JPH0321342A - ウイルス及び細胞の吸着分離剤並びにこれを用いたウイルス及び細胞の分離方法 - Google Patents
ウイルス及び細胞の吸着分離剤並びにこれを用いたウイルス及び細胞の分離方法Info
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- JPH0321342A JPH0321342A JP1156195A JP15619589A JPH0321342A JP H0321342 A JPH0321342 A JP H0321342A JP 1156195 A JP1156195 A JP 1156195A JP 15619589 A JP15619589 A JP 15619589A JP H0321342 A JPH0321342 A JP H0321342A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
「利用分野」
本発明は、ウィルス及び動植物細胞の吸着分離剤並びに
これを用いたウィルス及び動植物細胞の分離方法に関す
る。
これを用いたウィルス及び動植物細胞の分離方法に関す
る。
「従来技術及びその問題点」
インフルエンザ等をはじめとするウィルス性疾患の予防
及び治療は、古くから医療分野における重要な課題とさ
れてきた。特に、近年、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤ
Ｓ）ウィルス感染者の急増などが話題になるに到り、そ
の必要性が更に重要視されるようになってきた。現在ま
でに、主に血液中のＢ型肝炎ウィルスを対象に高分子膜
・中空糸あるいはイオン交換樹脂により分離除去する方
法が提案されている。しかしながら、これらは、分離シ
ステム上、複雑であるばかりでなく、高価な装置になっ
てしまい、実用化までには到っていない。
及び治療は、古くから医療分野における重要な課題とさ
れてきた。特に、近年、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤ
Ｓ）ウィルス感染者の急増などが話題になるに到り、そ
の必要性が更に重要視されるようになってきた。現在ま
でに、主に血液中のＢ型肝炎ウィルスを対象に高分子膜
・中空糸あるいはイオン交換樹脂により分離除去する方
法が提案されている。しかしながら、これらは、分離シ
ステム上、複雑であるばかりでなく、高価な装置になっ
てしまい、実用化までには到っていない。
近年、リン酸カルシウム系化合物は、その優れた生体親
和性により人工骨、人工歯根などの生体材料として応用
研究が盛んに行われている。また、蛋白質などの生体高
分子を分離精製するための液体クロマトグラフィー用充
填剤として以前から使用されており、最近の技術の進歩
により高性能の充填剤も開発され、分析用としても使用
されるようになってきた． 更に、最近では、特開昭６１−２３５７５２号公報など
に示されているように細胞に対する特異的吸着能が見出
され、免疫学的応用も検討されつつある。しかしながら
、この公報には、細胞分離剤としてリン酸カルシウム系
顆粒が持つべき微細構造について検討されておらず、操
作時間は短縮されたものの保水性に問題があり、分離性
能はなお改善の余地を残している。
和性により人工骨、人工歯根などの生体材料として応用
研究が盛んに行われている。また、蛋白質などの生体高
分子を分離精製するための液体クロマトグラフィー用充
填剤として以前から使用されており、最近の技術の進歩
により高性能の充填剤も開発され、分析用としても使用
されるようになってきた． 更に、最近では、特開昭６１−２３５７５２号公報など
に示されているように細胞に対する特異的吸着能が見出
され、免疫学的応用も検討されつつある。しかしながら
、この公報には、細胞分離剤としてリン酸カルシウム系
顆粒が持つべき微細構造について検討されておらず、操
作時間は短縮されたものの保水性に問題があり、分離性
能はなお改善の余地を残している。
また、特開昭６３−２８４号公報には、繊維状アパタイ
トにより保水性を向上させ、分離性能を向上させたこと
が記載されているが、この公報に記載されているものに
限らず、繊維状のものはカラム等の分離器に均一に充填
することが困難であり、また、ロフトによりバラツキが
大きく、顆粒状のものに比べて性能が安定しにくいとい
う欠点を持っている。
トにより保水性を向上させ、分離性能を向上させたこと
が記載されているが、この公報に記載されているものに
限らず、繊維状のものはカラム等の分離器に均一に充填
することが困難であり、また、ロフトによりバラツキが
大きく、顆粒状のものに比べて性能が安定しにくいとい
う欠点を持っている。
一方、特開昭６３−１６０４５号公報には、液体クロマ
トグラフィー用充填材としてのリン酸カルシウム系多孔
質顆粒が開示されているが、ウィルスあるいは細胞の吸
着分離剤として有効であるための微細気孔構造について
検討がなされていない． 「発明の目的」 本発明の目的は、リン酸カルシウム系化合物の持つ細胞
に対す為吸着能を向上させ、より高い分離吸着性能及び
充分な保水性を有し、しかも安定性に優れた微細祷造を
有するウィルス及び細胞の吸着分離剤並びにこれを用い
た分離方法を提供することにある。
トグラフィー用充填材としてのリン酸カルシウム系多孔
質顆粒が開示されているが、ウィルスあるいは細胞の吸
着分離剤として有効であるための微細気孔構造について
検討がなされていない． 「発明の目的」 本発明の目的は、リン酸カルシウム系化合物の持つ細胞
に対す為吸着能を向上させ、より高い分離吸着性能及び
充分な保水性を有し、しかも安定性に優れた微細祷造を
有するウィルス及び細胞の吸着分離剤並びにこれを用い
た分離方法を提供することにある。
「発明の構成」
本発明のウィルス及び細胞の吸着分離剤は、平均孔径２
０〜５ ０ ０ ｎｍの連続微細気孔と平均孔径１〜５
０μｍの連続小気孔の２種類の連続気孔構造を有するリ
ン酸カルシウム系多孔質顆粒であることを特徴とする。
０〜５ ０ ０ ｎｍの連続微細気孔と平均孔径１〜５
０μｍの連続小気孔の２種類の連続気孔構造を有するリ
ン酸カルシウム系多孔質顆粒であることを特徴とする。
本発明の吸着分離剤は、上記のように２種類の連続気孔
構造を有する多孔質顆粒である。顆粒状の吸着分離剤に
ウィルスを吸着させるには、通過経路を長くするために
顆粒を多孔質にする必要がある。ウィルスの大きさは、
その種類によって異なるが、一般に２０〜３００ｎｍの
範囲の径を持っている。したがって、ウィルスが通過す
るための気孔径は２０ｎｍ以上である必要がある。また
、この気孔がウィルスよりあまり大きすぎても吸着の機
会を減少するだけで、無意味となるため、気孔径は５０
０ｎｍ以下であればよい。一方、この顆粒に充分な保水
性を持たせるためには、ウィルスや細胞の浮遊液が比較
的浸透しやすい１〜５０μｍの連続小気孔が必要である
。
構造を有する多孔質顆粒である。顆粒状の吸着分離剤に
ウィルスを吸着させるには、通過経路を長くするために
顆粒を多孔質にする必要がある。ウィルスの大きさは、
その種類によって異なるが、一般に２０〜３００ｎｍの
範囲の径を持っている。したがって、ウィルスが通過す
るための気孔径は２０ｎｍ以上である必要がある。また
、この気孔がウィルスよりあまり大きすぎても吸着の機
会を減少するだけで、無意味となるため、気孔径は５０
０ｎｍ以下であればよい。一方、この顆粒に充分な保水
性を持たせるためには、ウィルスや細胞の浮遊液が比較
的浸透しやすい１〜５０μｍの連続小気孔が必要である
。
本発明の吸着分離剤においては、顆粒が上記のような２
種類の気孔構造を有すると共に、１０〜７５％の気孔率
を有することが好ましい。顆粒の気孔率は、保水性と大
きく関係し、１０％未満では、ウィルスや細胞の吸着に
必要な保水性が得られず、７５％を超えると、顆粒自体
の強度を保持できなくなる． 更に、本発明の吸着分離剤は、平均粒径１０〜２０００
μｍの顆粒であるのが好ましい。細胞の分離用としては
、１００μｍ以上あれば、顆粒の間隙を細胞が通過でき
る。しかし、２０００μｍを超えると、間隙が大きくな
りすぎ、細胞を吸着できなくなる。また、ウィルスの分
離用としては１μｍ以上の粒径であれば良いが、実用上
は１０μｍ以上の粒径であることが好ましい。
種類の気孔構造を有すると共に、１０〜７５％の気孔率
を有することが好ましい。顆粒の気孔率は、保水性と大
きく関係し、１０％未満では、ウィルスや細胞の吸着に
必要な保水性が得られず、７５％を超えると、顆粒自体
の強度を保持できなくなる． 更に、本発明の吸着分離剤は、平均粒径１０〜２０００
μｍの顆粒であるのが好ましい。細胞の分離用としては
、１００μｍ以上あれば、顆粒の間隙を細胞が通過でき
る。しかし、２０００μｍを超えると、間隙が大きくな
りすぎ、細胞を吸着できなくなる。また、ウィルスの分
離用としては１μｍ以上の粒径であれば良いが、実用上
は１０μｍ以上の粒径であることが好ましい。
上記のような２種類の気孔構造を有するリン酸カルシウ
ム系多孔質顆粒は、公知の方法で湿式合威したリン酸カ
ルシウム系化合物の結晶粒子を原料として様々な方法で
製造することができる。例えば、この原料粒子を懸濁し
たスラリーを直接噴霧乾燥などにより二次粒子に造粒す
るか、あるいはこのスラリーに粘度調整剤、熱分解性有
機化合物粒子又は繊維等の添加物を加えて噴霧乾燥など
により二次粒子に造粒する。この二次粒子を再びスラリ
ー状に懸濁して湿式或形するか又は加圧による乾式或形
等によりブロック体に戒形する。その際、焼威により熱
分解してｌ〜５０μｍの気孔を形威するための有機化合
物を添加してもよい．無添加でも、焼成温度など、他の
条件を調節することにより気．孔径を制御することもで
きる．得られたブロック体を５００゜Ｃ〜１３００℃の
温度範囲で焼戒する，５００’Ｃ未満では、有機化合物
の熱分解やブロック体の焼結が充分に行われない．また
、焼或を１３００℃を超える高温で行うと、焼結体が緻
密化しすぎたり、リン酸カルシウムが分解を起こすおそ
れがある。
ム系多孔質顆粒は、公知の方法で湿式合威したリン酸カ
ルシウム系化合物の結晶粒子を原料として様々な方法で
製造することができる。例えば、この原料粒子を懸濁し
たスラリーを直接噴霧乾燥などにより二次粒子に造粒す
るか、あるいはこのスラリーに粘度調整剤、熱分解性有
機化合物粒子又は繊維等の添加物を加えて噴霧乾燥など
により二次粒子に造粒する。この二次粒子を再びスラリ
ー状に懸濁して湿式或形するか又は加圧による乾式或形
等によりブロック体に戒形する。その際、焼威により熱
分解してｌ〜５０μｍの気孔を形威するための有機化合
物を添加してもよい．無添加でも、焼成温度など、他の
条件を調節することにより気．孔径を制御することもで
きる．得られたブロック体を５００゜Ｃ〜１３００℃の
温度範囲で焼戒する，５００’Ｃ未満では、有機化合物
の熱分解やブロック体の焼結が充分に行われない．また
、焼或を１３００℃を超える高温で行うと、焼結体が緻
密化しすぎたり、リン酸カルシウムが分解を起こすおそ
れがある。
このように焼成したブロック体を粉砕後、分級して必要
な粒径の顆粒を得ることができる．この顆粒の２０〜５
０ ０ ｎｍの微細気孔は、二次粒子造粒用の原料ス
ラリー中の結晶粒子の大きさ、スラリ一の粘度、添加物
などを適切に調節することによって調整することができ
る。また、１〜５０μｍの小気孔は、前記のように二次
粒子からブロック体戒形時に戒形方法や添加物を適切に
選択することによって調整することができる。
な粒径の顆粒を得ることができる．この顆粒の２０〜５
０ ０ ｎｍの微細気孔は、二次粒子造粒用の原料ス
ラリー中の結晶粒子の大きさ、スラリ一の粘度、添加物
などを適切に調節することによって調整することができ
る。また、１〜５０μｍの小気孔は、前記のように二次
粒子からブロック体戒形時に戒形方法や添加物を適切に
選択することによって調整することができる。
本発明の吸着分離剤に用いるリン酸カルシウムとしては
、Ｃａ／Ｐ比が１． ４〜１． ８のものであれば各種
のものを使用することができるが、焼結性や顆粒の強度
を考慮すると、１． ５〜１．６７であることが好まし
い。さらに具体的には、ハイドロキシアパタイト、フッ
素アバタイト等の各種のアバタイト、α一及びβ−リン
酸三カルシウム、リン酸四カルシウム並びにこれらの２
種以上の混合物を使用することができる。
、Ｃａ／Ｐ比が１． ４〜１． ８のものであれば各種
のものを使用することができるが、焼結性や顆粒の強度
を考慮すると、１． ５〜１．６７であることが好まし
い。さらに具体的には、ハイドロキシアパタイト、フッ
素アバタイト等の各種のアバタイト、α一及びβ−リン
酸三カルシウム、リン酸四カルシウム並びにこれらの２
種以上の混合物を使用することができる。
本発明の吸着分離剤において、上記のようなリン酸カル
シウム系多孔質顆粒の表面に、例えば生体由来のヒアル
ロン酸、コンドロイチン硫酸、キチン誘導体、フィブロ
ネクチン、オステオネクチンなどの多ｔＪＭ［、ムコ多
＃Ｍ類及び蛋白質並びにそれらの誘導体のうちの１種以
上を部分吸着させ、顆粒表面の物理化学的性質あるいは
免疫学的性質を変調して対象細胞群のそれぞれに対する
吸着活性を巧妙に変化させることもできる。これによっ
て、カラムの分離特性を効果的に変化させ、シャープな
溶出パターンを与える分離特性や、分離スペクトルの制
御を行うことができる。さらに、細胞のサブボピュレー
ションの各々に対する吸着効果が変調されて、特定のサ
ブボビュレーションを選択分離することも可能である． 本発明の吸着分離剤は、ウィルス及び特定の動植物細胞
を吸着する。したがって、本発明は、この吸着分離剤を
用いて生物学的液体からウィルス及び細胞を分離する方
法を提供するものである。
シウム系多孔質顆粒の表面に、例えば生体由来のヒアル
ロン酸、コンドロイチン硫酸、キチン誘導体、フィブロ
ネクチン、オステオネクチンなどの多ｔＪＭ［、ムコ多
＃Ｍ類及び蛋白質並びにそれらの誘導体のうちの１種以
上を部分吸着させ、顆粒表面の物理化学的性質あるいは
免疫学的性質を変調して対象細胞群のそれぞれに対する
吸着活性を巧妙に変化させることもできる。これによっ
て、カラムの分離特性を効果的に変化させ、シャープな
溶出パターンを与える分離特性や、分離スペクトルの制
御を行うことができる。さらに、細胞のサブボピュレー
ションの各々に対する吸着効果が変調されて、特定のサ
ブボビュレーションを選択分離することも可能である． 本発明の吸着分離剤は、ウィルス及び特定の動植物細胞
を吸着する。したがって、本発明は、この吸着分離剤を
用いて生物学的液体からウィルス及び細胞を分離する方
法を提供するものである。
生物学的液体としては、血液、血清、尿、唾液あるいは
細胞及び／又はウィルスの浮遊液が挙げられる。本発明
の分離方法は、生物学的液体中のウィルスの除去、特定
細胞の回収、例えば全血又はリンパ細胞からＴ細胞の回
収などに利用することができる。全血を対象とする場合
には、採血時にヘパリン、クエン酸などの血液凝固阻止
剤を添加し、培養液で１〜１０倍に希釈して用いるのが
好ましい．希釈液を用いると、血液の粘性が低下するの
で、分離が促進される。しかし、１０倍を超えて希釈す
ると、取り扱い量が多くなり、不都合である． 本発明の吸着分離剤を用いてウィルスあるいは細胞の分
離を行うには、カラム等の分離器にガラスウールなどを
液体の出口側に詰めて吸着分離剤の流出を防止した後、
吸着分離剤を充填し、洗浄後、生物学的液体を流し、こ
の仕物学的液体を充分に浸透させた後、洗浄液を流し、
非吸着仕の細胞を洗い流し、回収すればよい。
細胞及び／又はウィルスの浮遊液が挙げられる。本発明
の分離方法は、生物学的液体中のウィルスの除去、特定
細胞の回収、例えば全血又はリンパ細胞からＴ細胞の回
収などに利用することができる。全血を対象とする場合
には、採血時にヘパリン、クエン酸などの血液凝固阻止
剤を添加し、培養液で１〜１０倍に希釈して用いるのが
好ましい．希釈液を用いると、血液の粘性が低下するの
で、分離が促進される。しかし、１０倍を超えて希釈す
ると、取り扱い量が多くなり、不都合である． 本発明の吸着分離剤を用いてウィルスあるいは細胞の分
離を行うには、カラム等の分離器にガラスウールなどを
液体の出口側に詰めて吸着分離剤の流出を防止した後、
吸着分離剤を充填し、洗浄後、生物学的液体を流し、こ
の仕物学的液体を充分に浸透させた後、洗浄液を流し、
非吸着仕の細胞を洗い流し、回収すればよい。
浮遊液、希釈用培養液又は洗浄液としては、含まれるウ
ィルスあるいは細胞に応じて適宜選択することができる
が、例えば生理食塩水、ハンクス培地（ＨＢＳＳ）、血
清培地（例えばＲＰＭＩ−１６４０）、無血清培地など
を用いることができる。
ィルスあるいは細胞に応じて適宜選択することができる
が、例えば生理食塩水、ハンクス培地（ＨＢＳＳ）、血
清培地（例えばＲＰＭＩ−１６４０）、無血清培地など
を用いることができる。
また、ＴＩＩ胞などのように有用細胞の分離を行う場合
には、含まれる細胞に障害を与えないように室温〜３７
゜Ｃ程度の温度で分離操作を行うのが好ましい。このよ
うにして回収されたＴ細胞は、生存率、抗体産生調節機
能などの性質において分離操作前と実質的に同一であっ
た。
には、含まれる細胞に障害を与えないように室温〜３７
゜Ｃ程度の温度で分離操作を行うのが好ましい。このよ
うにして回収されたＴ細胞は、生存率、抗体産生調節機
能などの性質において分離操作前と実質的に同一であっ
た。
「発明の実施例」
次に、実施例に基づいて本発明をさらに詳しく説明する
が、本発明はこれに限定されるものではない。
が、本発明はこれに限定されるものではない。
なお、下記の実施例及び比較例においては、インフルエ
ンザウィルスＰＲ８を生理食塩水中に浮遊させて用いた
。また、力価の測定は、下記の方法で行った． 力価の測定方法 インフルエンザウィルスが赤血球に付着すると、この赤
血球同士が凝集を起こす．この反応を利用して、ウィル
ス浮遊液を生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液
）で２倍、４倍、８倍、ｌ６倍、・・・と２倍段階希釈
した液と、同量の０． ４％ニワトリ赤血球浮遊液とを
混合して何倍希釈液まで凝集反応を起こすかによって原
液（希釈前の液）の力価（ｔｉｔｅｒ）を評価する． 実施例Ｉ Ｃａ／Ｐ比１．６７のハイドロキシアパタイトをＩ２０
０℃で焼成し、気孔率２０％、粒径３００〜６００ａｍ
の顆粒を製造した。この顆粒の平均微細気孔径は２０ｎ
ｍ、平均小気孔径は２μｍであった． 内容積６ｄのシリンジにガラスウール０． ０ ３ ｇ
をほぼｌｍ１になるように詰め、その上に上記の顆粒１
ｇを充填した．こうして調製したカラムにインフルエン
ザウィルスＰＲ８の浮遊液を流し、カラム通過後のウィ
ルス浮遊液の力価を下記の方法で測定した．結果を第１
表に示す． 実施例２ 顆粒の粒径が１００〜３００μｍである以外は実施例ｌ
と同様の顆粒を用い、実施例１と同様に操作し、カラム
通過後のウィルス浮遊液の力価を測定し、結果を第１表
に示す。
ンザウィルスＰＲ８を生理食塩水中に浮遊させて用いた
。また、力価の測定は、下記の方法で行った． 力価の測定方法 インフルエンザウィルスが赤血球に付着すると、この赤
血球同士が凝集を起こす．この反応を利用して、ウィル
ス浮遊液を生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液
）で２倍、４倍、８倍、ｌ６倍、・・・と２倍段階希釈
した液と、同量の０． ４％ニワトリ赤血球浮遊液とを
混合して何倍希釈液まで凝集反応を起こすかによって原
液（希釈前の液）の力価（ｔｉｔｅｒ）を評価する． 実施例Ｉ Ｃａ／Ｐ比１．６７のハイドロキシアパタイトをＩ２０
０℃で焼成し、気孔率２０％、粒径３００〜６００ａｍ
の顆粒を製造した。この顆粒の平均微細気孔径は２０ｎ
ｍ、平均小気孔径は２μｍであった． 内容積６ｄのシリンジにガラスウール０． ０ ３ ｇ
をほぼｌｍ１になるように詰め、その上に上記の顆粒１
ｇを充填した．こうして調製したカラムにインフルエン
ザウィルスＰＲ８の浮遊液を流し、カラム通過後のウィ
ルス浮遊液の力価を下記の方法で測定した．結果を第１
表に示す． 実施例２ 顆粒の粒径が１００〜３００μｍである以外は実施例ｌ
と同様の顆粒を用い、実施例１と同様に操作し、カラム
通過後のウィルス浮遊液の力価を測定し、結果を第１表
に示す。
実施例３
実施例２と同じ顆粒を３ｇ使用した以外は、実施例Ｉと
同様にしてカラム通過後のウィルス浮遊液の力価を測定
し、結果を第１表に示す。
同様にしてカラム通過後のウィルス浮遊液の力価を測定
し、結果を第１表に示す。
実施例４
Ｃａ／Ｐ比１．６７のハイドロキシアパタイトを９００
゜Ｃで焼成し、気孔率４５％、粒径１００〜３００μｍ
の顆粒を製造した。この顆粒の平均微細気孔径は５０ｎ
ｍ，平均小気孔径は４μｍであった。
゜Ｃで焼成し、気孔率４５％、粒径１００〜３００μｍ
の顆粒を製造した。この顆粒の平均微細気孔径は５０ｎ
ｍ，平均小気孔径は４μｍであった。
得られた顆粒１ｇを使用して実施例１と同じ操作を行い
、カラム通過後のウィルス浮遊液の力価を測定し、結果
を第１表に示す。
、カラム通過後のウィルス浮遊液の力価を測定し、結果
を第１表に示す。
実施例５
Ｃａ／Ｐ比１．６７のハイドロキシアパタイトを７００
゜Ｃで焼成し、気孔率６０％、粒径１００〜３００μｍ
の顆粒を製造した。この顆粒の平均微細気孔径は１００
ｎｍ，平均小気孔径は６μｍであった。
゜Ｃで焼成し、気孔率６０％、粒径１００〜３００μｍ
の顆粒を製造した。この顆粒の平均微細気孔径は１００
ｎｍ，平均小気孔径は６μｍであった。
得られた顆粒１ｇを使用して実施例ｌと同じ操作を行い
、カラム通過後のウィルス浮遊液の力価を測定し、結果
を第１表に示す。
、カラム通過後のウィルス浮遊液の力価を測定し、結果
を第１表に示す。
実施例６
実施例５と同じ顆粒を２ｇ使用して実施例１と同じ操作
を行い、カラム通過後のウィルス浮遊液の力価を測定し
、結果を第１表に示す。
を行い、カラム通過後のウィルス浮遊液の力価を測定し
、結果を第１表に示す。
実施例７
Ｃａ／Ｐ比１．５のリン酸カルシウムを１１００゜Ｃで
焼威し、気孔率３０％、粒径１００〜３００μｍの顆粒
を製造した。この顆粒の平均微細気孔径は３００ｎｍ、
平均小気孔径は８μｍであった。
焼威し、気孔率３０％、粒径１００〜３００μｍの顆粒
を製造した。この顆粒の平均微細気孔径は３００ｎｍ、
平均小気孔径は８μｍであった。
得られた顆粒１ｇを使用して実施例１と同じ操作を行い
、カラム通過後のウィルス浮遊液の力価を測定し、結果
を第１表に示す。
、カラム通過後のウィルス浮遊液の力価を測定し、結果
を第１表に示す。
実施例８
Ｃａ／Ｐ比１． ５のリン酸カルシウムを７００゜Ｃで
焼威し、気孔率６０％、粒径１００〜３００μｍの顆粒
を製造した。この顆粒の平均微細気孔径はｌｏｏｎｍ、
平均小気孔径は１０μｍであった。
焼威し、気孔率６０％、粒径１００〜３００μｍの顆粒
を製造した。この顆粒の平均微細気孔径はｌｏｏｎｍ、
平均小気孔径は１０μｍであった。
得られた顆粒１ｇを使用して実施例Ｉと同じ操作を行い
、カラム通過後のウィルス浮遊液の力価を測定し、結果
を第１表に示す． 実施例９ 実施例８と同じ顆粒を２ｇ使用して実施例１と同じ操作
を行い、カラム通過後のウィルス浮遊液の力価を測定し
、結果を第ｌ表に示す。
、カラム通過後のウィルス浮遊液の力価を測定し、結果
を第１表に示す． 実施例９ 実施例８と同じ顆粒を２ｇ使用して実施例１と同じ操作
を行い、カラム通過後のウィルス浮遊液の力価を測定し
、結果を第ｌ表に示す。
実施例１０
Ｃａ／Ｐ比ｌ．５７のリン酸カルシウムを１１００℃で
焼威し、気孔率２５％、粒径１００〜３００μｍの顆粒
を製造した。この顆粒の平均微細気孔径は５０ｎｍ、平
均小気孔径は３ｐｍであった．得られた顆粒１ｇを使用
して実施例ｌと同じ操作を行い、カラム通過後のウィル
ス浮遊液の力価を測定し、結果を第１表に示す． 比較例Ｉ Ｃａ／Ｐ比が１．６７のリン酸カルシウムを７００℃で
焼威して得た、平均孔径５０ｎｍの微細気孔のみを有し
、気孔率が５０％、粒径が１００〜３００，ｕｍの顆粒
１ｇを使用して実施例ｌと同じ操作を行い、カラム通過
後のウィルス浮遊液の力価を測定し、結果を第ｌ表に示
す。
焼威し、気孔率２５％、粒径１００〜３００μｍの顆粒
を製造した。この顆粒の平均微細気孔径は５０ｎｍ、平
均小気孔径は３ｐｍであった．得られた顆粒１ｇを使用
して実施例ｌと同じ操作を行い、カラム通過後のウィル
ス浮遊液の力価を測定し、結果を第１表に示す． 比較例Ｉ Ｃａ／Ｐ比が１．６７のリン酸カルシウムを７００℃で
焼威して得た、平均孔径５０ｎｍの微細気孔のみを有し
、気孔率が５０％、粒径が１００〜３００，ｕｍの顆粒
１ｇを使用して実施例ｌと同じ操作を行い、カラム通過
後のウィルス浮遊液の力価を測定し、結果を第ｌ表に示
す。
比較例２
比較例ｌと同じ顆粒を２ｇ使用した以外は、比較例ｌと
同様に操作し、カラム通過後のウィルス浮遊液の力価を
測定し、結果を第１表に示す。
同様に操作し、カラム通過後のウィルス浮遊液の力価を
測定し、結果を第１表に示す。
第１表
表に示した力価は、流出液中のインフルエンザウィルス
の単位体積中の濃度に比例している．したがって、実施
例中最もｒＩｉ．ｔｌの悪かった実施例ｌでも、比較例
ｌ及び２と比べると、ウィルスが半分に減少している．
しかも、実施例６及び９では全ウィルスがほぼ完全に吸
着されて流出せず、本発明のリン酸カルシウム顆粒の吸
着性能の高さを示している。また、実施例５、６、８及
び９から本発明による顆粒は、その量を増加することに
より吸着量も上昇することが可能である．これに対して
、比較例２では、比較例１の２倍の顆粒を使用している
にもかかわらず吸着量は向上していない。
の単位体積中の濃度に比例している．したがって、実施
例中最もｒＩｉ．ｔｌの悪かった実施例ｌでも、比較例
ｌ及び２と比べると、ウィルスが半分に減少している．
しかも、実施例６及び９では全ウィルスがほぼ完全に吸
着されて流出せず、本発明のリン酸カルシウム顆粒の吸
着性能の高さを示している。また、実施例５、６、８及
び９から本発明による顆粒は、その量を増加することに
より吸着量も上昇することが可能である．これに対して
、比較例２では、比較例１の２倍の顆粒を使用している
にもかかわらず吸着量は向上していない。
実施例１１
内容積６ｄのシリンジにガラスウール０． ０ ３ ｇ
をほぼｌＩＩｉになるように詰め、その上に実施例１で
製造した顆粒１ｇを充填した。こうして調製したカラム
にヒト末梢血リンパ細胞５Ｘ１０”個を浮遊させたハン
クス培地０． ２ ｄを流し、この浮遊液が顆粒に充分
浸透した後、３ＩＩＩ１のハンクス培地を流して非吸着
細胞を流出させて回収した。この回収した細胞に蛍光標
識抗体、抗Ｌｅｕ ４と抗Ｌｅｕｌ２をラベルした後、
Ｆ Ａ Ｃ Ｓ （ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｃｔｉ
ｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）を用いてＴ細胞
及びＢ細胞の陽性率を調べた．結果を第２表に示した。
をほぼｌＩＩｉになるように詰め、その上に実施例１で
製造した顆粒１ｇを充填した。こうして調製したカラム
にヒト末梢血リンパ細胞５Ｘ１０”個を浮遊させたハン
クス培地０． ２ ｄを流し、この浮遊液が顆粒に充分
浸透した後、３ＩＩＩ１のハンクス培地を流して非吸着
細胞を流出させて回収した。この回収した細胞に蛍光標
識抗体、抗Ｌｅｕ ４と抗Ｌｅｕｌ２をラベルした後、
Ｆ Ａ Ｃ Ｓ （ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｃｔｉ
ｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）を用いてＴ細胞
及びＢ細胞の陽性率を調べた．結果を第２表に示した。
実施例１２
Ｃａ／Ｐ比１．６７のハイドロキシアパクィトを９００
″Ｃで焼成し、気孔率４５％、粒径３００〜６００μｍ
の顆粒を製造した．この顆粒の平均微細気孔径は５０ｎ
ｍ、平均小気孔径は４μｍであった． この顆粒１ｇを用いて実施例１ｌと同様に操作してＴ細
胞及びＢ細胞の陽性率を調べた。結果を第２表に示した
． 実施例１３ Ｃａ／Ｐ比ｌ．６７のハイドロキシアパタイトを７００
゜Ｃで焼威し、気孔率６０％、粒径３００〜６００μｍ
の顆粒を製造した。この顆粒の平均微細気孔径はｌ００
ｎｍ、平均小気孔径は６μｍであった． この顆粒１ｇを用いて実施例１１と同様に操作してＴ細
胞及びＢ細胞の陽性率を調べた。結果を第２表に示した
。
″Ｃで焼成し、気孔率４５％、粒径３００〜６００μｍ
の顆粒を製造した．この顆粒の平均微細気孔径は５０ｎ
ｍ、平均小気孔径は４μｍであった． この顆粒１ｇを用いて実施例１ｌと同様に操作してＴ細
胞及びＢ細胞の陽性率を調べた。結果を第２表に示した
． 実施例１３ Ｃａ／Ｐ比ｌ．６７のハイドロキシアパタイトを７００
゜Ｃで焼威し、気孔率６０％、粒径３００〜６００μｍ
の顆粒を製造した。この顆粒の平均微細気孔径はｌ００
ｎｍ、平均小気孔径は６μｍであった． この顆粒１ｇを用いて実施例１１と同様に操作してＴ細
胞及びＢ細胞の陽性率を調べた。結果を第２表に示した
。
比較例３
Ｃａ／ Ｐ 比１． ６ ７のハイドロキシアバタイト
を７００″Ｃで焼威し、平均孔径５０ｎｍの微細気孔の
みを有する気孔率５０％、粒径３００〜６００μｍの顆
粒を製造した。
を７００″Ｃで焼威し、平均孔径５０ｎｍの微細気孔の
みを有する気孔率５０％、粒径３００〜６００μｍの顆
粒を製造した。
この顆粒１ｇを用いて実施例１１と同様に操作してＴ細
胞及びＢ細胞の陽性率を調べた．結果を第２表に示した
。
胞及びＢ細胞の陽性率を調べた．結果を第２表に示した
。
第２表
実施例１１，１２及びｌ３においては、この順でＢ細胞
の吸着量が大きくなっているが、これは顆粒全体の体積
がその順に大きくなっているためと考えられるが、実施
例ｌ２及び１３は比較例３よりも体積は小さいにもかか
わらず、良い吸着性能を示している．また、実施例１ｌ
においても、比較例３に比べて高い吸着が行われている
。
の吸着量が大きくなっているが、これは顆粒全体の体積
がその順に大きくなっているためと考えられるが、実施
例ｌ２及び１３は比較例３よりも体積は小さいにもかか
わらず、良い吸着性能を示している．また、実施例１ｌ
においても、比較例３に比べて高い吸着が行われている
。
実施例ｌ４
Ｃａ／Ｐ比１．６７のハイドロキシアバタイトを１２０
０℃で焼戒し、気孔率２０％、粒径３００〜６００μｍ
の顆粒を製造した．この顆粒の平均微細気孔径は２０ｎ
ｍ、平均小気孔径は２μｍであった． 内容積６ａｌｌのシリンジにガラスウール０． ０ ３
ｇをほぼｌｌＩ１になるように詰め、その上に上記の
顆粒ｌｇを充填してカラムとした． 採血時に血液凝固阻止剤としてクエン酸を１３％添加し
た血液ＩＩｄを上記力ラムに流し、流出した血液を回収
した．この回収した血液中の細胞に蛍光標識抗体、ＣＤ
３ （抗−Ｌｅｕ４）とＣＤ１９（抗−Ｌｅｕｌ２）を
ラベルした後、ＮＨ．ｃ／！で赤血球を溶血させ、ＦＡ
ＣＳを用いてＴ１ｌｌ胞とＢ細胞の陽性率を調べた．結
果を第３表に示した．実施例ｌ５ 実施例１４と同様にして作成したカラムに実施例１４と
同様の方法で採血後にハンクス培地で２倍に希釈した血
液２ｄを流し、さらに実施例１４と同様に操作し、結果
を第３表に示した。
０℃で焼戒し、気孔率２０％、粒径３００〜６００μｍ
の顆粒を製造した．この顆粒の平均微細気孔径は２０ｎ
ｍ、平均小気孔径は２μｍであった． 内容積６ａｌｌのシリンジにガラスウール０． ０ ３
ｇをほぼｌｌＩ１になるように詰め、その上に上記の
顆粒ｌｇを充填してカラムとした． 採血時に血液凝固阻止剤としてクエン酸を１３％添加し
た血液ＩＩｄを上記力ラムに流し、流出した血液を回収
した．この回収した血液中の細胞に蛍光標識抗体、ＣＤ
３ （抗−Ｌｅｕ４）とＣＤ１９（抗−Ｌｅｕｌ２）を
ラベルした後、ＮＨ．ｃ／！で赤血球を溶血させ、ＦＡ
ＣＳを用いてＴ１ｌｌ胞とＢ細胞の陽性率を調べた．結
果を第３表に示した．実施例ｌ５ 実施例１４と同様にして作成したカラムに実施例１４と
同様の方法で採血後にハンクス培地で２倍に希釈した血
液２ｄを流し、さらに実施例１４と同様に操作し、結果
を第３表に示した。
実施例ｌ６
実施例１５と同様にして作戒したカラムに実施例ｌ４と
同様の方法で採血後にハンクス培地で４倍に希釈した血
液４Ｉｄを流し、さらに実施例１４と同様に操作し、結
果を第３表に示した．第３表 なお、上記の実施例においては、インフルエンザウィル
ス及びリンパ細胞に対する吸着性能を測定したが、本発
明の吸着分離剤は、これらのウィルス及び細胞ばかりで
なく、他のウィルス及び細胞に対しても同様に機能する
。
同様の方法で採血後にハンクス培地で４倍に希釈した血
液４Ｉｄを流し、さらに実施例１４と同様に操作し、結
果を第３表に示した．第３表 なお、上記の実施例においては、インフルエンザウィル
ス及びリンパ細胞に対する吸着性能を測定したが、本発
明の吸着分離剤は、これらのウィルス及び細胞ばかりで
なく、他のウィルス及び細胞に対しても同様に機能する
。
また、本発明の吸着分離剤は、花粉症の原因となるスギ
花粉などの植物細胞の吸着剤としても使用することがで
きる． 「発明の効果」 以上のように、本発明の吸着分離剤は、ウィルス及び動
植物細胞に対して高い吸着能を示し、これらの吸着分離
に有効である。本発明の吸着分離剤は、Ｂ細胞やマクロ
ファージを選択的に吸着し、一方、Ｔ細胞には影響を与
えないので、Ｔ細胞をサブセットの分布を変えずに高純
度に回収できるため、Ｔ細胞の分析だけでなく、免疫学
的研究や臨床検査に利用することができる。臨床検査と
しては、癌、自己免疫疾患、エイズなどに関してＴ細胞
の分布、機能検査を行うことができる。臨床検査におい
ては、採血後の全血をそのまま検査装置にかけて検査を
行うこともあり、このような場合に、予め本発明の吸着
分離剤によりＢ細胞やマクロファージを除去しておくこ
とにより、より精度の高いＴ細胞検査が可能になる。
花粉などの植物細胞の吸着剤としても使用することがで
きる． 「発明の効果」 以上のように、本発明の吸着分離剤は、ウィルス及び動
植物細胞に対して高い吸着能を示し、これらの吸着分離
に有効である。本発明の吸着分離剤は、Ｂ細胞やマクロ
ファージを選択的に吸着し、一方、Ｔ細胞には影響を与
えないので、Ｔ細胞をサブセットの分布を変えずに高純
度に回収できるため、Ｔ細胞の分析だけでなく、免疫学
的研究や臨床検査に利用することができる。臨床検査と
しては、癌、自己免疫疾患、エイズなどに関してＴ細胞
の分布、機能検査を行うことができる。臨床検査におい
ては、採血後の全血をそのまま検査装置にかけて検査を
行うこともあり、このような場合に、予め本発明の吸着
分離剤によりＢ細胞やマクロファージを除去しておくこ
とにより、より精度の高いＴ細胞検査が可能になる。
さらに、本発明の吸着分離剤は、充分な保水性を有し、
しかも安定性に優れた微細構造を有するので、短時間に
再現性の高い分離を行うことができる。また、本発明の
吸着分離剤を用いて分離を行う場合には、インキュベー
シゴンを必要としないので、操作は極めて簡略化される
。
しかも安定性に優れた微細構造を有するので、短時間に
再現性の高い分離を行うことができる。また、本発明の
吸着分離剤を用いて分離を行う場合には、インキュベー
シゴンを必要としないので、操作は極めて簡略化される
。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、平均孔径２０〜５００ｎｍの連続微細気孔と平均孔
径１〜５０μｍの連続小気孔の２種類の連続気孔構造を
有するリン酸カルシウム系多孔質顆粒であることを特徴
とするウィルス及び細胞の吸着分離剤。 ２、気孔率が１０〜７５％である請求項１記載の吸着分
離剤。 ３、平均粒径が１０〜２０００μｍである請求項１又は
２記載の吸着分離剤。 ４、顆粒表面に生体由来の多糖類、ムコ多糖類及び蛋白
質並びにそれらの誘導体のうちの１種以上を部分吸着さ
せてなる請求項１記載の吸着分離剤。 ５、請求項１記載の吸着分離剤を充填したカラムに生物
学的液体を流すことを特徴とするウィルス及び細胞の分
離方法。 ６、生物学的液体が血液、血清、尿、唾液あるいは細胞
及び／又はウィルスの浮遊液である請求項５記載の分離
方法。 ７、生物学的液体が、採血時に血液凝固阻止剤を添加し
た血液を培養液で１〜１０倍に希釈したものである請求
項６記載の分離方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1156195A JP2543766B2 (ja) | 1989-03-01 | 1989-06-19 | ウイルス及び細胞の吸着分離剤並びにこれを用いたウイルス及び細胞の分離方法 |
| SE9000650A SE9000650L (sv) | 1989-02-28 | 1990-02-23 | Separation av celler eller virus |
| DE4006293A DE4006293C2 (de) | 1989-02-28 | 1990-02-28 | Verfahren zum Abtrennen von Zellen oder Viren |
| DE4042579A DE4042579C2 (de) | 1989-02-28 | 1990-02-28 | Trennmittel zum Abtrennen von Zellen oder Viren |
| US07/486,220 US5085781A (en) | 1989-02-28 | 1990-02-28 | Separating agent, separator and method of separating cell or virus |
| US08/193,760 USRE35267E (en) | 1989-02-28 | 1994-02-03 | Separating agent, separator and method of separating cell or virus |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4917589 | 1989-03-01 | ||
| JP1-49175 | 1989-03-01 | ||
| JP1156195A JP2543766B2 (ja) | 1989-03-01 | 1989-06-19 | ウイルス及び細胞の吸着分離剤並びにこれを用いたウイルス及び細胞の分離方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0321342A true JPH0321342A (ja) | 1991-01-30 |
| JP2543766B2 JP2543766B2 (ja) | 1996-10-16 |
Family
ID=26389535
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1156195A Expired - Lifetime JP2543766B2 (ja) | 1989-02-28 | 1989-06-19 | ウイルス及び細胞の吸着分離剤並びにこれを用いたウイルス及び細胞の分離方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2543766B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6627229B2 (en) | 2000-02-18 | 2003-09-30 | Hiromi Houzawa | Antiviral agent and method of producing the same |
| JP2006192271A (ja) * | 2005-01-10 | 2006-07-27 | Haemosys Gmbh | ウイルスおよびウイルス成分を液体、特に血液および血漿から除去するための吸着系 |
| JP2010188426A (ja) * | 2009-01-26 | 2010-09-02 | Emprie Technology Development LLC | 清拭シート |
| JP2011193972A (ja) * | 2010-03-18 | 2011-10-06 | Olympus Corp | 破骨細胞除去フィルタおよび破骨細胞除去装置 |
| US10960380B2 (en) | 2015-12-28 | 2021-03-30 | Jnc Corporation | Adsorbent and method for producing the same |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20250035521A1 (en) | 2021-12-06 | 2025-01-30 | Asahi Kasei Kabushiki Kaisha | Microorganism Concentration Method and Concentration Vessel |
-
1989
- 1989-06-19 JP JP1156195A patent/JP2543766B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6627229B2 (en) | 2000-02-18 | 2003-09-30 | Hiromi Houzawa | Antiviral agent and method of producing the same |
| JP2006192271A (ja) * | 2005-01-10 | 2006-07-27 | Haemosys Gmbh | ウイルスおよびウイルス成分を液体、特に血液および血漿から除去するための吸着系 |
| JP2010188426A (ja) * | 2009-01-26 | 2010-09-02 | Emprie Technology Development LLC | 清拭シート |
| JP2011193972A (ja) * | 2010-03-18 | 2011-10-06 | Olympus Corp | 破骨細胞除去フィルタおよび破骨細胞除去装置 |
| US10960380B2 (en) | 2015-12-28 | 2021-03-30 | Jnc Corporation | Adsorbent and method for producing the same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2543766B2 (ja) | 1996-10-16 |
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