JPH0321857A - 酵素センサ及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は酵素電極を用いて電流法（アンベロメトリック
法）により基質濃度を測定する酵素センサに関し、特に
酵素反応を電子移動媒体（メディ工一タ）の酸化還元反
応により直接測定するようにした酵素センサ及びその製
造方法に関する。

［従来の技術］ 酵素センサは、主に臨床化学分析に用いられ、測定対象
としてグルコース（ブドウ糖）、尿素、中性およびリン
脂質等に対するものが実用化されている。たとえば、測
定対象がβ一Ｄ−グルコースの場合の酵素反応は次式に
より表わされる。

？・・　（１） すなわち、β−Ｄ−グルコースは、β一Ｄ−グルコース
オキシダーゼ（ＧＯＤ）の作用により、酸素（０■）を
消費して有機酸（グルコノラクトン）と過酸化水素（Ｈ
２０２）を生成する。したがって、過酸化水素やグルコ
ノラクトンの発生量、あるいは酸素消費量よりグルコー
ス濃度を測定することができるものである。

ところで、従来、過酸化水素の発生量によりグルコース
濃度を測定する場合には、生成した過酸化水素を金属電
極で酸化し、その酸化電流を測定したり、あるいは還元
して還元電流を測定したりする方法が用いられていた。

しかし、これらの酸化還元電流は，酸素の影響を受けや
すく、また従来の検出電極では、その表面状態の変化の
影響を受けやすかった。また、電気化学的手法による測
定原理では、電極基体／液／酵素固定膜／被検出液から
成るセンサ構成としており、電極と膜との間に存在する
液によりセンサの微小化が困難であった。

さらに、従来、グルコース濃度の他の測定方法として、 （１）カタラーゼにより過酸化水素を酸素と水に分解し
、その酸素の量を測定するか、 （２）酵素（ベルオキシダーゼ）や無機触媒（モリブデ
ン）等の存在下でヨウ化物イオンを酸化し、次の反応を
行わせることによりヨウ素の量を測定し、これにより間
接的に過酸化水素の量を測定する方法があった。

２Ｈ２　０　　　・・・　（２） ［発明が解決しようとする課題］ 上述のように従来、過酸化水素の発生量によりグルコー
ス濃度を測定する場合には、酸素の消費量またはヨウ素
の発生量を測定し、その量により間接的に過酸化水素の
発生量を得ていた。

しかしながら、このように２段階の反応にょり測定する
方法では、グルコース等を過酸化水素に分解するための
酵素電極の他に、酸素またはヨウ素を測定するための電
極が別途必要であり、測定が極めて煩雑であるとともに
測定時間が長くなるという問題があった。一方、従来の
電気化学的方法では、前述のようにセンサが内部液を含
むため、測定液の汚染や微小化が困難であるという問題
があった。

本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、
グルコース等の基質濃度を簡易かつ短時間に精度よく測
定することができるとともに、汚染のおそれもなく、か
つ微小化も実現可能な酵素センサ及びその製造方法を提
供することを目的とする。

［課題を解決するための手段］ 上記従来の課題を解決するために、本発明に係る酵素セ
ンサは、導電性基体と、該導電性基体の少なくとも一部
を被覆するとともに、電子移動媒体および酵素を含む単
分子膜とを備えたことを特徴とするものである。

すなわち、この酵素センサは、単分子腹中において、酵
素と導電性基体との間で電子移動媒体による電子移動反
応（酸化還元反応）を行わせ、酵素反応をこの電子移動
反応の変化より測定するもので、この電子移動反応を、
電子移動媒体の活性電位一定時における電流変化として
検出するものである。

上記電子移動媒体と酵素とは、互いに直接結合した状態
で単分子腹中に固定化されていることが好ましく、また
電子移動媒体としてはレドックス中心を持つ化合物であ
って、酵素の活性中心を酸化あるいは還元できるレドッ
クス電位を持つ化合物が好ましく、特に酵素がグルコー
スオキシダーゼの場合、具体的にはフエロセン誘導体、
特にフェロセンカルボン酸であることが好ましい。

また、レドックス中心を持つ化合物としては、他にキノ
ン系化合物、トリホスホビリジンヌクレオチド系化合物
、フラビンアデニンヌクレオチド系化合物を利用できる
。

電子移動媒体および酵素を固定化する単分子膜と　しで
は、　Ｌ　Ｂ　　（Ｌａｎｇｍｕｉｒ　　Ｂｌｏｄｇｅ
ｔｔ，ラングミュ？・プロジェット）法によるＬＢ膜が
好ましい。このＬＢ法によれば、導電性基体上に，各分
子の配向がそろうとともに、単分子長の厚さの薄膜を容
易に形成することができる。したがって膜表面で起った
反応が導電性基体上に伝わりやすくなる、すなわち高感
度のセンサを得ることができる。また、ＬＢ膜の各層の
厚さは高い秩序性を有しているので安定な累積膜を形成
でき、その累積数，すなわち膜厚あるいは膜中の酵素の
量の制御が容易になる。

次に、本発明による酵素センサの製造方法は、導電性基
体を作製する工程と、電子移動媒体を含有する酵素溶液
の表面に、単分子膜物質を展開させるとともに一定の２
次元外圧を加え、各分子の配向がそろった単分子膜を形
成する工程と、前記導電性基体を前記表面に単分子膜が
形成された酵素溶液中に浸漬し、当該導電性基体上に電
子移動媒体および酵素を含む単分子膜を形成する工程と
を含むことを特徴とするものである。

上記単分子膜の形成には、脂肪酸たとえばステアリン酸
ＣＣＨ３　　（ｃＨｚ　）１８ｃＯＯＨ）が用いられ、
このステアリン酸をテフロン（登録商標）の薄板で仕切
られた一方の水面に滴下すると、配同性のよくない単分
子膜が形成された状態になる。この状態で他方の水面に
ピストン油として、たとえば才レイン酸を滴下すると、
このオレイン酸の拡散力によりテフロン薄板に対して圧
力が加わり、テフロン薄板は両側の圧力が平衡に達する
まで一方の水面側に移動し、その結果ステアリン酸の単
分子膜に２次元外圧が加わるとともに配同性がよくなる
。この配同性がそろった単分子膜を、酵素ポット内に入
れられた電子移動媒体を含む酵素溶液表面に流し込むよ
うにすれば、単分子膜の各分子の親木基側に酵素ととも
に電子移動媒体が吸着される。したがってこの溶液中に
導電性基体を浸漬し、引き上げると、当該導電性基体上
に電子移動媒体および酵素を含む単分子膜が被着形成さ
れることとなる。

なお、導電性基体は電極となるもので、たとえばガラス
基板または透明導電性ガラス基板（ＩＴＯ）上に、電極
となる酸化イリジウム（Ｉ，ＯＫ）や白金薄膜等の金属
膜をスパッタリング法等により形成して作製することが
できるが、当該基体全体を金属等の導電性部材により構
成してもよい。

また、この導電性基体は、電界効果トランジスタ（ＦＥ
Ｔ）を用いた酵素センサの場合には、そのゲート部また
はゲート部の延長部に形成するようにすれば、出力部を
含むセンサ全体の小型化を図ることが可能になる。

［作　用］ 本発明による酵素センサにおいては、単分子膜中に電子
移動媒体および酵素が固定されているため、その基本的
原理は次のようになる。すなわち、酵素としてたとえば
グルコースオキシダーゼ（ＣＯＤ）を用いた場合、適当
な電子移動媒体を用いることにより、グルコースを酸化
して自らは還元型となったグルコース才キシダーゼ中の
フラビンアデニンヌクレ才チド（　Ｆ　Ａ　Ｄ　Ｈ　２
　）を酸化型（ＦＡＤ）に再酸化することができ、これ
により間接的に酵素を酸化還元することができる。この
現象を利用して酵素と導電性基体（電極）との間で電子
移行を行わせ，酵素反応を直接電気化学的に検出するこ
とができる。すなわち、電子移動媒体としてフエ口セン
誘導体を用いると、グルコースオキシダーゼのフラビン
部から導電性基体（電極）への電子移動が起こる。

フェロセン誘導体として具体的に、たとえばフェロセン
カルボン酸（ＦＣＡ）を用いると、次式のような反応が
進行する。

ＧＯＤ−ＦＡＤ　＋グル］一ス　ーＧＯＤ−ＦＡＤＨ．
十グルコノラクトン ２　Ｆ　Ｃ　Ａ　”　＋　Ｇ　Ｏ　Ｄ　−　Ｆ　Ａ　Ｄ
　Ｈ　ｚ一２ＦＣＡ＋ＧＯＤ−ＦＡＤ＋２Ｈ” ２　　ＦＣＡ−２　　ＦＣＡ”　　＋２　　ｅ第ｌ図に
上記反応による電子の移動状態を示す。すなわち、この
ような電子移動により導電性基体（電極）に電流が増加
するもので、この増加電流値によりグルコース濃度が測
定される。

［実施例］ 以下、本発明の実施例を図面を参照して具体的に説明す
る。

（実施例ｌ） 先ず、第２図および第３図に示すように、基体としての
ガラス板（　１　５ｍｍＸ　５ｍｍＸ　ｌ　．　　２ｎ
＋ｍ）ｌをアセトン・メタノール混合溶液により超音波
洗浄し、水洗いの後乾燥させた。続いて、高周波スパッ
タリング装置（ＳＰＦ−２　１　０Ｈ型，日電アネルバ
社製）を用い、次の条件で膜厚０．　　１μｍの酸化イ
リジウム膜２ａをガラス板１上に被着させた。さらにこ
の酸化イリジウム膜２ａ上に膜厚約Ｏ．ｌμｍの白金薄
膜２ｂを被着させて導電性基体（電極〉を作製した。

次に，第４図ないし第７図に示すＬＢ膜作製装置を用い
て上記導電性基体４の表面に酵素とともに電子移動媒体
が固定化されたＬＢ膜（単分子膜）３を形成した。第８
図はこのＬＢ膜の形成状態を模式的に示すものである。

すなわち、先ず全面にテフロンコーティングがなされた
水槽ｌＯの深部分に酵素ボットｌ１を入れ、このボット
１１の外側に，純水中に塩化バリウム（ＢａＣｌよ）お
よび炭酸水素カリウム（ＫＨＣＯ．）を含む下層液ｌ２
を入れるとともに、ボットｌ１の内側に電子移動媒体を
含む酵素溶液を入れる。この酵素ボット１１の内側と外
側は切欠き部１１ａの箇所でのみ連結しており、内部酵
素の漏れ出しをある程度抑えるようになっている。なお
、下層液ｌ２中に入れる塩化バリウムは後述のステアリ
ン酸との化合により安定な膜を作るためであり、また炭
酸水素カリウムは水相のｐＨを調整するために用いられ
るものである。

一方、水槽ＩＯの水面にはテフロン製の仕切板ｌ３が浮
かべられており、水面をＡ，Ｂの２つの領域に仕切って
いる。

次に、酵素ポット１１側の水面Ａに単分子膜物質として
ステアリン酸の溶液を滴下し、水面Ａに単分子膜を展開
させるとともに、他方の水面Ｂに才レイン酸を微量滴下
させると、このオレイン酸の拡散により水面ＡとＢとの
間が平衡状態に達するまで２仕切板ｌ３が押される。こ
れによりステアリン酸の単分子に二次元外圧が加わり当
該分子間の配同性がよくなる。このとき酵素ボットｌ１
の内部は外部と切欠き部１１ａによって連結しているた
め、内部表面にも配同性のよい単分子膜ｌ４が形成され
た状態となっている。そして、この単分子膜ｌ４の親木
基側は酵素ポットｔｉの内部の酵素−フェロセン結合物
質ｌ５を吸着する。

この状態で上記導電性基体４を酵素ボット１１内に降ろ
し、徐々に引上げると、白金薄膜２ａの表面に配同性の
良い単分子膜が形成される。

この作業を繰り返し、導電性基体４上に酵素−フェロセ
ン結合物質ｌ５を吸着した膜を累積（１ないし７層）さ
せることによりＬＢ膜３を形成し、グルコースセンサを
作製した。

上記酵素溶液は次のようにして作製した。

グルコースオキシダーゼ　　４００　ｍｇフエロセンカ
ルボン酸　　　　４０　ｍｇシアナミド（結合剤）　　
　　　２　ｍｇ尿　素（結合剤）　　　　　　３６０３
．６ｍｇをリン酸塩緩衝液（ｐＨ　＝６．８６）　　ｌ
ＯｍｊＺ中に溶かし、この溶液をセロハン紙製袋に入れ
、１〜２日水に浸漬させておく。これにより尿素が透析
され、酵素一フエロセン結合物質ｌ５を作製できる。

なお、第４図において、１６はＬＢ膜採取器、また第５
図において、ｌ７は表面圧計、矢印は恒温水の循環経路
をそれぞれ示す。

（比較例ｌ） 酵素溶液中にフェロセンカルボン酸を添加しなかった以
外は実施例１と同様にしてグルコースセンサを作製した
。

Ｘ荻盟ユ 実施例ｌおよび比較例ｌで作成したセンサ２３を作用極
として第９図の電流測定系の被測定溶液２０中に浸し、
基準極（塩化ナトリウムカロメロ電極）２１および対極
（白金（Ｐｔ））２２でセンサ２３の出力電流を測定し
た。すなわち、第１０図に具体的回路構成を示すボテン
シオスタット（定電位装置）２４により電極電位を常に
一定（０．３〜０．６Ｖ）にしながら、センサ２３から
の信号をボテンシオスタット２４を介して電流（Ｉ）一
電圧（Ｖ）コンバータ２５に人力し、ここで電圧に変換
し、さらにアナログ（Ａ）一デジタル（Ｄ）コンバータ
２６によりデジタル信号に変換した後、コンピュータ２
７に入力させた。なお、測定に際して、マグネティック
スターラ２８により撹拌子２９を回転させて被測定溶液
２０を撹拌させた。

このセンサ２３の基準極２１との間の各電位における出
力電流値を第１１図に示す。

この結果、実施例ｌのセンサにおいては、０．４Ｖで最
も大きな出力電流（約５．０μＡ）が得られた。一方、
比較例ｌのフエロセンカルボン酸を添加していないセン
サの場合は、０．　６Ｖまでに徐々に出力電流が増加す
るが、０．６Ｖでも出力電流は約１．０μＡであった。

したがって、電子移動媒体としてのフエロセンカルボン
酸の添加効果が大きいことが判明した。

（実施例２） 実施例ｌのセンサのＬＢ膜３の膜厚を５層とした以外は
実施例ｌと同様にしてグルコースセンサを作製した。

Ｘ狡旦ｌ 第９図の装置を用い、グルコース濃度ｌＯ，５０，１　
００，２００，５００ｍｇ／ｄＩ２の場合の出力電流の
変化を測定した。その結果を第１２図に示す。これによ
ればグルコース濃度に対する出力電流の変化は、グルコ
ース濃度５　０　ｍｇ／ｄＩ２以下では直線性が成り立
つが、これ以上の濃度では収束する曲線を示している。

また、第９図の測定セル中に窒素ガスをパブリングする
ことによって脱酸素を行った後、上述と同様にしてグル
コース濃度に対する出力電流変化を測定した結果、第１
２図に示す電流値の約８０％以上が流れ、同様に５０ｆ
ｆｉｇ／ｄ１２以下では良い直線性を示した。このこと
から本発明の酵素センサは無酸素状態でも使用できるこ
とがわかった。

第１３図は上記センサの再現性実験結果を示すもので、
その結果２回目の測定値は１回目の測定値よりかなり落
ちるが、２回目以降はほぼ同じ値をとり、比較的再現性
は優れていることがわかった。

このように本実施例のグルコースセンサにおいては、酵
素固定化膜としてのＬＢ膜３中に電子移動媒体を添加す
ることにより、グルコース濃度を比較的低濃度のｌｏｍ
ｇ／ｄｆ２程度まで測定することができ、高感度となっ
た。この大きな理由は、電位測定法ではＳ／Ｎ比が２程
度であるのに対し、電流法ではＳ／Ｎ比が３０と大幅に
改善されており、信号とノイズとが分離されたことによ
るものと考えられる。第１４図（ａ）に電位測定系にお
けるセンサ出力、また同図（ｂ）に電流測定系における
センサ出力の一例を示す。

尚、上記実施例においては、本発明の酵素センサをグル
コースセンサとしてグルコースの濃度を測定するように
したが、本発明はこれに限定するものでなく、その他の
酵素を用いて他の基質濃度を測定するセンサにも適用で
きることは勿論である。

［発明の効果］ 以上説明したように本発明に係る酵素センサによれば、
配同性のそろった単分子膜中において酵素と導電性基体
（電極）との間で電子移動媒体による電子移動反応（酸
化還元反応）を行わせ、酵素反応をこの電子移動反応の
変化より測定するようにしたので、従来の電位応答では
ノイズにかくされていた基質濃度が低濃度の場合の酵素
反応の応答を精度よく測定でき、応答特性が著しく向上
する。また、構造が簡素化されるとともに、測定が極め
て容易となり、さらに測定時間の短縮化を図ることもで
きる。さらに、酵素固定化膜の形成にＬＢ法を用いるよ
うにしたので、電極基板の大きさが微小であっても膜被
覆が可能であり、その上固体電極構成であり、従来のよ
うな内部液室等が不要であるため，測定液の汚染のよう
な問題がない。また、超微小電極の作製も可能となり、
特に医療分野のセンサとしてその利用度が極めて高くな
るという効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明の一実施例を示すもので、第１図は酵素セ
ンサにおける電子移行状態を示す模式図、第２図は酵素
センサの構造を示す平面図、第３図は第２図の■一■線
に沿う断面図、第４図はＬＢ膜作製装置の平面図、第５
図は同じく側面図、第６図は酵素ポットの正面図、第７
図は同じく側面図、第８図はＬＢ膜の形成状態を示す模
式図、第９図は電流測定装置の構成図、第ｌＯ図はボテ
シ才スタットの回路構成図、第１１図はセンサー標準電
極間電圧と出力電流との関係を示す図、第１２図はグル
コース濃度と出力電流との関係を示す図、第１３図はセ
ンサの再現特性を示す図、第１４図（ａ）は電位測定系
におけるセンサ出力、第１４図（ｂ）は電流測定系にお
けるセンサ出力をそれぞれ示す波形図である。 ｌ・・・ガラス板、２ａ・・・酸化イリジウム膜２ｂ・
・・白金薄膜、３・・・ＬＢ膜 ４・・・導電性基体、１１・・・酵素ポットｌ２・・・
下層液、ｌ４・・・単分子膜ｌ５・・・酵素一フエロセ
ン結合物質

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）導電性基体と、該導電性基体の少なくとも一部を
   被覆するとともに、電子移動媒体および酵素を含む単分
   子膜とを備えたことを特徴とする酵素センサ。
2. （２）前記電子移動媒体が酵素と直接結合されてなる請
   求項１記載の酵素センサ。
3. （３）前記電子移動媒体がレドックス中心を有する化合
   物である請求項１または２記載の酵素センサ。
4. （４）前記レドックス中心を有する化合物がフェロセン
   誘導体である請求項１ないし３のいずれか１つに記載の
   酵素センサ。
5. （５）請求項１記載の酵素センサを製造する製造方法で
   あって、導電性基体を作製する工程と、電子移動媒体を
   含有する酵素溶液の表面に、単分子膜物質を展開させる
   とともに一定の２次元外圧を加え、各分子の配向がそろ
   った単分子膜を形成する工程と、前記導電性基体を前記
   表面に単分子膜が形成された酵素溶液中に浸漬し、当該
   導電性基体上に電子移動媒体および酵素を含む単分子膜
   を形成する工程とを含むことを特徴とする酵素センサの
   製造方法。