JPH03216189A - 血小板細胞接着分子及びその変形体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明はインビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）において血小板膜
及び内皮細胞膜に結合するようなタンパク質及びその他
の試薬に対するリガンドとして機能するボりベブチド分
子に関する。

多くの種類の細胞は、その細胞を取り巻く環境に対する
細胞の接着に影響を与えるフィブロネクチン、ビトロネ
クチン（ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）　、オストボンチン
（ＯＳｔＯｐＯｎｔｉｎ）、コラーゲン、トロンボスボ
ンジン（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）、及びフォン
・ビルプラント因子（ν一Ｆ）のような細胞外タンパク
質によって認識される［インテグリン（ｉｌｌｔｅ（ｌ
ｒｉｎ）Ｊと呼ばれる表面タンパク質を有する。上記の
細胞外タンパク質の幾つかに対するレセプターとして機
能するインテグリンとして、露出した血管内皮細胞への
血小板のＶＷＦ一依存性の接着を部分的に媒介するヒト
血小板糖タンパク質１ｂ（ＧＰＩａ）　：フィブロネク
チンレセプターのβ鎖に対応するＧＰＩＩａ　；並びに
血小板において、フィブリノーゲンレセプターフィブリ
ノーグン不存在下のＶＷＦレセプター　フィブロネクチ
ンレセプター、及びビトロネクチンレセプターとして機
能するヘデロダイマータンパク質複合体ＧＰＩＩｂ−Ｇ
ＰＩＩＩａ，が同定されている。

ＧＰＩｌｂとＧＰＩＩＩａに共通するα一β鎖配置はイ
ンテグリンに属するレセプターに典型的なものである。

一般にＵ細胞接着分子Ｊ　（ＣＡＭ）と呼ばれる別のグ
ループに属する接着促進タンパク質は、免疫グロブリン
遺伝子スーパーファミリーの遺伝子によってコードされ
るタンパク質で分類される。例えば、Ｗｉ　ｌ　ｌ　ｉ
ａｍｓ及びＢａｒｃｌａｙ，＾ｎｎ．　Ｒｅｖ．　Ｉｍ
ｍｕｎｏ．旦，３８１−４０５頁（１９８８）を参照さ
れたい。免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに
関連する他のタンパク質と同様に、ＣＡ）４は共通の構
造（免疫グロブリン相同単位）を有しているが、この構
造は中心に位置したジスルフィド架１（これは一連の逆
平行β鎖をいわゆる抗体折りたたみ構造中に安定化する
）を有する約１００残基のアミノ酸配列によって特徴付
けられる。免疫グロブリン相同単位は、特に、保存され
たアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｘ−Ｘ−Ｖａｌ／Ｌｅｕ／Ｉｌ
ｅ−Ｘ−Ｖａｌ／Ｌｅｕ／Ｉｌｅ−Ｘ−Ｃｙｓ／（３５
−５５アミノ酸）／Ａｓｐ−Ｘ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｘ−ＴＶ
ｒ−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ−Ｖａ　ｌ　／Ａ　ｌ　ａを含んテ
イる。

Ｈｕｎｋａｐ　ｉ　Ｉ　ｌ　ｅｒ及びＨｏｏｄ，　Ｎａ
ｔｕｒｅ，　３２３．１５頁（１９８６）を参照のこと
。

公知のＣＡＭの中には、インテグリンリンパ球機能関連
分子−１　（ＬＦ＾−１）の結合による白血球の接着を
媒介する細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）　：がん
胎児性抗原（ＣＥへ）；フ７シクリンＩＩ（ｆａｓｃｉ
ｃｌｉｎ　ＩＩ）　；旧Ｖ−Ｉに対する細胞性レセプタ
ーの一成分であるＴ細胞サブセットマーカー、ＣＤ−４
　：神経細胞の接着を媒介する神経細胞接着分子（Ｎ−
ＣＡＭ）　：ミエリン形成において機能すると思われる
ミエリン関連糖タンパク質（ＨＡＧ）　；リンパ球機能
関連抗原−３（　ＬＦＡ−３）　：及び末梢ミエリンの
主要糖タンパク質（ＰＯ）、などがある。ＣＤ−４のＨ
ＩＶ−１との機能的関連性に加えて、ウイルスレセプタ
ーとしてのＣＡＭの役割は、２種類のビコルナウイルス
、すなわちヒトライノウイルスとポリオウイルスに対す
るそれぞれのレセプターとして、ＩＣＡｔ４−１、及び
３つの免疫グロプリン様ループ領域（ＩＣＡＭ−１では
５つのかかる領域があることと比較して）から成る細胞
表面糖タンパク質、が同定されたという事実に反映して
いる。

ＣＡＭ分子はインビボにおいて重要な機能を果たしてい
るが、血小板から実質的に純粋な形で得られたタンパク
質で、構造もしくは機能面からＣＡＭに属するものとし
て同定されたものは未だにない。

かかるタンパク質及びそれに基づく変形分子が、血小板
の自己集合（凝集）を含め、血小板の関与する他の血液
細胞並びに血管を覆う内皮細胞との基本的細胞表面認識
事象、並びに細胞外マトリックス成分（例えば血管が傷
害を受けたときに露出する内皮下の層）との血小板の接
着、においで果たすと思われる役割からすると、この種
のものの特徴付けは重要な意味を有するであろう。

発明の概要 本発明の目的は、従って、血小板及び内皮細胞において
見られるＣＡＭタンパク質の精製形を実際に回収可能な
量で供することである。

血小板膜タンパク質に結合するタンパク質及び他の試薬
に対するレセプターとして、インビボでＣＡＭと同じよ
うに機能するポリペプチド分子を供することも、本発明
の別の目的である。

免疫グロブリンスーパーファミリーに関連した構造上の
属性を有し、血小板表面における認識事象に影響を与え
るために用いることのできるタンパク質を供することも
また本発明の目的の一つである。

上記の目的を達成するために、本発明の一つの態様にお
いては、回収可能な最のＰＥＣＡＭ−１を含む組成物を
供する。好ましい実施態様の一つにおいては、本組成物
は実質的に純粋な形のＰＥＣＡＭ−１であり、また別の
好ましい実施態様においては本組成物は成熟型ＰＥＣＡ
Ｍ−１を含む。

本発明の別の態様においては、ＰＥＣＡＭ変異タンパク
質、及びＰＥＣＡＭ−１の一部に相当する又はＰＥＣＡ
Ｍ−１と一致はしないがその一部を含んで成る分子にし
て接着促進活性をテする分子から成る群から選択したＰ
ＥＣＡＭ変形体を供する。好ましい実施態様の一つにお
いては、このＰＥＣＡＭ変形体は、ＰＥＣＡＭ−１の細
胞膜貫通部分でも細胞内部分でもなく、ＰＥＣＡＭ−１
の細胞外部分に相当する、もしくは該細胞外部分を含ん
で成るものである。また別の好ましい実施態様において
は、上記細胞外部分は各々、Ｇｉｎ−ＧＩＬＩ−ＡＳｎ
−Ｓｅｒ−ＰｈｅというＮ末端を含んでおり、５７４残
基のアミノ酸配列を有している。

本発明のまた別の態様においては、ＰＥＣＡＭ−１のア
ミノ酸配列の一部を含んで成るアミノ酸配列を有するポ
リペプチド分子にして、（ａ）前記ＰＥＣＡＭ−１のア
ミノ酸配列と一致しないものでしかも（ｂ）ＰＥＣＡＭ
−１活性を有するポリペプチド分子を供する。

好ましい実施態様においては、このポリペプチドはアミ
ノ酸残基の長さが４乃至１００である。

本発明のさらにまた別の態様においては、ＰＥＣＡＭ−
１をコードする単離したポリヌクレオチド分子、並びに
ＰＥＣＡＭ変形体をコードするポリヌクレオチド分子を
供する。好ましい実施態様の一つにおいては、ポリヌク
レオチド分子は、Ｎ末端がＧｌ　ｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−
Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｔｌｅで好ましくはボリベブ
チドの分子量が約７９キロダルトン（ｋｄ）のタンパク
質をコードし、しかも第１図に示した塩基配列の少なく
とも約１０個のヌクレオチドから成る部分と相補的なオ
リゴヌクレオチドプローブと高抑υ１条件下でハイブリ
ッドを形成するものである。

本発明においてさらに供するオリゴヌクレオチドは、第
１図に示した塩基配列の一部に相当するもしくは第１図
に示した塩基配列の一部と相補的なオリゴヌクレオチド
にして、ＰＥＣＡＭ−１又はＰＥＣＡＭ−１変形体をコ
ードするＤＮＡ配列を発現する細胞中に該オリゴヌクレ
オチド又はその転写生成物が存在すると該ＤＮ＾配列の
転写又は翻訳が阻害されるようなオリゴヌクレオチドで
ある。好ましい実施態様においては、上記オリゴヌクレ
オチドはＲＮＡにして上記ＤＮＡ配列の翻訳を阻害する
ものか、又はＤＮＡにして上記ＤＮ＾配列の転写を阻害
するものである。

本発明のその他の目的、特色、及び利点は後述の詳細な
説明によって明らかとなるであろう。しかしながら、本
明細書の詳細な説明から本発明の意図するところ並びに
その範囲内で様々な変史及び修正を加えることは当業者
の容易になし得るところであり、詳細な説明及び特定の
例は本発明の好ましい実施例を示したものではあっても
、説明することのみを目的として挙げたものであると理
解されたい。別記しない限り、本明細書中で引用した文
献の各々の内容は引用によって本発明に組み込まれる。

好ましい実施態様の詳細な説明 前述の基準に従いＣＡＭとして適切に特徴付けられる血
小板膜糖単タンパク質を発見した。２７個のアミノ酸シ
グナルペブチド配列を欠く成熟型タンパク質は１３０キ
ロダルトン（ｋｄ）の分子量を有する。

この分子量の大きさは多くの公知の血小板膜糖タンパク
質のものと同じ範囲にあるが、本発明によればこの新規
糖タンパク質は回収可能な量で得ることができ、銀染色
したＳＯＳ−ＰＡＧＥゲル上で糖タンパク質標品が単一
バンドとして泳動されるような形（「実質的に純粋な形
」）で得ることができる。

好ましくはこの糖タンパク質は、以降で論ずるようなも
のも含め、治療に関する事柄に用いることができるよう
十分な純度にある。

本発明の糖タンパク質は、血小板膜及び内皮細胞股双方
に見出だされるＣＡＭであるので、血小板／内皮細胞接
着分子−１　（ＰＥＣＡＭ−１：　Ｐｌａｔｅｌｅｔ／
Ｅｎｃｌｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ａｄｈｅｓｉｏ
ｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）と名付けた。成熟型ＰＥＣ
Ａｌ４−１は、第１図にシグナルベプチドと共に示した
７１１個のアミノ酸配列（ポリペプチド分子ｆＡ　：７
９５７８ダルトン）を有している。

ＰＥＣＡＭ−１は、その分子量のおよそ３９％を炭水化
物が占めるようになるまでグリコシル化され、その成熟
型タンパク質は第１図に黒三角で示した９つのアスパラ
ギンー結合グリコシル化推定部位を有づる。これらの部
位はすべて糖タンパク質の５７４個のアミノ酸を有する
細胞外ドメインに存在している。ＰＥＣＡＭ−１は、１
９個のアミノ酸から成る膜貫通部、及び１１８個のアミ
ノ酸から成る細胞質ドメインをも含んでいる。ドメイン
のこの配＠（第２図参照）は形質膜内でのＰＥＣＡＭ−
１の向きと一致しており、他の膜内在性糖タンパク質に
もよく見られるものである。

ＰＥＣＡＭ−１をコードする塩基配列を含むポリヌクレ
オチドも第１図に示されている。２５５７塩基対（ｂｐ
）のこの配列は、１４１　ｂｐの５′不翻訳（ＵＴ）領
域、成熟型タンパク質とシグナルペブチドを構成する７
３８個のアミノ酸をコードする２２１４ｂｌ）の読み取
り枠（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ）　、及
び２０２　ｂｐの３’ＵＴ領域、を含んでいる。ＰＥＣ
ＡＭ−　１をコードする配列を含むポリヌクレオチドを
得る際、ＰＥＣＡＭ−１コード配列をポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＢ）又は同様の増幅技術で増幅することを目
的として相補的オリゴヌクレオチドプライマーを作製す
るのに５′及び３’ｌｌＴ領域の配列を使用するのが好
ましい。

ＰＥＣＡＭ−１は、血小板と内皮細胞の膜以外にも、好
中球、半球、骨ＩＩＩｉＩｌｌ胞、未成熟リンパ球、骨
髄造血系細胞、並びに白血病とリンパ腫の患者から得ら
れる細胞の膜にも見つけることができる。実質的に純粋
なＰＥＣＡＭ−１は、これらの細胞源からタンパク質を
単離すること、並びに以下により詳細に述べる慣用的遺
伝子工学技術を用いることによって、回収可能な世で製
造することができる。

この「回収可能な量」とは、糖タンパク質の単離した量
がイムノアッセイのような放射性標識法よりも感度の低
い技術で検知でき、しかも溶液中へのタンパク質自体の
移入を含めた操作にさらに付し得るものであることを意
味する。好ましくは、回収可能な量のＰＥＣＡＭ−１は
タンパク質を溶液中に移入したときに５０ｎＭ以上の濃
度、より好ましくは１μＭ以上の濃度を与えるべきであ
る。

天然の材料から実質的に純粋なＰＥＣＡＭ−１を回収可
能な量で単離するには、好ましくは、血小板のようなＰ
ＥＣＡＭ−１含有細胞からの可溶化膜タンパク質の調製
、及び公知手順に従った免疫アフィニティーク口マトグ
ラフィーでの成熟型糖タンパク質の精製を含めて行う。

ＷｉｌＣｈｅＣｋ他編、ＨｅｔｈＯｄＳｎ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ，　１０４　．３頁（１９８４）、及びＡｕ
ｓｕｂｅ他編、ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴ．ＯＣＯＬＳ
　ＩＮ　ＨＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ［　Ｗｉ
ｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　（　ニューヨーク
）刊、（１９８７．　１９８９）］セクション１０１１
参照。例えば、血小板を単離し、可溶化し、そして遠心
した後、得られた上清をレクチンーセフｊ７ロース力ラ
ム［例えばコンカナバリンＡ　（ＣｏｎＡ）一セフ７ロ
ース力ラム］にかけることができる。ＰＥＣＡＭ−１は
ＣＯｎＡ様レクチンに結合しないので、かかるカラムの
非吸着流出物をＰＥＣＡＭ−１濃縮標品を得るのに用い
ることができる。

さらに精製を進めるためには、ＰＥＣＡＭ−　１一特異
的モノクローナル抗体（ＨＡｂ）をセファロース力ラム
のようなアフィニティー力ラムに結合させることもでき
（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌの上記文献、セクション１０
．　１６を参照）　、ＰＥＣＡＭ−１を結合させるため
に上記非吸着流出物をこのアフィニティー力ラムに再び
流すこともできる。カラム中の１１８と塩濃度を調整す
ることによって、ＰＥＣＡ？４−　１を結合させる際の
非特異的結合を減少させることができる。実質的に純粋
なＰＥＣＡＭ−１は、次にジギトニン、オクチルグルコ
シド、ＣＨＡＰＳ又はグリシン／トリトンＸ一１００の
ような温和な界面活性剤を含んだ適当な酸性溶出緩衝液
を用いてカラムから溶出させ、次に有用な聞で回収する
。

このようにして得られたＰＥＣＡＭ−１の純度は、Ｐ［
ＣＡＨ−１標品をＳ［ｌＳ−ＰＡＧＥに還元及び非還元
条件下で泳動してＰＥＣＡＭ−１が単一バンドとして泳
動されるかどうかを調べることによって、評価できる。

必要とあれば、溶出させたＰＥＣＡＭ−　１を小麦胚芽
凝集素セファロースのような追加のレクチンーセファロ
ース力ラムに吸着させ、次いで適当な溶出緩衝液（例え
ば温和な界面活性剤を含んだグリシンＩｆ衝液）を用い
てカラムから溶出させて実質的に純粋なＰＥＣＡＭ−１
を得る。

免疫アフィニティークロマトグラフィーを用いるＰＥＣ
ＡＭ−１の精製に使用するのに適した抗体は、以下でよ
り詳細に述べるような方法で得ることができる。リンパ
球及び骨髄細胞の分化の異なる段階を識別することなど
のＰＥＣＡＭ−　１精製以外の状況に既に使用されてい
たある種のＨＡｂが、本発明のＰＥＣＡＭ−１の免疫ア
フィニティー精製にも使用できることも判明した。かか
るＨＡｂには、抗−ｈｅｃ７　　［　Ｎｕ　ｌ　ｌｅｒ
他、Ｊ．　　Ｅｘｐ．　　Ｈｅｄ．　　１７０　３９９
−４７４頁　（１９８９）　　］　、ＳＧ１３４　　［
Ｇｏｙｅｒｔ他、Ｊ．　　Ｉ＋＋ｍｕｎｏ１３７．　３
９０９頁（１９８６）］　、ＣＬＢ−ＨＥＣ　７５　［
ｖａｎ　Ｈｏｕｒｉｋ他、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ
．　２６０．　１１３００頁（１９８５）コ、並びにＴ
Ｈ２及びＴＨ３　［ＯｈｔＯ他、Ｂｌｏｏｄ，６６，　
８７３頁（１９８５）］が含まれる。

免疫アフイニティークＣ１マトグラフイーの代わりに、
カラムクロマトグラフイーを用いる慣用的糖タンパク質
精製法を用いて細胞からのＰＥＣＡＭ−１の単離を行う
こともできる。Ａｕｓｕｂｅｌの上記文献、セクション
１０．　１２−１０．　１５を参照されたい。この方法
によるＰＥＣＡＭ−１の単離には、一つ以上のイオン交
換高圧液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ）、サイズ排
除（ＳＥ）−ＨＰＬＣ，高性能クロマトフオーカシング
、及び疎水結合クロマトグラフィーが使用される。

高性能クロマトフオーカシング及び疎水結合クロマトグ
ラフィーが好ましい単離手段である。どちらの方法でも
、ＰＥＣＡＭ〜１のような生物学的に活性で界面活性剤
可溶性タンパク質を、変性を最小限にとどめ、しかも高
い収率で、迅速に精製することができるからである。

第１図の塩基配列、並びに成熟型ＰＥＣＡＭ−１分子の
細胞外ドメインと膜貫通ドメインと細胞内ドメインに関
する知識（第２図参照）に基づいて、天然に存在する分
子の変形体であるポリペプチド分子を製造ずることもで
きる。かかるポリペプチド分子は本明細書中では一般に
ｒ　ＰＥＣＡＭ−１変形体」と呼んでおり、例えばＰＥ
ＣＡＭ変異タンパク質及びＰＥＣＡＭ−１の一部分に相
当する分子などが含まれる。

ここにｒ　ＰＥＣＡＭ変異タンパク質」という用語は、
基本的な構造的属性（すなわち、免疫グロブリン相同単
位）並びにＣＡＭの接着促進活性を保持し、しかもＰＥ
ＣＡｌ４１と相同なポリペプチドを指す。この説明にお
いて、２つの配列間の「相同」とは、第二の配列から第
一の配列が派生したことを示唆するような同一性を欠く
類似性を内包するものである。特にあるポリペプチドと
ＰＥＣＡＭ−１のアミノ酸配列を比較して７０％よりも
高い同一性を有していた場合、このポリペプチドはＰＥ
ＣＡＭＩと「相同」であるという。このような配列の比
較は、Ｌｉｐｍａｎ及びＰｅａｒｓｏｎがＳｃｉｅｎｃ
ｅ　２２７．　１４３５頁（１９８５）に開示したよう
なコンピューターで容易に実行できる公知のアルゴリズ
ムを用いて行うことができる。

本発明のＰＥＣＡＭ変異タンパク質は、得られるポリペ
プチドを生物学的に不活性とすることなく修飾し得るＰ
ＥＣＡｌ４〜１分子の特定残基を機械的に割り出す一方
法である、慣用の特定部位の突然変異誘発法（ｓｉｔｅ
−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）　Ｆ生
産すルコとができる。Ａｕｓｕｂｅｌの上記文献、セク
ション８を参照されたい。［ｉｌ所望のヌクレオチド置
換（突然変異）を含む配列のオリゴヌクレオチドの合成
、［肖］このオリゴヌクレオチドとＰＥＣＡＭ−１をコ
ードする構造配列を含む鋳型とのハイブリッド形成、及
び［ｉｉｉｌブライマーとしてこのオリゴヌクレオチド
を伸長させるためのＴ４　ＤＮＡポリメラーゼの使用、
を含んだオリゴヌクレオチド特定突然変異誘発が好まし
い。ＰＥＣＡＭ−１の構造配列に所定の変化を与えたと
きの影響を調べるのに直ちに用いることができるからで
ある。この方法は比較的高価であるので、別の公知の特
定突然変異誘発法を選んでもよい。

上述したように、ＰＥＣＡＭ−１の一部分に相当する分
子、又はＰＥＣＡＭ−１の一部を含むが天然に存在する
分子とは一致しない分子、及びＣＡＨの接着促進活性を
呈する分子も、本発明におけるＰＥＣＡＭ変形体として
例示できる。これらの変形体の中には、ＰＥＣＡＭ−１
の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列を含み、膜貫
通部分及び細胞内部分を持たない、ＰＥＣＡＭ−１の「
可溶性レセプター」型であるポリペプチドがある。

本発明の他のＰＥＣＡｌ４変形体としては、ＣＡＭ様接
着促進活性を保持したＰＥＣＡＭ−１の断片がある。同
様に、（ｉ）　ＰＥＣＡＭ−１のアミノ酸配列の一部に
相当し、かつ（　ｉ　ｉ　）ＰＥＣＡＭ−　１に特徴的
な活性を保持した合成ポリペプチドも本発明の範囲内で
ある。このような合成ポリペプチドは、好ましくはアミ
ノ酸残基数が４乃至１００のものである。

ある合成ポリペプチドが上記の基準（ｉ）を満足しさら
に基準（ｉｉ）を満たすかどうかは、ＰＥＣＡＭ−１活
性に関するアッセイによって機械的に決定し得る。かか
る活性には、化学誘引物質に応答した細胞の接着依存性
運動（化学走性）の媒介と内皮細胞同士の接着の媒介と
の二つがある。前者の活性は、ＯｈｔＯらの方払［８ｆ
ｏｏｄ，６６，　８７３−８８１頁（１９８５）コに従
い、問題の合成ポリペプチドに結合する抗体がはたして
Ｅ．　ｃｏｌｉエンドトキシンのような適切な刺激物質
に応答した好中球又は単中球の化学走性をも阻害するか
どうか、を調べることでアツセイできる。内皮細胞同士
の接着を媒介する能力は、同様にして、すなわちポリペ
プチドを認識する抗体が、分散させた内皮細胞が適当な
支持層に足場をもつことを阻害するかどうか及び／又は
以降の細胞間結合の形成を阻害するかどうかを試験する
ことによって機械的にアッセイできる。

ＰＥＣＡＭ変形体は、公知のドウノボ合成技術、及びＰ
ＥＣＡＭ−１分子自体の断片化によっても作製すること
ができ、また遺伝子工学技術を施し、ホストの形質転換
に用いる異種ポリヌクレオチドでコードされたＰＥＣＡ
Ｍ断片を発現するホスト細胞を産生ずることによっても
作製することができる。

ＰＥＣＡＭ−１又はＰＥＣＡＭ変形体の組換え体の発現
に使用する、ＰＥＣＡＭ−１又はＰＥＣＡＭ変形体をコ
ードするポリヌクレオチド分子は、好ましくは選択した
ホスト（以降の記載を参照）に対し、コドン使用、翻訳
開始、最適グリコシル化、並びに製品として有用なテの
ＰＥＣＡＭ−１又はＰＥＣＡＭ変形体の発現、に関して
最適化した（所望のアミノ酸配列に対応する）塩基配列
を含むものである。選んだホストをかかるポリヌクレオ
−チド分子で形質転換させるために選択したベクターは
、有効に維持でき、しかも該ポリペプチドをコードした
配列を効率的に発現させるものでなくてはならない。

形質転換に一般に用いられているホストの中で、本発明
において好ましいものは、第１図に示した部位でグリコ
シル化をなし得る真核生物である。かかる真核生物は、
各々サツ力ロミセス（　　ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
）　、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）　、クルイベロミセス（
κＩｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　）種を用いる発現系を含
めた、酵母発現系で例示される。例えば、米国特許第４
４５６０８２号及び第４８３７１４７号（サツ力ロミセ
ス）：米国特許第４８５５２３１号、第４８０８５３７
号、及び第４８５７４６７号（ビキア）；並びに米国特
許第（タルイベロミセス） ４８０６４７２号及び第４８５９５９６号を参照された
い。

形質転換に適した酵母株の選択は、用いたベクターの選
択マーカー及び他の特性によって大部分決定される。ま
た、治療用の組換えＰＥＣＡＭ分子は該分子をグリコシ
ル化したホスト関連炭水化物部分に対するアレルギー反
応を引き起こす恐れがあるので、グリコシル化の少ない
異種ＰＥＣＡＭタンパク質を生産する能力によってホス
トを選択するのが有利であろう。かかるＰＥＣＡＭ生産
ホスト細胞を選択したら、次に特異的クローンをスクリ
ーニングして、多様なグリコシル化のパターンの中から
治療用に最適な種類のものについて選択する。本発明に
使用するのに適した酵母株の例としては、遺伝子型がａ
　ｔｒｙｌ　ｇａｌｌ　ａｄｅ１　ｈｉｓｌのＸ２１８
１−１Ｂ株［イースト・ジエネティック・ストック・セ
ンター（Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｔｏｃｋ　Ｃ
ｅｎｔｅｒ１カリフオノレニア州バークレイ）から入手
可能］、遺伝子型がａ　　ｈｉｓ２　ａｄｅ１　ｔｒｙ
１　ｍｅｔ１４　ｕｒａ３のＡＴＣＣ　５２６８３株［
ａｋａ　”Ｊ１７株゛、アメリカン・タイプ・カルテャ
−］レクション（＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌ
ｔｕｒｅ　Ｃｏｔｅｃｔｉｏｎ　、メリーランド州ロッ
クビル）から入手可能Ｊ、遺伝子型がａ　ｈｉｓｌ　ｔ
ｒｐｌの＾ＴＣＣ　４６１８３株（　ａｋａ　”ＩＬ１
６６−５８株″、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクションから入手可能）、が挙げられる。

本発明における別の種類の好ましい発現系としては、ポ
リヌクレオチドで形質転換した噛乳類のホスト細胞が含
まれる。この目的に使用できる、ホストとして適当な噛
乳類細胞の例としては、ＵｒｌａＵｂ及びＣｈａｓｉｎ
［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ
ＳＡ７７．　４２１６頁（１９８０）　］によって記載
されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；受
託番号ＡＴＣＣＣＣＬ　１０で寄託されている細胞系統
及び別の＾ＴＣＣＣＣＬ　７０系統で例示される新生ハ
ムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞；受託番号ＡＴＣＣ　ＣＲ
Ｉ．　１６５１　（　ａｋａ　”ＣＯ３７゛゜）で寄託
されている系統で例示される、ＳＶ４０で形質転換した
サル腎＠　ＣＶ１細胞；　Ｇｒａｈａｇ＋他［Ｊ．Ｇｅ
ｎ．　Ｖｉｒｏｌ．３６．　５９頁（１９７７）　］に
よって記載された細胞系統に代表される種類のヒト胎児
腎臓細胞：Ｈａｔｈｅｒ［Ｂｉｏｌ．　Ｒｅｐｒｏｄ．
　２３，　２４３−２５１頁（１９８０）　］によって
記載されたマウスセルトリー細胞；受託番号ＡＴＣＣ　
ＣＲＬ　１５８γ（　ａｋａ　”ＶＥｆｉＯ−７６”）
で寄託されている系統で例示される、アフリカミドリザ
ル腎臓細胞；ヒト子宮頚がん（ＨＥＬＡ）細胞（例えば
ＡＴＣＣＣＣＬ　２系統）；＾ＴＣＣ　３４組リ゛’Ｈ
ＤＣκ″）で寄託されている種類のイヌ腎臓細胞；＾Ｔ
ＣＣ　ＣＲＬ　１４４２（ａｋａ’“ＢＲＬ　３Ａ”）
の系統で例示されるようなバッファローラット肝臓細胞
；　ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　７５　（匹”Ｗ１３８”）の系
統で代表されるようなヒト肺細胞；ヒト肝細胞（例えば
Ｈｅｐ　Ｇ２、ＨＢ　８０６５）　；　ＡＴＣＣ　ＣＣ
Ｌ５１　（　ａｋａ　”ＨＨＴ　０６０５６２”）で寄
託されている種類のマウス乳がん細胞：並びにＨａｔｈ
ｅｒ他［Ａｎｎ．　ＮＹ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　３
８３．　４４頁（１９８２）　］によって記載されてい
るようなＴＲＩｌ［ｌ胞、などが挙げられる。

本発明において、酵母発現系と噛乳類発現系のどちらに
対しても用いることのできる形質転換及びスクリーニン
グの慣用的ブロトコールが存在する。この点に関する標
準的技法は、ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ
’　ＨＯＬＥＣＵＬ＾Ｒ　ＢＩＯＬＯＧＹの第９章（＠
乳類細胞）と第１３章（酵母細胞）、及び上記引用文献
中に詳細に記載されている。例えば後述するように、適
切なＰＥＣＡＭ特異性を示−ｉ　ＨＡｂを用いることに
よって、機能的ＰＥＣＡＭ−１又はＰＥＣＡＭ変形体の
発現に関して形質転換細胞を選択することができる。

本発明のポリヌクレオチドを酵母細胞に導入するために
最も普通に用いられるプロトコールである酢酸リチウム
法は、アルカリカチオンによって酵母細胞膜がＤＮＡに
対して透過性になること、さらには外来ＤＮＡの取込み
がポリエチレングリコールのような高分子量の分子の存
在によって促進されるという事実、を活用したものであ
る。別の方法であるスフェロブラスト形質転換法を用い
ることもできるが、酢酸リヂウム法よりも時間がかかる
。ただし、この方法を用いると加えたＤＮＡ当りの形質
転換の効率が高まる。

本発明のポリヌクレオチドを補乳類細胞に導入して、Ｐ
ＥＣＡＭ−１又はＰＥＣＡＭ変形体を発現する組換え細
胞を作製することは、リン酸カルシウム又はＤＥＡＥ−
デキストラントランスフエクションによるような慣用的
手順で達成できる。Ａｕｓｕｂｃｌの上記文献第９章を
参照されたい。本発明のこのような組換え細胞が発覗す
ると回収可能な范のＰＥＣＡＭ−１又はＰＥＣＡＭ変形
体が得られる。

後述のように、ＰＥＣＡＭ−１は、Ｌｅｅ他［Ｊ．　Ｅ
ｘｐＨｅｄ．　１６８．１１９３−［９８頁（１９８８
）　］によって血清学的に特徴付けられてはいるが回収
可能な状態で得られたことのない「ｃＤ３１Ｊと叶ばれ
る抗原に、少なくとも免疫学的に関連している。ＣＤ３
１は様々な種類の白血病において特異な発現をするので
、白血病の種類に対する指標として使用できる。ＰＥＣ
ＡＭ−１も同様にして白血病の指標として有用であり、
またＰＥＣＡＭ−１又はＰＥＣＡＭ変形体をコードする
ポリヌクレオチドに基づいて、様々な白血病の状態の分
類に使用し得る標識オリゴヌクレオチドプローブ（　１
”ＰＥＣＡＭブローブ」）を設計することもできる。

この種のＰＥＣＡＭブローブは、ＰＥＣＡＭ−１又はＰ
ＥＣＡＭ変形体をコードするポリヌクレオチドと相補的
なオリゴヌクレオチドの断片でもよい。また合成オリゴ
ヌクレオチドをＰＥＣＡＭブローブとして使用すること
もできるが、これはＰＥＣＡＭ−１を又はＰＥＣＡＭ変
形体をコードするポリヌクレオチドに特異的であるよう
にするために、好ましくはヌクレオチドの長さが約１０
個以上のものである。核酸は患者血液又はｌｆｌ織生検
から単離し、標識ＰＥＣＡＭプローブとのハイブリッド
形成によって分析する。

かかるブローブは好ましくは、高抑制条件下、すなわち
ブローブの非特異的結合が最小となるようなく緩衝液イ
オン強度、温度、時間、などの）ハイブリッド形成と洗
浄の条件下で、ＰＥＣＡＭ−１をコードするヌクレオチ
ドとハイブリッド形成するものである。ブローブの設計
、ハイブリッド形成技法、及び高抑制条件に関しては、
Ａｕｓｕｂｅｌの上記文献、セクション６．３及び６．
４を参照されたい。ブローブを設計及び検出するために
、例えばＬａｎｄｅｇｒｅｎ他［Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４
１．１０７７−１０８０　（１９８８）］によって開示
されたりガーゼ媒介遺伝子検出（ＬＨＧＯ）　、及びＷ
ｏｆｆ　［　　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　
Ｓｃｉ．ＩＪｓＡ　８５　　８７９０−８７９４　Ｎ（
１９８８）］　ｋ：　ヨツＴＨ示サレた螢光共鳴エネル
ギートランスフ．−（ＦＲＥＴ）のような、別の手段を
用いることもできる。

ＰＥＣＡＭ−１は好中球の化学走性及び内皮細胞の細胞
間結合の形成においても癲能していると考えられている
。従って、ＰＥＣＡｌ４−１及びＰＥＣＡＭ変形体、特
に前述の可溶性レセプター型は、例えば腫瘍の進行にお
いて、好中球の化学走性及び内皮細胞間の結合の形成に
依存した脈管形成過程の調節に有用性を有することがわ
かる。

関連静脈において、いわゆる［抗感作（ａｎｔｉ−ｓｅ
ｎｓｅＮオリコヌクレオチドを、（ａ）ＰＥＣＡＭ−１
又はＰＥＣＡＭ変形体をコードするＤＮＡを含む塩基配
列もしくは（ｂ）ＰＥＣＡＭ−１又はＰＥＣＡＭ変形体
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む塩基配列に相
補的なポリヌクレオチドとして製造することもできる。

どちらのタイプのものにしても、本発明の抗感作オリゴ
ヌクレオチドの長さは、プロモーター配列（　ＤＮＡに
関しては）又はシャインーダルガルノ部位（　ＲＮＡに
関しては）が存在しない限り、さほど重要ではない。（
ａＪタイプの抗感作オリゴヌクレオヂドは、例えば第１
図に示したｃＤＮＡ挿入部の塩基配列に関する知識に基
づいて、ドゥノボで合成される。タイプ（ｂ）の抗感作
オリゴヌクレオチドも、ドゥノボ（　　ＤＮ八又はＲＮ
Ａ　）で、もしくはＰＥＣＡＭ−１又はＰＥＣＡＭ変形
休ｍＲＮＡに結合するＲＮＡに構造的に転写されるＤＮ
Ａで適当なホスト細胞を形質転換することによって、作
ることができる。本発明の　（ａｌタイプオリゴヌクレ
オチド及び　（ｂｌタイプオリゴヌクレオチドはどちら
も、細胞表面上のＰＥＣＡＭ−１の発現の「ダウンレギ
ュレーション」（抑制）剤、もしくは転写［タイプ（ａ
）］又は翻訳［タイプ（ｂ）］阻害剤としての有用性を
期待できる。

ＰＥＣＡＭ−１及びＰＥＣＡＭ変形体、もしくは１種以
上のこれらのポリペプチドに対する抗体は、転移性の病
気に有用性を有すると期待できる。ここにおける「抗体
」とは、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体とを
包含する。かかる抗体はどんなクラス（　　［ｇＧ、ｒ
（ｌ｝ｌ，　　ＩＩ；ｌ＾など）に属する抗体であって
もよい。モノクローナル抗体（　ＨＡｂ）の作製に関し
ては、一般にリンパ球を単離してそれらを骨髄腫細胞と
融合させてハイブリドーマを作ることによって進めるこ
とができる。クローニングしたハイブリドーマを次に「
抗ＰＥＣＡＭ　Ｊ抗体、すなわちＰＥＣＡＭ−１　　（
未切断型又は成熟型）もしくはＰＥＣＡＭのどちらかに
優先的に結合する抗体の産生に関してスクリーニングす
る。「抗体」には、抗ＰＥＣＡＭ抗体のＦ（ａｂ）及び
Ｆ（ａｂ’）２のようなフラグメント、及びかかるフラ
グメントの結合体、及び例えば米国特許第４７０４６９
２号の記載に従って抗ＰＥＣＡＭ抗体から得られるいわ
ゆる「抗体結合タンパク質」　（単鎖抗体）も含まれる
。

本発明において、ＨＡｂ又はそのフラグメントはまた別
に、そのようなＨＡｂの可変部をコードする単離　ＤＮ
八を、　Ｅ．　　ｃｏｌｉ　［Ｗａｒｄ他、Ｎａｔｕｒ
ｅ　３４１，５４４−５４６頁（１９８９）　］又はマ
ウス骨髄腫細胞［　Ｇｉｌｌｉｅｓ他、Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ．　７，　７９９−８０４頁（１９８９）及びＮ
ａｋａｔａｎｉ他、同上、８０５−８１０頁］のような
ホスト細胞中で発現させることによる慣用的手順で作る
こともできる。さらに、Ｆａｂ分子はＥ．　ｃｏｌｉの
ような遺伝学的に形質転換されたホスト中で発現及びア
ツセンブリさせるこどもできる。従って、λベクター系
を、元の抗体を産生ずるものと同じもしくはそれ以上の
多様性に富んだ一群のＦａｂを発視させるのに利用し得
る。Ｈｕｓｅ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４６．１２７５−
１２８１頁（１９８９）参照。

ＰＥＣＡＭ−１又はＰＥＣＡＭ変形体に対する抗体は、
例えば上記ハイブリドーマを使用することによって、慣
用的手法による抗イディオタイプ抗体（抗ＰＥＣＡＭ抗
体に結合する抗体）の作製にも使用することができる。

例えば米国特許第４６９９８８０号参照。

かかる抗イディオタイプ抗体は、抗ＰＥＣＡＭ抗体を個
体内で隔離するのに使用でき、そうすることによって、
その個体の免疫系によってＰＥＣＡＭ−１が１非自己」
として認識される免疫応答に関連して起こる恐れのある
病理状態を処理又は防止に用いることができる。

本発明を以下の例示的な実施例に照らしてさらに詳細に
説明する。

実施例１　　　ＰＥＣＡＭ−１含有溶解物の調製、及び
血小板膜タンパク質に対する多特異性ポリクローナル抗
体の産生 ヒト血小板膜内在性タンパク質の濃縮された溶解物をＮ
ｅｖｍａｎ他［Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅｓ．　２７
，　２２１−２２４（１９８２）］に従って調製し、そ
の溶解物に対する多特異性ポリクローナル抗体をＮｅｗ
ｉａｎ他［Ｊ．　ＣｅｌｌＢｉｏｌ．　１０３．　８１
−８６　（１９８６）　］に従って調製した。

すなわち、血小板濃縮物は何単位ものヒト全面の分画遠
心によって得、血小板膜はその濃縮物から超音波処理及
び分画遠心によって調製した。

Ｎｅｗｌａｎ他、Ｊ．　　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　　９
０，　　２４９−２５３　（１９８１）参照。１単位の
血小板膜から５乃至８　ｕのタンパク質を含む膜のベレ
ットが得られる。このペレットを、１％トリトンｘ−１
００　（シグマ・ケミカル・カンパニー、ミズーリ州セ
ントルイス）及びさらにプロテアーゼインヒビターとし
て０．４　１ＩＩＨのフエニルメチルスルフォニルフル
オリドと５Ｉｌｌｇを含む２献の１Ｏ　ｎ＋Ｈ　丁ｒｉ
ｓ１１５０　ｍＨ　ＮａＣｌ　（ｐＨ　７．４）中に溶
解させた。簡単に超音波処理して膜の塊を分散させた後
、氷上で６０分間可溶化処理を行った。

このトリトンで可溶化した膜を次に１０００００　ｘ　
ｇで６０分間遠心し、２００μｇの上清を１ｄボリスチ
レン製フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）遠心チューブ中の
３００μ１の６％シヨ糖クッションの上に注意深くのせ
たくフィッシャー５９型マイクロ遠心ｔａ＞。このチュ
ーブを３１℃で５分間インキユベートして界面活性剤の
曇り点より上に温め、次に１５００　Ｘ　Ｑで５分間遠
心して生じた大きなタンパク質一界面活性剤混合ミセル
塊をベレットとした。シヨ糖クッションの上に残った水
相を取ってＯ℃に冷却し、氷冷したトリトンＸ−１１４
を終濃度で１％となるように加えて再抽出した。上記の
ように、この溶液を再び温め、６％シヨ糖クッションの
゛上にのせて遠心した。シヨ糖クッションの下の黄色い
油状の液滴として界面活性剤相を回収した。

界面活性剤相と水相双方を先ずタンパク質濃度について
アツセイし、次にＳＯＳ可溶化溶液（４％ＳＤＳ，　１
００　ｍＨ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　、ｐＨ　６．８、１０
％グリセロール、０．００１％プロモフェノールブルー
）で１：１に稀釈した後にＳＤＳポリアクリルアミドグ
ル電気泳動で分析した。還元型試料には、２−メルカブ
トエタノールを終濃度で５％加えた。試料を５分間沸騰
させた後、各レーン当り５−５０μｇのタンパク質を７
％ＳＯＳボリアクリルアミドスラブゲルにのせて、３０
０１Ａでおよそ３時間電気泳動を行った。泳動後、Ｍｅ
ｒｒｉｌ他の方法ＥＳｃｉｅｎｃｅ　２１１，１４３７
−１４３８　（１９８１）　］に従って、ゲルを固定し
銀染色した。

ポリクローナル抗血清は、上記濃縮溶解物を１か月に２
度ウサギに皮内注射することによって調製した。精製Ｉ
ｇＧは従来通り硫安分画とＤＥＡＥセルロースクロマト
グラフィーの組合せで得た。得られた標品の特異性は、
公知の方法に従って、放射性ヨウ素で標識した可溶化血
小板の免疫沈降、可溶化した全血小板に対する交差免疫
電気泳動、並びにウエスターンプロット分析、で確認し
た。例えばＡｕｓｕｂｅｌの上記文献、セクション１０
参照。

実施例２　　　ＰＥＣＡＭ−１をコードするクローンの
ＣＤＮＡライブラリーの抗体スクリーニング、及びＰＥ
ＣＡＭ−１特異性抗体のエピトープ選択このようにして
調製したポリクロー太ル抗体を用いて、永久内皮細胞／
肺がん腫ハイブリッド細胞系統のＥＡ’ｈｙ　２９６［
　Ｅｄｇｅｌ、Ｐｒｏｃ．　ＮａｔｌＡｃａｄ．　Ｓｃ
ｉ．　ＵＳＡ　　８０．　３７３４頁（１９８３）に記
載〕から作製したｃＤＮＡλｇｔ１１発現ライブラリー
をスクリーニングした。特に、抗体陽性クローンの同一
性は、例えばＨａｌｌ他の［　Ｎａｔｕｒｅ　３１１，
　３７９頁（１９８４）　］の開示した、ブラーク精製
した抗体陽性クローンからの固定化したβ−ガラクトシ
ダーゼ融合タンパク質を用いて、各融合タンパク質の特
異的エピトーブに結合し得る抗体を多特異性抗血清から
選択するという、「エピトーブ選択ｊ法によって決定し
た。

この方法で２つのクローン、８Ｂ及び８Ｃが、単一の１
３０　ｋｄ血小板タンパク質とイムノプロット上で反応
する選択された抗体で同定された。１３０　ｋｄタンパ
ク質を同じ分子但範囲の公知の血小板膜糖タンパク質か
ら単離するために、非運元／遠元条件下で二次元ゲル電
気泳動を行ってクローン８Ｂ及び８Ｃでコードされるタ
ンパク質の正確な特徴付けができるようにした。

より詳細には、１．６　ｋｂの挿入を含むバクテリオフ
ァージλｇｔ１１をＥ．　ｃｏｌｉ　１０９０株上でお
よそ５００００　ｐｆｕ／プレートの密度まで増殖させ
、イソブロビルチオガラクトシドでそのβ−ガラクトシ
ダーゼ融合タンパク質の発現を誘導した。１５０　ｍｎ
＋径のニトロセルロースをプレートに３時間重ねて、誘
導されたファージタンパク質を吸着させた。未結合部を
ゼラチンでブロツクした後、ヒト血小板膜内在性タンパ
ク質に対して免疫したボリクローナルなウサギ抗血清で
ニトロセルロース膜をインキユベートして、発現した各
エビトーブに対する特異的抗体群が固定化融合タンパク
質に特異的に結合するようにする。エピトープ選択した
抗体ＥＳ８Ｂは、十分に洗浄した後、ｐＨ　２．３のグ
リシン−ＩＣ　＋でニトロセルロース膜から溶出させ、
Ｔｒｉｓ塩基で中和し、全血小板溶解物のウエスターン
プロットと反応させて、この抗体が１３０　ｋｄ血小板
タンパク質の単一タンパク質スポットに対して有する特
異性を明らかにさせた。結合は、アルカリフォスフ７タ
ーゼを結合ざせた第二の抗体を用い、５−ブロモー４−
クロロ−３−インドイルリン酸／ニトロブルーテトラゾ
リウム塩の基質対で発色させた。

実施例３　　　ＰＥＣＡＭ−１の特徴付け、及びエピト
ーブ選択抗体による結合 クローン８８からエピトーブ選択した抗体は、このよう
にウエスターンプロット上でＰＥＣＡＭ−１と単一のタ
ンパク質スポットとして反応したが、このスポットはＧ
ＰＩａ，　　ＧＰＩＩａ，ＧＰ［ｂ，及びＧＰＩＩＩａ
を含めた他の血小板膜タンパク質とははっきりと異なる
ものであった。このようにして識別されたタンパク質Ｐ
ＥＣＡＭ−１は、還元剤によって電気泳動度の影響され
ないタンパク質群によって形成される斜行線よりも僅か
に上方に泳動された。このことはこの単離されたタンパ
ク質が鎖内にジスルフィド結合を含む単鎖のタンパク質
であることを示している。

ＰＥＣＡＭ−１に当てはまることの判明した様々な生化
学的特徴は、高度にグリ］シル化された主要な膜表面糖
タンパク質と一致していた。従って、インタクトな血小
板をトリブシン、ノイラミニダーゼ、及びトグリカナー
ゼで処理すると単離したＰＥＣＡＭ−１ポリペプチドの
分子量がかなり低下することが、その後洗浄し界面活性
剤で溶解した血小板のウエスターンプロット分析で判明
する。このように分子ｌが低下することは、ＰＥＣＡＭ
−１がかなりグリコシル化されており、ＰＥＣＡＭ−１
のタンパク質部分がトリブシン加水分解を受けやすい暴
露されたアミノ酸配列を含んでいることを示している。

ＰＥＣＡＭ−１は、インタクトな血小板を過ヨウ素酸塩
／［３　旧水素化ホウ素ナトリウムで処理する炭水化物
特異的標識で効率良くラベルされ、またこれよりも効率
は悪いがラクトペルオキシダーゼで触媒される表面の放
射性ヨウ素化によってもラベルされる。種々の十分に特
徴付けられた血小板膜糖タンパク質に対する抗体ブロー
ブを用いた、半石論的比較用ウエスターンプロット分析
はＰＥＣＡＭ−１が主要な膜成分であることを示した。

ＰＥＣＡＭ−１はクーマシーブルーを用いた場合僅かに
しか染色されないが、このことがＰＥＣＡＭ−　１がこ
れまで生離されず、特徴付けられてこなかった一因であ
ろう。

ＰＥＣＡＭ−１と同様の大きさ及び等電点を有する血小
板及び内皮細胞表面糖タンパク質に対して予め作製して
おいた一連のモノクローナル抗体を、ＰＥＣＡＭ−１分
子との反応性について試験した。これらのモノクローナ
ル抗体の内の２つ、すなわち抗ＣＤ３１と抗ｈｅｃγ抗
体はＳＯＳ−ＰＡＧＥゲル上でＰＥＣＡＭ−　１と同じ
泳動度の血小板タンパク質と反応した。前述のように、
ＣＤ３１はその構造と鏝能が未だに特徴付けられていな
い白血球分化抗原であって、ヒト血小板、内皮細胞、顆
粒球、及び単球上に存在すると報告されている（ただし
、これらから回収可能な吊で得られたことはない）。Ｋ
ｎａｌ）ｌ）他、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｏｙ　Ｔｏｄａｙ　
　１０，　２５３頁（１９８９Ｊ参照。ｈｅｃ７抗原は
、これも回収可能な量で単離されたことはないが、ヒト
血小板の細胞間結合に局在化していると報告されテイる
。Ｍｕｔｔｅｒ他、Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｈｅｄ．１７０，
　３９９頁（１９８９）参照。

ｈｅｃ７及びＣＤ３１抗原を含む標品を、それぞれのモ
ノクローナル抗体との免疫沈降でヒト内皮細胞溶解物か
ら調製した。ＨＡｂは−ｉ１ｌｉａｍ　Ａ．　Ｈｕｌｌ
ｅｒ博士（ロックフェラー・ユニバーシティ》、及びＳ
ａｎｎａ　Ｈ．　ｃｏｙｅｒｔ博士（コーネル・ユニバ
ーシティ》から提供されたものである。抗ＰＥＣＡＭ抗
血清とのイムノブ口ツティングでこれらの標品を分析す
ると、ＰＥＣＡＭ−１　、ＣＤ３１抗原、及びｈｅｃ　
７抗原が少なくとも免疫学的に関連していることが示唆
された。実施例４　　　ＰＥＣＡＭ−１をコードする塩
基配列の決定 クローン８Ｂから（７）１．６　ｋｂ（７）ｃＤＮＡ挿
入部分ヲｐｕｃ１８由来のブラスミドｐＴ７１８ｒ中に
サブクローン化した。次に、例えばＡｕｓｂｅｌの上記
文献、セクション６．３に開示ざれた公知の手順に従っ
て、８Ｂ挿入部を２３の追加クローンを同定するための
ブローブとして用いた。これらの追加クローンは、続い
て公知方法に従った制限マッピング及びハイブリッド形
成分析で特徴付けた。これらのクローンの内の２つ、６
−４（第１図の１番目のヌクレオチドから１１７０番目
のヌクレオチドまで）、及び６−２（　　７１５番目の
ヌクレオチドから２５５７番目のヌクレオチドまで）は
重複しており、第１図に示したＰＥＣＡＭ−１をコード
する全配列を含んでいることが判明した，前述のように
、２５５７　ｂｌ）のＰＥＣＡＭ−１は、成熟型タンパ
ク質をシグナルペブチドをコードする２２１４　ｂｐの
配列に加えて、１４ｌ　ｂ＋１の５゛不翻訳（旧）領域
と２０２　ｂｐの３゜ＵＴ領域を含んでいる。５’ＵＴ
領域は、各々９５番目の塩基と　１４２番目の塩基から
始まる２つの真核生物開始（ＡＵＧ）コドンを含んでい
る、これらのコドンの側には共にＴ残基が大幅に欠け、
−３の位置にプリンを有することによってタンパク質合
成の開始を調節する［コザック　（κｏｚａｋ）配列．
から成るヌクレオチドが位置している。Ｋｏｚａｋ他、
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．　　１５．　８１
２５頁（１９８７）参照。

コザック配列中に位置する多くの上流開始コドンに見ら
れるように、ＰＥＣＡＭ−１をコードするヌクレオチド
配列の９５塩基目の＾ＴＧはその直ぐ１５塩基下流にＴ
ＡＡ終結コドンが続いている。この配置は、恐ら＜１５
ｂｐの「ミニシストロン」が翻訳されて終結し、その後
リボゾーム上で１４２塩基目から再び翻訳が開始されて
２３５６塩基目の終結コドンまで翻訳が続くことを示唆
している。

実施例５　　天然の材料からのＰＥＣＡＭ−１の精製回
収可能な量の実質的に純粋なＰＥＣＡＭ−１を血液血小
板から以下のようにして単離した。血小板は従来の手法
に従い全面から分画遠心によって調製した。血小板はＴ
ＢＳ　（２０　ｍＨ　Ｔｒｉｓ，　１５０　ｍＨ　　Ｎ
ａＣＩ、１　ｉＨ　　ＥＤＴＡ，　ｐＨ　７．４）中で
数回洗浄し、次にプロテアーゼインヒビター（０．４ｍ
Ｈフエニルメチルスルフォニルクロリド、１０　　μＨ
口イペブチン）存在下に１％トリトンｘ−ｉｏｏ及び１
　　ｍＨ　ＣａＣｌ２を含むＴＢＳ中で可溶化した。こ
の混合物を次に１５０００×ｇで３０分間遠心して不溶
物を沈殿させ、その上清を次にコンカナバリンＡセファ
ロース力ラムに加えて他のすべての糖タンパク質を除い
た。このカラムの非吸着流出物を抗ｈｅｃ７抗体をセフ
７ロース力ラムに結合させたＰＥＣＡＭ−１特異性免疫
アフィニテイー力ラムにかけた。

ＰＥＣＡＭ−１は次にｐＨ　２．４の１００■Ｈグリシ
ン／　ＨＣ及び０．　１％　ｉ−リトンＸ−１００を含
む溶液を少蚤流して４ 溶出させた。溶出液はトリス塩基で中和し、純度を確認
するためにＳＯＳ−ＰＡＧＥで分析した。さらに蹟製が
必要な場合は、上記溶出液を小麦胚芽凝集素カラムに吸
着差せて０．３８Ｎ−アセチルグルコサミンで溶出させ
た。このようにして回収可能な量のＰＥＣＡＭ−１を、
運元条件下でも非運元条件下でもＳＯＳ−ＰＡＧＥゲル
上で単一バンドとして泳動される標品として得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明における血小板膜糖タンパク質（ＰＥ
ＣＡＭ−１）の一次構造を、該一次構造をコードする塩
基配列と共に示したものである。下線部は上記成熟糖タ
ンパク賀の推定上の疎水性シグナルペブチド及び膜貫通
ドメインである。元々存在する２つのＥｃｏ　Ｒ１部位
は四角で囲んである。ＰＥＣＡＭ−１の外部ドメイン全
体にわたり、ほぼ５０残基づつ離れて位置するシステイ
ン残基は円で囲んであるが、これらのシステイン残基は
個々の免疫グロブリン相同単位内でのジスルフィド結合
の形成に関与していると思われる。予想されるグリコシ
ル化部位は黒三角で示してある。６８６残基目の潜在的
チロシンリン酸化部位は黒丸で示してある。ＴＡＧ終結
コドンは太線で下線を引いてある。 第２図は、ＰＥＣＡＭ−１を前述の幾つかの他のＣＡＭ
分子と共に、細胞膜（網点部分）と関連させて、図説的
に描いた図である。円形の部分は個々の免疫グロブ’Ｊ
ン相同単位を表す。Ｗｉｌｌｉａｍｓ，　Ｉｍｍｕ−ｎ
ｏｌｏｎ　Ｔｏｄａｙ，　８　，２９８頁（１９８７）
の分類によると、Ｎ末端にＶ型ドメインを一つ有するＣ
Ｆ八を除いては、ここに描いたＣＡＭはＣ−２型ドメイ
ンから成るものである。ファシクリンＩＩ及びＮ−ＣＡ
Ｍにおける躾に隣接する斜線枠はフイブ口ネクチンタイ
ブＩＩ■ドメインを表す。ＰＥＣＡＭ−１上における推
定上のＮ一結合した炭水化物鎮は（一》という記号で表
した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）回収可能な量のＰＥＣＡＭ−１を含む組成物。 （２）前記組成物が実質的に純粋な形のＰＥＣＡＭ−１
   であることを特徴とする請求項１記載の組成物。 （３）前記組成物が約５０ｎＭ以上の濃度のＰＥＣＡＭ
   −１の水溶液であることを特徴とする請求項１記載の組
   成物。 （４）前記ＰＥＣＡＭ−１が成熟型ＰＥＣＡＭ−１であ
   ることを特徴とする請求項１記載の組成物。 （５）ＰＥＣＡＭ変異タンパク質、並びにＰＥＣＡＭ−
   １の一部に相当する又はＰＥＣＡＭ−１と一致はしない
   がその一部を含んで成る分子にして接着促進活性を呈す
   る分子、から成る群から選択したＰＥＣＡＭ変形体。 （６）前記変形体は、ＰＥＣＡＭ−１の細胞外部分に相
   当するもしくは該細胞外部分を含んで成るが、ＰＥＣＡ
   Ｍ−１の細胞膜貫通部分及び細胞内部分には相当せずし
   かも含みもしないことを特徴とする請求項５記載のＰＥ
   ＣＡＭ変形体。 （７）前記細胞外部分がＧｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｓｅ
   ｒ−ＰｈｅのＮ末端を含んで成ることを特徴とする請求
   項６記載のＰＥＣＡＭ変形体。 （８）前記細胞外部分が５７４残基のアミノ酸配列を有
   することを特徴とする請求項７記載のＰＥＣＡＭ変形体
   。 （９）前記細胞外部分が、添付図面の第１図のアミノ酸
   １−５７４に相当するアミノ酸配列を有することを特徴
   とする請求項８記載のＰＥＣＡＭ変形体。 （１０）変形体がＰＥＣＡＭ変異タンパク質であること
   を特徴とする請求項５記載のＰＥＣＡＭ変形体。 （１１）前記ＰＥＣＡＭ変異タンパク質がＧｌｎ−Ｇｌ
   ｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−ＰｈｅのＮ末端を含んで成ること
   を特徴とする請求項１０記載のＰＥＣＡＭ変形体。 （１２）前記ＰＥＣＡＭ変異タンパク質が５７４残基の
   アミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１０記載
   のＰＥＣＡＭ変形体。 （１３）ＰＥＣＡＭＡＭ−１のアミノ酸配列の一部を含
   んで成るアミノ酸配列を有するポリペプチド分子にして
   、 （ａ）前記ＰＥＣＡＭ−１のアミノ酸配列と一致せず、
   しかも （ｂ）ＰＥＣＡＭ−１活性を有することを特徴とするポ
   リペプチド分子。 （１４）前記アミノ酸配列はアミノ酸残基の長さが４乃
   至１００であることを特徴とする請求項１３記載のポリ
   ペプチド分子。 （１５）ＰＥＣＡＭ−１をコードする単離ポリヌクレオ
   チド分子。 （１６）ＰＥＣＡＭ−１変形体をコードするポリヌクレ
   オチド分子。 （１７）前記ＰＥＣＡＭ変形体がＰＥＣＡＭ−１の可溶
   性レセプター型であることを特徴とする請求項１６記載
   のポリヌクレオチド分子。 （１８）Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔ
   ｈｒ−ＩｌｅのＮ末端を有するタンパク質をコードする
   ポリヌクレオチド分子にして、添付図面の第１図に示す
   塩基配列の少なくとも一部分（ただし、該部分は少なく
   とも約１０個のヌクレオチドから成る）と相補的なオリ
   ゴヌクレオチドプローブと高抑制条件下でハイブリッド
   を形成することを特徴とするポリヌクレオチド分子。 （１９）前記タンパク質が約７９キロダルトン（ｋｄ）
   のポリペプチド分子量を有することを特徴とする請求項
   １８記載のポリヌクレオチド分子。 （２０）添付図面の第１図に示した塩基配列の一部に相
   当するもしくは該第１図に示した塩基配列の一部と相補
   的なオリゴヌクレオチドにして、ＰＥＣＡＭ−１又はＰ
   ＥＣＡＭ−１変形体をコードするＤＮＡ配列を発現する
   細胞中に該オリゴヌクレオチド又はその転写産物が存在
   すると該ＤＮＡ配列の転写又は翻訳が阻害されるような
   オリゴヌクレオチド。（２１）前記オリゴヌクレオチド
   がＲＮＡであって、しかも前記ＤＮＡ配列の翻訳を阻害
   することを特徴とする請求項２０記載のオリゴヌクレオ
   チド。 （２２）前記オリゴヌクレオチドがＤＮＡであつて、し
   かも前記ＤＮＡ配列の転写を阻害することを特徴とする
   請求項２０記載のオリゴヌクレオチド。