JPH03218397A - ポリペプチドおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 奮粟上支札址分り 本発明は、単純ヘルペスウイルス−１型（以下、ＨＳＶ
−１と略称）深山（Ｍｉｙａｍａ）株の表面蛋白ｇＢお
よびその誘導体の製造のための組換えＤＮＡに関する。

従』６鉱皮哲一 社会環境や生活様式の変化によってヘルペス脳炎、性器
ヘルペスなどの単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染症
が問題化してきている。

ほとんどのＨＳＶ感染は不顕性感染である。この感染し
たウイルスは三叉神経節に潜伏し、時としてこれが活性
化して発症するのである。今日、この発症を予防したり
、潜伏化を予防するためのワクチンの開発が望まれてい
る。

ＨＳＶには潜伏感染という性質や発癌性の疑いもあるた
めに、生ワクチンや不活化ワクチンは不適当であり、成
分ワクチンが望ましいと考えられている。ＨＳＶ粒子や
ＨＳＶ感染細胞から部分精製された糖蛋白ｇＢとｇＤは
ＨＳＶ−１と−２型に共通のエピトープを持っており、
ワクチンの免疫原として有望である。事実、ＨＳＶ−１
感染Ｖｅｒｏ細胞から精製されたｇＢを用いる成分ワク
チンはＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスにおけるＨＳＶ急
性感染と、それに続く三叉神経節での潜伏感染をも防御
しうろことが報告されている〔城野洋一郎：臨床とウイ
ルス，　１２，４４１（１９８４））。

最近、遺伝子工学的手法によってｇＢやｇＤが調製され
、ワクチン免疫原としてのそれらの可能性が調べられて
いる。すなわち、Ｐ　．　Ｗ　．　Ｂｅｒｍａｎら［サ
イエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２７．１４９０（１９
８４）］はチャイニーズハムスター卵巣細胞で産生され
たｇＤがモルモットにおけるＨＳＶ−２型の膣内感染を
防御することを報告している。また、Ｃ，Ｎｏｚａｋｉ
ら〔ウィルス　リサーチ（Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ．），４
，１０７（１９８５））は酵母で産生されたｇＢがマウ
スにおけるＨ　Ｓ　Ｖ一１型の腹腔内感染を防御するこ
とを証明している。さらに，最近Ｙ．Ｋｉｎｏら〔ワク
チン（Ｖａｃｃｉｎｅ，７，１５５　（１９８９））は
、このｇＢがマウスにおけるＨＳＶ一１型の角膜感染お
よびモルモットにおけるＨＳＶ−２型の腔内感染を防御
すると報告している。

しかしながら、これまでに知られている方法では、得ら
れるｇＢやｇＤは微量であり至適な発現レベルにあると
は言えない。

本発明者らは、遺伝子工学的手法を用いてより大量にＨ
ＳＶ−１型深山株の表面蛋白ｇＢを得ることを目的に鋭
意研究の結果、本発明を完成した。

が　　じょうとする ７ 上記のようにＨＳＶの表面蛋白を大量に生産する技術の
開発が望まれていた。

を　決するための手段 本発明者らはすでに知られているＨＳＶ−１型ＫＯＳ株
（Ｄ．Ｊ．Ｂｚｉｋら，ウィロロジ−（Ｖｉｒｏｌ．）
，１３３，３０１（１９８４））やＦ株（Ｐ，Ｅ，Ｐｅ
ｌｌｅｔｔら，ジャーナルオブウィロロジー（Ｊ．Ｖｉ
ｒｏ１），５３，２４３，（１９８５））のｇＢ遺伝子
の塩基配列の一部をＤＮＡプローブとして合成し、これ
を用いてＨＳＶ−１型深山株［Ｎｉｉ，Ｓ．，＆　Ｋａ
ｍａｈｏｒａ，Ｊ．　：ビケンジャーナル（Ｂｉｋｅｎ
　Ｊ．），４．７５（１９６１））のウイルスゲノムよ
りｇＢ遺伝子をクローニングした。

本発明はこのクローニングに基くもので、このたび解析
されたｇＢ遺伝子の塩基配列、それから推測されるアミ
ノ酸配列は新規なものである。本発明はｇＢ遺伝子が含
むポリペプチド、該ポリペプチドをコードする塩基配列
を含有する組換えＤＮＡ、該組換えＤＮＡを保持する形
質転換体、該形質転換体を培養することによる上記ポリ
ペプチドの製造法に関する。即ち本発明は、（１）その
−８ 分子中に下記式で表されるアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチド（Ｉ）： Ａｌａ　Ｐｒｏ Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇ
取Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　
Ａｌａ　Ａｌａ　ＡｓｎＧｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｌ
ａ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｌａ
　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　ＴｈｒＧ
ｌｙ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｙ
ｓ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ
　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ＰｒｏＰｒｏ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａ
ｌａ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｖａ
ｌ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ
Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａ
ｓｐ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｈ
ｒ　Ａｓｐ　Ａｌａ　ＡｓｎＰｈｅ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　
Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ａ
ｌａ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｐｈｅ　Ｇｌ
ｕＧｌｎ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　
Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａ
ｓｎ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　ＧｌｕＧｌｙ　Ｉｌｅ　Ａｌａ
　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　
Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌ
ｙｓＡｌａ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ
　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　
Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ　ＧｌｙＨｉｓ　Ａｒｇ　Ｔｙ
ｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ
　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　
ＶａｌＰｒｏ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｉｌ
ｅ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｌｙｓ
　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　ＡｒｇＳｅｒ　Ｔｈｒ　Ａ
ｌａ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ａｓ
ｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｐｈｅ
　ＨｉｓＡｒｇ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｔ
ｈｒ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒ
ｏ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ａｌａ　ＡｌａＴｈｒ　Ａｒｇ　
Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｈｉｓ　Ｔ
ｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ａｓ
ｎ　ＰｒｏＳｅｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　
Ｐｈｅ　｝Ｉｉｓ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　
Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｉｌ■ Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ａ
ｒｇ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ａｓ
ｎ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　ＶａｌＬｅｕ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　
Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｓ
ｅｒ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｒ
ｇＧｌｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　
Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａ
ｓｐ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　ＬｙｓＧｉｎ　Ｖａｌ　Ａｓｐ
、 （２）ポリペプチド（１）をコードする塩基配列を含有
する組換えＤＮＡ　（ＩＩ）　　：（３）組換えＤＮＡ
　（ｕ）を保持する形質転換体：および（４）組換えＤ
ＮＡ　（ＩＩ）を保持する形質転換体を培養し、培養物
中にポリペプチド（１）を生成蓄積せしめ、これを採取
することを特徴とするポリペプチド（１）の製造法を提
供するものである。

ポリペブチド（１）の一例としては、第２図に示される
ようなアミノ酸配列を含有するポリペプチドが挙げられ
る。

ポリペプチド（１）をコードする塩基配列を含有するＤ
ＮＡとしては第１図に示すものが一例として挙げられ、
そのＮＯ、３４１からＮｏ．　２９６２までが、その必
須部分に相当する部分である。

本発明方法におけるポリペプチド（Ｉ）をコードする塩
基配列を含有する組換えＤＮＡのうち、例えば発現型ベ
クターは、例えば（イ）ＨＳＶ−１型深山株からゲノム
ＤＮＡを分離し、（口）ゲノムＤＮＡを制限酵素Ｂａｍ
ＨＩで消化し、消化物を大腸菌で複製できるプラスミド
に組み込み、（ハ）得られた組換えプラスミドで宿主大
腸菌を形質転換し、（二）得られた形質転換体を培養後
、形質転換体から適当な方法、例えばＤＮＡプローブを
用いたコロニーハイブリタイゼーション法によって目的
とするＤＮＡを含有するプラスミドを単離し、（ホ）そ
のプラスミドから目的とするクローン化ＤＮＡを切り出
し、（へ）必要により該クローン化ＤＮＡを制限酵素処
理、ヌクレアーゼ処理、適当なリンカーの付加反応に付
した後、該クローン化ＤＮＡを、または該クローン化Ｄ
ＮＡの５′末端側に、ｇＢ本来のシグナル配列の代わり
に酵母で作動するシグナルペプチドのすべてまたは一部
をコードするＤＮＡを結合させたＤＮＡを、外来遺伝子
発現用ビークル中のプロモーターの下流に読み枠が一致
するように連結することにより、作製することができる
。

本発明に用いるベクター（例、プラスミド）とし１１ー ては、宿主に対応して複製可能なものであれば何でもよ
い。宿主が大腸菌である場合には、例えばｐ　Ｂ　Ｒ３
２２　［Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．，コールドスプ
リングハーバーシンポジウム（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　ＨａｒｂｏｒＳｙｍｐｏｓｉｕｍ），４３．７７（１
９７９））にプロモーターを挿入することによって外来
遺伝子発現用ビークルが得られる。宿主が酵母の場合に
は、例えばｐｓＨ１９（Ｈａｒａｓｉｍａ，Ｓ．ら、モ
レキュラーセルラーオブバイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．　），４，　７７１（１９８４））、ｐ
ｓＨ１９−１（ヨーロッパ特許出願公開ＥＰ−Ａ−１２
３５４３０）などが挙げられ、これらにプロモーターを
挿入することによって外来遺伝子発現用ビークルが得ら
れる。宿主が動物細胞の場合には、例えばｐ　Ｂ　Ｒ３
２２にＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウィルスの
プロモーターなどを挿入することによって外来遺伝子発
現用ビークルが得られる。

本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発
現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば
いかなるものでもよい。宿主が大腸菌である場合は、λ
Ｐ　プロモーター、λＰＲＬ −１２ー プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモータ
．Ｔ７プロモーターなどが好ましく用いられる。

宿主が酵母である場合は、ＧＬＤ（ＧＡＰＨ）プロモ・
一ター、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、
ＡＤＨプロモーター、ＧＡＰプロモータ、ＰＨ０８１プ
ロモーターなどが好ましく用いられる。宿主が動物細胞
である場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロ
ウィルスのプロモーターなどが挙げられる。

プロモーターは対応する遺伝子より酵素的に調製するこ
とができる。また、化学合成することもできる。

ポリペプチド（Ｉ）をコードするＤＮＡを発現させる発
現プラスミドは上記の発現用ベクターのプロモーターの
下流にポリペブチド（１）をコードするＤＮＡを挿入す
ることによって得られる。

このＤＮＡとしては、先に述べたように第１図に示すも
のが一例として挙げられる。

宿主が大腸菌の場合は、発現用ベクターとしては、たと
えばｐ　Ｔ　Ｒ　Ｐ　８０１　（Ｆｕｊｉｓａ＋ｙａ，
　Ｙら、ニュークレイックアシッズリサーチ（ＮｕＣ］
．ＡＣｊｄＳＲｅｓ．），１１．　３５８１（１９８３
）），　ｐ　ＴＢ２８１　（Ｔａｎｉｙａｍａ，　Ｙ．
ら、ジャーナルオブザタケダリサーチラボラトリーズ（
Ｊ．Ｔａｋｅｄａ　Ｒｅｓ．　Ｌａｂｓ．），４５，１
３６（１．９８６）），　ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ　ＬＫＢ，　Ｓｗｅｄｅｎ）などが挙げられ
る。宿主が酵母の場合の発現用ベクターとしては、たと
えばｐＰＨＯ１７、ｐＧＬＤ９０６、ｐＧＬＤ　９０６
−１、ｌ：Ｉｔｏｈ，Ｙ．ら，バイオケミカルアンドバ
イオフィジカルリサーチコミュニケーション（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ　．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕ
ｎ　．　）　，　１３８，　２６８　，　（１９８６）
）があげられる。宿主が動物細胞の場合の発現ベクター
としては、たとえばｐ　ｃ　Ｄ　ｘ　（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ　ＬＫＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）とｐ　ＭＡＭｎｅｏ（Ｔ
ｏｙｏｂｏ　Ｃｏ，　Ｌｔｄ．，　Ｊａｐａｎ）とを組
み合わせて用いることができる。この場合、ポリペプチ
ド（１）をコードするＤＮＡの下流にターミネーターを
挿入することによって該ＤＮＡの発現量を高めることが
できる。このターミネーターとしては、例えば酵母の場
合には、フオスフオグリセレートキナーゼ遺伝子（ＰＧ
Ｋ）、２μＤＮＡのＦ　Ｌ　Ｐ遺伝子、インベルターゼ
遺伝子（ＳＵＳ２）などのターミネーターが挙げられる
。

本発明における発現プラスミトを構築するための方法は
公知であり、文献たとえば〔モレキュラークローニング
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８２）
，コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃ０１ｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
）（１９８２）］に記載されている。

組換えＤＮＡ　（ＩＩ）により形質転換される宿主とし
ては、大腸菌、酢母、動物細胞などが挙げられる。大腸
菌としては、Ｃ６００，ＭＭ２９４，Ｎ４８３０−１，
ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳなどが挙げられる。

酵母としては、たとえばサツ力口マイセスセレビシエ（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
ＡＨ２２Ｒ−，　ＮＡ７４−３Ａ　（ρ−）　＋ＮＡ８
７−１１．Ａ．，ＤＫＤ−５Ｄなどが挙られるが、特に
、Ｓ．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの呼吸欠損株（ρ−）が
宿主として適している。

呼吸能を有する酵母（親株ρ＋）から呼吸欠損株（ρ一
）を得る方法自体は公知であり、例えば、〔［ラホラト
リーコースマニュアルフオーメ−１５− ソッズインイーストジェネティクス（Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ　Ｃｏｕｒｓｅ　Ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒ　Ｍｅｔｈ
ｏｄ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｊ．ｃＳ）」，コ
ールドスプリングハーバーラボラトリー　（Ｃｏｌ．ｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
），　（１９８６）：１に記載されている。即ち、親株
をエチジウムブロマイドを含む培地で培養したのち、炭
素源としてグルコースを含む培地では生育できるがグリ
セロールを含む培地では生育できない菌株を分離するこ
とによって呼吸欠損株を容易に得ることができる。また
頻度は低いが親株の単一コロニーの中から呼吸欠損株を
得ることができる。ここで言う親株が、発現プラスミド
を有する形質転換株（組換え体）の場合には、その呼吸
欠損株を得ることによって目的とする遺伝子発現量が高
い組換え体を直接に得ることができる。また親株が発現
プラスミドを保持しない場合には、その呼吸欠損株を得
たのち、これに発現プラスミドを導入することによって
目的の組換え体が得られる。

動物細胞としては、たとえばサル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅ
ｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨ一１６ー Ｏ，マウスＬ細胞，マウスミエローマ細胞，ヒトＦＬ細
胞などが挙げられる。

発現プラスミド（組換えＤＮＡ）を用いて大腸菌を形質
転換する方法は自体公知の方法、たとえばプロシージン
グス・オブ・ザ・ナショナルアカデミーオブサイエンス
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），
６９，２１１０（１９７２），ジーン，　１．７，　１
０７（１９８２）などに記載の方法に従って行われる。

組換えＤＮＡ　（プラスミド）を用いて酵母を形質転換
する方法は自体公知の方法、たとえばリチウム法（Ｈ．
Ｉｔｏら，「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ
．Ｂａｃｔｅｒｉｏ１．），１５３，１６３（１９８３
）），プロトプラスト法（Ａ．ｔＩｉｎｎｅｎら、プロ
シージングス・オブ・ザ・ナショナルアカデミーオブサ
イエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，Ｕ
ＳＡ），７５，１９２７（１９７８））などが挙げられ
る。動物細胞を形質転換するには、たとえばヴイロロジ
ー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　５２，４５６（１９７３）に
記載の方法に従って行なわれる。

このようにして得られた形質転換体（組換え体）をそれ
自体公知の方法で培養する。

形質転換体を培養する際、培養に使用される培地として
は液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生
育に必要な炭素源，窒素源，無機物その他が含有せしめ
られる。炭素源としては、たとえばグルコース，デキス
トリン，可溶性澱粉，シヨ糖など、窒素源としては、た
とえばアンモニウム塩類，硝酸塩類，コーンスチープ・
リカーペプトン，カゼイン，肉エキス，大豆粕，バレイ
ショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては
たとえば塩化カルシウム，リン酸二水素ナトリウム，塩
化マグネシウムなどがあげられる。

また、酵母，ビタミン類，成長促進因子などを添加して
もよい。

培地のｐＨは約６〜８が望ましい。

大腸菌用の培地としては、たとえばＬＢ培地〔モレキュ
ラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎ
ｇ）　　（１９８２），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ
ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），グルコースやカ
ザミノ酸を含むＭ９培地（Ｍｉｌｌｅｒ，ジャーナル・
オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー砦ジェネ
ティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅ
ｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
），４３１−４３３，　　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ
ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ
　　１９７２）　　］が好ましい。ここに必要によりプ
ロモーターを効率よく働かせるために、たとえばＩＡＡ
　（３β−インドリルアクリル酸），ＩＰＴＧ（イソプ
ロビル−１−チオーβ−Ｄ−ガラクシド）のような薬剤
を加えることができる。

培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要
により、通気や撹拌を加えることもできる。

酵母用の培地としては、たとえばパークホールダー（Ｂ
ｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔アメリカンジャーナル
オブボタニー（Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｂｏｔ．），　３０，　
２０６（１９４３））あるいはその改変培地〔Ａ．Ｔｏ
ｈｅら、ジャーナルオブバクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃ
ｔｒｉｏｌ．），　ＩＩＬ７２７（１９７３））　．ま
たは低リン酸培地（Ａ　．　Ｔｏｈｅら、ジャーナルオ
ブバクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｒｉｏｌ．），　１
１３，　７２７（１９７３））が挙げられる。培養は通
常約１５℃〜４０℃、好ましくは２４℃〜３７℃で１０
〜１６８時間，好ましくは２４〜７２時間行う。振どう
培養でも静置培養でもよいが、必要に応じて通気や攪拌
−１９− を加える。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する
際、培地としては、たとえば約５〜２０％の胎児牛血清
を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）１２
２，５０１（１９５２）），　ＤＭＥＭ培地〔ヴイロロ
ジー（Ｖｉｒｏ−１ｏｇｙ），８，３９６（１９５９）
），　Ｒ　Ｐ　Ｍ　Ｉ　１　６　４０培地〔ジャーナル
・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーショ
ン（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）　
１９９，５１９（１９６７）），１９９培地〔プロシー
ジング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオ
ロジカル・メデイスン（Ｐｒｏ−ｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ
　ｔｈｅ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）７３．　１　（１９
５０）］などが挙げられる。

ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０
℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気
や攪拌を加える。

本発明によれば、ＨＳＶ　　ｇＢ活性を有するペプチド
は通常の蛋白質抽出・精製法、例えばガラスビーズによ
り菌体破砕、遠心分離、塩析、等電点沈殿、ゲルろ過、
イオン交換クロマトグラフイ、高速液体クロマトグラフ
イー、アフイニテイ・２〇一 クロマトグラフィー、シヨ糖グラジエント超遠心、塩化
セシウムグラジエント超遠心などの精製工程を適当に組
み合わせることによって容易に精製することができる。

なお、本願明細書や図面において、塩基やアミノ酸など
を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　Ｃｏｍｍ
ｉｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅ
ｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における
慣用略号に基づくものであり、その例を次に挙げる。ま
たアミノ酸に関して光学異性体があり得る場合は、特に
明示しなければＬ一体を示すものとする。

ＤＮＡ　　：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸 ＲＮＡ　　：リボ核酸 ｍＲＮＡ：メッセンジャーＲＮＡ Ａ　　：アデニン Ｔ　　：チミン Ｇ　　：グアニン Ｃ　　：シトシン ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオ
キシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ：デオ
キシシチジン三リン酸 ＡＴＰ　　：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ　　：ドデシル硫酸ナトリウム ａｔｙ　　：グリシン（Ｇ） Ａｌａ　　：アラニン（Ａ） Ｖａｌ　　：バリン（Ｖ） Ｌｅｕ　　：ロイシン（Ｌ） Ｉ１ｅ　　：イソロイシン（Ｉ） Ｓｅｐ　　：セリン（Ｓ） Ｔｈｒ　　：スレオニン（Ｔ） Ｃｙｓ　　：システイン（Ｃ） １／２Ｃ　ｙ　ｓ　　：ハーフシスチンＭｅｔ：メチオ
ニン（Ｍ） Ｇｌｕ　　：グルタミン酸（Ｅ） Ａｓｐ：アスパラギン酸（Ｄ） Ｌｙｓ　　：リジン（Ｋ） Ａｒｇ　　：アルギニン（Ｒ） Ｈｉｓ：ヒスチジン（Ｈ） Ｐｈｅ　　：フェニールアラニン（Ｆ）Ｔｙｒ　　：チ
ロシン（Ｙ） Ｔｒｐ　：トリプトファン（Ｗ） Ｐｒｏ　　：プロリン（Ｐ） Ａｓｎ　　：アスパラギン（Ｎ） Ｇｉｎ　　：グルタミン（Ｑ） ＡＰｒ　：アンピシリン耐性遺伝子 Ｔｃｒ　：テトラサイクリン耐性遺伝子ＡＲＳ　　ｌオ
ートノマス・レプリケーション・シークエンス１　（ａ
ｕｔｏｎｏｍｏｕｓ　ｒｅｐｌｉｃａｔｊｏｎＳ６ｑｕ
ｅｎｃｅ　１　） なお、本発明のペプチドにおいては、そのアミノ酸配列
の一部が修飾（付加、除去、その他のアミノ酸への置換
など）されていてもよい。

走皿反登紘果 本発明で得られるＨＳＶ　　ｇＢはＨＳＶ感染細胞を原
料にして製造されるＨＳＶｇＢと同様の生物活性を有し
、ＨＳＶウイルスの予防のためのワクチンとして、また
診断用キットの材料とじて−２３− 用いることができる。

本発明方法によりＨＳＶ　　ｇＢを従来より安価で安全
に、しかも大量に製造することができる。

夫胤粁 以下の参考例および実施例により本発明をより具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない
。

後述の実施例４で得られた形質転換体サツ力口マイセス
セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）ＮＡ７４−３Ａ（ρ一）／ｐＨＳＢ１０６
は平成１年６月８日に通商産業省工業技術院微生物工業
技術研究所（Ｆ　Ｒ　Ｉ　）に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−
２４５７として寄託され、また該微生物は平成１年５月
２６日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号Ｉ
ＦＯ　　１０４７０として寄託されている。

後述の実施例６で得られた形質転換体サツ力口マイセス
セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）ＮＡ７４−３Ａ（／）−）／ｐＨｓＢ１０
６ΔＴｔｈは平成１年１１月２７日に通商産業省工業技
術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に受託番号ＦＥＲ
一２４− Ｍ　ＢＰ−２６６７として寄託され、また該微生物は平
成１年１１月１７日から財団法人発酵研究所（ＩＦ○）
に受託番号ＩＦ○　１０４９１として寄託されている。

後述の参考例１で得られたプラスミドｐＧＦＥ２１３を
保持するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ　Ｎ　Ａ　７４−３Ａ（ρ−）／ｐＧＦＥ２１３
は昭和６３年１０月１１日に通商産業省工業技術院微生
物工業技術研究所（Ｆ　Ｒ　Ｉ　）に受託番号ＦＥＲＭ
　ＢＰ−２０９５として寄託され、また該微生物は昭和
６３年９月１９日に財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に受
託番号ＩＦＯ　　１０４６０として寄託されている。

参考例１　発現ベクターの構築 公知の卵白リゾチームのシグナルペプチドのアミノ酸配
列（Ｊｕｎｇ，　Ａら、プロシージングスオブザナショ
ナルアカデミーオブサイエンス（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ
．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．，７７，　５７５
９（１９８０））を参考に第５図−１に示すような５′
末端にＸｈｏＩ、３′末端にＨｉｎｆＩの切り口と結合
するサイトがもうけられている合成ヌクレオチド配列を
用いる。全配列は６個のオリゴヌクレオチドブロック（
＃１，＃２，＃３，＃４，＃９，　＃１０）から成り、
これらはホスフオアミダイド法（　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ
，　Ｍ．　Ｈ．ら、テトラヘドロン　レターズ（　Ｔｅ
ｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）２２．１８５９
（１９８１））によって合成された。これらのオリゴヌ
クレオチドをＴ４ＤＮＡリガーゼで連結して改良型シグ
ナルペプチドとヒトＥＧＦのＮ末端側をコードする７６
ｂｐ　Ｘ　ｈ　ｏ１−Ｈｉｎｆｌ断片を調製した。プラ
スミドｐＴＢ３７０（谷山ら、「ジャーナルオブタケダ
リサーチラボラトリーズ（Ｊ．　Ｔａｋｅｄａ　Ｒｅｓ
．　Ｌａｂ．）Ｊ，４５，　１３６（１９８６），特開
昭６１−　８８８８１）によりＮ末端側が一部欠失して
いるヒトＥＧＦをコードする０．１６ｋｂ　Ｈｉｎｆ　
Ｉ−Ｐｓｔｌ断片を単離し、その５′末端に上記の７６
ｂｐ　Ｘｈ　ｏ　ｌ−Ｈｉ　ｎ　ｆ　Ｉ断片をＴ４ＤＮ
Ａリガーゼで連結したのち、ＸｈｏｌおよびＰｓｔＩで
処理し、０．２４ｋｂ　Ｘ　ｈ　ｏ　Ｉ　−　Ｐｓｔｌ
断片を単離した。この断片にＰｓｔｌ−Ｓｍａｌアダプ
ターをＴ４ＤＮＡリガーゼで連結したのち、Ｘｈｏｌお
よびＳｍａ　Ｉで処理し、改良型シグナルペプチドとヒ
トＥＧＦをコードする０．２４ｋｂ　Ｘｈ　ｏ　Ｉ−Ｓ
ｍａ　Ｉ断片を単離した。

ヒトリゾチーム遺伝子の発現プラスミドｐＧＥＬ　１２
５（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，　Ｋ．ら、バイオケミカルア
ンドバイオフィジカルリサーチコミュニケーション（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍ
ｍｕｎ．，１４５，　７１２（１９８７月の該遺伝子の
３′末端側のＸｈｏＩ部位をＸｈｏＩの部分分解によっ
て開裂させた後、Ｓｍａｌ認識部位をもつ合成リンカー
（５’　ＴＣＧＡＣＣＣＧＧＧ３’　）を結合させるこ
とによってプラスミドｐＥＲＩ８６０２を作製した。こ
のプラスミドをＸｈｏＩおよびＳｍａｌで切断して改良
型シグナルペプチドとヒトリゾチームをコードするＤＮ
Ａ断片を除去し、代りに上記の０．２４ｋｂ　ＸｈｏＩ
−Ｓｍａｌ断片を挿入してプラスミドＰＧＦＥＩＯＩを
得た（第５図−１）。

プラスミドｐＧＬＤＰ３１−ＲｃＴ　（ヨーロッパ出願
公開Ｅ　Ｐ　−　Ａ　−　０２３５４３０）よりＰＧＫ
ターミネーターを含む０．２８ｋｂ　Ａｈ　ａｍ−Ｘｈ
　ｏ　Ｉ断片を単離し、これをプラスミドｐ　Ｓ　Ｐ　
６４（Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ２７ー 社、米国）のＳｍａｌ−Ｓａｉ１部位に挿入し、ブラス
ミドｐＳＰ　６４−Ｔ　（ＰＧＫ）を得た。該プラスミ
ドからＰＧＫターミネーターを含むＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔ
ｌ断片を単離し、これにＰｓｔＩ−Ｓｍａｌアダプター
およびＳｍａｌ−ＥｃｏＲＩアダプターを付加したのち
、上記のプラスミトＰＧＦＥ１吋のＳｍａ　１部位に挿
入し、ヒトＥＧＦ分泌プラスミドｐＧＦＥ２１３を得た
（第５図−２）。

実施例１　単純ヘルペスウイルス深山株のウイルスＤＮ
Ａの調製 Ｖ　ｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎細胞）に０．０
５〜０．５Ｐ　Ｆ　Ｕ／　ｃ　ｅ　１　１の単純ヘルペ
スウイルス１型（ＨＳＶ−１）深山株を感染させ、３７
℃で培養した。十分に細胞変性が起きた時点で、感染細
胞のけん濁した培養液を回収し、該培養液を低速遠心分
＠　（３，０００　ｒｐｍ，　１０分）にかけて上清と
細胞とに分けた。この細胞を凍結融解（−８０℃と３７
℃にて、３回凍結融解を繰り返す）によって破壊した後
に、上清を細胞のｌＯ倍量加えた。この混合液を、低速
で遠心分離（３．０００　ｒｐｍ，　１０分）にか２８
ー けて細胞残渣を除去し、上清を、先に得た上清液に加え
た。該上清を、２０　．　００Ｏｒｐｍで４時間遠心し
て、上清を除去し、ウイルス粒子が含まれるペレットを
得た。このペレットに、リン酸緩衝液一生理食塩液〔０
．８％ＮａＣＱ，０．０２％ＫＣＱ，０．１１５％Ｎ　
ａ　２Ｈ　Ｐ　Ｏ４，　０．０２％　ＫＨ　２　Ｐ　Ｏ
　４　（　ｐ　Ｈ　７　．２）〕を加えて、ウイルス懸
濁液を調製した。この液にまずＤＮａｓｅｌ　　１０ｐ
ｇ／ｍＱおよびＲＮａ　ｓ　ｅ　Ａ　０．３ｍｇ／ｍ　
Ｑを加え、３７℃で１時間反応させ、次いで１７５量の
５ＸＳＴＥＰ　（０．５％ＳＤＳ，　５０ｍＭ　Ｔｒｉ
　ｓ−ＨＣＱ，　ｐＨ７．５，　０．４Ｍ　ＥＤＴＡ，
０．１％プロテイナーゼＫ）を加えて、５０゜Ｃで１時
間反応させた。さらに、この反応液を等量のフェノール
ークロロホルム（１　：　１）　．次いでクロロホルム
で処理して、ＤＮＡを含む水層を得た。

この水層をＴＥ緩衝液（１０　ｍＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　
−ＨＣＱ（ｐＨ８．０），１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に一夜透
析した。

透析内液に冷エタノールを加えて遠心分離（１２．００
Ｏｒｐｍ，　２０分間）を行って上清を除去し、得られ
た沈殿物（ＤＮＡ）を風乾後、ＴＥ液（１０　ｍＭ　Ｔ
ｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣ　Ｑ　，　ｐ　Ｈ８．０．　１ｍＭ
　Ｅ　ＤＴＡ）に溶解した。

実施例２　　ＨＳＶ−１型深山株ＤＮＡ断片を含有する
プラスミドの作製 得られた該ＨＳＶ−１型のＤＮＡ約２μｇに３０ユニッ
トの制限酵素ＢａｍＨｌ（宝酒造（株）製〕を、３０ｔ
ｔＱの反応液（ｌｏ＋ｎＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩＩ（ｐＨ
８．０），７ｍＭ　ＭｇＣＱ２，１００ｍＭ　Ｎａ（ｉ
ｌｌ，２ｍＭ２−メルカプトエタノール〕中で、３７℃
、１時間作用させた後、フェノールで除蛋白し、冷エタ
ノールで、沈殿させた。

前記と同様にして、制限酵素ＢａｍＨＩにより開裂され
た、プラスミドｐＢＲ　３２２約１００ｎｇと、上記Ｂ
ａｍＨＩで切断したＨＳＶ−Ｉ　　ＤＮＡ約２００ｎｇ
とを混合し、２０μＱの反応液（６６　ｍＭＴｒｉ　ｓ
−ＨＣＱ（ｐＨ７．６），６６ｍＭ　ＭｇＣＱ２，１０
　ｍＭ　ジチオスレイトール，１ｍＭ　ＡＴＰ，３００
ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ〔宝酒造（株）製〕中、
１６℃で一夜作用させて、ＤＮＡを結合させた。

この反応液を用いて大腸菌ＤＨ−１を形質転換させ、ア
ンピシリン耐性の形質転換体（ＨＳＶ−ＩＤＮＡライブ
ラリー）の中からプラスミドＤＮＡをアルカリ抽出法［
Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら、モレキュラークローニング（
阿ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ］．ｏｎｉｎｇ）　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　３６６頁（
１９８２）　）によって単離した。そのプラスミドＤＮ
Ａを制限酵素ＢａｍＨＩにより切断した後、０．８％ア
ガロース（Ｓｉｇｍａ社）スラブゲルを用いて緩衝液（
０．０４Ｍ　Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ，　０．００２
Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ．　（　ｐ　Ｈ８．０））中、ＩＯ
ＯＶ．約１時間電気泳動にかけた。

約７，Ｏｋｂから約９．０ｋｂのＤＮＡ断片を、ニトロ
セルロースフィルター（エスアンドエス社、ＢＡ８５）
上に移した〔サザンブ口ッティング法、Ｔ．Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら、モレキュラークローニング　（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　３８２頁（１９８２）〕。

一方、Ｐ　．　Ｅ　．　Ｐ　ｅｌｌｅｔｔら〔ジャーナ
ルオブバイオロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５３，　２４
３（１９８５））により報告されているＨ　Ｓ　Ｖ　−
　１型Ｆ株ｇＢタンパクの塩３１ー 基配列をもとにして、ｇＢタンパクのＮ末端に対応する
塩基配列に相補的な塩基鎖（５’　ＧＧＣＧＣＣＣＴＧ
ＧＣＧＣＡＴＧＧＣ　　３’　）および中央部に対応す
る塩基配列に相補的な塩基鎖（５′ＧＣＡＣＣＣＡＧＴ
ＣＣＣＡＧＧＣＣＡＣＧＧＴＧＡＡＣＴＴ　３’　）を
化学合成した。この２種のオリゴヌクレオチドをＴ４ボ
リヌクレオチドキナーゼ〔宝酒造（株）製〕を用いて５
０μΩの反応液〔オリゴヌクレオチド０．１μｇ，　５
０　ｍＭ　Ｔｒｉ　ｓ−ＨＣＱ，ｐＨ８．０，ｌｏｍＭ
　ＭｇＣＱ２．１０　ｍＭ　　２一メルカプトエタノー
ル，　５０μＣｉγ−３２ｐＡＴ　Ｐ　（７５０００Ｃ
　ｉ　／ｍｍｏｌ），　３ユニットＴ４ボリヌクレオチ
ドキナーゼ〕中で、３７℃、１時間反応させ、オリゴヌ
クレオチドの５′末端を３２Ｐで標識した。

上記方法で標識した２種のオリゴヌクレオチドプローブ
をＤＮＡを固定した前記フィルターに別々に会合させた
。会合反応は、１０μＣｉのプローブを含む６ＸＳＳＣ
　（１５０ｍＭ　ＮａＣＱ，　１５ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ
　ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ　７．０）），　５　ＸＤｅｎ
ｈａｒｄｔ液、０．５％３２ー ＳＤＳ，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ，１００μｇ／ｒｎＱ変性
サケ精子ＤＮＡを含む溶液３ｍＱ中で、３７℃、１６時
間行い、反応後フィルターを５ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤ
Ｓ溶液で室温で２回、さらに４０゜Ｃ、３０分ずつ２回
洗浄した（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら、モレキュラークロ
ーニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　ｌ｛ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　
３０９頁（１９８２）　）。

洗浄したフィルターのラジオオートグラフィーから約８
．１ｋｂのＤＮＡ断片が２種のプロープと反応すること
がわかった。この約８，ｌｋｂのＤＮＡ断片を、制限酵
素ＸｈｏＩ（宝酒造（株）製）で消化することによって
、約３．６ｋｂ　ＤＮＡ断片を調製し、この断片につい
て、その塩基配列をジデオキシヌクレオチド合成鎖停止
法（ＪＪＢｓｓｉｎｇら、ヌクレイックアシッズリサー
チ（Ｎｕｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ），
　９，　３０９（１９８１））により決定した（第１図
）。

コノ結果より、該３．６ｋｂ　ＤＮＡ断片中ｋ．　Ｈ　
Ｓ　Ｖ一１型深山株のｇＢタンパクの全アミノ酸配列が
コードされていることが分った。上記塩基配列から推定
されるアミノ酸配列を第２図に示す。塩基配列は、Ｆ株
で報告されているｇＢタンパクの塩基配列と非常によく
似ているものの、１１塩基の置換（５アミノ酸残基の相
違）と、３塩基の付加が見られ、またＫＯＳ株［Ｄ．Ｊ
．Ｂｉｋら、ウィロロジー（Ｖｉｒｏｌ．），１３３，
　３０１　（１９８４））とは、３塩基の付加と２８塩
基の置換（２７アミノ酸残基の相違）が確認された。こ
れらの結果から、該３。６ｋｂＤＮＡ断片がＨＳＶ−１
型深山株のｇＢタンパクをコードしていることが分った
。

上記３．６ｋｂ　ＤＮＡ断片が挿入されたｐＢＲ３２２
をｐ　Ｈ　Ｓ　Ｂ　２００と名づけた。

実施例３ 実施例２で調製したＨＳＶ−１型深山株ｇＢ遺伝子を有
するプラスミドベクターｐ　Ｈ　Ｓ　Ｂ　２００を制限
酵素ＮｏｔｌとＢ　ａ　ｍ　Ｈ　Ｉで消化して約３．１
ｋｂのＤＮＡ断片を得た。第３図に示すような５′側に
ＸｈｏＩサイトと３′側にＮｏｔＩサイトを有する４５
ｂｐのＤＮＡ断片を化学的に合成し、これと上記Ｎｏｔ
ｌ−ＢａｍＨＩ断片を反応させることにより約３．１ｋ
ｂのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片を得、プラスミドベクタ
ーｐＨｓＧ３９７のＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ消化物と反応
させ、サブクローニングプラスミドｐ　Ｈ　Ｓ　Ｇ３９
７−　ｇ　Ｂ　１０６を作製した。

このプラスミドを制限酵素ＸｈｏｌとＮｈｅｌで消化し
、約２．４ｋｂのＤＮＡ断片を調製した。

一方、実施例２で調製したＨＳＶ−１型深山株ｇＢ遺伝
子を有するプラスミドベクターｐＨＳＥ２００を制限酵
素ＮｈｅｌとＳｐｈｌで消化して２３９ｂｐのＤＮＡ断
片を得、プラスミドｐ　Ｂ　Ｒ３２２のＮｈｅｌ−Ｓｐ
ｈｌ消化物と反応させサブクローニングプラスミドｐ．
　Ｂ　Ｒ３２２−　ｇ　Ｂ　２３９を得た。

このプラスミドを制限酵素ＳｐｈＩで消化した後、Ｔ４
ポリメラーゼ〔宝酒造（株）〕処理を行い、更に制限酵
素ＨｉｎＤｍで消化し、４３９ｂｐのＤＮＡ断片を得た
。このＤＮＡ断片にリン酸化ＳａｃＩリンカーｄ　（Ｐ
ＣＧＡＧＣＴＣＧ）と反応させ、約０．４４ｋｂのＨｉ
ｎｄ■−Ｓａｃｌ断片を得、プラスミドベクターｐＵｃ
１８のＨｊｎｄＩＩＩ−Ｓａｃ３５− Ｉ消化物と反応させ、サブクローニングプラスミドｐＵ
ｃ１８−ｇＢ０．４４を得た。このプラスミドを制限酵
素ＮｈｅｌとＳａｃｌで消化することにより、約０．２
４ｋｂのＮｈｅＩとＳａｃＩ断片を得た。

このＤＮＡ断片を先に調製した約２．４ｋｂのｘｈｏ１
−ＮｈｅＩ断片を参考例１に記載のプラスミ弐ｐＧＦＥ
２１３のＸｈｏＩ−Ｓａｃｌ消化物と反応させることに
よりｇＢ遺伝子発現プラスミドｐＨＳＥ１０６を得た（
第４図）。

実施例４ ＨＳＶ−１型　　株ｇＢ遺伝子の　母における■ 実施例３において構築したブラスミドｐＨＳＢ１０６で
酵母サツ力口マイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　　Ａ　Ｈ　２　２
　Ｒ一とＮＡ７４−３Ａρ一を形質転換し、形質転換体
サツ力ロマイセスセレビシエＡＨ２２Ｒ／ｐＨｓＢ１０
６とＮ　Ａ　７　４．　−　３　Ａρ−／　ｐ　Ｈ　Ｓ
　Ｂ　１　０　６をそれぞれ得た。

得られた形質転換体をそれぞれヨーロッパ特許−３６− 出願公開Ｅ　Ｐ　−　Ａ　−　０２３５４３０の実施例
１５に記載の培地で培養した後、菌体を集めた。より具
体的には、酵母形質転換体を５耐の培養液〔ＩＱあたり
、Ｋ．ＨＰ０，３ｇ，グルコース３０ｇ，アスパラギン
４ｇ，Ｌ−ヒスチジン１００ｎＩｇ，　ＫＩ　Ｏ，ｌｍ
ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ，０　５００ｍｇ，ＣａＣｌ．・
２Ｈ２０３３０Ｈ，ＣｕＳＯ４・５Ｈ２０　０．４＋ｎ
ｚ，ＦｅＳ０．７Ｈ．０　２．５ｍｇ，　Ｍｎ　Ｓｏ４
・４Ｈ２０　０．４ｍＨ，　（ＮＨ４）．ＰＯ．・１２
ＭｏＯ，・３Ｈ２０　０．２ｍｇ，Ｚｎ　ＳＯ４・７Ｈ
２０　３．１■，イノシトール１０■，チアミン０．２
■，ピリドキシン０．２■，Ｃａ−パントテン酸０．２
■，ナイアシン０．２■，ビオチン０．００２■を含む
〕中で３０℃で１日間振どう培養を行った後、その２＋
＋＋１を１８ｍｌの新鮮培地〔ＩＱあたり、ＫＨ２Ｆ０
．　３００ｍｇ，　Ｌ／よ糖５０ｇ，アスパラギン４　
ｇ　＋Ｌ−ヒスチジン１００■，　ＫＣＩ　　１．５ｇ
，　ＫＩ　Ｏ．１ｍｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０　５００
＋ｎｇ，ＣａＣｌ２・２Ｈ，０　３３０■，グルコース
ｔｏｇ，トリスーマレイン酸（ｐ　Ｈ６．５）　２５ｍ
Ｍ，　Ｃ　ｕ　Ｓ　Ｏ４・５　Ｈ，０　０．４ｒｕ，Ｆ
ｅ　ＳＯ４・７Ｈ２０　２．５ｍｇ，Ｍｎ　Ｓｏ４・４
Ｈ２０　０．４ｍ５，（ＮＨ．）３ＰＯ４・１２Ｍ　ｏ
　Ｏ．　・　３　Ｈ２０　０．２■，　Ｚ　ｎ　Ｓ　Ｏ
，　・７　Ｈ２０　３．１ｍｇ，イノシトール１０■，
チアミン０．２■，ピリドキシン０．２■，Ｃａ−パン
トテン酸０．２■，ナイアシン０．２■，ビオチン０．
００２■を含む〕に移し、さらに３０℃で２日間振どう
培養を行い、菌体を遠心で集めた。

菌体約２００ｍｇをリン酸ナトリウムバッファ一〔１０
０ｍＭ　リン酸ナトリウム（ｐ　Ｈ８．１），　７．４
Ｍ　ｕｒｅａ，１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００．　０．
１ｍＭ（ｐ−アミジノフェニル）メタンスルホニル　フ
ルオライドハイドロクロライド〕５００μ悲に懸濁し、
ガラスビーズ１ｇを加え、Ｖｏｒｔｅｘで約２０分激し
く混合した。１０，ＯＯＯｒｐｍ，５分間遠心分離にか
けて、上澄液を得た。この抽出液に等量の２倍濃度のＬ
ａｅｍｍｌｉ　ｂｕｆｆｅｒを加え、１００℃、１０分
間加熱した。冷却後、１０，ＯＯＯｒｐｍ，５分間遠心
分離にかけ、上澄液を得た。該抽出液４０μＱをＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかけ、さらに電
気的にニトロセルロースフィルターにブロッティングし
た。このフィルターに、ＤＡＫＯＰＡＴＴＳ社の抗Ｈｅ
ｒｐｅｓ　ｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　１　（Ｍａｃｌｒｌ
ｔｙｒｅ）抗体（ｒａｂｂｉｔ）を反応させ、次にｈｏ
ｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識抗ウサ
ギ抗体を反応させ、ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｒｅａｇ
ｅｎｔ（Ｂｉｏ　ｒａｄ社）で発色させると特異的なバ
ンドが検出された。

実施例５ ＨＳＶ−１型深山株のｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｇ　Ｂ遺伝
子の発現プラスミドの構築 実施例３で得られたサブクローニングプラスミドｐＨＳ
Ｇ３９７−ｇＢ１０６を制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍｌで
消化し、約３．１ｋｂのＤＮＡ断片を調製し、この断片
を更に制限酵素Ｔｔｈｌｌｌｌで消化し、約２．０ｋｂ
のＸｈ　ｏ　Ｉ−Ｔｔ　ｈｌｌｌｌ断片を得た。第６図
に示すストップコドンを有する１４ｂｐＤＮＡ断片を化
学的に合成し、これと上記Ｘｈｏｌ−Ｔｔｈｌｌｌｌ断
片を反応させ、制限酵素ＳａｃｌとＸｈｏｌで消化して
約２．０ｋｂのＸｈｏｌ−ＳａｃＩ断片を得た。この断
片をプラスミドベクタ−ｐＨｓＧ３９７のＸｈｏＩ−Ｓ
ａｃｌ消化物と反応させ、サブクローニングプラスミド
ｐ　Ｈ　Ｓ　Ｇ　３　９　７　−　ｇ　Ｂ　１　０　６
ΔＴｔｈを作製３９ー した。このプラスミドを制限酵素ＳａｃＩとｘｈｏ１で
消化して得られた約２．０ｋｂのＸｈｏＩＳａｃＩ　　
ＤＮＡ断片と参考例１に記載のプラスミドｐＧＦＥ２１
３（ＩＦ○１０４６０，　ＦＥＲＭ　ＢＰ一２０９５由
来）のＸｈｏｌ−ＳａｃＩの消化物を反応させることに
より発現プラスミドｐＨｓＢ１０６ΔＴｔｈを得た（第
６図）。また、得られたｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｇ　Ｂ遺
伝子の塩基配列と推定されるアミノ酸配列を第７図に示
す。

実施例６ 実施例５において構築したプラスミドｐＨＳＢ１０６Δ
Ｔｔｈで酵母サツ力口マイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅＳｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　Ｎ　Ａ　７
　４　−　３Ａρ−を形質転換し、形質転換体サツ力ロ
マイセスセレビシエＮＡ７４−３Ａρ−／　ｐ　Ｈ　Ｓ
　Ｂ　１０６ΔＴｔｈを得た。

得られた形質転換体をヨーロッパ特許出願公開Ｅ　Ｐ　
−　Ａ　−　０２３５４３０の実施例１５に記載の培地
で−４０− 培養した後、菌体を集めた。より具体的には、酵母形質
転換体を４ｍｌの培養液［］Ｑあたり、Ｋ２ＨＰＯ４　
３ｇ，グルコース３０ｇ，アスパラギン４ｇｔＬ−ヒス
チジン１００■，ＫＩ０．１■，ＭｇＳ○４・７Ｈ２０
５００ｍｇ，　Ｃ　ａ　Ｃ　１　２・２　Ｈ２０　３３
０ｍｇ，ＣｕＳＯ４・５Ｈ２００．４■，ＦｅＳ０４・
７Ｈ２０２．５ｍｇ，　Ｍ　ｎ　Ｓ　０４・４　Ｈ２０
０．４１１１ｇ　＋　（Ｎ　Ｈ４）３　ＰＯ．・１２Ｍ
ｏＯ，　・３Ｈ２０　０．２ｍｇ，Ｚｎ　Ｓｏ４・７Ｈ
２０　３．１■，イノシトール１０■，チアミン０．２
■，ピリドキシン０．２■，Ｃａ−パントテン酸０．２
■，ナイアシン０．２■，ビオチン０．００２■を含む
）中で３０℃、３日間振とう培養した後、その０．５ｎ
＋Ｉ２を上記同培地４．５ｍＱに移し、さらに３０℃で
１日間振どう培養を行う。次に、その２ｍＱを１８ｍΩ
の新鮮培地（ＩＱあたり、Ｋ　Ｈ２Ｐ　０４３００ｍｇ
，シヨ糖８０ｇ，アスパラギン４ｇ，Ｌ−ヒスチジン１
００■，ＫＣＱ　　２．Ｏｇ，ＫＩ　　Ｏ．１ｍｇ，Ｍ
ｇＳＯ４・７Ｈ２０５００■，ＣａＣ１２・２Ｈ２０３
３０■，グルコース１０ｇ．トリスーマレイン酸（ｐ　
Ｈ６．５）　２５ｍＭ，　Ｃ　ｕ　Ｓ　Ｏ。

５Ｔ｛２０　０．４＋ｎｇ，　Ｆ　ｅ　Ｓｏ．・７Ｈ，
０　２．５■，　ＭｎＳＯ４・４Ｈ２０　０．４ｍｇ，
（ＮＨ４）．ＰＯ．−１２Ｍｏ０３・　３Ｈ２０　　０
，２■，ＺｎＳＯ４・　７Ｈ２０　　３．１■，イノシ
トール１０■，チアミン０．２■，ピリドキシン０．２
■，Ｃａ−パントテン酸０．２■，ナイアシン０．２■
，ビオチン０．００２■を含む〕に移し、さらに３０℃
で３日間振どう培養を行い、菌体を遠心で集めた。

菌体約１５０■をリン酸ナトリウムバッファ一〔１００
ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４），　７．０Ｍ尿素
，１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００．　０．１ｍＭ（ｐ−
アミノジフェニル）メタンスルホニル　フルオライドハ
イドロクロライド，　１０ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（ｐ
　Ｈ８．０））　５００μＢに懸濁し、ガラスビーズ１
ｇを加え、Ｖｏｒｔｅｘで約３０分間激しく撹拌した。

１０．００Ｏｒｐｍ，　５分間遠心分離にかけて、上澄
液を得た。この抽出液に１／３量の４倍濃度のＬａｅｍ
ｍｌｉ　ｂｕｆｆｅｒを加え、１００℃、１０分間加熱
した。冷却後、１０，ＯＯＯｒｐｍ，　５分間遠心分離
にかけ、上澄液を得た。該抽出液８０μＱをＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲルの電気泳動にかけ、さらに電気的
にニトロセルロースフィルターにブロツテイングした。

このフィルターに、ＤＡＫＯＰＡＴＴＳ社の抗Ｈｅｒｐ
ｅｓ　ｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　１　（Ｍａｃｌｎｔｙｒ
ｅ）抗体（ｒａｂｂｉｔ）を反応させ、次にｈｏｒｓｅ
ｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識抗ウサギ抗体
を反応させ、ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｒｅａｇｅｎｔ（
Ｂｉｏ　ｒａｄ社）で発色させると特異的なバンドが検
出された。

【図面の簡単な説明】

第１図はＨＳＶ−１型深山株ｇＢ遺伝子を含むＤＮＡの
塩基配列を示し、第２図はＨＳＶ−１型深山株ｇＢ遺伝
子のアミノ酸配列を示すものである。第３図は実施例３
で用いた合成ＤＮＡ断片の塩基配列であり、第４図はＨ
ＳＶ−１型深山株ｇＢ遺伝子発現プラスミドの構築図で
ある。第５図はプラミドＰＧＦＥ２１３の構築図である
。第６図はＨＳＶ−１型深山株ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｇ
　Ｂ遺伝子発現プラスミドの構築図である。第７図はＨ
ＳＶ一１型深山株ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｇ　Ｂ遺伝子の
塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す
ものである。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）その分子中に下記式で表されるアミノ酸配列を含
   有するポリペプチド。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】
2. （２）下記式で表されるアミノ酸配列を含有する請求項
   １記載のポリペプチド。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】
3. （３）請求項１記載のポリペプチドをコードする塩基配
   列を含有する組み換えＤＮＡ。
4. （４）請求項３記載の組換えＤＮＡを保持する形質転換
   体。
5. （５）請求項４記載の形質転換体を培養し、培養物中に
   請求項１記載のポリペプチドを生成蓄積せしめ、これを
   採取することを特徴とする請求項１記載のポリペプチド
   の製造法。