JPH03216123A - 培養植物体の増殖促進方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【発明の目的】

［産業上の利用分野］ 本発明は、ｊ／７ｖｉｔｒｏにおける無菌培養法により
培養されている植物体の組織を効率的に、かつ急速に増
殖させるための方法に関する。 ［従来の技術］ （１）背景 近年、最良品種の栄養体を大量生産する方法として、ｉ
ｎ　ｖｉｔｒｏにおける植物組織の無菌培養技術が広く
採用されている。植物体の組織を無菌的に摘出して培養
し、胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ）、プロトコーム（ｐｒ
ｏｔｏｃｏｒｍ）　、ライゾーム（　ｒｈｉｚｏｍｅ）
又はカルス（ｃａｌｌｕｓ）等を生成させる技術が注目
を集めている。例えば、現在、ラン類を中心とした花弁
園芸作物、果樹等の木本性植物及び頭菜類では、組織培
養技術を応用して、対象植物組織を無菌的に摘出・培養
し、これらを増殖させた後、植物体の再生を促すという
段階を経る幼苗の大量生産が試みられている。しかし現
在の培養技術では、これらの組織から迅速に植物を再生
させる手段として、これら培養の大部分の段階において
、培地への植物ホルモンその他の生長調整物質の添加が
不可欠であると考えられている。 ｛２｝従来技術の問題点 ところが、長期間植物ホルモン入りの培地で培養を継続
した場合植物体の変異が誘発され易く、■　培養中、組
織の器官形成能力が低下し植物体が再生されない。 ■　品種の重要形質が欠損する。 等の当該植物ホルモン添加による変異が頻発し易い。こ
れらの変異現象は、幼苗の経済的生産に対し著しい障害
を与えるから、この問題は、本産業の直面する深刻な問
題の一つである。 本発明者らは、上記問題を解決する目的で植物ホルモン
に替わる増殖促進手段につき組織的な研究を進めた結果
、先に、水溶性の銀塩が植物体の迅速かつ同調的再生に
有効であることを見出した（特願昭６３　−　２２６９
６８号）。 以上の水溶性銀塩は、植物組織の再分化に対し顕著な効
果を示すが、植物体の活着率がやや低いという欠点を有
する（これは、恐らく銀塩の酵素阻害作用に因ると思わ
れる。）。 ［発明が解決しようとする課題］ そこで本発明が解決しようとする課題は、上記先発明の
欠点であった活着率を改善することによって、植物体の
組織培養時における胚機体、プロトコーム、ライゾーム
又はカルス等の任意の生育段階において、植物体の再生
等の器官形成能力低下及び変異誘発を抑制しながら、迅
速かつ効率良く植物体を生産する技術を提供することで
ある。

【発明の構成】

［課題を解決するための手段］ （１）概念 本発明者らは、上述した活着率の低さという先発明の欠
点を改善する手段につき多くの実験を試みた結果、ここ
に水溶性銀塩で処理された植物組織をポリビニルピロリ
ドンを含む培養液中で培養することにより、水溶性銀塩
の特性を失わせることなしに活着率を著しく向上させう
る事実を見出した。本発明はこの知見に基づくものであ
る。 （２］　　概要 即ち、本発明に係る培養植物体増殖促進方法は、以上の
知見にに基づき、水溶性銀塩溶液で処理した植物体の組
織をポリビニルピロリドン（以下“ｐｖｐ’“と称する
）を含む培地中で培養することを要旨とする。敷祈すれ
ば、本発明は、胚又は胚機体、プロトコーム、ライゾー
ム又はカルス等の植物体の組織培養時における任意の生
育段階において、これらの組織を銀塩の水溶液で処理す
ると共に、組織をＰＶＰを含む培地中で培養することに
よって迅速かつ効率的にシュートの分化を促し、遺伝的
に均一な大量の幼苗の生産を短期間内に可能ならしめる
ための植物組織の培養法に係るものである。 以下、発明に関連する主要な事項に付き説明する。 （３）植物組織 本発明剤の対象となる胚機体、プロトコーム、ライゾー
ム又はカルスとは、ラン類を中心とした花弁園芸作物、
果樹等の木本性植物、及び、薇菜類の諸器官く茎葉、花
器等）を培養して得られた組織を含む植物体を意味する
が、別段これらに限定されるものではない。 ４）水溶性銀塩 本発明の客体である銀塩は、実質的に水に可溶性のもの
であれば何でもよく、好適な例として、例えば硝酸銀、
硫酸銀等の無機酸塩及びシュウ酸塩、酒石酸塩等の有機
酸塩その他、水に易溶性乃至難溶性の銀塩を例示できる
が、水に対する溶け易さ、入手の容易さ及び熱に対する
安定性などの点で硝酸銀が最も好ましい。しかし、塩化
銀又は臭化銀のような難溶性の銀塩類であっても、水に
１　ｐｐｍ程度以上溶けるものであれば、充分利用可能
である。 （（５）　ＰＶＰ ｐＶＦ！　（化学名ボリ（Ｎ−ビニル−２−ビロリジノ
ン；一般名「ボビドン」）は、ラジカル触媒の存在下に
Ｎ−ビニル−２−ピロリジノン（モノマー）を塊状、溶
液又は懸濁重合させることにより得られる。このものは
、物理的にアルブミンに近い性質を有しており、第二次
世界大戦中、ドイツで代用血漿として盛んに利用された
程の無害な物質である。本物質は、ポリフェノール物質
（培養中生成する褐変物質）を特異的に吸着する作用を
有し、かつ熱に対し安定であるので、オートクレープ滅
菌が可能である。 （６）培地 上述の培地としては、ムラシゲ・アンド・スクーグ培地
、ハイボネツクス培地、ナドゾンＣ培地、ニツチ培地、
リンズマイヤー・スクーグ培地、ホワイト培地、バーシ
ン・アンド・ベント培地、Ｂ−５培地、ガムボルグ培地
などを用いる。 炭素源としては、シヨ糖、グルコース、フルクトースな
どが単独で又は二種類以上の混合物として用いられる。 炭素源は、培地中に約１〜５０ｇ／ρの濃度で存在すれ
ばよいが、好ましくは約５〜３０ｇ／ρである。 培地のｐＨは４．０〜７．０に調整するのが適当であり
、特に４．８〜５．８の範囲が好ましい。 これらの培地は、液体培地・固体培地のいずれでもよく
、培養温度は１５〜３０゜Ｃの範囲内、殊に１８〜２５
℃の温度で行われるのが望ましい。かつ、更に好ましく
は、培養は恒温条件下で約５００〜２０００ルックスの
光照射下で行われるのが望ましい。 なお品種によっては、ココナッツミルク（約１〜２０重
量％）、バナナジュース（約１〜１０重量％）、トマト
ジュース（約１〜１０重量％）、ジャガイモジュースく
約１〜１０重量％）などを単独で、又は混合して使用し
た方が好ましい場合もある。更に必要により、培地成分
として、ゼアチン、カイネチン、ペンジルアミノフ゜リ
ン、２ｉＰ、４ＰＵなどの天然又は合成サイトカイニン
類や２．４−Ｄ、オーキシン、α−インドール酢酸、α
−インドール酪酸、α−ナフタリン酢酸、アブシジン酸
、ジベレリンなどの天然又は合成植物ホルモンの使用が
好ましいこともある。 （７）培養法 本発明剤を用いる組織培養においても、従来のと同じく
、無菌的に摘出した植物の組織を、無機・有機塩類及び
シヨ糖を含む培地上に置床して活着させたのち、それを
培地に移植し、胚裸体、プロトコーム・ライゾーム又は
カルス等の増殖を行う。 次に、増殖したこれら組織を、滅菌済みの銀塩水溶液中
に浸漬し、滅菌水で水洗後、ＰＶＰを含む培地に移植、
培養して、これら組織から茎葉及び根を持つ完全なシュ
ートを形成させる。この場合、適当な水溶性銀塩の濃度
は、植物の種、品種、培養条件等により相違するが、通
常、浸漬液中帆０１〜１００ｐＰｍより好ましくは０．
１４０ｐｐｍの範囲内である。また培地中に溶解させる
ＰＶＰの濃度は、概ね０．１〜１％、好ましくは０．５
％付近である。 ［作用］ 本発明において、銀塩が胚又は胚裸体、プロトコーム、
ライゾーム又はカルスその他、植物体の組織培養時にお
ける任意の生育段階において、植物ホルモンに代わり、
これらの組織を迅速かつ効率的に増殖させてシュートの
分化を促し、突然変異のない遺伝的に均一な大量の幼苗
分化させる作用を奏するという事実の理論的説明として
、銀塩が植物組織におけるメチオニンの代謝系に何らか
の影響を及ぼし、例えばＳ−アデノシルメチオニン（Ｓ
ＡＭ）から１−アミノプ口パン−１−カルボン酸へのＡ
ＣＣ合成酵素の生産を阻害することに因るのではないか
と想像されることについては、既に先発明明細書中既述
した通りであるが、進んで、ＰＶＰがどのような機作で
銀塩処理組織の活着率を顕著に向上させるのかという理
由については説明が困難である。但し、これに関する蓋
然性のある一つの説明としては、ＰＶＰが複合体形成作
用を有するという事実から、このものが被処理組織に付
着する義援と複合体を形成し、組織の成長分化に有用な
酵素系への銀塩の有害な影響を阻止することを挙げるこ
とができよう。 ［実施例］ 以下、製造例及び使用例を示し、比較例と対照して発明
実施の効果を説明するが、例示は当然説明用のもので、
発明思想の限定を意図したものではない。 造例１（銀塩水　液の調　例） 試薬特級の硝酸銀を、蒸留水に夫々濃度０．１、１．０
及び１０ｐｐｍになるように溶かした水溶液各５００ｍ
ｌを調製し、各水溶液のｐＨを塩酸で５．５に調節後、
２００一容の広口三角フラスコに１００−づつ分注し、
アルミニウムキャップを施してから、オートクレープ中
、圧力１．２　ｋｇ／ｃｏ（、１２１℃の条件下で１５
分間加圧蒸気滅菌して放冷後、硝酸銀水溶液を調製した
。 製゛告　２（培　の＝乳１例） ムラシゲ・アンド・スクーグ培地（ショ糖２０ｇ／！２
）に夫々ｐｖｐを０．５ｇ／！；ｌ、５　ｇ／ρ及び５
０ｇ／ρの濃度になるように溶かし、ｐ｝｛５ｉ．　５
に調製後、各々に寒天８ｇづつを加え、加熱、溶解させ
た後、１００ｍｌ容の培養瓶に３０−づつ分注し、プラ
スチックキャップを施してからオートクレープ中、圧力
１．２ｋｇ／ｃｆｆｌ　（１２１℃）の条件下に１５分
間、加熱滅菌後、放冷して試験用培地を得た。 培養例１ シュンランの新芽（長さ１５〜２５ｍｎ＋　）を採取し
てその外葉３〜４枚を取り除きウィルソン氏液で表面を
１５分間殺菌したのち、滅菌水で３回洗浄しその茎頂芽
及び腋芽を無菌的に切り出し、ムラシゲ・アンド・スク
ーグ寒天培地に置床して、２０℃の恒温条件下で培養し
てライゾームを形成させ、増殖させた。 次いで、増殖したライゾームの先端部を約５ｍｎ＋の長
さに切り取り、上記各濃度の無菌硝酸銀水溶液中に夫々
０．５　＋　２、１２及び２４時間の各時間浸漬処理し
たのち、上記ＰＶＰ含有ムラシゲ　アンド．スクーグ培
地に置床して２０゜Ｃの恒温下で２ケ月間培養を行った
。なお対照として、上記ライゾームを硝酸銀で処理後、
ＰＶＰを含まないムラシゲ．アンド・スクーグ培地に置
床した区（対照区Ａ）と、硝酸銀で処理しないまま直接
ＰＶＰ含有ムラシゲ・アンド・スクーグ培地に置床した
区（対照区Ｂ）とにつき同様に培養試験を実施した。そ
の結果、ＰＶＰを培地中に含む区（発明区）では、培地
中にＰＶＰを含まない区（対照区Ａ）と比較して、硝酸
銀濃度の高低に拘らず約２倍の活着率を示した。特に、
硝酸銀濃度１〜１０ｐｐｍ−浸漬時間２時間、ｐｖｐ濃
度０．５％の培地置床区では、対照区と比較して、 ■　シュートの形成率：約２倍に増大、■　ライゾーム
の増殖及び進度：約１．５倍に増大、 ■　活着率：約８０〜９０％増大、 ■　重要形質の変異発生率；約２０％減少、という良好
な結果が得られた。 培養例２ デンファレ（ファレノプシス系デンドロビウム）の新芽
（長さ３〜５ｃｍ）を採取してウィルソン氏液）て裏面
を１５分間殺菌したのち、滅菌水で３回洗浄し、その茎
頂芽及び腋芽を無菌的に切り出し、ムラシゲ・アンド・
スクーグ寒天培地に置床して、２５゜Ｃの恒温条件下で
培養してプロトコームを形成させた。 得られたプロトコームを、更にココナッツミルク（　１
５０ｇ／ρ）を含むムラシゲ・アンド・スクーグ液体培
地に移し、振盪培養機を用い、６０ｒｐｍの条件て振盪
培養してプロトコーム様体（Ｐ．Ｌ．Ｂ）を増殖させた
。 このＰ．Ｌ．Ｂを分割し、培養例１と同様に硝酸銀処理
を行ったのち、ＰＶＰ含有ムラシゲ・アンド　スクーグ
寒天培地に置床し、２ケ月間、２５℃の恒温条件下に培
養した。なお対照として、ＰｖＰを含まないムラシゲ・
アンド・スクーグ寒天培地を用いて同様の試験を行った
。この結果、ＰＶＰ含有培地を用いた発明区ではいずれ
も良好な活着性が認められたが、特に硝酸銀濃度１〜ｌ
Ｑｐｐｌｌ１、浸漬時間２時間、ＰＶＰ濃度０．５％の
培地置床区では、対照区と比較して、 ■　シュートの形成率：約５０〜６０％増大、■　シュ
ートの仲度：約２〜３倍に増大、■　Ｐ．　Ｌ．　Ｂの
活着率：約６０〜８０％増大、■　重要形質の変異発生
率：約３０％減少、という良好な結果が得られた。

【発明の効果】

以上説明した通り、本発明は、胚又は胚機体、プロトコ
ーム、ライゾーム又はカルス等の植物体の組織培養時に
おける任意の生育段階において、これらの組織を処理す
ることによって迅速かつ効率的にシュートの分化を促し
、遺伝的に均一な大量の幼苗の生産を短期間内に可能な
らしめるため実用的な手段を提供し得たことにより、組
織培養産業の合理化及び発展に寄与しうる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　水溶性銀塩溶液で処理した植物体の組織をポリビニ
   ルピロリドンを含む培地中で培養することを特徴とする
   培養植物体の増殖促進方法。 ２　水溶性銀塩が硝酸銀である請求項１記載の方法。