JPH0321153B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0321153B2 JPH0321153B2 JP57186285A JP18628582A JPH0321153B2 JP H0321153 B2 JPH0321153 B2 JP H0321153B2 JP 57186285 A JP57186285 A JP 57186285A JP 18628582 A JP18628582 A JP 18628582A JP H0321153 B2 JPH0321153 B2 JP H0321153B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid
- dna
- present
- ofr1290
- molecular weight
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
本発明は組換DNA遺伝子工学に有用な新規な
放射菌由来のプラスミドに関する。 近年遺伝子操作技術を用いて種々の遺伝子
DNAにつき、その構造及び機能を解析したり、
特定の有用な構造遺伝子をベクターに組み込ませ
て異種DNAを作成し、これを宿主細胞系又は他
の微生物細胞系に取り込ませて、例えばインシユ
リン、ソマトスタチン等の動物ホルモンや、抗生
物質、酵素等の有用な代謝生成物を製造する試み
が種々研究開発されつつある。これらの組換え
DNA技術の多くは、宿主細胞として大腸菌
（Eschrichia coli）を使用するものである。一方
放線菌殊にストレプトミセス（Streptomyces）
属放線菌は、抗生物質を始めとする多種多様な二
次代謝産物を生産する菌群としてよく知られてお
り、之等放線菌の抗生物質産生にプラスミド遺伝
子が関与することが最近明らかとなり、該放線菌
でのプラスミドの研究が急速に進展してきてい
る。 本発明はこの放射菌由来の新しいプラスミドを
提供するものである。 以下本発明プラスミドの製造法につき詳述す
る。 本発明プラスミドは、徳島県池田町の土壌より
新たに分離され、ストレプトミセス エスピー
OFR1290（Streptomyces SP OFR1290）と命名
された微生物から得ることができる。該微生物
OFR1290株は、以下の菌学的性質を示す。 （） 形態学的特徴 本菌株OFR1290を各種寒天培地上で28℃、２
週間培養すると、気菌糸は単純分枝をなし、胞子
鎖は２〜３巻乃至数巻の螺施状をなしている。培
地によつては、フツクもしくはオープンループ状
が認められる場合がある。胞子は10個以上連鎖を
なしており、その形態は楕円形乃至円筒形で0.6
〜0.9×1.2〜1.5μmの大きさをしている。胞子の
表面構造は、とげ状乃至毛状をなしている。鞭毛
胞子及び胞子のうは認められない。 （） 各種培地における生育状態 各種培地に於ける生育状態を、下記第１表（28
℃、２週間培養後）に示す。色調の記載は、カラ
ー・ハーモニー・マニユアル（Color Harmony
Mannual）〔コンテナー・コーポレーシヨン・オ
ブ・アメリカ・シカゴ（Container Corporation
of America，Chicago）〕を参照した。
放射菌由来のプラスミドに関する。 近年遺伝子操作技術を用いて種々の遺伝子
DNAにつき、その構造及び機能を解析したり、
特定の有用な構造遺伝子をベクターに組み込ませ
て異種DNAを作成し、これを宿主細胞系又は他
の微生物細胞系に取り込ませて、例えばインシユ
リン、ソマトスタチン等の動物ホルモンや、抗生
物質、酵素等の有用な代謝生成物を製造する試み
が種々研究開発されつつある。これらの組換え
DNA技術の多くは、宿主細胞として大腸菌
（Eschrichia coli）を使用するものである。一方
放線菌殊にストレプトミセス（Streptomyces）
属放線菌は、抗生物質を始めとする多種多様な二
次代謝産物を生産する菌群としてよく知られてお
り、之等放線菌の抗生物質産生にプラスミド遺伝
子が関与することが最近明らかとなり、該放線菌
でのプラスミドの研究が急速に進展してきてい
る。 本発明はこの放射菌由来の新しいプラスミドを
提供するものである。 以下本発明プラスミドの製造法につき詳述す
る。 本発明プラスミドは、徳島県池田町の土壌より
新たに分離され、ストレプトミセス エスピー
OFR1290（Streptomyces SP OFR1290）と命名
された微生物から得ることができる。該微生物
OFR1290株は、以下の菌学的性質を示す。 （） 形態学的特徴 本菌株OFR1290を各種寒天培地上で28℃、２
週間培養すると、気菌糸は単純分枝をなし、胞子
鎖は２〜３巻乃至数巻の螺施状をなしている。培
地によつては、フツクもしくはオープンループ状
が認められる場合がある。胞子は10個以上連鎖を
なしており、その形態は楕円形乃至円筒形で0.6
〜0.9×1.2〜1.5μmの大きさをしている。胞子の
表面構造は、とげ状乃至毛状をなしている。鞭毛
胞子及び胞子のうは認められない。 （） 各種培地における生育状態 各種培地に於ける生育状態を、下記第１表（28
℃、２週間培養後）に示す。色調の記載は、カラ
ー・ハーモニー・マニユアル（Color Harmony
Mannual）〔コンテナー・コーポレーシヨン・オ
ブ・アメリカ・シカゴ（Container Corporation
of America，Chicago）〕を参照した。
【表】
【表】
（） 生理的性質
生育温度範囲
９〜38℃（至適生育温度33〜36℃）
生育PH範囲
５〜10℃（至適生育PH６〜７）
ゼラチンの液化（グルコース・ペプトン・ゼ
ラチン培地上） 陽性 スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天
地上） 陽性 脱脂牛乳の凝固・ペプトン化 凝固しない。 ペプトン化する。 メラニン様色素の生成（チロシン寒天培地、
ペプトン・イースト・鉄寒天培地上及びトリプ
トン・イーストエキス培地中） 陰性 硝酸塩還元作用 陽性 セルロース分解能 陰性 （） 炭素源の利用性（プリドハム・ゴドリー
ブ寒天培地上） Ｌ−アラビノース ＋ Ｄ−キシロース ＋ Ｄ−グルロース ＋ Ｄ−フラクトース ± シユクロース − イノシトール − Ｌ−ラムノース ＋＋ ラフイノース − Ｄ−マンニツト ＋ 但し＋＋はよく利用するを、＋は利用するを、±
は利用が疑わしいを、−は利用しないを示す。 （） 細胞壁中のジアミノピメリン酸 LL−ジアミノピメリン酸 以上を要約すると、本菌株OFR1290はストレ
プトミセス属に属する菌株であり、インター・ナ
シヨナル・ストレプトミセス・プロジエクト（略
称ISP）の方法によれば、胞子形成菌糸の形態は
セクシヨン スパイラルズ（Spirales）に属し、
胞子表面はとげ状乃至毛状で成熟した気菌糸の色
は、灰色系統（Cray color series）である。基
生菌糸の色は、無色（colorless）〜黄色〜淡茶
色であり、裏面の色は淡黄色〜淡茶色である。メ
ラニン様色素は産生せず、それ以外の可溶性色素
は、イースト・麦芽寒天培地乃びペプトン・イー
スト・鉄寒天培地で黄色色素が認められる程度で
ある。炭素源はＬ−ラムノース、Ｌ−アラビノー
ス、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マン
ニツトを利用し、シユークロース、イノシトー
ル、ラフイノースを利用しない。 以上の性状及びその他の諸性状を“バージー
ズ・マニユアル・オブ・デイターミネイテイブ・
バクテリオロジー（Berqey's Manual of
Determinative Bacteriology）”第８版（1974
年）、S.A.ワツクスマン（S.A.Waksman）著
“ジーアクチノミセーテス（The
Actinomycetes）”第２巻（1961年）並びにE.B.
シヤーリング（E.B.Shirting）及びD.ゴドリーブ
（D.Gottieb）によるISPの報告であるインターナ
シヨナル・ジヤーナル・オブ・システマテイツ
ク・バクテリオロジー（International Journal
of Systematic Bacteriology）第18巻第69〜189
頁（1968年）、同第18巻第279〜392頁（1968年）、
同第19巻第391〜512頁（1969年）及び同第22巻第
265〜394頁（1972年）に検索したところ該当する
公知の放射菌はなく、類縁菌としてストレプトミ
セス・ビリデイビオラセウス（Streptomyces
viridiviolaceus）〔バージーズ・マニユアル・オ
ブ・デイターミネイテイブ・バクテリオロジー等
８版、第782頁、第785頁（1974年）、インターナ
シヨナル・ジヤーナル・オブ・システマテイツ
ク・バクテリオロジー第22巻第368〜370頁（1972
年）〕が挙げられる。即ち本菌株OFR1290は胞子
形成菌糸の形態がセクシヨン スパイラルズに属
し、胞子表面がとげ状乃至毛状である点、灰色系
統の気菌糸を着生する点、メラニン様色素を産生
しない点などにおいてストレプトミセス・ビリデ
イビイオラセウスとよく類似している。しかし、
ストレプトミセス・ビリデイビオラセウスが特徴
とする赤色系の裏面及び可溶性色素を示すのに対
し、本菌株OFR1290はそれらを示さない。した
がつて、本発明者は本菌株OFR1290を新種と同
定し、ストレプトミセスエスピーOFR1290
（Streptomyces SP OFR−1290）と命名し、公
知菌株と区別することとした。該OFR1290株は
工業技術院微生物工業技術研究所に微生物菌寄第
6526号（FERMP−6526）として寄託されてい
る。 本発明方法は、上記OFR1290株又は他の本発
明プラスミドを保持する放線菌例えば該
OFR1290株の人工突然変更株等を利用して通常
の方法〔J.Antibiotics，33，88（1980）〕に準じて
実施される。即ち該方法は、基本的には、上記微
生物を適当な培地に培養し、採取した倍養菌を常
法に従い溶菌して、次いで該溶菌液中より所望の
プラスミドを通常の物理化学的手段により単離す
ることにより行なわれる。上記微生物の培養は通
常の栄養物及び添加物を含有する培地で行なわれ
る。培養基として一般に用いられる窒素源として
は、例えば大豆粉、綿実粉、コーンスチツプリカ
ー、酵母エキス、乾燥酵母、肉エキス、カゼイン
加水分解物等を例示でき、炭素源としては、例え
ばブドウ糖、グリセリン、麦芽糖、デンプン、乳
糖、糖蜜等を例示できる。また培地に添加される
添加物としては例えば炭酸カルシウム、塩化ナト
リウム、硫酸マグネシウム、リン酸等の無機塩を
例示でき、更に該培地は必要に応じて、鉄、銅、
マンガン、亜鉛等の金属の塩を微量含有していて
もよい。好ましい培地の具体例は、後記実施例に
示す通りである。培養は、上記培養基を含有する
通常の水性培地で、表面培養でも深部通気撹拌培
養でも実施できるが、深部通気撹拌培養を行うの
が好ましい。培養条件は特に限定なく、通常の放
射菌の培養条件が採用される。具体的には例えば
通常の通気条件下に、液性がPH6.0〜8.0、好まし
くはPH6.5〜7.5及び倍養温度15〜37℃、好ましく
は28〜36℃で通常２〜４日間で有利に実施でき
る。培養後の培養菌体の採取も亦常法に従い、例
えば遠心分離法等により行なわれ、該菌体の溶菌
方法も亦常法に従い、通常の各種の物理化学的手
段により行なうことができる。具体的な溶菌手段
としては、例えば、上記菌体を適当な緩衝液中で
ホモジネートした後、遠心分離して得た菌体を、
適当な緩衝液中で可溶化剤を用いて処理すること
により行なわれる。用いられる可溶化剤として
は、一般に放射菌を溶菌可溶化できることの知ら
れている各種酵素類例えば細胞壁溶解剤としての
リゾチームやプロテナーゼＫ（ベーリンガー マ
ンハイム山の内(株)）等及び各種界面活性剤例え
ば、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、トライト
ンーX100（和光純薬(株)）、ザルコシル（ソジウム
ラウリルザルコシネート）、ブリツジ58（Brij58）
（和光純薬(株)）等を例示でき、又それらを適宜に
組み合せて使用してもよい。 かくして得られる溶菌液中からの所望のプラス
ミドの単離における物理化学的手段としては、例
えば、遠心分離法（密度勾配法）、電気泳動法、
ポリエチレングリコールやエタノール等の沈殿剤
を用いた処理法等、単離する所望のプラスミドの
物理的・化学的性質に基づいた通常の分離法を適
宜組み合わせて採用すればよい。之等単離操作に
先立つて、常法に従い蛋白分解酵素やRNA分解
酵素等による酵素処理や、SDS−NaCl等による
塩析、フエノール等による抽出を行なうことがで
きる。より好ましくは上記プラスミドの単離は、
まず上記溶菌液を遠心分離して所望のプラスミド
を含む上清（クリアード ライセート）を得、こ
れを塩析法により除蛋白後、RNaseA（シグマ社
製）等のRNA分解酵素及びプロナーゼＥ（科研化
学社製）等の蛋白分解酵素処理により混在する
RNA及び蛋白を分解処理し、次いでこれに例え
ばポリエチレングリコール、エタノール等の沈殿
剤を加えて遠心分離して所望のプラスミドを沈殿
させ、これを例えばセシユームクロライドの平衡
密度勾配遠心法に付して所望のプラスミドを単離
精製することにより実施され、かくして本発明の
プラスミドpOF041を得る。この方法の詳細は後
述する実施例に示す通りである。 本発明プラスミドpOF041は、上記の通りスト
レプトミセス エスピーOFR1290から得られる
点及び下記各試験の結果よりその特徴付けがなさ
れる。 １ 電気泳動による分子量の測定 本発明プラスミドpOF041を下記組成のＥ−バ
ツフアーを用いて電気泳動させ、その分子量を次
の通り測定した。 〈Ｅ−バツフア−組成〉 トリス〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン〕 40mM 酢酸ナトリウム 20mM EDTA・2Na 2mM PH＝7.4 即ち分子量マーカーとなる既知の各種プラスミ
ドDNAを対照として用い、之等各マーカー（プ
ラスミドDNA）の移動度の対数と、それらの分
子量の対数をプロツトして、予め標準曲線を作成
しておき、同一試験により、本発明プラスミド
pOF041の移動度を求め、その対数を上記標準曲
線上にプロツトすることにより、該プラスミドの
分子量を求めた。尚すべての電気泳動は、水平型
装置（和研薬製、TWF−１型）を用いて試験し、
各プラスミドDNAの検出は、エチジウムブロマ
イド（EtBr）1μq／mlを含む0.7〜1.0％アガロー
ス（ドータイト、タイプ、同仁化学社製）上
で、上記組成のＥ−バツフアー中、80〜100V、
４〜６時間泳動後、紫外線照射により求めた。ま
た分子量マーカーとして用いたプラスミドDNA
及びその分子量は次の通りである。 pBR322 2.7×106ダルトン pBR328（ペーリンガーマンハイム社）
3.2×106ダルトン Col El DNA（宝酒造） 4.2×106ダルトン RSF1010 5.5×106ダルトン pN2DNA 6.4×106ダルトン 上記により求められた本発明pOF041の分子量
は、2.85メガダルトンであつた。 ２ 電子顕微鏡による分子量測定 山岸の方法〔1975年東京化学同人社発行「生化
学実験法」第２巻、該酸の化学、第348頁〕に
従いサンプルを作製し、対照サンプルとして
pM2DNA（分子量6.4メガダルトン）を用い、透
過型電子顕微鏡（日立Ｈ−500電子顕微鏡）で検
鏡、写真撮影し、その陽画（５〜10倍に引き伸し
たもの）よりキルビメーターを用いて長さを測定
し、対照サンプルのそれを基準として、本発明プ
ラスミドpOF041の分子量を算出した。その結果
該プラスミドは分子量約2.9メガダルトンであり、
上記１の電気泳動によるそれとほぼ一致した。 ３ 制限酵素によるプラスミドDNAの切断試験
反応液（宝酒造株式会社のマニユアルに従う）
50μlに本発明プラスミドpOF041の1μgと、これに
対し過剰量の各制限酵素溶液（いずれも宝酒造社
製のものを用いた）とを加え、37℃下１時間反応
させて、プラスミドDNAの切断試験を行なつた。
また異なる二種以上の制限酵素溶液を用いて以下
の通り二重消化試験を行なつた。即ちまず塩濃度
が低い条件で活性のある制限酵素を反応させた
後、65℃で５分間加熱処理して反応を停止させ、
次いで他方の制限酵素が反応できるよう塩濃度を
高めた後、該他方の制限酵素を加えて同様に反応
させるか或は、一方の制限酵素を用いた反応後、
フエノール処理を行ない、DNAをエタノール中
に沈殿させ、この沈殿物を他方の制限酵素が反応
できる条件に溶解後、他方の制限酵素を加えて同
様に反応させた。 上記各制限酵素による切断反応後の反応液につ
き、上記１と同様にしてアガロースゲル電気泳動
法により、切断プラスミドDNAの検出（分子量
測定）を行なつた。尚この分子量測定においては
DNA分子量マーカーとして、DNA分子量マーカ
ー（λDNAのHind消化物、ベーリンガー
マンハイム GmbH（Boehringer Mannhein
GmbH）、パイオケミカ社製）とバクテリオフア
ージ φ×174RF DNAのHae消化物（ニユー
イングランド バイオランド社製）を用いた。 上記切断試験の結果、本発明プラスミド
pOF041の各制限酵素による切断数は、下記第２
表に示す通りであつた。 第２表 制限酵素 切断数 BamH ０ Bql ０ EcoR ０ Hind ０ Hpa ０ Kpn ３ Mlu ２ Pst ０ Pvu ０ Sal １ Sma １ Xho ０ 上記表より本発明プラスミドpOR041は、Sal
、及びSmaでは１ヶ所で切断され、Mluで
は２ヶ所及びKpnでは３ヶ所で切断されること
が判る。 また上記各制限酵素の二種を適宜組み合せて行
なつた二重消化試験の結果より、本発明プラスミ
ドpOR041は、以下の制限酵素地図を示すことが
明らかにされた。 上記の通り、本発明によればストレプトミセス
エスピー OFR1290を起源として、約2.8〜
2.9Mdの大きさを有し、上記制限酵素開裂地図に
より特定される構造を有する新規なプラスミドが
確立される。 本発明により確立されたプラスミドpOF041は、
組換DNA遺伝子工学分野において、例えば所望
の遺伝子をプラスミドに組入れて組換型プラスミ
ドを作成することができ、またかかる組換型プラ
スミドを適当な宿主中に変換させる際のDNA研
究でのクローン化ベクターを提供するものとして
有用なものである。上記方法は当分野で周知であ
り、例えば本発明プラスミドはこれを制限酵素例
えばSal、Sma、Mlu等により之等制限酵
素の種類に応じて、特定の限られた位置で開裂さ
せることができ、またこの開裂により得られる綿
状DNA分子（綿状ベクター）は、同様にして開
裂された他の非ベクターDNA分子と、公知の
DNAリガーゼにより共有結合され、単一のDNA
環を形成させ得る。上記他の非ベクターDNA分
子としては、所望の遺伝子要素例えばソマトスタ
チン、インシユリン等の各種動物ホルモンや酵
素、坑生物質等の有用代謝産物をコードする遺伝
子を利用することができる。殊に本発明のプラス
ミドは、これが放線菌からの遺伝情報例えば有用
抗生物質の産生に関する情報例えば該抗生物質の
生合成経路全体の遺伝情報、該抗生物質の生合成
を調節する遺伝情報、上記生合成の速度を決定す
る酵素等についての遺伝情報等をクローン化する
のに適している。また上記で得られる所望の遺伝
子要素を含む組換型プラスミドは、該遺伝子要素
の表現のために、これを通常の法例えば代表的に
はプロトプラストを用いるトランスホーメーシヨ
ン（形質転換）技術に従い、適当な宿主生物に導
入することができ、これにより例えば有用抗生物
質産生能を具備した宿主生物が提供され、該生物
の培養により有用抗生物質の採取が可能となる。 尚本発明プラスミドpOF041は、工業技術院微
生物工業技術研究所への寄託が受付けられなかつ
たが、本発明者らにより、常に分譲可能な状態に
て保存されている。 以下本発明を更に詳しく説明するために本発明
プラスミドpOF041の製造例を実施例として挙げ
る。 実施例 １ ストレプトミセス エスピーOFR1290
（Streptomyces SP OFR1290）の胞子を20mlの
GGCY培地（ブドウ糖1.0％、グリシン0.1％、カ
ザミノ酸（デイフコ社製）0.4％、酵母エキス
（デイフコ社製）0.05％、硫酸マグネシウム・７
水塩0.1％、塩化カルシウム・２水塩0.01％、リ
ン酸二水素カリウム0.2％、リン酸一水素二ナト
リウム・12水塩0.8％、微量金属溶液（脱イオン
水100mlあたり硫酸第１鉄・７水塩0.1g、塩化マ
ンガン・４水塩0.1ｇ、硫酸亜鉛・７水塩0.1ｇ）
４ml／）の入つた100mlエルレンマイヤーフラ
スコに植菌し、30℃で２目間、回転振盪培養機
（200rpm）で培養し、これを種培養として、次
に、100mlのGGC培地（グリセロール0.4％、グリ
シン0.1％、カザミノ酸（デイフコ社製）0.4％、
硫酸マグネシウム・７水塩0.1％、塩化カルシウ
ム・２水素0.01％、リン酸二水素カリウム0.2％、
リン酸一水素二ナトリウム・12水塩0.8％、微量
金属溶液４ml／）の入つた500mlのエルレンマ
イヤーフラスコに種培養を１ml植菌し、30℃で２
日間回転振盪培養機（150rpm）で培養する。培
養後菌糸体を低速遠心（4700×ｇ、20min、４
℃）で集める。この湿菌体約１mlあたりに、10ml
の２×TES緩衝液（TES：トリス（ハイドロキ
シメチルアミノメタン）25mM、EDTA・２ナト
リウム塩25mM、NaCl25mM）に懸濁後、ポリ
トロン（Kinematica社、スイス製）でホモジナ
イズし、遠心（7200×ｇ、10min、４℃）により
菌糸体を集め、これを20mlの10mMEDTA・二ナ
トリウム塩を含む0.1Nアンモニア水に懸濁させ、
37℃で20分間放置する。その後、遠心7200×ｇ、
10min、４℃）で集菌後、19mlの２×TES緩衝液
に懸濁させ、0.25Mトリス一塩酸（PH８・０）に
20mg／mlになるように溶かしたリゾチーム溶液を
2.2ml加え、37℃で1.5時間放置する。そして10％
SDSを2.6ml加え、室温で20分間放置後、遠心
（34000×ｇ、30分、４℃）し、上清を分離する。
この上清に5M NaClを0.25容量加え０℃で一晩
放置する。遠心（10000×ｇ、20分、４℃）後、
上清を分離し、これに10mg／mlのリボヌクレアー
ゼＡを40μg／mlの濃度になる様に加え、37℃で
30分間反応後10mg／mlのプロナーゼＥを100μ
ｇ／mlの濃度になる様に加え、更に37℃で30分間
反応させる。その後ポリエチレングリコール6000
を10％の濃度になる様に加え、４℃で４時間以上
放置後、遠心（650×ｇ、20分、４℃）する。沈
殿物をTE緩衝液（10mMトリス一塩酸、1mM
EDT A2ナトリウム、PH８・０）に溶解させ、
これを塩化セシウムとエチジウムブロミドと混合
し、密度を1.57〜1.58にする。この溶液を平衡密
度勾配遠心（86000×ｇ／40h、15℃）する。遠
心後、長波長紫外線照射下で共有結合した閉環状
プラスミドDNA部分のバンドを分画し、塩化セ
シウムで飽和したイソプロパノールでエチジウム
ブロミドを除き、水相をTE緩衝液で４℃で透析
し、本質的に純粋なプラスミドpOF041を得る。
ラチン培地上） 陽性 スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天
地上） 陽性 脱脂牛乳の凝固・ペプトン化 凝固しない。 ペプトン化する。 メラニン様色素の生成（チロシン寒天培地、
ペプトン・イースト・鉄寒天培地上及びトリプ
トン・イーストエキス培地中） 陰性 硝酸塩還元作用 陽性 セルロース分解能 陰性 （） 炭素源の利用性（プリドハム・ゴドリー
ブ寒天培地上） Ｌ−アラビノース ＋ Ｄ−キシロース ＋ Ｄ−グルロース ＋ Ｄ−フラクトース ± シユクロース − イノシトール − Ｌ−ラムノース ＋＋ ラフイノース − Ｄ−マンニツト ＋ 但し＋＋はよく利用するを、＋は利用するを、±
は利用が疑わしいを、−は利用しないを示す。 （） 細胞壁中のジアミノピメリン酸 LL−ジアミノピメリン酸 以上を要約すると、本菌株OFR1290はストレ
プトミセス属に属する菌株であり、インター・ナ
シヨナル・ストレプトミセス・プロジエクト（略
称ISP）の方法によれば、胞子形成菌糸の形態は
セクシヨン スパイラルズ（Spirales）に属し、
胞子表面はとげ状乃至毛状で成熟した気菌糸の色
は、灰色系統（Cray color series）である。基
生菌糸の色は、無色（colorless）〜黄色〜淡茶
色であり、裏面の色は淡黄色〜淡茶色である。メ
ラニン様色素は産生せず、それ以外の可溶性色素
は、イースト・麦芽寒天培地乃びペプトン・イー
スト・鉄寒天培地で黄色色素が認められる程度で
ある。炭素源はＬ−ラムノース、Ｌ−アラビノー
ス、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マン
ニツトを利用し、シユークロース、イノシトー
ル、ラフイノースを利用しない。 以上の性状及びその他の諸性状を“バージー
ズ・マニユアル・オブ・デイターミネイテイブ・
バクテリオロジー（Berqey's Manual of
Determinative Bacteriology）”第８版（1974
年）、S.A.ワツクスマン（S.A.Waksman）著
“ジーアクチノミセーテス（The
Actinomycetes）”第２巻（1961年）並びにE.B.
シヤーリング（E.B.Shirting）及びD.ゴドリーブ
（D.Gottieb）によるISPの報告であるインターナ
シヨナル・ジヤーナル・オブ・システマテイツ
ク・バクテリオロジー（International Journal
of Systematic Bacteriology）第18巻第69〜189
頁（1968年）、同第18巻第279〜392頁（1968年）、
同第19巻第391〜512頁（1969年）及び同第22巻第
265〜394頁（1972年）に検索したところ該当する
公知の放射菌はなく、類縁菌としてストレプトミ
セス・ビリデイビオラセウス（Streptomyces
viridiviolaceus）〔バージーズ・マニユアル・オ
ブ・デイターミネイテイブ・バクテリオロジー等
８版、第782頁、第785頁（1974年）、インターナ
シヨナル・ジヤーナル・オブ・システマテイツ
ク・バクテリオロジー第22巻第368〜370頁（1972
年）〕が挙げられる。即ち本菌株OFR1290は胞子
形成菌糸の形態がセクシヨン スパイラルズに属
し、胞子表面がとげ状乃至毛状である点、灰色系
統の気菌糸を着生する点、メラニン様色素を産生
しない点などにおいてストレプトミセス・ビリデ
イビイオラセウスとよく類似している。しかし、
ストレプトミセス・ビリデイビオラセウスが特徴
とする赤色系の裏面及び可溶性色素を示すのに対
し、本菌株OFR1290はそれらを示さない。した
がつて、本発明者は本菌株OFR1290を新種と同
定し、ストレプトミセスエスピーOFR1290
（Streptomyces SP OFR−1290）と命名し、公
知菌株と区別することとした。該OFR1290株は
工業技術院微生物工業技術研究所に微生物菌寄第
6526号（FERMP−6526）として寄託されてい
る。 本発明方法は、上記OFR1290株又は他の本発
明プラスミドを保持する放線菌例えば該
OFR1290株の人工突然変更株等を利用して通常
の方法〔J.Antibiotics，33，88（1980）〕に準じて
実施される。即ち該方法は、基本的には、上記微
生物を適当な培地に培養し、採取した倍養菌を常
法に従い溶菌して、次いで該溶菌液中より所望の
プラスミドを通常の物理化学的手段により単離す
ることにより行なわれる。上記微生物の培養は通
常の栄養物及び添加物を含有する培地で行なわれ
る。培養基として一般に用いられる窒素源として
は、例えば大豆粉、綿実粉、コーンスチツプリカ
ー、酵母エキス、乾燥酵母、肉エキス、カゼイン
加水分解物等を例示でき、炭素源としては、例え
ばブドウ糖、グリセリン、麦芽糖、デンプン、乳
糖、糖蜜等を例示できる。また培地に添加される
添加物としては例えば炭酸カルシウム、塩化ナト
リウム、硫酸マグネシウム、リン酸等の無機塩を
例示でき、更に該培地は必要に応じて、鉄、銅、
マンガン、亜鉛等の金属の塩を微量含有していて
もよい。好ましい培地の具体例は、後記実施例に
示す通りである。培養は、上記培養基を含有する
通常の水性培地で、表面培養でも深部通気撹拌培
養でも実施できるが、深部通気撹拌培養を行うの
が好ましい。培養条件は特に限定なく、通常の放
射菌の培養条件が採用される。具体的には例えば
通常の通気条件下に、液性がPH6.0〜8.0、好まし
くはPH6.5〜7.5及び倍養温度15〜37℃、好ましく
は28〜36℃で通常２〜４日間で有利に実施でき
る。培養後の培養菌体の採取も亦常法に従い、例
えば遠心分離法等により行なわれ、該菌体の溶菌
方法も亦常法に従い、通常の各種の物理化学的手
段により行なうことができる。具体的な溶菌手段
としては、例えば、上記菌体を適当な緩衝液中で
ホモジネートした後、遠心分離して得た菌体を、
適当な緩衝液中で可溶化剤を用いて処理すること
により行なわれる。用いられる可溶化剤として
は、一般に放射菌を溶菌可溶化できることの知ら
れている各種酵素類例えば細胞壁溶解剤としての
リゾチームやプロテナーゼＫ（ベーリンガー マ
ンハイム山の内(株)）等及び各種界面活性剤例え
ば、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、トライト
ンーX100（和光純薬(株)）、ザルコシル（ソジウム
ラウリルザルコシネート）、ブリツジ58（Brij58）
（和光純薬(株)）等を例示でき、又それらを適宜に
組み合せて使用してもよい。 かくして得られる溶菌液中からの所望のプラス
ミドの単離における物理化学的手段としては、例
えば、遠心分離法（密度勾配法）、電気泳動法、
ポリエチレングリコールやエタノール等の沈殿剤
を用いた処理法等、単離する所望のプラスミドの
物理的・化学的性質に基づいた通常の分離法を適
宜組み合わせて採用すればよい。之等単離操作に
先立つて、常法に従い蛋白分解酵素やRNA分解
酵素等による酵素処理や、SDS−NaCl等による
塩析、フエノール等による抽出を行なうことがで
きる。より好ましくは上記プラスミドの単離は、
まず上記溶菌液を遠心分離して所望のプラスミド
を含む上清（クリアード ライセート）を得、こ
れを塩析法により除蛋白後、RNaseA（シグマ社
製）等のRNA分解酵素及びプロナーゼＥ（科研化
学社製）等の蛋白分解酵素処理により混在する
RNA及び蛋白を分解処理し、次いでこれに例え
ばポリエチレングリコール、エタノール等の沈殿
剤を加えて遠心分離して所望のプラスミドを沈殿
させ、これを例えばセシユームクロライドの平衡
密度勾配遠心法に付して所望のプラスミドを単離
精製することにより実施され、かくして本発明の
プラスミドpOF041を得る。この方法の詳細は後
述する実施例に示す通りである。 本発明プラスミドpOF041は、上記の通りスト
レプトミセス エスピーOFR1290から得られる
点及び下記各試験の結果よりその特徴付けがなさ
れる。 １ 電気泳動による分子量の測定 本発明プラスミドpOF041を下記組成のＥ−バ
ツフアーを用いて電気泳動させ、その分子量を次
の通り測定した。 〈Ｅ−バツフア−組成〉 トリス〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン〕 40mM 酢酸ナトリウム 20mM EDTA・2Na 2mM PH＝7.4 即ち分子量マーカーとなる既知の各種プラスミ
ドDNAを対照として用い、之等各マーカー（プ
ラスミドDNA）の移動度の対数と、それらの分
子量の対数をプロツトして、予め標準曲線を作成
しておき、同一試験により、本発明プラスミド
pOF041の移動度を求め、その対数を上記標準曲
線上にプロツトすることにより、該プラスミドの
分子量を求めた。尚すべての電気泳動は、水平型
装置（和研薬製、TWF−１型）を用いて試験し、
各プラスミドDNAの検出は、エチジウムブロマ
イド（EtBr）1μq／mlを含む0.7〜1.0％アガロー
ス（ドータイト、タイプ、同仁化学社製）上
で、上記組成のＥ−バツフアー中、80〜100V、
４〜６時間泳動後、紫外線照射により求めた。ま
た分子量マーカーとして用いたプラスミドDNA
及びその分子量は次の通りである。 pBR322 2.7×106ダルトン pBR328（ペーリンガーマンハイム社）
3.2×106ダルトン Col El DNA（宝酒造） 4.2×106ダルトン RSF1010 5.5×106ダルトン pN2DNA 6.4×106ダルトン 上記により求められた本発明pOF041の分子量
は、2.85メガダルトンであつた。 ２ 電子顕微鏡による分子量測定 山岸の方法〔1975年東京化学同人社発行「生化
学実験法」第２巻、該酸の化学、第348頁〕に
従いサンプルを作製し、対照サンプルとして
pM2DNA（分子量6.4メガダルトン）を用い、透
過型電子顕微鏡（日立Ｈ−500電子顕微鏡）で検
鏡、写真撮影し、その陽画（５〜10倍に引き伸し
たもの）よりキルビメーターを用いて長さを測定
し、対照サンプルのそれを基準として、本発明プ
ラスミドpOF041の分子量を算出した。その結果
該プラスミドは分子量約2.9メガダルトンであり、
上記１の電気泳動によるそれとほぼ一致した。 ３ 制限酵素によるプラスミドDNAの切断試験
反応液（宝酒造株式会社のマニユアルに従う）
50μlに本発明プラスミドpOF041の1μgと、これに
対し過剰量の各制限酵素溶液（いずれも宝酒造社
製のものを用いた）とを加え、37℃下１時間反応
させて、プラスミドDNAの切断試験を行なつた。
また異なる二種以上の制限酵素溶液を用いて以下
の通り二重消化試験を行なつた。即ちまず塩濃度
が低い条件で活性のある制限酵素を反応させた
後、65℃で５分間加熱処理して反応を停止させ、
次いで他方の制限酵素が反応できるよう塩濃度を
高めた後、該他方の制限酵素を加えて同様に反応
させるか或は、一方の制限酵素を用いた反応後、
フエノール処理を行ない、DNAをエタノール中
に沈殿させ、この沈殿物を他方の制限酵素が反応
できる条件に溶解後、他方の制限酵素を加えて同
様に反応させた。 上記各制限酵素による切断反応後の反応液につ
き、上記１と同様にしてアガロースゲル電気泳動
法により、切断プラスミドDNAの検出（分子量
測定）を行なつた。尚この分子量測定においては
DNA分子量マーカーとして、DNA分子量マーカ
ー（λDNAのHind消化物、ベーリンガー
マンハイム GmbH（Boehringer Mannhein
GmbH）、パイオケミカ社製）とバクテリオフア
ージ φ×174RF DNAのHae消化物（ニユー
イングランド バイオランド社製）を用いた。 上記切断試験の結果、本発明プラスミド
pOF041の各制限酵素による切断数は、下記第２
表に示す通りであつた。 第２表 制限酵素 切断数 BamH ０ Bql ０ EcoR ０ Hind ０ Hpa ０ Kpn ３ Mlu ２ Pst ０ Pvu ０ Sal １ Sma １ Xho ０ 上記表より本発明プラスミドpOR041は、Sal
、及びSmaでは１ヶ所で切断され、Mluで
は２ヶ所及びKpnでは３ヶ所で切断されること
が判る。 また上記各制限酵素の二種を適宜組み合せて行
なつた二重消化試験の結果より、本発明プラスミ
ドpOR041は、以下の制限酵素地図を示すことが
明らかにされた。 上記の通り、本発明によればストレプトミセス
エスピー OFR1290を起源として、約2.8〜
2.9Mdの大きさを有し、上記制限酵素開裂地図に
より特定される構造を有する新規なプラスミドが
確立される。 本発明により確立されたプラスミドpOF041は、
組換DNA遺伝子工学分野において、例えば所望
の遺伝子をプラスミドに組入れて組換型プラスミ
ドを作成することができ、またかかる組換型プラ
スミドを適当な宿主中に変換させる際のDNA研
究でのクローン化ベクターを提供するものとして
有用なものである。上記方法は当分野で周知であ
り、例えば本発明プラスミドはこれを制限酵素例
えばSal、Sma、Mlu等により之等制限酵
素の種類に応じて、特定の限られた位置で開裂さ
せることができ、またこの開裂により得られる綿
状DNA分子（綿状ベクター）は、同様にして開
裂された他の非ベクターDNA分子と、公知の
DNAリガーゼにより共有結合され、単一のDNA
環を形成させ得る。上記他の非ベクターDNA分
子としては、所望の遺伝子要素例えばソマトスタ
チン、インシユリン等の各種動物ホルモンや酵
素、坑生物質等の有用代謝産物をコードする遺伝
子を利用することができる。殊に本発明のプラス
ミドは、これが放線菌からの遺伝情報例えば有用
抗生物質の産生に関する情報例えば該抗生物質の
生合成経路全体の遺伝情報、該抗生物質の生合成
を調節する遺伝情報、上記生合成の速度を決定す
る酵素等についての遺伝情報等をクローン化する
のに適している。また上記で得られる所望の遺伝
子要素を含む組換型プラスミドは、該遺伝子要素
の表現のために、これを通常の法例えば代表的に
はプロトプラストを用いるトランスホーメーシヨ
ン（形質転換）技術に従い、適当な宿主生物に導
入することができ、これにより例えば有用抗生物
質産生能を具備した宿主生物が提供され、該生物
の培養により有用抗生物質の採取が可能となる。 尚本発明プラスミドpOF041は、工業技術院微
生物工業技術研究所への寄託が受付けられなかつ
たが、本発明者らにより、常に分譲可能な状態に
て保存されている。 以下本発明を更に詳しく説明するために本発明
プラスミドpOF041の製造例を実施例として挙げ
る。 実施例 １ ストレプトミセス エスピーOFR1290
（Streptomyces SP OFR1290）の胞子を20mlの
GGCY培地（ブドウ糖1.0％、グリシン0.1％、カ
ザミノ酸（デイフコ社製）0.4％、酵母エキス
（デイフコ社製）0.05％、硫酸マグネシウム・７
水塩0.1％、塩化カルシウム・２水塩0.01％、リ
ン酸二水素カリウム0.2％、リン酸一水素二ナト
リウム・12水塩0.8％、微量金属溶液（脱イオン
水100mlあたり硫酸第１鉄・７水塩0.1g、塩化マ
ンガン・４水塩0.1ｇ、硫酸亜鉛・７水塩0.1ｇ）
４ml／）の入つた100mlエルレンマイヤーフラ
スコに植菌し、30℃で２目間、回転振盪培養機
（200rpm）で培養し、これを種培養として、次
に、100mlのGGC培地（グリセロール0.4％、グリ
シン0.1％、カザミノ酸（デイフコ社製）0.4％、
硫酸マグネシウム・７水塩0.1％、塩化カルシウ
ム・２水素0.01％、リン酸二水素カリウム0.2％、
リン酸一水素二ナトリウム・12水塩0.8％、微量
金属溶液４ml／）の入つた500mlのエルレンマ
イヤーフラスコに種培養を１ml植菌し、30℃で２
日間回転振盪培養機（150rpm）で培養する。培
養後菌糸体を低速遠心（4700×ｇ、20min、４
℃）で集める。この湿菌体約１mlあたりに、10ml
の２×TES緩衝液（TES：トリス（ハイドロキ
シメチルアミノメタン）25mM、EDTA・２ナト
リウム塩25mM、NaCl25mM）に懸濁後、ポリ
トロン（Kinematica社、スイス製）でホモジナ
イズし、遠心（7200×ｇ、10min、４℃）により
菌糸体を集め、これを20mlの10mMEDTA・二ナ
トリウム塩を含む0.1Nアンモニア水に懸濁させ、
37℃で20分間放置する。その後、遠心7200×ｇ、
10min、４℃）で集菌後、19mlの２×TES緩衝液
に懸濁させ、0.25Mトリス一塩酸（PH８・０）に
20mg／mlになるように溶かしたリゾチーム溶液を
2.2ml加え、37℃で1.5時間放置する。そして10％
SDSを2.6ml加え、室温で20分間放置後、遠心
（34000×ｇ、30分、４℃）し、上清を分離する。
この上清に5M NaClを0.25容量加え０℃で一晩
放置する。遠心（10000×ｇ、20分、４℃）後、
上清を分離し、これに10mg／mlのリボヌクレアー
ゼＡを40μg／mlの濃度になる様に加え、37℃で
30分間反応後10mg／mlのプロナーゼＥを100μ
ｇ／mlの濃度になる様に加え、更に37℃で30分間
反応させる。その後ポリエチレングリコール6000
を10％の濃度になる様に加え、４℃で４時間以上
放置後、遠心（650×ｇ、20分、４℃）する。沈
殿物をTE緩衝液（10mMトリス一塩酸、1mM
EDT A2ナトリウム、PH８・０）に溶解させ、
これを塩化セシウムとエチジウムブロミドと混合
し、密度を1.57〜1.58にする。この溶液を平衡密
度勾配遠心（86000×ｇ／40h、15℃）する。遠
心後、長波長紫外線照射下で共有結合した閉環状
プラスミドDNA部分のバンドを分画し、塩化セ
シウムで飽和したイソプロパノールでエチジウム
ブロミドを除き、水相をTE緩衝液で４℃で透析
し、本質的に純粋なプラスミドpOF041を得る。
Claims (1)
- １ 放射菌起源のプラスミドであつて、分子量約
2.8〜2.9メガダルトンであり、次の制限酵素開裂
地図を有することを特徴とするプラスミド
pOF041。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57186285A JPS5974990A (ja) | 1982-10-22 | 1982-10-22 | プラスミドｐＯＦ０４１ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57186285A JPS5974990A (ja) | 1982-10-22 | 1982-10-22 | プラスミドｐＯＦ０４１ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5974990A JPS5974990A (ja) | 1984-04-27 |
| JPH0321153B2 true JPH0321153B2 (ja) | 1991-03-22 |
Family
ID=16185625
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57186285A Granted JPS5974990A (ja) | 1982-10-22 | 1982-10-22 | プラスミドｐＯＦ０４１ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5974990A (ja) |
-
1982
- 1982-10-22 JP JP57186285A patent/JPS5974990A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5974990A (ja) | 1984-04-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH028714B2 (ja) | ||
| CA1170202A (en) | Process for cloning the gene coding for a thermostable alpha-amylase into escherichia coli and bacillus subtilis | |
| US5888786A (en) | Method for producing 2-keto-L-gulonic acid | |
| JP2729628B2 (ja) | 巨大菌からのグルコース・デヒドロゲナーゼの調製方法 | |
| JPH084515B2 (ja) | 有機化合物の製造方法 | |
| JPS6037989A (ja) | ペニシリンアシラーゼの増産方法に用いるプラスミド | |
| JP2577876B2 (ja) | 遺伝子的に修飾された生物体を用いるビタミンｃ先駆体の製造に係る酵素、およびその製造方法 | |
| JP2886547B2 (ja) | ノイラミニダーゼの製造法 | |
| EP0213898B1 (en) | A host-vector system | |
| US4517300A (en) | Plasmid pSAN 181 | |
| JPH0321153B2 (ja) | ||
| JP3850557B2 (ja) | 新規遺伝子及びその遺伝子を保有する形質転換細胞 | |
| JP2960775B2 (ja) | ノカルジオフォーム微生物由来のｄｎａ配列の発現 | |
| JPH0321152B2 (ja) | ||
| JP2672551B2 (ja) | チトクロームｐ−４５０遺伝子を含有するｄｎａ | |
| US4478937A (en) | Plasmid and production thereof | |
| EP0038156A2 (en) | A plasmid and its microbiological preparation | |
| GB2045253A (en) | A plasmid and its microbiological preparation | |
| JP3829950B2 (ja) | 新規なクレアチニンアミドヒドロラーゼ | |
| JPH05130876A (ja) | プラスミドベクター | |
| JP3396740B2 (ja) | ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子 | |
| SU908793A1 (ru) | Штамм еSснеRIснIа coLI в834 ( @ , @ ),несущий плазмиду RSF 2124,-тест субстрат дл рестрикционной эндонуклеазы ecoR11 | |
| JP2588707B2 (ja) | サルコシン・オキシダーゼの製造法 | |
| JPH0113359B2 (ja) | ||
| JP2001252088A (ja) | クレアチンアミジノヒドロラーゼをコードする遺伝子 |