｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ｏｆ ｔｈ
ｅＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒ
ｅ） （ペオリア（Ｐｅｏｒｉａ）、ＩＬ）のカルチャ
ー・コレクションへ寄託されたＮＲＲＬ１８４９１であ
る。
を備えた酵素、エキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼを
産生ずるセファロスポリウム・アクレモニウムとは対照
的に、Ｓ、クラブリゲルスはエキスパンダーゼ酵素およ
びヒドロキシラーゼを別々の酵素として産生ずる。多数
のＳ、クラブリゲルス株が、本発明方法で使用するのに
入手可能である。そのような株の１つは、アメリカン・
タイプ、カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ
ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ ＣｏＩＩｅｃｔｉｏｎ）に
寄託されたＡＴＣＣ２７０６４である。好ましい株は、
ノーザン・レジオナル・リサーチ・ラボラトリーズ・オ
ブ・ザ デパートメント・オブ・アグリカルチャー（Ｎ
ｏｒｔｈ−ｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ｏｆ ｔｈ
ｅＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒ
ｅ） （ペオリア（Ｐｅｏｒｉａ）、ＩＬ）のカルチャ
ー・コレクションへ寄託されたＮＲＲＬ１８４９１であ
る。
ＤＡＯＣヒドロキシラーゼは不安定であると認められて
おり、したがって無細胞抽出物から高純度の状態で単離
し、入手することは困難であった。
おり、したがって無細胞抽出物から高純度の状態で単離
し、入手することは困難であった。
例えばＤＡＯＣヒドロキシラーゼを、微生物の粗製抽出
物から１５ｍＭ）リス−ＨＣｌ ｉｌｌ街液（ｐＨ７，
５）で４℃Ｔ：調製すると、僅か１２時間の半減期を示
すだけであった。抽出物調製の際、フェニルメチルスル
ホニルフルオリド（Ｐ Ｍ Ｓ Ｆ ）およびエチルア
ルコールの添加は、ＤＡＯＣシンテターゼを失活から部
分的に保護することが知られているが、このヒドロキシ
ラーゼの安定性に、なんら効果がなかった。
物から１５ｍＭ）リス−ＨＣｌ ｉｌｌ街液（ｐＨ７，
５）で４℃Ｔ：調製すると、僅か１２時間の半減期を示
すだけであった。抽出物調製の際、フェニルメチルスル
ホニルフルオリド（Ｐ Ｍ Ｓ Ｆ ）およびエチルア
ルコールの添加は、ＤＡＯＣシンテターゼを失活から部
分的に保護することが知られているが、このヒドロキシ
ラーゼの安定性に、なんら効果がなかった。
本発明の方法では、酵素の粗製無細胞抽出物の調製およ
びその単離・純化の間、どちらの場合も使用するヒドロ
キシラーゼ安定化緩衝液の利用を含む、この安定化ｗＬ
衝樹液以下、緩衝液Ａと言う）は、１ｍＭ尿酸、１ｍＭ
マンニットおよび０．１Ｍ ＫＣｌを含有している１
５ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐ＋−１７，３）からなる、
粗製無細胞抽出物を安定化緩衝液で調製すると、ヒドロ
キシラーゼの半減期は、トリス−ＨＣｌ ｌ樹液で観察
されたよりも６倍、即ち７２時間に改善された。この改
良された緩衝液系により、酵素を高純度の状態で単離す
るのに必要な多段階クロマトグラフィ二を実施する能力
は著しく増強した。
びその単離・純化の間、どちらの場合も使用するヒドロ
キシラーゼ安定化緩衝液の利用を含む、この安定化ｗＬ
衝樹液以下、緩衝液Ａと言う）は、１ｍＭ尿酸、１ｍＭ
マンニットおよび０．１Ｍ ＫＣｌを含有している１
５ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐ＋−１７，３）からなる、
粗製無細胞抽出物を安定化緩衝液で調製すると、ヒドロ
キシラーゼの半減期は、トリス−ＨＣｌ ｌ樹液で観察
されたよりも６倍、即ち７２時間に改善された。この改
良された緩衝液系により、酵素を高純度の状態で単離す
るのに必要な多段階クロマトグラフィ二を実施する能力
は著しく増強した。
本発明の方法は、安定化！！衝樹液使用に加え、さらに
無細胞抽出物の調製に音波処理による制御された細胞破
壊、および組合わせたクロマトグラフィー段階を含む、
この処理によって、以下に説明する第一のモノＱ（Ｍｏ
ｎｏ Ｑ） Ｆ Ｐ ＬＣから外挿して、タンパク質１
ｍｇ当たり約０．４５Ｕの比活性を有するほぼ電気泳動
的な均質性まで純化されたヒドロキシラーゼを提供する
。
無細胞抽出物の調製に音波処理による制御された細胞破
壊、および組合わせたクロマトグラフィー段階を含む、
この処理によって、以下に説明する第一のモノＱ（Ｍｏ
ｎｏ Ｑ） Ｆ Ｐ ＬＣから外挿して、タンパク質１
ｍｇ当たり約０．４５Ｕの比活性を有するほぼ電気泳動
的な均質性まで純化されたヒドロキシラーゼを提供する
。
無細胞抽出物の調製および数段階のクロマトグラフィー
処理は、約り℃〜約４℃の温度で実施した。緩衝液Ａは
使用前に脱ガスする。
処理は、約り℃〜約４℃の温度で実施した。緩衝液Ａは
使用前に脱ガスする。
本発明の方法では、Ｓ、クラブリゲルスの新鮮な細胞を
、１ｍＭ尿酸、１ｍＭマンニットおよび０．１Ｍ ＫＣ
ｌの存在で１５ｒｎＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７，３）に浮遊
させる。この緩衝液系を「Ｍ析液Ａ」と言う、細胞浮遊
液の制御された音波処理により、約０℃〜４℃の温度で
細胞を破壊する０本明細書で用いる「、制御された音波
処理」とは、０℃〜約４℃の温度に維持した緩衝液Ａ中
でＳ、クラブリゲルス細胞の浮遊液を断続的に音波処理
することを言う、その間、約１５〜２５秒ずつの長さで
約２〜６回に変更し得る間隔で、音波処理器を稼働する
。各音波処理ののち、音波処理器を止め、次の音波処理
までの問、浮遊液を４℃またはそれ以下の温度を保つた
めに約２秒〜約２分間静止させる。好ましくは約２０秒
間ずつ約３〜５回、抽出物の調製に音波処理を行なう。
、１ｍＭ尿酸、１ｍＭマンニットおよび０．１Ｍ ＫＣ
ｌの存在で１５ｒｎＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７，３）に浮遊
させる。この緩衝液系を「Ｍ析液Ａ」と言う、細胞浮遊
液の制御された音波処理により、約０℃〜４℃の温度で
細胞を破壊する０本明細書で用いる「、制御された音波
処理」とは、０℃〜約４℃の温度に維持した緩衝液Ａ中
でＳ、クラブリゲルス細胞の浮遊液を断続的に音波処理
することを言う、その間、約１５〜２５秒ずつの長さで
約２〜６回に変更し得る間隔で、音波処理器を稼働する
。各音波処理ののち、音波処理器を止め、次の音波処理
までの問、浮遊液を４℃またはそれ以下の温度を保つた
めに約２秒〜約２分間静止させる。好ましくは約２０秒
間ずつ約３〜５回、抽出物の調製に音波処理を行なう。
上記の制御された音波処理によってＳ、クラブリゲルス
のヒドロキンラーゼ含有細胞から一層高い酵素活性を有
する無細胞抽出物が生じる。絶え間ない音波処理または
あまり長時間の音波処理は、ヒドロキシラーゼの失活を
もたらす、完全に音波処理すると細胞から一層多くのタ
ンパク質が遊離するが、−層比活性の低い抽出物を生じ
る。音波処理は、好ましくは処理の間に約３０秒〜１分
間の短い静止時間を挿入してそれぞれ２０秒間ずつ、４
回実施する。音波処理物を４７０００Ｘｇで３０分間遠
心することによって、ヒドロキシラーゼの粗製無細胞抽
出物が得られる。
のヒドロキンラーゼ含有細胞から一層高い酵素活性を有
する無細胞抽出物が生じる。絶え間ない音波処理または
あまり長時間の音波処理は、ヒドロキシラーゼの失活を
もたらす、完全に音波処理すると細胞から一層多くのタ
ンパク質が遊離するが、−層比活性の低い抽出物を生じ
る。音波処理は、好ましくは処理の間に約３０秒〜１分
間の短い静止時間を挿入してそれぞれ２０秒間ずつ、４
回実施する。音波処理物を４７０００Ｘｇで３０分間遠
心することによって、ヒドロキシラーゼの粗製無細胞抽
出物が得られる。
上記のようにして調製した粗製無細胞抽出物を、ジエチ
ルアミンエチルセルロースのような誘導体化したセルロ
ース型の弱陰イオン交換樹脂、好ましくはＤＥＡＥ−セ
ファロース（ファーマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉ
ｎｃ、）、ビス力タウエイ（Ｐ ｉｓｃａｔａｗａｙ
）、ＮＪ）によりクロマトグラフィーを行なう、樹脂を
使用する前に緩衝液Ａで平衡化し、溶出前に好ましくは
約１カラム容積に対応する量のＭ析液Ａで洗浄する。結
合しているタンパク質を緩衝液Ａ中、ＫＣｌの直線濃度
勾配（０，１Ｍ−０，５Ｍ）により溶出する。ＤＡＯＣ
ヒドロキシラーゼは、ＤＡＯＣシンターゼから分離した
主として単一の活性ピークとして溶出される。典型的な
溶出パターンのグラフを第３Ａ図に示す。
ルアミンエチルセルロースのような誘導体化したセルロ
ース型の弱陰イオン交換樹脂、好ましくはＤＥＡＥ−セ
ファロース（ファーマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉ
ｎｃ、）、ビス力タウエイ（Ｐ ｉｓｃａｔａｗａｙ
）、ＮＪ）によりクロマトグラフィーを行なう、樹脂を
使用する前に緩衝液Ａで平衡化し、溶出前に好ましくは
約１カラム容積に対応する量のＭ析液Ａで洗浄する。結
合しているタンパク質を緩衝液Ａ中、ＫＣｌの直線濃度
勾配（０，１Ｍ−０，５Ｍ）により溶出する。ＤＡＯＣ
ヒドロキシラーゼは、ＤＡＯＣシンターゼから分離した
主として単一の活性ピークとして溶出される。典型的な
溶出パターンのグラフを第３Ａ図に示す。
ヒドロキシラーゼ活性合計の約４０％を含有する画分を
プールして、さらに小容量に濃縮し、濃縮物を硫酸アン
モニウムで分別する。４５−７０％のＮＨ，ＳＯ，濃度
で得られた画分をバイオゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ ） Ａ
０ 、５ ｍまたはバイオゲルＰ−６０（バイオラド
・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ）、リッチモンド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ ）、Ｃ
Ａ）または好ましくはウルトラゲル（Ｕｌｔｒａｇｅｌ
）Ａ ｃ Ａ ５４（ＩＢＦ・バイオテクニクス（ＩＢ
Ｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃｓ）、ピルヌーブラ ガレン
（Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ−１ａ−Ｇａｒｅｎｎｅ）。
プールして、さらに小容量に濃縮し、濃縮物を硫酸アン
モニウムで分別する。４５−７０％のＮＨ，ＳＯ，濃度
で得られた画分をバイオゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ ） Ａ
０ 、５ ｍまたはバイオゲルＰ−６０（バイオラド
・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ）、リッチモンド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ ）、Ｃ
Ａ）または好ましくはウルトラゲル（Ｕｌｔｒａｇｅｌ
）Ａ ｃ Ａ ５４（ＩＢＦ・バイオテクニクス（ＩＢ
Ｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃｓ）、ピルヌーブラ ガレン
（Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ−１ａ−Ｇａｒｅｎｎｅ）。
フランス）のような好適なゲルを使用してクロマトグラ
フィーを行なう、ゲルを使用する前にＨ！衝樹液で平衡
化し、タンパク質を緩衝液Ａで溶出する。ヒドロキシラ
ーゼ活性は単一の活性ピークとして溶出される。ヒドロ
キシラーゼ活性合計の約６０％を含有している画分をプ
ールし、予め緩衝ＭＡで平衡化したヒドロキシルアパタ
イトでクロマトグラフィーを行なう、まずヒドロキシル
アパタイトを約２カラム容積に対応する量の緩衝液Ａで
洗浄する。結合しているタンパク質を緩衝液Ａ中、リン
酸カリウムの直線濃度勾配（０−１００ｍＭ）により溶
出する。ヒドロキシラーゼ活性は、第３Ｂ図に示した典
型的な溶出パターンのグラフで示されるように単一の活
性ピークとして溶出される。
フィーを行なう、ゲルを使用する前にＨ！衝樹液で平衡
化し、タンパク質を緩衝液Ａで溶出する。ヒドロキシラ
ーゼ活性は単一の活性ピークとして溶出される。ヒドロ
キシラーゼ活性合計の約６０％を含有している画分をプ
ールし、予め緩衝ＭＡで平衡化したヒドロキシルアパタ
イトでクロマトグラフィーを行なう、まずヒドロキシル
アパタイトを約２カラム容積に対応する量の緩衝液Ａで
洗浄する。結合しているタンパク質を緩衝液Ａ中、リン
酸カリウムの直線濃度勾配（０−１００ｍＭ）により溶
出する。ヒドロキシラーゼ活性は、第３Ｂ図に示した典
型的な溶出パターンのグラフで示されるように単一の活
性ピークとして溶出される。
ヒドロキシラーゼ活性合計の約７０％を含有している溶
出画分をプールし、モノＱ（ファーマシア社、ビス力タ
ウエイ、ＮＪ）のような強陰イオン交換樹脂を使用する
高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）に
掛ける。使用前に樹脂を緩衝液Ａで平衡化し、結合して
いるタンパク質を緩衝液Ａ中、ＫＣｌの直線塩濃度勾配
（０，１Ｍ−０，５Ｍ）により溶出する。第３Ｃ図の典
型的な溶出パターンのグラフに示したように、ヒドロキ
シラーゼは単一の活性ピークとして溶出される。
出画分をプールし、モノＱ（ファーマシア社、ビス力タ
ウエイ、ＮＪ）のような強陰イオン交換樹脂を使用する
高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）に
掛ける。使用前に樹脂を緩衝液Ａで平衡化し、結合して
いるタンパク質を緩衝液Ａ中、ＫＣｌの直線塩濃度勾配
（０，１Ｍ−０，５Ｍ）により溶出する。第３Ｃ図の典
型的な溶出パターンのグラフに示したように、ヒドロキ
シラーゼは単一の活性ピークとして溶出される。
最高のヒドロキシラーゼ活性を含有する画分をプールし
て濃縮し、濃縮物を、バイオゲルＰ６０（バイオラド・
ラボラトリーズ、リッチモンド、ＣＡ）またはスーパー
ロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ） Ａ１２（ファーマシア社
、ビス力タウエイ、ＮＪ）のような好適なゲルでクロマ
トグラフィーを行なう、ゲルを使用する前に緩衝液Ａで
平衡化し、ヒドロキシラーゼは緩衝液Ａにより単一の活
性ピークとして溶出される。
て濃縮し、濃縮物を、バイオゲルＰ６０（バイオラド・
ラボラトリーズ、リッチモンド、ＣＡ）またはスーパー
ロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ） Ａ１２（ファーマシア社
、ビス力タウエイ、ＮＪ）のような好適なゲルでクロマ
トグラフィーを行なう、ゲルを使用する前に緩衝液Ａで
平衡化し、ヒドロキシラーゼは緩衝液Ａにより単一の活
性ピークとして溶出される。
最高の酵素活性を含有している画分をプールして、予め
緩衝液Ａで平衡化したモノＱのような強陰イオン樹脂で
、もう−度クロマトグラフィーを行なう、ヒドロキシラ
ーゼ活性を含有する画分をプールする。典型的な精製工
程の第２のモノＱクロマトグラフィーの結果を第３Ｄ図
に示す。
緩衝液Ａで平衡化したモノＱのような強陰イオン樹脂で
、もう−度クロマトグラフィーを行なう、ヒドロキシラ
ーゼ活性を含有する画分をプールする。典型的な精製工
程の第２のモノＱクロマトグラフィーの結果を第３Ｄ図
に示す。
工程の第２のＦＰＬＣで得られたＤＡＯＣヒドロキシラ
ーゼの純度を、溶出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって
示す、第４Ａ図に示したようにＦＰＬＣ？８１ｆｌ！液
は、主タンパク質バンドおよび微量タンパク質バンドと
して移動する。ゲルのレーザデンシトメーター走査の結
果から、主タンパク質は約９２％純粋であった。残り８
％の微量タンパク質のアミノ末端配列分析から、微量タ
ンパク質は主ヒドロキシラーゼタンパク質の分解産物で
あることが判明した。ネイティブ（ＮＡＴＩＶＥ）−Ｐ
ＡＧＥによるタンパク質分析では、幅広い単一のバンド
だけが認められた（第４Ｂ図）。
ーゼの純度を、溶出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって
示す、第４Ａ図に示したようにＦＰＬＣ？８１ｆｌ！液
は、主タンパク質バンドおよび微量タンパク質バンドと
して移動する。ゲルのレーザデンシトメーター走査の結
果から、主タンパク質は約９２％純粋であった。残り８
％の微量タンパク質のアミノ末端配列分析から、微量タ
ンパク質は主ヒドロキシラーゼタンパク質の分解産物で
あることが判明した。ネイティブ（ＮＡＴＩＶＥ）−Ｐ
ＡＧＥによるタンパク質分析では、幅広い単一のバンド
だけが認められた（第４Ｂ図）。
最高純度のヒドロキシラーゼは上記の第７段階（即ち２
回目のＦＰＬＣ）で得られる９段階６のゲルクロマトグ
ラフィーおよび段階７の２回目のＦＰＬＣによってタン
パク質の若干の見掛けの失活があるので、１回目のＦＰ
ＬＣ（段階５）で得らノまた酵素活性からの損失がある
０段階５の１回目のＦＰＬＣで得られたヒドロキシラー
ゼは約７０％純粋であるが、２回目のＦＰＬＣで得られ
たヒドロキシラーゼは９０％以上純粋である０段階５で
得られた活性は一般に約１２００ｍｔＪであるが、段階
７（２回目のＦＰＬＣ）のあとの活性は通常約９０ｍＵ
である。これを比活性で示すと、段階５のあとの比活性
は通常約３００ｍＵ／ｍｇであるが、段階７のあとは約
１２５〜１３０ｍＵ／ｍｇである。
回目のＦＰＬＣ）で得られる９段階６のゲルクロマトグ
ラフィーおよび段階７の２回目のＦＰＬＣによってタン
パク質の若干の見掛けの失活があるので、１回目のＦＰ
ＬＣ（段階５）で得らノまた酵素活性からの損失がある
０段階５の１回目のＦＰＬＣで得られたヒドロキシラー
ゼは約７０％純粋であるが、２回目のＦＰＬＣで得られ
たヒドロキシラーゼは９０％以上純粋である０段階５で
得られた活性は一般に約１２００ｍｔＪであるが、段階
７（２回目のＦＰＬＣ）のあとの活性は通常約９０ｍＵ
である。これを比活性で示すと、段階５のあとの比活性
は通常約３００ｍＵ／ｍｇであるが、段階７のあとは約
１２５〜１３０ｍＵ／ｍｇである。
その高い活性と実質上の純度のため、段階５の完了によ
って得られたヒドロキシラーゼは最高純度を必要としな
い用途に好適であり得る０例えばこのヒドロキシラーゼ
は、本発明で提供したＤＡＯＣのＤＡＣへの無細胞変換
、あるいはＥＭＣＣのＤＡＣへの変換に使用できる。
って得られたヒドロキシラーゼは最高純度を必要としな
い用途に好適であり得る０例えばこのヒドロキシラーゼ
は、本発明で提供したＤＡＯＣのＤＡＣへの無細胞変換
、あるいはＥＭＣＣのＤＡＣへの変換に使用できる。
したがって本発明で提供するヒドロキシラーゼは実質的
に純粋な形であり、本明細書で用いる場合、約７０％か
ら９０％以上の純度を言う。
に純粋な形であり、本明細書で用いる場合、約７０％か
ら９０％以上の純度を言う。
ＤＡＯＣヒドロキシラーゼの活性を、下記の検定方法に
より全工程を通じて測定する。ヒドロキシラーゼ活性を
、ドララフおよびイエ−が報告した（１９８７年、ジャ
ーナル・オブ・バクテリオロジー、１６９巻、１６１１
〜１６１８頁）、ＤＡＯＣからのＤＡＣの生成をＨＰＬ
Ｃで２６０ｎｍでモニターする方法によって測定した。
より全工程を通じて測定する。ヒドロキシラーゼ活性を
、ドララフおよびイエ−が報告した（１９８７年、ジャ
ーナル・オブ・バクテリオロジー、１６９巻、１６１１
〜１６１８頁）、ＤＡＯＣからのＤＡＣの生成をＨＰＬ
Ｃで２６０ｎｍでモニターする方法によって測定した。
典型的な検定混合物は１ｍｌ容量であって、１５ｍＭＭ
０ Ｐ Ｓｌｌ液液ｐＨ７，３）４：、ＤＡＯＣｏ、３
μＭ、α−ケトグルタレート０３μＭ、［酸第−鉄０１
μＭ、アスコルベート０２５μＭ、ＤＴＴ １μＭ、Ａ
ＴＰ Ｏ，０５μＭ、および該酵素０．００００５〜
０．００３単位を含有する。ＤＡＯＣの添加によって酵
素反応を開始し、２９℃で２０分間反応を行なう、ＤＡ
Ｃの生成は４０分間まで反応時間と直線的である。酵素
活性の１単位は、上記の測定条件下でＤＡＯＣから１分
間比たり１マイクロモルのＤＡＣ生成を生じるのに要す
るヒドロキシラーゼの量と定義する。
０ Ｐ Ｓｌｌ液液ｐＨ７，３）４：、ＤＡＯＣｏ、３
μＭ、α−ケトグルタレート０３μＭ、［酸第−鉄０１
μＭ、アスコルベート０２５μＭ、ＤＴＴ １μＭ、Ａ
ＴＰ Ｏ，０５μＭ、および該酵素０．００００５〜
０．００３単位を含有する。ＤＡＯＣの添加によって酵
素反応を開始し、２９℃で２０分間反応を行なう、ＤＡ
Ｃの生成は４０分間まで反応時間と直線的である。酵素
活性の１単位は、上記の測定条件下でＤＡＯＣから１分
間比たり１マイクロモルのＤＡＣ生成を生じるのに要す
るヒドロキシラーゼの量と定義する。
ヒドロキシラーゼの比活性はタンパク質１ｍｇ当たりの
単位と定義する。
単位と定義する。
第４Ａ図に示したＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定に
使用した標準タンパク質および第１Ｂ図に示したそのプ
ロットは、ホスホリラーゼＢ（分子量９２０００）、ウ
シ血清アルブミン（分子量６６２００）、オハルフミン
（分子１４５０００）、カルホニックアンヒドラーゼ（
分子１１３１０００）、大豆トリプシン阻害因子、およ
びリボヌクレアーセ（分子量１３７００）であった。
使用した標準タンパク質および第１Ｂ図に示したそのプ
ロットは、ホスホリラーゼＢ（分子量９２０００）、ウ
シ血清アルブミン（分子量６６２００）、オハルフミン
（分子１４５０００）、カルホニックアンヒドラーゼ（
分子１１３１０００）、大豆トリプシン阻害因子、およ
びリボヌクレアーセ（分子量１３７００）であった。
タンパク質含量は、ウシ血清アルブミンを標準として使
用するブラッドホードの方法［ブラッドホード（Ｂｒａ
ｄｆｏｒｄ、 Ｍ、Ｍ、）、１９７９年、アナリティカ
ル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ
、）、７２巻、２４８〜２５４頁〕により測定する。
用するブラッドホードの方法［ブラッドホード（Ｂｒａ
ｄｆｏｒｄ、 Ｍ、Ｍ、）、１９７９年、アナリティカ
ル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ
、）、７２巻、２４８〜２５４頁〕により測定する。
本発明はまた、ｐＨ約７，０〜約７．５の水性媒質中で
酸素、第一鉄およびα−ケトグルタレートの存在で、７
β−（Ｄ−α−アミノアジパミド）−３エキソメチレン
セファム−４−カルボン酸をデアセトキシセファロスポ
リンＣヒドロキシラーゼと接触させることからなるデア
セチルセファ凸スポリンＣの生産方法を提供する。
酸素、第一鉄およびα−ケトグルタレートの存在で、７
β−（Ｄ−α−アミノアジパミド）−３エキソメチレン
セファム−４−カルボン酸をデアセトキシセファロスポ
リンＣヒドロキシラーゼと接触させることからなるデア
セチルセファ凸スポリンＣの生産方法を提供する。
この方法は、約２５℃〜約３５℃、好ましくは約り７℃
〜約３０℃の温度で実施する。好ましいｐＨは約ｐＨ７
，３である。この方法を実施するのに最も好ましい条件
は、ヒドロキシラーゼが前記のように至適活性を示す条
件である。
〜約３０℃の温度で実施する。好ましいｐＨは約ｐＨ７
，３である。この方法を実施するのに最も好ましい条件
は、ヒドロキシラーゼが前記のように至適活性を示す条
件である。
この方法は、好ましくは一般に収率の増加をもたらす還
元剤の存在で実施する。
元剤の存在で実施する。
ここに示した「還元剤」の話は、酵素技術で、酵素また
はその補因子を還元状態に維持するために一般に使用さ
れる試薬を表わし、例えばアスコルベ−１〜、ジチオト
レイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリ１へリトール等であ
る。また還元剤の組合わせもこの語の意味に包含される
０例えばＤＴＴとアスコルベートを組み合わせて使用で
き、アスコルベートと還元型グルタチオンも同様である
。
はその補因子を還元状態に維持するために一般に使用さ
れる試薬を表わし、例えばアスコルベ−１〜、ジチオト
レイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリ１へリトール等であ
る。また還元剤の組合わせもこの語の意味に包含される
０例えばＤＴＴとアスコルベートを組み合わせて使用で
き、アスコルベートと還元型グルタチオンも同様である
。
この方法に使用する第一鉄イオンの濃度はさまざまに変
え得るが、約０．０５ｍＭ〜約０．２ｍＭの濃度が好適
である。それより一層高い濃度も使用し得る。α−ケト
グルタレートは約０．０５ｍＭ〜約０．６ｍＭの濃度、
好ましくは約０．３ｍＭの濃度で使用する。
え得るが、約０．０５ｍＭ〜約０．２ｍＭの濃度が好適
である。それより一層高い濃度も使用し得る。α−ケト
グルタレートは約０．０５ｍＭ〜約０．６ｍＭの濃度、
好ましくは約０．３ｍＭの濃度で使用する。
この方法は、好ましくは十分な酸素供給が得られる開口
容器で実施する。ただし大規模の反応器の場合は、酵素
に十分な酸素供給を確保するため反応器へ酸素を通気す
ることができる。
容器で実施する。ただし大規模の反応器の場合は、酵素
に十分な酸素供給を確保するため反応器へ酸素を通気す
ることができる。
この方法は水性無細胞系で実施し得るが、別法としてカ
ラム反応器に固定化した酵素により実施することができ
る。固定化酵素法の場合は、原料物質、第一鉄イオン、
α−ＫＧおよび還元剤を含有する水性媒質をカラムへ注
入して反応を実施することができる。
ラム反応器に固定化した酵素により実施することができ
る。固定化酵素法の場合は、原料物質、第一鉄イオン、
α−ＫＧおよび還元剤を含有する水性媒質をカラムへ注
入して反応を実施することができる。
以下に実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明する。
実施例は単に発明を説明するためのものであって、発明
の範囲を限定するのではない。
の範囲を限定するのではない。
実施例１ デアセトキシセファロスポリンＣヒドロキシ
ラーゼの単離および純化 ストレプトマイセス・クラブリゲルスＮＲＲＬ１８４９
１を１５０リツトルの発酵槽で、ナガラジャン（Ｎａｇ
ａｒａｊａｎ、 Ｒ，）らが報告した条件［１９７１年
、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサ
イエティー（Ｊ、 Ａｍｅｒ、 Ｃｈｅｍ、 ５ｏｃ）
、９３巻、２３０８〜２３１０頁］を使用して発育させ
た。１６時間後、細胞を遠心により回収し、１ｍＭ尿酸
、１ｍＭマンニット、１．ＯＭ ＫＣｌ、を含有する１
５ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７，３）でこれを洗浄し、つ
いで０．ＩＭ ＫＣｌ ！街液で洗浄して、使用するま
で一７０℃で貯蔵した。
ラーゼの単離および純化 ストレプトマイセス・クラブリゲルスＮＲＲＬ１８４９
１を１５０リツトルの発酵槽で、ナガラジャン（Ｎａｇ
ａｒａｊａｎ、 Ｒ，）らが報告した条件［１９７１年
、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサ
イエティー（Ｊ、 Ａｍｅｒ、 Ｃｈｅｍ、 ５ｏｃ）
、９３巻、２３０８〜２３１０頁］を使用して発育させ
た。１６時間後、細胞を遠心により回収し、１ｍＭ尿酸
、１ｍＭマンニット、１．ＯＭ ＫＣｌ、を含有する１
５ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７，３）でこれを洗浄し、つ
いで０．ＩＭ ＫＣｌ ！街液で洗浄して、使用するま
で一７０℃で貯蔵した。
新鮮な細胞（正味重量１ ｋｇ）を２５０ｇずつ４部に
分け、各部を、１ｍＭ尿酸、１ｍＭマンニ・７１−１０
．１Ｍ ＫＣｌの存在で１５ｍＭＭ０ＰＳ］ｐＨ７，
３）（緩衝液Ａ）に全量２５０ｍ１となるように再浮遊
させた。４つの浮遊液を４℃で音波処理に掛けた。音波
処理は、音波処理の間に静止時間を置いて２０秒ずつ４
回断続的に行なった。音波処理物を４７０００Ｘｇで３
０分間遠心し、上清をヒドロキシラーゼの無細胞抽出物
として分離した。タンパク質２８３３ｍｇについて分析
した粗製抽出物合計は、２０４３３の活性（ｍＵ）およ
び７．２の比活性（ｍｕ／ｍｇ）を示した。
分け、各部を、１ｍＭ尿酸、１ｍＭマンニ・７１−１０
．１Ｍ ＫＣｌの存在で１５ｍＭＭ０ＰＳ］ｐＨ７，
３）（緩衝液Ａ）に全量２５０ｍ１となるように再浮遊
させた。４つの浮遊液を４℃で音波処理に掛けた。音波
処理は、音波処理の間に静止時間を置いて２０秒ずつ４
回断続的に行なった。音波処理物を４７０００Ｘｇで３
０分間遠心し、上清をヒドロキシラーゼの無細胞抽出物
として分離した。タンパク質２８３３ｍｇについて分析
した粗製抽出物合計は、２０４３３の活性（ｍＵ）およ
び７．２の比活性（ｍｕ／ｍｇ）を示した。
４つの粗製抽出物を得たのち、これらを予め緩ｆｆ１液
Ａで平衡化した２、６ｃｍＸ７５ｃｍのＤＥＡＥ−セフ
ァロース（ファーマシア社、ビス力タウエイ、ＮＪ）カ
ラムへ通導した。４つの抽出物をすべてカラムへ加えた
のち、１カラム容積の緩衝液Ａでカラムを洗浄し、結合
しているタンパク質を緩衝液Ａ中、ＫＣｌの直線濃度勾
配（０，１０，５Ｍ＞により溶出した。ＤＡＯＣヒドロ
キシラーゼは、第３Ａ図に示したように主として単−の
活性ピークとして溶出され、ＤＡＯＣシンターゼから十
分に分離された（第３Ａ図には示していない）０分離可
能な主シンターゼ活性の他に、微量シンターゼ活性がヒ
ドロキシラーゼと一緒に７容出されるようである。
Ａで平衡化した２、６ｃｍＸ７５ｃｍのＤＥＡＥ−セフ
ァロース（ファーマシア社、ビス力タウエイ、ＮＪ）カ
ラムへ通導した。４つの抽出物をすべてカラムへ加えた
のち、１カラム容積の緩衝液Ａでカラムを洗浄し、結合
しているタンパク質を緩衝液Ａ中、ＫＣｌの直線濃度勾
配（０，１０，５Ｍ＞により溶出した。ＤＡＯＣヒドロ
キシラーゼは、第３Ａ図に示したように主として単−の
活性ピークとして溶出され、ＤＡＯＣシンターゼから十
分に分離された（第３Ａ図には示していない）０分離可
能な主シンターゼ活性の他に、微量シンターゼ活性がヒ
ドロキシラーゼと一緒に７容出されるようである。
ヒドロキシラーゼ活性合計の約４０％を含有している５
画分（＃３９〜４３）をプールして濃縮し、硫酸アンモ
ニウムにより分別した。４５％−７０％飽和硫酸アンモ
ニウムの画分の一部（２，５ｍ１）を、予め緩衝液Ａで
平衡化したウルトラゲルＡｃＡ３４ （ＩＢＦバイオテ
クニクス、ピルヌーブーラーガレン、フランス）カラム
＜１．６Ｘ９５ ｃ ｍ ）へ負荷した。タンパク質を
緩衝液Ａで溶出した。ヒドロキシラーゼは単一の活性ピ
ークとして溶出された。ヒドロキシラーゼ活性合計の６
０％を含有している画分３９〜４３をプールし、予め緩
衝液Ａで平衡化したヒドロキシルアパタイトカラム（１
，０ｃｍＸ６０ｃｍ）へ通導した。
画分（＃３９〜４３）をプールして濃縮し、硫酸アンモ
ニウムにより分別した。４５％−７０％飽和硫酸アンモ
ニウムの画分の一部（２，５ｍ１）を、予め緩衝液Ａで
平衡化したウルトラゲルＡｃＡ３４ （ＩＢＦバイオテ
クニクス、ピルヌーブーラーガレン、フランス）カラム
＜１．６Ｘ９５ ｃ ｍ ）へ負荷した。タンパク質を
緩衝液Ａで溶出した。ヒドロキシラーゼは単一の活性ピ
ークとして溶出された。ヒドロキシラーゼ活性合計の６
０％を含有している画分３９〜４３をプールし、予め緩
衝液Ａで平衡化したヒドロキシルアパタイトカラム（１
，０ｃｍＸ６０ｃｍ）へ通導した。
カラムを２カラム容積の緩衝液Ａで洗浄し、結合してい
るタンパク質を緩衝液Ａ中、リン酸カワウムの直線濃度
勾配（０’−１００ｍＭ）で溶出した。
るタンパク質を緩衝液Ａ中、リン酸カワウムの直線濃度
勾配（０’−１００ｍＭ）で溶出した。
ヒドロキシラーゼは、第３Ｂ図に示したように羊−な活
性ピークとして溶出された。
性ピークとして溶出された。
ヒドロキシラーゼ活性合計の７０％を含有している３画
分（＃１８〜２０）をプールして、予め緩衝液Ａで平衡
化したモノＱ（ファーマシア社。
分（＃１８〜２０）をプールして、予め緩衝液Ａで平衡
化したモノＱ（ファーマシア社。
ビス力タウエイ、ＮＪ）カラム（０，５ｃｍｘ５ｃｍ）
へ通導した。結合しているタンパク質を緩衝ＭＡ中、Ｋ
Ｃｌの直線濃度勾配（０，１−０，５Ｍ）で溶出した。
へ通導した。結合しているタンパク質を緩衝ＭＡ中、Ｋ
Ｃｌの直線濃度勾配（０，１−０，５Ｍ）で溶出した。
ヒドロキシラーゼは、第３ｃ図に示したように単一の活
性ピークとして溶出された。
性ピークとして溶出された。
最高のヒドロキシラーゼ活性を有する画分２１〜２３を
プールし、セントリコン（Ｃｅロ七閂ＣＯロン３０（ア
ミコン（Ａｍｉｃｏｎ） ）で０．２ｍｌまで濃縮し、
濃縮物を、予め緩衝液Ａで平衡化したスーパーロースＡ
１２（ファーマシア社、ビス力タウェイ、ＮＪ）カラム
（１，６ｃｍＸ８５ｃｍ）へ通導した。ヒドロキシラー
ゼの単一の活性ピークが観察され、最高のヒドロキシラ
ーゼ活性を有する画分４７および４８をプールして、予
め緩衝液Ａで平衡化した第２のモノＱカラム（０，５ｃ
ｍｘ５ｃｍ）へ通導した。前回と同様にモノＱカラムを
溶出し、以後さらに使用のため、ヒドロキシラーゼ活性
を含有している画分１５〜２０を一７０℃で貯蔵した。
プールし、セントリコン（Ｃｅロ七閂ＣＯロン３０（ア
ミコン（Ａｍｉｃｏｎ） ）で０．２ｍｌまで濃縮し、
濃縮物を、予め緩衝液Ａで平衡化したスーパーロースＡ
１２（ファーマシア社、ビス力タウェイ、ＮＪ）カラム
（１，６ｃｍＸ８５ｃｍ）へ通導した。ヒドロキシラー
ゼの単一の活性ピークが観察され、最高のヒドロキシラ
ーゼ活性を有する画分４７および４８をプールして、予
め緩衝液Ａで平衡化した第２のモノＱカラム（０，５ｃ
ｍｘ５ｃｍ）へ通導した。前回と同様にモノＱカラムを
溶出し、以後さらに使用のため、ヒドロキシラーゼ活性
を含有している画分１５〜２０を一７０℃で貯蔵した。
上記のクロマトグラフィー段階によるヒドロキシラーゼ
の純化過程を第５表に示す。
の純化過程を第５表に示す。
第５表Ｓ、クラブリゲルスからのＤＡＯＣヒドロキシラ
ーゼの純化 タンパク質 活性 比活性 回収 段階（ｍｇ＞ 、 （ｍＬＩ） （ｍｕ／ｍｇ） （
％）粗製抽出物 ２８３３ ２０４３３
７．２ １００ＤＥＡＥ−セファロース 溶出液 ８５４ ８１８４ ９．６ ４０
４５−７０％ （ＮＨ４）２ＳＯ４画分 １７６ ２６０７
１４．８ １３ウルトラゲル ＡｃＡ３４溶出液 ４７．３ ６８７ ５６．８ ３ ヒドロキシル アパタイト溶出液 １６．７ ６４８ ９８．７ （第５表つづき） モノＱｆ溶出液 ３．９４ １２００ ３０４
．６ ６スーパーロース１２ 溶出液 １．９６ ４７１ ２４１．０
２モノＱｌｌ溶出液 ０．６９ ８８
１２７．５ ０．４表に示したように、最後の２段
階、即ちスーパーロースＡ１２ ＦＰＬＣおよびモノ
ＱＩＩＦＰＬＣ段階にわたって部分的な酵素失活がある
０部分的な失活にもかかわらず、高度に純粋なヒドロキ
シラーゼが得られた。モノＱＵ溶出液がら得た主タンパ
ク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づいて、得られたヒド
ロキシラーゼは約９２％純粋であった。
ーゼの純化 タンパク質 活性 比活性 回収 段階（ｍｇ＞ 、 （ｍＬＩ） （ｍｕ／ｍｇ） （
％）粗製抽出物 ２８３３ ２０４３３
７．２ １００ＤＥＡＥ−セファロース 溶出液 ８５４ ８１８４ ９．６ ４０
４５−７０％ （ＮＨ４）２ＳＯ４画分 １７６ ２６０７
１４．８ １３ウルトラゲル ＡｃＡ３４溶出液 ４７．３ ６８７ ５６．８ ３ ヒドロキシル アパタイト溶出液 １６．７ ６４８ ９８．７ （第５表つづき） モノＱｆ溶出液 ３．９４ １２００ ３０４
．６ ６スーパーロース１２ 溶出液 １．９６ ４７１ ２４１．０
２モノＱｌｌ溶出液 ０．６９ ８８
１２７．５ ０．４表に示したように、最後の２段
階、即ちスーパーロースＡ１２ ＦＰＬＣおよびモノ
ＱＩＩＦＰＬＣ段階にわたって部分的な酵素失活がある
０部分的な失活にもかかわらず、高度に純粋なヒドロキ
シラーゼが得られた。モノＱＵ溶出液がら得た主タンパ
ク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づいて、得られたヒド
ロキシラーゼは約９２％純粋であった。
第１Ａ図はゲルが適法によるＤＡＯＣヒドロキシラーゼ
の分子量測定、第１Ｂ図はＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によるＤ
ＡＯＣヒドロキシラーゼの分子量測定、第２図はＤＡＯ
ＣヒドロキシラーゼによるＤＡＯＣのＤＡＣへの変換の
化学量論的分析、第３Ａ図はＤＡＯＣヒドロキシラーゼ
のＤＥＡＥ〜セファロースによるクロマトグラフィーの
結果、第３Ｂ図はヒドロキシルアパタイトクロマトグラ
フィーによる結果、第３Ｃ図はモノＱによる第一のＦ
Ｐ Ｌ Ｃの結果、第３Ｄ図はモノＱによる第２のＦ
Ｐ Ｌ Ｃの結果、第４Ａ［Ｚは純化したＤＡＯＣヒド
ロキシラーゼ（モノＱｎ画分）のＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
る分子量測定、第４Ｂ図はネイティブＰＡＧＥによるモ
ノＱＨ画分のタンパク質分析である。 ＦＩＧ、１八 に良Ｖ ゲノノ礎ｊか ＦＩＧ、１Ｂ
の分子量測定、第１Ｂ図はＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によるＤ
ＡＯＣヒドロキシラーゼの分子量測定、第２図はＤＡＯ
ＣヒドロキシラーゼによるＤＡＯＣのＤＡＣへの変換の
化学量論的分析、第３Ａ図はＤＡＯＣヒドロキシラーゼ
のＤＥＡＥ〜セファロースによるクロマトグラフィーの
結果、第３Ｂ図はヒドロキシルアパタイトクロマトグラ
フィーによる結果、第３Ｃ図はモノＱによる第一のＦ
Ｐ Ｌ Ｃの結果、第３Ｄ図はモノＱによる第２のＦ
Ｐ Ｌ Ｃの結果、第４Ａ［Ｚは純化したＤＡＯＣヒド
ロキシラーゼ（モノＱｎ画分）のＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
る分子量測定、第４Ｂ図はネイティブＰＡＧＥによるモ
ノＱＨ画分のタンパク質分析である。 ＦＩＧ、１八 に良Ｖ ゲノノ礎ｊか ＦＩＧ、１Ｂ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ゲル濾過法による測定で約３５０００ダルトン、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ法による測定で約３８０００ダルトンの
分子量を有し、 単量体分子であり、 下記のアミノ酸組成： ３５０００ダルトン アミノ酸当たりの残基数 Ａｓｐ＋Ａｓｎ２５ Ｔｈｒ２６ Ｓｅｒ２７ Ｇｌｕ＋Ｇｌｎ３２ Ｐｒｏ１８ Ａｌａ３７ ｃｙｓ５ Ｖａｌ２１ Ｍｅｔ９ ｌｌｅ８ Ｌｅｕ２３ Ｔｙｒ１１ Ｐｈｅ１７ Ｈｉｓ８ Ｌｙｓ６ Ａｒｇ１９ Ｔｒｐ２ を有し、 ２８残基アミノ末端配列：Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐ
ｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｅ
ｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ
−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−
Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｖａ１−Ｈｉｓ−Ｌｅｕを有
し、 ９残基アミノ末端配列を有する内部配列： Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｔ
ｙｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒを有し、 ３残基カルボキシ末端配列：Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａを
有し、 触媒活性発現のために第一鉄イオン、α−ケトグルタレ
ートおよび酸素を必要とし、 ジチオトレイトールおよびアスコルベートの存在で触媒
活性を増強し、 下記の反応速度論的なパラメーター： Ｋｍ（ＤＡＯＣ）＝５０μＭ Ｋｍ（α−ケトグルタレート）＝１０μＭ Ｋａ（Ｆｅ＾＋＾＋）＝２０μＭ を示し、そして ７β−（α−アミノアジパミド）−３−エキソメチレン
−セファム−４−カルボン酸をデアセチルセファロスポ
リンＣへ変換する 実質的に純粋な形のデアセトキシセファロスポリンＣヒ
ドロキシラーゼ。 ２、（１）制御された音波処理によるヒドロキシラーゼ
含有細胞の破壊によって得られたヒドロキシラーゼの粗
製無細胞抽出物を、弱陰イオン交換樹脂によるクロマト
グラフィーに掛け、結合しているタンパク質をＫＣｌの
０．１Ｍ−０．５Ｍ直線濃度勾配により溶出し、 （２）請求項１記載の濃縮された溶出液を硫酸アンモニ
ウムで分別し、約４５％〜約７０％の硫酸アンモニウム
濃度で得られた画分を濃縮し、（３）段階２の濃縮物を
ゲルクロマトグラフィーに掛けてヒドロキシラーゼ活性
合計の約６０％を含有するヒドロキシラーゼ溶出画分を
プールし、（４）段階３のプールした画分をヒドロキシ
ルアパタイトによるクロマトグラフィーに掛け、結合し
ているタンパク質をリン酸カリウムの１−１０ＯＭ直線
濃度勾配により溶出し、ヒドロキシラーゼ活性合計の約
７０％を含有する溶出画分をプールし、 （５）段階４のプールした溶出液を高速タンパク質液体
クロマトグラフィーにより、強陰イオン樹脂を使用して
クロマトグラフィーを行ない、結合しているタンパク質
をＫＣｌの０．１Ｍ−０．５Ｍ直線濃度勾配によって溶
出し、請求項１記載のヒドロキシラーゼを約７０％の純
度で提供する段階からなり、 ここで段階１から段階５までを、約０℃〜約４℃の温度
で実施し、また段階１から段階５までの各段階を、それ
ぞれ１ｍＭ尿酸、１ｍＭマンニットおよび０．１ｍＭＫ
Ｃｌを含有する１５ｍＭ３−（Ｎ−モルホリノ）プロバ
ンスルホン酸緩衝液（ｐＨ７．０〜７．４）からなる緩
衝液Ａで実施することからなる請求項１記載のヒドロキ
シラーゼの生産方法。３、さらに（１）最高のヒドロキ
シラーゼ活性を含有している段階５の溶出画分を、緩衝
液Ａでゲルクロマトグラフィーに掛け、緩衝液Ａでヒド
ロキシラーゼを溶出し、最高のヒドロキシラーゼ活性を
含有している溶出画分をプールし、（２）プールした画
分を緩衝液Ａ中、強陰イオン交換樹脂により再びクロマ
トグラフィーに掛け、結合したタンパク質を緩衝液Ａ中
で、ＫＣｌの０．１Ｍ−０．５Ｍ直線濃度勾配により溶
出し、ヒドロキシラーゼ活性を含有している溶出画分を
プールして請求項１記載のヒドロキシラーゼを９０％以
上の純度で得る段階を含んでなる請求項２記載の方法。 ４、段階１で、ストレプトマイセス・クラブリゲルス細
胞から粗製無細胞抽出物を得る請求項２記載の方法。 ５、段階１で、弱陰イオン交換樹脂がＤＥＡＥ−セファ
ロースである請求項２記載の方法。 ６、段階５で、高速タンパク質液体クロマトグラフィー
を樹脂モノＱで実施する請求項２記載の方法。 ７、ｐＨ約７．０〜約７．５に維持した水性媒質中、酸
素、第一鉄イオンおよびα−ケトグルタレートの存在で
約２５℃〜約３５℃の温度で、７β−（α−ァミノアジ
パミド）−３−エキソメチレン−セファム−４−カルボ
ン酸をデアセトキシセファロスポリンＣヒドロキシラー
ゼと接触させることからなるデアセチルセフアロスポリ
ンＣの生産方法。 ８、式Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒ
ｏ−ＩＩｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ
−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ−
Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｈ
ｉｓ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕで示される化合物。 ９、式Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｔｙ
ｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒで示される化合物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US41276189A | 1989-09-26 | 1989-09-26 | |
| US412761 | 1989-09-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03206884A true JPH03206884A (ja) | 1991-09-10 |
Family
ID=23634379
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2260288A Pending JPH03206884A (ja) | 1989-09-26 | 1990-09-26 | デアセトキシセファロスポリンｃヒドロキシラーゼ |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5714363A (ja) |
| EP (1) | EP0420562B1 (ja) |
| JP (1) | JPH03206884A (ja) |
| AT (1) | ATE121453T1 (ja) |
| CA (1) | CA2026041C (ja) |
| DE (1) | DE69018749T2 (ja) |
| DK (1) | DK0420562T3 (ja) |
| ES (1) | ES2072400T3 (ja) |
| IL (1) | IL95764A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6709859B1 (en) | 1986-01-31 | 2004-03-23 | Beecham Group P.L.C. | Chromosomal DNA Fragments Encoding Enzymes for Encoding B-Lactam Biosynthesis Enzymes, and Vector and Transformants for Their Expression |
| DE3789880T2 (de) * | 1986-01-31 | 1994-09-08 | Beecham Group Plc | Isolierung und Expression von bei der Biosynthese von Beta-Laktamen beteiligten Genen. |
| US5571910A (en) * | 1994-12-09 | 1996-11-05 | Schering Corporation | Process for the preparation of intermediates useful in the synthesis of cephalosporins |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US1252973A (en) * | 1915-05-03 | 1918-01-08 | Roessler & Hasslacher Chemical | Catalyzer and process of making the same. |
| US2689203A (en) * | 1951-09-27 | 1954-09-14 | Armour & Co | Preparation of stabilized catalase |
| US3242056A (en) * | 1962-06-08 | 1966-03-22 | Lysofrance Soc | Thermally stable lysozyme composition and process for preparing same |
| US3637462A (en) * | 1969-04-21 | 1972-01-25 | Wadley Res Inst & Blood Bank | Purification of enzymes |
| US3761420A (en) * | 1970-06-08 | 1973-09-25 | Staley Mfg Co A E | Stabilized liquid enzyme stain remover |
| US4693977A (en) * | 1982-08-23 | 1987-09-15 | Queen's University At Kingston | Enzyme immobilization for producing cephalosporin antibiotics |
| US4536476A (en) * | 1982-08-23 | 1985-08-20 | Queen's University At Kingston | Stable epimerase reagent, cyclase reagent and ring expansion reagent for cell-free production of cephalosporins |
-
1990
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