JPH03209166A - 金属ゾル試剤の製造及び使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、種々の免疫分析系に有用な予じめ選択された
寸法の粒子を有する金属ゾル試剤の製造法及び顕微鏡的
技術における使用法に関する。

要するに本発明によれば、広い種類の免疫分析系に有用
な方法及び試験キットが提供される。即ち予じめ選択さ
れた寸法の金属ゾル粒子を含む金属ゾル試剤の製造法が
提供される。金属含有溶液を最適なｐＨ条件下に還元し
て予じめ選択された寸法の金属ゾル粒子を製造し、この
粒子を結合化合物で被覆し、次いで少くとも１つの選択
された免疫化学的に反応する成分を結合させる。また異
なる免疫化学的特異性を有する粒子を混合して多くの選
択された免疫化学的特異性を有する試剤を製造する。

コロイド溶液又はゾルは縮合法で製造することができる
。通常還元剤を、金属粒子を形戊する金属塩に添加する
。

金ハイドロゾルの最もしばしば使用される製造法は、ク
ロル金酸を適当な還元剤で還元するものである。ホルム
アルデヒド、過酸化水素、燐、置換アンモニア例えばヒ
ドロキシルアミン及びヒドラジンを含む多くの還元剤が
使用できる。金ゾルの製造法は一般にロス（Ｒｏｔｈ）
　．　　Ｊ．　，　　ｒ光学及び電子顕微鏡細胞化学に
対するコロイド状金マーカー系」、プルロック（Ｂｕｌ
ｌｏｃｋ）　．　Ｇ．Ｒ．及びベトラスズ（Ｐｅｔｒｕ
ｓｚ）　，　Ｐ，編，免疫細胞化学の技術２．２１７〜
２８４頁；ホリスバーガ−（Ｈｏｒｊｓｂｅｒｇｅｒ）
　，　Ｍ．　．　　ｒコロイド状金：光学及び蛍光顕微
鏡に対する及び透過型及び走査型電子顕微鏡に対する細
胞化学的マーカーＪ，ＳＥＭ１１　：９　〜３１　（１
９８１）；ワイザー（Ｗｅｉｓｅｒ），Ｈ．Ｂ．，　　
ｒコロイド状元素」、無機コロイド化学、Ｊ，ワイリー
・アンド・サンズ（Ｊ．Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ）　
．　　ｌ〜ｌ　０　７頁、に議論されている。

寸法が２〜１４０ｎｍの範囲の金粒子は、種々の方法に
よって容易に製造される。参照、ゲグヘゴン（Ｇｅｏｇ
ｈｅｇｏｎ）　、Ｗ．Ｄ．．　　ｒ顕微鏡レヘルテの免
疫分析：固相コロイド状金法」，Ｊ．タリン・イミュノ
アツセイ（　Ｊ　．　　Ｃ　Ｉｉｎ．　Ｉ　ｍｍｕｎｏ
ａｓｓａｙ）１１（１）　　・１１〜２３　（１９８８
）。クエン酸三ナトリウムを還元剤として用いる場合、
粒子の直径はクエン酸塩の添加量の関数であることが発
見されている。参照、フレンズ（｝’　ｒｅｎｓ）　，
　Ｇ．，「単分散金懸濁液における粒子寸法の制御のた
めの調節された核形成」、ネーチャー・フイジカル・サ
イ（Ｎａｔｕｒｅ　Ｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｓｃｉ．）　．
　　２　４　１　：　２０〜２２（１．９７３）。粒子
寸法はクエン酸塩の添加量を変えることにより、凡そ１
５〜１４０ｎｍの寸法範囲にわたって変化させることが
できる。

白燐、アスコルビン酸、又はタンニン酸とクエン酸塩の
混合物を還元剤として用いることにより、２〜２０ｎｍ
の範囲の粒子が製造できる。

コロイド状金は、直接及び間接標識法を用いる種々の顕
微鏡法により標的分子を検知し且つ局在化させるために
粒状マーカーとして使用することができる。適当な条件
下に、コロイド状金は結合した巨大分子の特異的活性を
殆んど変化させずに非共有の静電吸着によって巨大分子
を結合しよう。

相互作用はイオン濃度、蛋白質の等電点と関連したｐＨ
値及び蛋白質の安定化程度によって影響される。

適当な条件下において、金ゾル粒子は多糖類、糖蛋白質
、蛋白質、レクチン及び抗体を含む種々の巨大分子で標
識することができる。

本明細書において「金属ゾル粒子」という術語を用いる
場合はいつでも、これは金属又は遷移金属、金属又は遷
移金属化合物或いは金属又は遷移金属もしくは金属又は
遷移金属化合物で被覆された重合体核からなるゾルの粒
子を意味するものと理解される。金属ゾルは金属又は遷
移金属或いはこれらの化合物例えば酸化物、水酸化物、
及び塩の、もしくは金属又は遷移金属或いはこれらの化
合物で被覆された重合体核のものであってよい。

例は白金、金、銀、鉄、銅、セレン、クロム、バナジウ
ム、チタン、マンガンを含む。更に本申請者の発明に従
って製造される金属ゾルは不溶性の金属塩、硫化物、酸
化物、水酸化物又は同様の化合物に転化しうることが認
識される一般に同業者の良く知る技術によって容易に示
すことのできるすべての金属、遷移金属又はこれらの化
合物は本申請者の発明に包含されることとする。

金粒子認識技術に関する一般的な議論に対しては、ホリ
スバーガー，Ｍ．「コロイド状金：光学及び蛍光顕微鏡
に対する及び透過型及び走査型電子顕微鏡に対する細胞
化学的マーカーＪ，ＳＥＭ１１：９〜３１　（１９８１
）を参照。多くの場合、吸着された分子の生物活性に殆
んど変化はない。

一般にこれらのプローブは吸着された分子の比活性を得
、そしてその貯蔵安定性は良好である。しかしながら、
金粒子を蛋白質で標識する場合、電解質による凝固に対
する完全な安定化は特に大きい寸法のマーカーの場合に
必ずしも観察されない。

ポリビニルピロリドン、ポリーＬ−リジン、ボリ−Ｌ−
プロリン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びカ
ーボワックスを含む多くの安定化剤が提案されている。

プローブとして金粒子は特に興味ある。その理由は、そ
の電子濃密性が透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による検知
を可能にする、その強い２次電子放射の能力が走査型電
子顕微鏡（ＳＥＭ）による可視化を可能にする、その特
徴的なＸ線のシグナルが細胞表面上の金マーカーの同定
を可能にするからである。更に金ブローブは金粒子を蛍
光分子で標識することによって蛍光顕微鏡においても有
用である。細胞表面に束縛された金粒子は、橙赤色のコ
ーティングとして見え、従って写真顕微鏡において及び
肉眼での観察において有用である。

金プローブの利点は一般にホリスバーガー，Ｍ．，「コ
ロイド状金：光学及び蛍光顕微鏡に対する及び透過型及
び走査型電子顕微鏡に対する細胞化学的マーカーＪ、Ｓ
ＥＭ．１１　：９〜３１（１９８１）；グツドマ：／　
（Ｇｏｏｄｍａｎ）　，　　Ｓ．Ｌ．ら、「コロイド状
金マーカー系の総覧Ｊ．ＳＥＭ，１１　：１３３〜１４
６　（１９８０）に議論されている、金ブローブ標識の
研究の文献はグツドマンの１３９頁に示されている。

特異的物質を選択し且つ金に吸着させて、その電子顕微
鏡（ＥＭ）に対するトレーサーとしての使用を最適化す
ることは可能であるということが示されている。また理
想的なトレーサー物質は必要に応じて変えることのでき
る被覆によって取りまかれた電子散乱核を有して、広い
範囲の均一な寸法で存在すべきであるということも提案
されている。参照、ゲグヘゴン，Ｗ．Ｄ．，ｒ顕微鏡レ
ベルでの免疫分析：固相コロイド状金法」，Ｊ，タリン
・イミュノアツセイ，１１　（１．）：　１１〜２３（
１９８８）。金はポリペブチド、ポリヌクレオチド、多
糖類及び有機重合体を含む種々の物質によって安定化さ
れる。

コロイド状金を用いる多くの免疫分析がある。

反応性蛋白質のブローブ上での存在は、直接及び間接的
放射性結合分析及び接合分析によって示され且つ定量化
される。参照、グツドマン，Ｓ．Ｌ．ら、「コロイド状
金マーカー系の総覧Ｊ，ＳＥＭ１１：１３３〜１４６　
（１９８０）。

金プローブを作るには、次の基本的な工程に従う：蛋白
質溶液とコロイド状金をｐＨ調整して蛋白質の吸着を最
適化、蛋白質の最小保護量を決定し、蛋白質の適当な量
をコロイド状金と混合し、そして２次安定化剤を添加す
る。次いで金ブローブを精製し、その濃度を予じめ決め
られた光学的密度に調節する。これらの一般的な原理を
用いることによって、リガンドを免疫分析に用いる金プ
ローブに結合させることができる。ジャンセン（　Ｊ　
ａｎｓｓｅｎ）のマニュアル、「巨大分子標識化のため
のコロイド状金ぞるＪ　　（１９８５）は、基本的なプ
ローブの構或技術を開示している。

米国特許第４，３１３．７３４号［リューバリング（　
Ｌ　ｅｕｖｅｒｉｎｇ）　］は金属粒子ゾルによる免疫
分析を開示している。リューバリングは、クロル金酸を
クエン酸三ナトリウムで還元して直径４５〜７０ｎｍの
金粒子を製造することによる金ゾルの製造を教示する。

次いでこの粒子を炭酸カリウムでｐＨ７．０に調節し、
そしてウサギの抗ＨＰＬ免疫グロブリン溶液を添加する
ことによりウサギの抗ＨＰＬ血清で標識する。この時こ
の被覆された金粒子は、比色又は原子吸光分光法により
ＨＰＬの決定に使用することができる。リューバリング
は、金粒子のヒツジの抗ＨＢｓＡｇ免疫グロブリン抱合
体を用いる肝炎Ｂの表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の視覚検知
を開示している。この方法において、金ゾル及び金一免
疫グロブリン抱合体は、ウサギの抗ＨＰＬ免疫グロブリ
ン溶液の代りにヒツジの抗ＨＢｓＡｇ免疫グロブリンの
希釈溶液を用いる以外前述のように調製される。リュー
バリングは凝集反応試験において金粒子一抗ＨＣＧ抱合
体を用いるＨＣＧの決定も開示している。この金ゾル及
び金粒子抗ＨＣＧ抱合体は前述した方法を用いて製造さ
れる。ＨＣＧに対する競争的受容体分析も開示されてい
る。直径６〜１５ｎｍの粒子からなる金分散液を、クエ
ン金酸の沸とう溶液にクエン酸ナトリウムを添加して調
製する。次いで透析したＨＣＧ溶液を金分散液に添加し
、混合物をカーボワックスで安定化する。次いで不溶化
されたＨＣＧ受容体及び金粒子一抗ＨＣＧ抱合体を用い
てＨＣＧに対するサンドウィッチ分析を行なう。

米国特許第４．７７５，６３６号［メレマンス（　Ｍｏ
ｅｒｅｍａｎｓ）ら〕は好ましくは寸法１００ｎｍのコ
ロイド状金属粒子を用いるプロット・オーバーレー（ｂ
ｌｏｔ　ｏｖｅｒｌａｙ）分析を開示している。メレマ
ンスらは金属又は金属化合物或いは金属又は金属化合物
で被覆された核の、プロット・オーバーレー技術におけ
る１つの検出手段としての使用を教示する。金粒子を含
むコロイド金属粒子は公知の方法によって製造される。

次いでコロイド状金属粒子は直接的又は間接的に特異的
結合剤に或いは公知の技法による第一の特異的結合剤に
特異的に結合する巨大分子に結合することができる。

メレマンスは、このように調製したコロイド状金属粒子
が特異的結合部位に蓄積し、そして驚くことに用いるコ
ロイド状金属粒子に特徴的な色、例えば金の場合には桃
色ないし暗赤色として見えるようになるということを発
見している。この信号は目で又は分光学的方法を用いて
読みとれる。

本発明はコロイド状金属粒子、特にコロイド状金ゾルが
特異的に結合する蛋白質又は免疫化学的に反応する成分
に結合するという化学的結合法に関する。これらの免疫
化学的に反応する戊分は、免疫グロブリン、ポリクロー
ナル及びモノクローナル抗体、免疫グロブリン抗体の免
疫化学的に活性な断片、抗抗体、受容体蛋白質例えば抗
原、ハプテン、及び免疫化学的に不活性な担体巨大分子
に結合したハブテン、レクチン、多糖類、酵素、血清蛋
白質、ホルモン、糖蛋白質、組換え蛋白質を含むベプチ
ド及びポリベブチド、ＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオチドシ
ーケンス、組換えオリゴヌクレオチドシーケンスを含む
。

この独特な結合法は、免疫化学的に反応する成分を、そ
の元の反応性の多くを保持しつつコロイド状金粒子の表
面に結合させる。

本発明の重要な観点は、コロイド状金粒子の、低ｐＨ条
件下におけるグルタルアルデヒドによる被覆である。こ
れは免疫化学的に反応する威分の付着場を固定する。コ
ロイド状金表面積に関するグルタルアルデヒドの濃度は
本方法の重要な観点である。

約２０〜約９２ｎｍ，好ましくは３０〜６０ｎｍ、最も
好ましくは約３５〜５Ｑｎｍの実質的な寸法範囲のコロ
イド状金が使用できる。５４０ｎｍの、６００ｎｍに対
する光学的密度比で測定される如き約１．７（大粒子）
〜３．５（小粒子）、好ましくは２〜２．５の実質的な
種類のコロイド状金の寸法が使用できる。好適な寸法範
囲内のコロイド状金粒子は溶液中の場合帯赤青色として
肉眼的に観察できる。

最良の方法は免疫化学的に反応する成分の、コロイド状
金属での直接的標識化を意図するけれど、同等の間接的
標識化も使用でき、ある環境下では好適なことさえもあ
る。そのような間接的な標識化は、典型的にはそれ自体
コロイド状金で標識され且つ順次検出すべきりガンドに
特異的な第２の免疫グロブリンと特異的に反応する第３
の免疫グロプリンを利用する。そのような方法は抗グロ
プリンで標識されたコロイド状金を用いる抗体試験に対
して特に有用である。再び間接的な標識化法は同業者の
容易に理解する主題である。

このように特異的な免疫化学的に反応する成分で標識さ
れたコロイド状金粒子は多くの免疫分析検知系において
特異的試剤として使用される。

重要な利点は、化学結合法がコロイド状金粒子の安定性
を高め且つそれが広範な厳しい免疫分析条件と共同して
該粒子を効果的に機能せしめるという本発明によって提
供される。

本発明による方法は免疫化学的に反応する成分例えば水
性試験媒体に存在するハプテン、抗原、又は抗体の定性
的及び／又は定量的決定に特に適当である。

この理由のために、本発明は同様に、直接的又は間接的
に免疫化学的に反応する威分が結合した金属ゾル粒子の
水性分散液からなる新規な免疫学的試剤からなる。

また本発明はそのような免疫学的試剤を含む新現な試験
キットに関する。

本発明のこれらの及び他の目的は、以下の更に詳細な記
述から明らかになるであろうし、添付する図面において
その特別な具体例によって例示される。

本発明はコロイド状金粒子、特にコロイド状金ゾルを特
異的に結合する蛋白質又は免疫化学的に反応する成分に
結合させるという新規な化学結合法を提供する。本新規
な方法は、免疫化学的に反応する成分のコロイド状金ゾ
ルへの強力な結合により、コロイド状金反応物の機能を
高める。結果として、これらの試剤は高イオン強度を有
する多種類の緩衝液及び広く許容しつるｐＨ範囲、即ち
ｐ　｝｛　４　．　４〜１０．０内で使用することがで
きる。

更にこれらの試剤は高塩濃度を含む緩衝系で機能するで
あろう。緩衝添加剤例えば洗剤（例えばトリトン７０５
、ツウイーン２０）又はチヤオトロフイツク（ｃｈａｏ
ｔｒｏｐｈｉｃ）剤も、免疫化学的機能を変えることな
しに本試剤と共用することができる。斯くしてこれらの
試剤はかなり厳しい免疫分析の緩衝剤環境においても向
上した安定性を維持する。

本発明の方法によって製造される試剤は凍結乾燥により
その安定性を向上させうる。同様に、それは免疫分析の
固相成分例えばセルロース細片、紙、膜、ニトロセルロ
ースシ一ト及び器具の表面上で風乾又は凍結乾燥するこ
ともできる。試剤はその生物学的活性及び免疫特異性並
びに再水和及び水性緩衝媒体中への再懸濁液の良好なコ
ロイド特性を保持する。

本発明の試剤は次の一般的な方法によって製造される。

オーバーヘッド（　ｏｖｅｒｈｅａｄ）撹拌機、窒素導
入管及び温度センサーを備えた３ツロ丸底フラスコ（又
は製造規模に依存して適当なガラス反応器）中において
、四塩化金酸水素三水和物［０．　１　ｇ、アルドリツ
チ・ケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅａ＋ｉｃａｌ
Ｃｏ．）］及びリンゴ酸（０．２ｇ、アルドリツチ）か
ら、ｐＨ範囲４．０〜５．５及び７０〜９５℃において
１時間反応させることによってコロイド状金粒子（原料
ゾル）を製造する、この方法において、平均の粒子寸法
が３０〜６０ｎｍである原料の被覆されてない金ゾル１
ｌが製造される。５４０ｎｍと６００ｎｍとにおける分
光学的吸光度の比はこれらの条件下において約１．８〜
３．５である。

このゾルを室温まで冷却した後、ｐＨを０．ＩＮ　　Ｋ
ＯＨ溶液で５，０〜９．０１：調節する。次い゛で水性
２５％グルタルアルデヒド溶液［ポリサイエンス社（　
Ｐ　ｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ　Ｉ　ｎｃ．　）．　　Ｅ　
Ｍ級］１０μｌを添加し、室温で４５〜１２０分間撹拌
する。

結合又は被覆させるべき抗体又は抗原を、０．１Ｍ燐酸
ナトリウム及び０．１％ナトリウムアジドを含むｐ　Ｈ
　５〜９の緩衝液中に入れる。これらの成分を続いて金
属ゾルに添加し、室温で０．５〜５．０時間撹拌する。

このように生威したシツフ塩基を、撹拌を５〜３０分間
継続しながら、固体の水素化ホウ素（５０〜９０ｍｇ）
をゾルに添加することによって還元する。水素化ホウ素
塩の添加直後に、燐酸ナトリウム（０．１Ｍ）一ナトリ
ウムアンド（１％）の緩衝液（ｐＨ６．０）４０ｍｌを
添加する。

還元の完了後、０．１Ｍ燐酸ナトリウム−０．１％ナト
リウムアジドのｐＨ７．０緩衝液中１％カーネーション
（　Ｃ　ａｒｎａｔｉｏｎ）脱脂ミルク溶液を添加し（
１０ｍｌ）、そして夜通し撹拌する。種々の等級（ＲＩ
Ａ，Ｆｒ，Ｖ，単量体など）の牛の血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）もブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）剤として使
用しつる。次いで被覆された金ゾル（染料試剤）を５〜
１０℃下に約ｓ．ｏｏｏ〜１０，００Ｏｒｐｍで２０分
間遠心分離する。

上ａ液を除去し、残存染料粒子を適当な緩衝液中に再懸
濁させる。染料を作業又は最終緩衝液で完全に洗浄する
ためにこの工程を２回繰返した。最後の洗浄後に添加す
べき緩衝液の量を、染料の５４Ｑｎｍにおける所望の最
終吸光度に依存して計算した。

ＤＬ−リンゴ酸は好適な還元剤であるけれど、他の好適
な還元剤はクエン酸、タートロン酸、ＤＬ一酒石酸、ム
チン酸、及び他のα−ヒドロキシカルポン酸、乳酸、タ
ンニン酸、アスコルビン酸、及び還元糖を含む。グルタ
ルアルデヒドは好適な結合化合物である。他の有用な結
合化合物はマロンアルデヒドビス（ジメチルアセタール
）、水溶性アルデヒド及びジアルデヒドを含む。還元剤
溶液のｐＨは重要である。与えられた還元剤を最適なｐ
Ｈに適合させることは、与えられた免疫分析試剤に対す
る正しい粒子寸法を保証する。反応時間及び温度、混合
速度並びに反応溶液の形体の明確な制御も重要である。

上述の一般的な方法に基づいて、次の試剤を製造するこ
とができる： ｉ）　風疹分析一使用抗体は上述した如く燐酸塩緩衝液
２ｍｌに溶解したマウスの抗人間１ｇＧ（２０ｍｇ／被
覆すべき原料ゾルｌ）である。最終緩衝液は１０ｍＭ　
　ＨＥＰＥＳ，０．３Ｍ７：／二トール、０．５％ＢＳ
Ａ　（単量体）、０　２％ナトリウムアジド、ｐＨ７．
Ｑである。５４０ｎｍにおける最終の吸光度は９〜１１
である。

ｉｉ）　　ＨＣＧ分析一適当な抗体は燐酸塩緩衝液ｌｍ
ｌに溶解した抗ＨＣＧクローン１０Ａ５Ｈ７（２０ｍｇ
／ｌ）である。作業緩衝液は１０ｍＭＨＥＰＥＳ　　０
．３Ｍマンニトール、２、５％ＢＳＡ（単量体）、０　
２％ナトリウムアジド、ｐＨ７．０であり、そして５４
０ｎｍにおける最終吸光度は４．５〜５　５である。

ｉｉｉ）　　排卵試験一使用抗体は０，ＩＭ燐酸ナトリ
ウム及び０　１％ナトリウムアジド（ｐＨ７．４）中抗
−ＬＨクローン２９Ｄ３Ｃ４Ｆ＋２　（２０ｍｇ／１）
である。最終緩衝液は０．１Ｍ燐酸ナトリウム、０．１
５Ｍ塩化ナトリウム、５％Ｄ−マンニトール、１％単量
体ＢＳＡ、０．０２％チメロサル（ｔｈｉｍｅｒｏｓａ
ｌ）　、ｐ　Ｈ　７．　４であり、そして最終吸光度は
１０．３である。

ｉｖ）　　毒性シヨつく症候群毒素（ＴＳＳＴ−１）こ
の染料の調製は上記風疹分析のもとで記述したものと同
一である。

多《の特異性を有する試剤も、予じめ異なる特異性の免
疫化学的成分、例えば組換え蛋白質（例えばＳＰ−１２
０．ＳＰ−４１、Ｐ３１，Ｐ２４）に対する人間の免疫
欠陥ウイルス１型（ＨＩＶ１）で被覆した金属ゾル粒子
を混合することにより、本発明の方法で製造することが
できる。同様に予じめ決められた形式に従って、ＨｒＶ
−２７一カー、ＨＡＶ，ＨＢＶ．ＨＣＶ　　ＣＭＶを種
々の具合にキット内で組合せることができる。

次の実施例は本発明を更に説明する。これらの実施例は
単に例示であって、本発明を特別な具体例に限定するも
のではない。

実施例１−コロイド状金ゾルの製造 コロイド状金ゾルと接触するすべてのガラス容器表面は
、１％シルウエット（　Ｓ　ｉｌｖｅｔ）　７　２　０
［ユニオン・カーバイド（Ｕｎｉｏｎ　Ｃａｒｂｉｄｅ
）　］を用い、１０分間浸し且つ次いで蒸留水でゆすぐ
ことによってシリコーン化すべきであった。ＩＩの濾過
した蒸留水を少くとも１０分間１００℃まで加熱した。

ミリ（Ｍｉｌｌｉ）　−Ｑで濾過した蒸留水中１％塩化
金（アルドリツチ）１０ｍｌを反応器に添加し、１分間
混合した。３４ｍＭクエン酸ナトリウム１０ｍｌ又は６
４ｍＭリンゴ酸ナトリウム又はリンゴ酸１０ｍｌをｐＨ
４．２で反応器に添加して還元剤として作用せしめ、迅
速に２０分間撹拌し続けた。色の変化は金ゾルの生成の
戊功を示した。次いで熱源を除去し、反応器を１５〜３
０℃まで冷却した。１％ＰＥＧ２０，０００１ｍｌを添
加し、ゾルのｐＨを０．１Ｍ　Ｋ２Ｃ○３の添加によっ
て７．１±０．１に調整した。コロイド状金の光学密度
を５４０ｎｍ及び６００ｎｍで測定した。この形におい
て金ゾルは抗体への結合に適当であった。このように製
造したコロイド状金は、光学密度比で決定して約４０〜
５Ｑｎｍであり、そのような寸法は化学的還元条件に依
存した。

実施例２−コロイド状金一抗体の結合 方注１一吸着的結合 分子量１２，０００〜１４，０００を遮断する透析管と
抗体１ｍｌ当り溶液３００ｍｌを用いることにより、抗
体をｐＨ７．１で１８時間０．ＯＩＭＨＥＰＥＳ緩衝溶
液中に透析し、次いで０．４５μｍスウイネクス（ＳＷ
ＩＮＥＸ７′″）フィルタ一を通して濾過した。抗体の
蛋白質濃度は、抗体の２８０ｎｍでの吸光度を測定する
ことによって得た。次いで抗体を０．０ＩＨＥＰＥＳ　
（ｐＨ７１）で３〜４ｍｇ／ｍｌの濃度まで希釈して、
標識すべき抗体で決定される如き最適な抗体−コロイド
状吸着結合を得た。実施例１からの反応器に存在するゾ
ルを用いて、ゾルを室温で撹拌しながら上述のように濾
過し且つ希釈した抗体を添加した。撹拌を約３０分間続
け、この間に０．ＯＩＭＨＥＰＥＳ，０．３Ｍ　　Ｄ−
マンニトール、００５％ＰＥＧ２０．ＯＯＯ，０．１％
ＢＳＡ（ＲＩＡ級）及び０．０５％ナトリウムアンドを
含んでなる緩衝液を添加した。撹拌を室温で３０分間継
続した。次いで溶液を高速遠心分離機に移し、遠心分離
し、上澄液を除去した。次いでゾルを上述の緩衝液で４
回洗浄し、１／１０出発ゾル濃度まで再響濁し、０．４
５μｍの膜を通して濾過し、２〜８℃で貯蔵した。

好適な方法２一共有結合 ｐＨを予じめ６．０に調整した実施例１に記述した如く
して得られるゾルに、当量重量のＢＳＡ（ＢＳＡ１００
ｍｇ／ゾル１００ｍｇ）を添加した。この混合物を室温
で２時間撹拌し、次いで０２２μの膜フィルターを通し
て濾過し、大きい粒子を除去した。光学密度を５４０及
び６００ｎｍで測定し、光学密度比を計算した。許容し
つる物質の比は２，５０±０．３０であるべきであった
。

このように製造したＢＳＡ−ゾル２００ｍｌを２５，０
００で３０分間遠心分離にかけ、次いで１回蒸留水で洗
浄した。洗浄した粒子をｌｗ／ｖ％のグルタルアルデヒ
ドと混合し、２時間撹拌した。

次いで混合物を２５，ＯＯＯＧで３０分間遠心分離にか
け、３回蒸留水で洗浄した。次いで活性化し且つ洗浄し
た粒子を、ｐＨ７．４の燐酸塩緩衝液中適当に精製した
モノクローナルＩｇＧ２ｍｇと混合し、２〜８℃で終夜
撹拌した。水素化ホウ素ナトリウム２．５ｍｇを添加し
て結合を安定化させた。３０分間撹拌し、そしてｐＨ８
．０のグリンンＢＳＡ緩衝液５ｍｌでクエンチングした
後、混合物を２５，ＯＯＯＧで３０分間遠心分離し、次
いで燐酸塩緩衝食塩水（ｐ｝｛８．０）で３回洗浄した
。次いで被覆した金を再懸濁し、そしてその濃度を５０
ｍＭトリエタノールアミン、１００ｍＭ　　ＮａＣ］、
０．２％ＢＳＡ，０．１％ＮａＮ３を含んでなる最終の
ｐ　Ｈ　８．　０の緩衝液により５４０ｎｍにおいて約
１０の光学密度まで調節した。

次いで被覆されたゾルを０．２２μのフィルターを通し
て濾過し、２〜８℃で貯蔵した。

実施例３一尿中のＬＨに対する感度 コロイド状金で標識した抗ＬＨ抗体２０μｌを２滴（１
００μｌ）の尿試料に添加し、試験管中で混合した。こ
れに適用される抗ＬＨ抗体を有する膜の細片の一端を試
験管中に浸した。濃度範囲０〜２　０　０ｍ　Ｉ　Ｕ／
ｍ　ｌで調製したＬＨ対照を用いて試験し、そして次の
結果を観察した感度ｍｌＶ／ｍｌ　　ＬＨ 対照　　　　　　０　　５　　１５　　４０　　１００
　　２００観察された反応　一−−＋＋＋ 実施例４一患者の試料 実施例３の方法に従い、２８日の月経周期を有する２人
の婦人からの尿試料を利用した。試料を５日間にわたっ
て集め、試験結果をアドバンスド・ケアズ・オブタイム
・テスト（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｃａｒｅ　ｓＯｖｕｔｉ
ｍｅ　ＴｅｓｔＴＭ）　　［オルト・ファーマシューテ
イカル社（Ｏｒｔｈｏ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
　Ｃｏｒｐ．）コで証明し、そして次の結果を観察した
：患者Ａ 周期中の日数　　９　　１０　　１１　　１２　　１３
試験結果　　　　一一＋＋ 排卵時期の結果　−−＋＋ 患者Ｂ 周期中の日数　　９　　１０　　１１　　１２　　１３
試験結果　　　　一　一＋＋ 排卵時期の結果　一−＋＋ 実施例５−ビルトーイン（ｂｕｉｌｔ−ｉ？）試験基準
を含む排卵試験 細片が２つの試剤バンドを有する以外実施例３に従って
膜の細片を製造した。下方のバンドを抗ＬＨ抗体で被覆
し（試験バンドを形威し）、そして上方のバンドを対照
バンドとして役立つＬＨＣ又は交叉反応性のために同様
に反応するｈＣＧ）で被覆した。コロイド状金で標識し
た抗ＬＨ抗体を実施例２に従って製造した。この方法は
次の通りであった。コロイド状金で標識した抗ＬＨ一抗
体２０μｌを尿素試料１００μｌと一緒に試験管に添加
し、混合した。上述した膜細片の一端を試験管中の混合
物に挿入し、５分間展開させた。観察された結果は次の
通りであった。

実施例４で試験した同一の２人の婦人の尿試料Ａ及びＢ
を試験して同一の結果を確認した。更にこの試験は適当
に行なった場合、すべての試験に対して工程試験基準バ
ンドを示す。

患者Ａ 周期中の日数　　９　　１０　　１１　　１２　　１３
試験バンド　　　ー−＋＋ 対照バンド　　　＋　＋＋＋＋ 参照（排卵時期）−−＋＋ 患者Ｂ 周期中の日数　　９　　Ｉｎ　　１１　　１２　　１３
試験バンド　　　一　一十＋ 対照バンド　　　＋　＋十＋＋ 参照（排卵時期）−−＋＋ 試験管で凍結乾燥したコロイド状金で標識した抗体を用
いて前述の作業を繰返した。３？ｆｊ（１００μｌ）の
尿を試験管に添加し、混合し、次いで膜細片の一端を挿
入し、５分間展開させた。観察された結果は同一であっ
た。

試験を臨床試料で繰返した： 試料数　陽性数　陰性数 婦人からの尿　　　２４　　　　６　　　　１８排卵時
期参照実験は同一の試料で行ない、結果を確認した。

本発明の特徴及び態様は以下の通りである１．金属含有
溶液を、最適化されたｐＨ条件下に還元して、予じめ決
められた寸法の金属ゾル粒子を製造し 該金属ゾル粒子を、少くとも１つの選択された免疫化学
的に反応する成分と反応させる前に、結合化合物で被覆
し： 該被覆された粒子を該免疫化学的に反応する威分と結合
させる、 ことを含んでなる予じめ決められた寸法の金属ゾル粒子
を含む金属ゾル試剤の製造法。

２，反応ｐＨ及び温度及び還元剤を、予じめ選択された
寸法の粒子が製造されるように選択することによってｐ
Ｈ条件を最適化する工程を更に含んでなる上記１の方法
。

３．該金属含有溶液が金塩溶液である上記１の方広。

４。還元工程をｐＨ４．２及び８０℃で行ない、還元剤
がリンゴ酸である上記３の方法。

５．該還元剤がリンゴ酸塩、リンゴ酸、クエン酸、ター
トロン酸、ＤＬ一酒石酸、ムチン酸、αーヒドロキジジ
カルボン酸、乳酸、アスコルビン酸、タンニン酸及び還
元剤からなる群から選択される上記１の方法。

６．該結合化合物がグルタルアルデヒドである上記１の
方法。

７．該結合化合物がグルタルアルデヒド、マロンアルデ
ヒド、水溶性アルデヒド、及び水溶性ジアルデヒドから
なる群から選択される上記１の方注。

８　該粒子の選択される寸法が５〜９０ｎｍである上記
１の方法。

９．該粒子の選択される寸法が好ましくは３０〜５Ｑｎ
ｍである上記８の方注。

１０．該粒子の選択される寸法が最も好ましくは４０〜
５０ｎｍである上記９の方法。

１１．少くとも１つの免疫化学的に反応する戊分が化学
的に結合している被覆された粒子を含んでなる金属ゾル
試剤，該試剤を含有する試験媒体，及びチヤオトロフイ
ツク剤を含む分析緩衝剤、を含んでなる免疫分析を行な
うためのキット。

１２．該粒子が金ゾル粒子である上記１１のキット。

１３．該チヤオトロフイツク剤がグアニジン、尿素、ト
リクロル酢酸及びその塩、トリフルオル酢酸及びその塩
、並びにトルエンスルホン酸及びその塩を含む群から選
択される上記１０のキット。

１４．該チヤオトロフイツク剤がグアニジンである上記
１３のキット。

１５．該粒子がグルタルアルデヒドで被覆されている上
記１１のキット。

１６，異なる選択された免疫化学的特異性を有する被覆
された金属ゾル粒子の混合物を含んでなる多数の選択さ
れた免疫化学的特異性を有する金属ゾル試剤：該試剤を
含有する試験媒体；及びチヤオトロフイツク剤を含有す
る分析緩衝剤、を含んでなる免疫分析を行なうためのキ
ット。

１７．該粒子がグルタルアルデヒドで被覆されている上
記１６のキット。

１８，該チヤオトロフイツク剤がグアニノン、尿素、ト
リクロル酢酸及びその塩、トリフルオル酢酸及びその塩
、並びにトルエンスルホン酸及びその塩を含む群から選
択される上記１６のキット。

１９　該チヤオトロフイツク剤がグアニンンである上記
１８のキット。

２０．異なる免疫化学的特異性を有する粒子を混合して
、多くの選択された免疫化学的特異性を有する試剤を製
造することを更に含んでなる上記１の方法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、金属含有溶液を、最適化されたｐＨ条件下に還元し
   て、予じめ決められた寸法の金属ゾル粒子を製造し； 該金属ゾル粒子を、少くとも１つの選択された免疫化学
   的に反応する成分と反応させる前に、結合化合物で被覆
   し； 該被覆された粒子を該免疫化学的に反応する成分と結合
   させる、 ことを含んでなる予じめ決められた寸法の金属ゾル粒子
   を含む金属ゾル試剤の製造法。 ２、少くとも１つの免疫化学的に反応する成分が化学的
   に結合している被覆された粒子を含んでなる金属ゾル試
   剤；該試剤を含有する試験媒体；及びチヤオトロフイツ
   ク剤を含む分析緩衝剤、を含んでなる免疫分析を行なう
   ためのキット。 ３、異なる選択された免疫化学的特異性を有する被覆さ
   れた金属ゾル粒子の混合物を含んでなる多数の選択され
   た免疫化学的特異性を有する金属ゾル試剤；該試剤を含
   有する試験媒体；及びチヤオトロフイツク剤を含有する
   分析緩衝剤、を含んでなる免疫分析を行なうためのキッ
   ト。