JPH03219880A - 細菌コラゲナーゼ遺伝子 - Google Patents
細菌コラゲナーゼ遺伝子Info
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- JPH03219880A JPH03219880A JP2244562A JP24456290A JPH03219880A JP H03219880 A JPH03219880 A JP H03219880A JP 2244562 A JP2244562 A JP 2244562A JP 24456290 A JP24456290 A JP 24456290A JP H03219880 A JPH03219880 A JP H03219880A
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- vibrio alginolyticus
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、ビブリオ・アルギノリティカス由来のコラゲ
ナーゼ遺伝子、該遺伝子が組み込まれた組換えベクター
、該ベクターにより形質転換された宿主細胞およびその
利用に関する。
ナーゼ遺伝子、該遺伝子が組み込まれた組換えベクター
、該ベクターにより形質転換された宿主細胞およびその
利用に関する。
（従来の技術）
動物の結合組織を構成するコラーゲンは、基本単位とし
てそれぞれ約９ ５．０ ０ ０の分子量をもつ３本の
ポリペブチド鎖からなり、左回りの三重らせん構造を有
する。コラーゲン分子を構成する各ペプチドのアミノ酸
配列はＧｌｙ−Ｐｒｏ ＸＧｌｙ（Ｘは種々のアミノ
酸残基を示す）の繰返しであり、各ペブチドは分子内ま
たは分子間で架僑されている。このようなコラーゲン特
有のらせん構造は、強靭な機械的性質と化学的安定性を
もたらし、それ故、コラーゲンは通常のプロテアゼに対
して抵抗性を示し、コラゲナーゼによってのみ分解され
る。
てそれぞれ約９ ５．０ ０ ０の分子量をもつ３本の
ポリペブチド鎖からなり、左回りの三重らせん構造を有
する。コラーゲン分子を構成する各ペプチドのアミノ酸
配列はＧｌｙ−Ｐｒｏ ＸＧｌｙ（Ｘは種々のアミノ
酸残基を示す）の繰返しであり、各ペブチドは分子内ま
たは分子間で架僑されている。このようなコラーゲン特
有のらせん構造は、強靭な機械的性質と化学的安定性を
もたらし、それ故、コラーゲンは通常のプロテアゼに対
して抵抗性を示し、コラゲナーゼによってのみ分解され
る。
コラゲナーゼは通常のタンパク質には作用せず、上記コ
ラーゲンあるいはその変性物であるゼラチンに対しての
み作用する。微生物の生産する数種のコラゲナーゼの内
、最も研究が進んでいるのは、アクロモバクタ−・コラ
ゲナーゼとして知られているビブリオ・アルギノリティ
カス・ケモバル・イオファガス（Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇ
ｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ ｃｈｅｍｏｖａｒｉｏｐｈａｇ
ｕｓ）由来のコラゲナーゼで、他起源のコラゲナーゼに
比較して特異的活性の高いことが知られている［ブイ・
カイルードロウハおよびビイ・カイル、バイオケミ力・
バイオフィジカ・アクタ（Ｖ、 Ｋｅｉｌ−Ｄｌｏｕｈ
ａ ａｎｄ Ｂ、Ｋｅｉｌ、Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ。
ラーゲンあるいはその変性物であるゼラチンに対しての
み作用する。微生物の生産する数種のコラゲナーゼの内
、最も研究が進んでいるのは、アクロモバクタ−・コラ
ゲナーゼとして知られているビブリオ・アルギノリティ
カス・ケモバル・イオファガス（Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇ
ｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ ｃｈｅｍｏｖａｒｉｏｐｈａｇ
ｕｓ）由来のコラゲナーゼで、他起源のコラゲナーゼに
比較して特異的活性の高いことが知られている［ブイ・
カイルードロウハおよびビイ・カイル、バイオケミ力・
バイオフィジカ・アクタ（Ｖ、 Ｋｅｉｌ−Ｄｌｏｕｈ
ａ ａｎｄ Ｂ、Ｋｅｉｌ、Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ。
Ａｃｔａ） 、 ５２２．２１８−２２８ （１９７８
）］ 。］アクロモバクターコラゲナーゼは分子量１１
０．０００、至適ｐＨ７，４、安定ｐＨ６〜７で、ＥＤ
ＴＡ。
）］ 。］アクロモバクターコラゲナーゼは分子量１１
０．０００、至適ｐＨ７，４、安定ｐＨ６〜７で、ＥＤ
ＴＡ。
０−７エナンスロリンによって活性が消失する亜鉛を含
む金属プロテアーゼであり ［ブイ・カイルドロウハ、
バイオケミ力・バイオフィジカ・アクタ（Ｖ、 Ｋｅｉ
ｌ−Ｄｌｏｕｈａ、 Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、 Ａｃｔａ）、４２９．２３９−２５１ （１９
７６）］ 、合成基質ＰＺ−Ｐｒ。
む金属プロテアーゼであり ［ブイ・カイルドロウハ、
バイオケミ力・バイオフィジカ・アクタ（Ｖ、 Ｋｅｉ
ｌ−Ｄｌｏｕｈａ、 Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、 Ａｃｔａ）、４２９．２３９−２５１ （１９
７６）］ 、合成基質ＰＺ−Ｐｒ。
Ｌｅｕ−Ｇａｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−ＡｒｇをＬｅｕ−、Ｇａ
ｙの間で切断する［ビイ・カイルら、ＦＥＢＳレター（
Ｂ、 Ｋｅｉｌ、 Ａ、Ｍ、 Ｇ１１ｌｅｓ、 Ａ。
ｙの間で切断する［ビイ・カイルら、ＦＥＢＳレター（
Ｂ、 Ｋｅｉｌ、 Ａ、Ｍ、 Ｇ１１ｌｅｓ、 Ａ。
Ｌｅｃｒｏｉｓｅｙ、Ｎ、 Ｈｕｒｉｏｎ、 Ｎ、Ｔ、
Ｔｏｎｇ、 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、）。
Ｔｏｎｇ、 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、）。
５６、２９２−２９６ （１９７５） ； エイ・レ
コロイジーら、ＦＥＢＳレター（Ａ、 Ｌｅｃｒｏｉｓ
ｅｙ、 Ｖ、 Ｋｅｉｌ−ＤｌｏｕｈａＤ、Ｒ，Ｗｏｏ
ｄｓ Ｄ、 Ｐｅｒｒｉｎ ａｎｄ Ｂ、 Ｋｅｉｌ
、 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、）５９．１６７−１７２ （
１９７５）； エヌ・ティ・トンら、バイオケミ力・バ
イオフィジカ・アクタ（Ｎ、Ｔ。
コロイジーら、ＦＥＢＳレター（Ａ、 Ｌｅｃｒｏｉｓ
ｅｙ、 Ｖ、 Ｋｅｉｌ−ＤｌｏｕｈａＤ、Ｒ，Ｗｏｏ
ｄｓ Ｄ、 Ｐｅｒｒｉｎ ａｎｄ Ｂ、 Ｋｅｉｌ
、 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、）５９．１６７−１７２ （
１９７５）； エヌ・ティ・トンら、バイオケミ力・バ
イオフィジカ・アクタ（Ｎ、Ｔ。
Ｔｏｎｇ、Ａ、 Ｔｓｕｇｉｔａ、 Ｖ、Ｋｅｉｌ−Ｄ
ｌｏｕｈａ、 Ｂｉｏｃｈｉｍ。
ｌｏｕｈａ、 Ｂｉｏｃｈｉｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）、 ８７４．２９６−３０
４ （１９８６）］。
４ （１９８６）］。
かかるコラゲナーゼの特異的な性質を利用して種々の用
途が期待され、実際に使用されている。
途が期待され、実際に使用されている。
たとえば、コラーゲンに富む構造の無制限な基質が生し
る種々の傷に使用される。治療できる傷の例として、火
傷、潰瘍、痴皮、コラーゲンベースの白色硬痴、ケロイ
ド、壊死とくに臥位または潰瘍による壊死がある。
る種々の傷に使用される。治療できる傷の例として、火
傷、潰瘍、痴皮、コラーゲンベースの白色硬痴、ケロイ
ド、壊死とくに臥位または潰瘍による壊死がある。
虫歯の治療にも使用される。すなわち元軸は主として緻
密な石灰質とコラーゲンから成り、虫歯では歯にヒビが
入るかまたは穴が開き、そこからカルノウムが漏出する
。このため、石灰質が除去されて残ったフレームは多孔
性になり細菌感染等の温床になり易いが、コラゲナーゼ
は多孔性コラーゲンを溶解するので、水洗により除去で
きる。
密な石灰質とコラーゲンから成り、虫歯では歯にヒビが
入るかまたは穴が開き、そこからカルノウムが漏出する
。このため、石灰質が除去されて残ったフレームは多孔
性になり細菌感染等の温床になり易いが、コラゲナーゼ
は多孔性コラーゲンを溶解するので、水洗により除去で
きる。
健康な石灰質コラーゲンにはコラゲナーゼは作用しない
。
。
その他、肉質軟化剤としても使用できる。食肉の硬さの
原因は、コラーゲンを主成分とする鍵による。この牌を
分解することによって肉質を軟化するために、パパイン
などのプロテアーゼが使用される。しかし、コラーゲン
は通常のプロテアーゼではほとんど分解されないし、パ
パイン等の非特異的プロテアーゼは食肉のテクスチュア
ーに重要なアクチン、ミオシン等のタンパク質も分解す
るので、パパイン処理によって食肉のテクスチュアーも
消失してしまう。この点で、コラゲナーゼは食肉中の硬
さの原因であるコラーゲンだけを特異的に分解し、その
他食肉のテクスチュアーに重要なタンパク質は分解しな
いので食肉軟化剤として最も適したプロテアーゼである
。
原因は、コラーゲンを主成分とする鍵による。この牌を
分解することによって肉質を軟化するために、パパイン
などのプロテアーゼが使用される。しかし、コラーゲン
は通常のプロテアーゼではほとんど分解されないし、パ
パイン等の非特異的プロテアーゼは食肉のテクスチュア
ーに重要なアクチン、ミオシン等のタンパク質も分解す
るので、パパイン処理によって食肉のテクスチュアーも
消失してしまう。この点で、コラゲナーゼは食肉中の硬
さの原因であるコラーゲンだけを特異的に分解し、その
他食肉のテクスチュアーに重要なタンパク質は分解しな
いので食肉軟化剤として最も適したプロテアーゼである
。
（発明が解決しようとする課題）
上記のような目的にコラゲナーゼを使用するにあたって
は、コラゲナーゼの安価な取得が困難であるという問題
がある。アクロモバクタ−・コラゲナーゼを取得するた
めには、その生産菌であるビブリオ・アルギノリティカ
スを培養し、その培養液よりコラゲナーゼを回収・精製
するが、当該細菌のコラゲナーゼ生産量が１０ｍｇ／ｆ
ｆと著しく低いことが問題である。また、当該細菌を培
養するに際して、特別な誘導物質を培養液に添加しなけ
れば当該細菌はコラゲナーゼを生産しないという問題も
ある。このような理由から、コラゲナゼを大量に安価に
取得することが困難となっている。
は、コラゲナーゼの安価な取得が困難であるという問題
がある。アクロモバクタ−・コラゲナーゼを取得するた
めには、その生産菌であるビブリオ・アルギノリティカ
スを培養し、その培養液よりコラゲナーゼを回収・精製
するが、当該細菌のコラゲナーゼ生産量が１０ｍｇ／ｆ
ｆと著しく低いことが問題である。また、当該細菌を培
養するに際して、特別な誘導物質を培養液に添加しなけ
れば当該細菌はコラゲナーゼを生産しないという問題も
ある。このような理由から、コラゲナゼを大量に安価に
取得することが困難となっている。
これらの問題を解決するために、遺伝子工学技術を利用
することができるが、当該アクロモバクタ−・コラゲナ
ーゼの遺伝子は取得されておらず、当該酵素を大量に生
産すべき、遺伝子工学的手段を講じることができない状
況にあった。
することができるが、当該アクロモバクタ−・コラゲナ
ーゼの遺伝子は取得されておらず、当該酵素を大量に生
産すべき、遺伝子工学的手段を講じることができない状
況にあった。
（課題を解決するための手段）
本発明者らは、これらの問題を解決すべく鋭意研究を重
ねた結果、ビブリオ・アルギノリティカス出来のアクロ
モバクタ−・コラゲナーゼの遺伝子を取得し、そのアミ
ノ酸配列を明らかにすることに成功し、本発明を完成す
るに至った。これより、アクロモバクタ−・コラゲナー
ゼを、例えば適当な宿主で大量に生産することや、コラ
ゲナーゼを遺伝子工学的手法により改良することなどの
手段が講じられるようになった。
ねた結果、ビブリオ・アルギノリティカス出来のアクロ
モバクタ−・コラゲナーゼの遺伝子を取得し、そのアミ
ノ酸配列を明らかにすることに成功し、本発明を完成す
るに至った。これより、アクロモバクタ−・コラゲナー
ゼを、例えば適当な宿主で大量に生産することや、コラ
ゲナーゼを遺伝子工学的手法により改良することなどの
手段が講じられるようになった。
すなわち、本発明は、ビブリオ・アルギノリティカス（
Ｖ １ｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）に属す
る細菌由来のコラゲナーゼ遺伝子、該遺伝子またはそれ
と生物学的に実質的に同等な遺伝子を含有する組換えベ
クター、該遺伝子を含有するプラスミドで形質転換され
た宿主細胞、該細胞を培養して得られるコラゲナーゼの
製造法を提供するものである。
Ｖ １ｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）に属す
る細菌由来のコラゲナーゼ遺伝子、該遺伝子またはそれ
と生物学的に実質的に同等な遺伝子を含有する組換えベ
クター、該遺伝子を含有するプラスミドで形質転換され
た宿主細胞、該細胞を培養して得られるコラゲナーゼの
製造法を提供するものである。
本発明のコラゲナーゼ遺伝子の取得に用いるビブリオ・
アルギノリティカスは特に限定するものではなく、アク
ロバクター・コラゲナーゼ生産菌として公知のものいず
れでもよく、例えば、アイ・エモントら、インターナシ
ョナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテ
リオロジ−（１゜ＥｍｏｎＬｏ ｅＬ ａｌ、、 Ｉｎ
ｔ、 Ｊ、 ５ｙｓｔ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）、３
３．４５１−４５９．１９８３に記載されるビブリオ・
アルギノリティカスを用いることができる。また、細菌
ＤＮＡの単離、遺伝子ライブラリーの作製、スクリーニ
ングは公知の方法によって行なうことができる。
アルギノリティカスは特に限定するものではなく、アク
ロバクター・コラゲナーゼ生産菌として公知のものいず
れでもよく、例えば、アイ・エモントら、インターナシ
ョナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテ
リオロジ−（１゜ＥｍｏｎＬｏ ｅＬ ａｌ、、 Ｉｎ
ｔ、 Ｊ、 ５ｙｓｔ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）、３
３．４５１−４５９．１９８３に記載されるビブリオ・
アルギノリティカスを用いることができる。また、細菌
ＤＮＡの単離、遺伝子ライブラリーの作製、スクリーニ
ングは公知の方法によって行なうことができる。
宿主細胞としては、エシェリヒア・コリ（Ｅ ｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ−ｃｏｌ ｉ）やバチルス−ズブチリス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）を用いることがで
き、ベクターとしては、エシェリヒア・コリ内で複製で
きるｐＵｃ１８、ｐＵｃ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＧＥＭ
３、ｐＧＥＭ４など、バチルス・ズブチリス内で複製で
きるｐＵＢｌｌｏＳ ｐＥ１９４、ｐＣ１９４などが使
用できる。
ｉｃｈｉａ−ｃｏｌ ｉ）やバチルス−ズブチリス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）を用いることがで
き、ベクターとしては、エシェリヒア・コリ内で複製で
きるｐＵｃ１８、ｐＵｃ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＧＥＭ
３、ｐＧＥＭ４など、バチルス・ズブチリス内で複製で
きるｐＵＢｌｌｏＳ ｐＥ１９４、ｐＣ１９４などが使
用できる。
得られたコラゲナーゼ遺伝子を含有するプラスミドで形
質転換された宿主細胞を用いてコラゲナーゼを製造する
には、例えば、エイ・レクロイジら、ＦＥＢＳレターズ
（Ａ、Ｌｅｃｒｏｉｓｅｙ ｅｔ ａｔ。
質転換された宿主細胞を用いてコラゲナーゼを製造する
には、例えば、エイ・レクロイジら、ＦＥＢＳレターズ
（Ａ、Ｌｅｃｒｏｉｓｅｙ ｅｔ ａｔ。
Ｆ Ｅ Ｂ Ｓ Ｌ ｅｔｔ、）、５９．１６７−１７
２．１９７５に記載される方法に従って、適当な炭素源
、窒素源および微量の金属元素を含む培地中で、該細胞
を培養することにより行なえる。得られた培養物を回収
し、培養上清を硫安沈澱（６０％飽和）処理し、種々の
カラムクロマトグラフィー（例えば、ＤＥＡＥセルロー
スカラムクロマトグラフィーおよびセファデンクスＧ−
１００カラムクロマトグラフィーなど）を用いて精製す
ることにより、所望のコラゲナーゼが得られる。
２．１９７５に記載される方法に従って、適当な炭素源
、窒素源および微量の金属元素を含む培地中で、該細胞
を培養することにより行なえる。得られた培養物を回収
し、培養上清を硫安沈澱（６０％飽和）処理し、種々の
カラムクロマトグラフィー（例えば、ＤＥＡＥセルロー
スカラムクロマトグラフィーおよびセファデンクスＧ−
１００カラムクロマトグラフィーなど）を用いて精製す
ることにより、所望のコラゲナーゼが得られる。
得られたコラゲナーゼは、従来のものと同様な用途に使
用できる。
用できる。
（実施例）
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明はこれらに限定されるものではない。
、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
遺伝子ライブラリーの作製
アクロモバクタ−・コラゲナーゼ生産菌ビブリオ・アル
ギノリティカスから常法により全ＤＮＡを単離した。細
菌ＤＮＡの単離法としては、例えば、サイトウ・ミウラ
法［エイチ・サイトウおよびケイ・ミウラ、バイオシミ
力・バイオロジー・アクタ（ｌ（，５ａｉｔｏ ａｎｄ
Ｋ、Ｍｉｕｒａ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ
。
ギノリティカスから常法により全ＤＮＡを単離した。細
菌ＤＮＡの単離法としては、例えば、サイトウ・ミウラ
法［エイチ・サイトウおよびケイ・ミウラ、バイオシミ
力・バイオロジー・アクタ（ｌ（，５ａｉｔｏ ａｎｄ
Ｋ、Ｍｉｕｒａ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ
。
Ａｃｔａ、）、 ７２．６１９．１９６３］等が挙げら
れる。このＤＮＡを制限酵素５ａｕ３ＡＩで部分分解し
、アガロースゲル電気泳動法により分画し、５ｋｂ以上
のＤＮＡ断片をを集めた。このＤＮＡ断片を、ＢａｍＨ
Ｉ処理したベクターｐＴＪｃ ｌ ８とＴ４リガーゼで
結合し、エシェリヒア・コリＪＭＩＯ１を形質転換して
、アンピシリン耐性形質転換体としてビブリオ・アルギ
ノリティカスの遺伝子ライブラリーを作製した。エシェ
リヒア・コリの形質転換は常法［例えば、エム・マンデ
ルおよびエイ・ヒガ、ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー（Ｍ、Ｍａｎｄｅｌ ａｎｄ Ａ、Ｉ（
ｉｇａ、 Ｊ、Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、。
れる。このＤＮＡを制限酵素５ａｕ３ＡＩで部分分解し
、アガロースゲル電気泳動法により分画し、５ｋｂ以上
のＤＮＡ断片をを集めた。このＤＮＡ断片を、ＢａｍＨ
Ｉ処理したベクターｐＴＪｃ ｌ ８とＴ４リガーゼで
結合し、エシェリヒア・コリＪＭＩＯ１を形質転換して
、アンピシリン耐性形質転換体としてビブリオ・アルギ
ノリティカスの遺伝子ライブラリーを作製した。エシェ
リヒア・コリの形質転換は常法［例えば、エム・マンデ
ルおよびエイ・ヒガ、ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー（Ｍ、Ｍａｎｄｅｌ ａｎｄ Ａ、Ｉ（
ｉｇａ、 Ｊ、Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、。
５３、 ｔｓｌ、 １９７０）を用いた。
実施例２
遺伝子ライブラリーのスクリーニング
形質転換体を選択するために、アクロモバクタ−・コラ
ゲナーゼの抗体を常法（例えば、続生化学実験法、第５
巻、１−２５頁、日本生化学金偏、１９８６年、東京化
学同人）により作製した。即ち、ｌ ｍｇの精製コラ
ゲナーゼを不完全７０インドアジユバントと混和し、ウ
サギの皮下に注射して免疫した。さらに、１週間毎に３
回、同様の操作を行い、追加免疫した。４週間目に全血
を採取、硫安分画によりＩｇ（１，画分を調製し、この
抗体をパーオキシダーゼで酵素標識した。抗体の酵素標
識は、例えば、過よう素酸ナトリウムによる方法が利用
可能であるが、詳細は免疫実験操作法■、１８３５頁（
日本免疫学金偏）に記載されている。この酵素標識した
抗コラゲナーゼ抗体を用いて、上記遺伝子ライブラリー
の中から、抗コラゲナーゼ抗体と反応する抗原を発現し
ているクローンとして、プラスミドｐＬｃｏ−１、ｐＬ
ｃｏ−２、ｐＬｃ。
ゲナーゼの抗体を常法（例えば、続生化学実験法、第５
巻、１−２５頁、日本生化学金偏、１９８６年、東京化
学同人）により作製した。即ち、ｌ ｍｇの精製コラ
ゲナーゼを不完全７０インドアジユバントと混和し、ウ
サギの皮下に注射して免疫した。さらに、１週間毎に３
回、同様の操作を行い、追加免疫した。４週間目に全血
を採取、硫安分画によりＩｇ（１，画分を調製し、この
抗体をパーオキシダーゼで酵素標識した。抗体の酵素標
識は、例えば、過よう素酸ナトリウムによる方法が利用
可能であるが、詳細は免疫実験操作法■、１８３５頁（
日本免疫学金偏）に記載されている。この酵素標識した
抗コラゲナーゼ抗体を用いて、上記遺伝子ライブラリー
の中から、抗コラゲナーゼ抗体と反応する抗原を発現し
ているクローンとして、プラスミドｐＬｃｏ−１、ｐＬ
ｃｏ−２、ｐＬｃ。
３を持つクローンを選択した。プラスミドｐＬＣＯ−１
は、約７．０ｋｂのビブリオ・アルギノリティカス由来
のＤＮＡ挿入断片を持つ。ｐＬＣＯ−１の挿入ＤＮＡ断
片の制限酵素地図を添付の第、１図に示した。
は、約７．０ｋｂのビブリオ・アルギノリティカス由来
のＤＮＡ挿入断片を持つ。ｐＬＣＯ−１の挿入ＤＮＡ断
片の制限酵素地図を添付の第、１図に示した。
なお、プラスミドｐＬｃｏ−１を持つエシェリヒア・コ
リＪＭＩ Ｏ１はエシェリヒア・コリ（Ｅｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ） ＳＡＭ１５１４と命名し、１９８
９年１１月２２日に工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研菌寄第１１１３１号（ＦＥＲＭ Ｐ−１１１３１
）として寄託しである。
リＪＭＩ Ｏ１はエシェリヒア・コリ（Ｅｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ） ＳＡＭ１５１４と命名し、１９８
９年１１月２２日に工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研菌寄第１１１３１号（ＦＥＲＭ Ｐ−１１１３１
）として寄託しである。
実施例３
アミノ酸配列の決定
アクロモバクタ−・コラゲナーゼの部分アミノ酸配列は
、以下のようにして決定した。精製したアクロモバクタ
−・コラゲナーゼを、常法（例えば、続生化学実験法、
第２巻、２６０−２７０頁、口本生化学金偏）によりト
リプシンおよびプロテアーゼｖ８で各々部分加水分解し
た。得られたペプチド断片を高速液体クロマトグラフィ
ーにより精製した後、自動化ニドマン分解法によりアミ
ノ酸配列を決定した。その結果、本発明におけるアクロ
モバクタ−・コラゲナーゼは少なくとも以下の２０個の
ペプチド断片のアミノ酸配列を有していた。
、以下のようにして決定した。精製したアクロモバクタ
−・コラゲナーゼを、常法（例えば、続生化学実験法、
第２巻、２６０−２７０頁、口本生化学金偏）によりト
リプシンおよびプロテアーゼｖ８で各々部分加水分解し
た。得られたペプチド断片を高速液体クロマトグラフィ
ーにより精製した後、自動化ニドマン分解法によりアミ
ノ酸配列を決定した。その結果、本発明におけるアクロ
モバクタ−・コラゲナーゼは少なくとも以下の２０個の
ペプチド断片のアミノ酸配列を有していた。
式（ａ） ： ＳＱＬＳＲ
式（ｂ） ： ＩＹＲ
式（ｃ）：ＹＴＧＮＡＳＳＶＶＫ
式（ｄ） ：ＡＳＳＩＧＡＥＤＥＦＭＡＡＮＡＧＲＥ
式（ｅ） ： ＥＳＶＤＡＦＶＮ
式（ｆ） ：ＱＧＮＷＩＮＹＫ
式（ｇ） ＋ＭＧＹＥＥＧＹＦＨＱＳＬ式（ｈ）：ＡＬ
ＧＤＦＡＬＲ 式（ｉ） ：ＷＧＹＬＡＶＲ 式（ｊ） ：ＡＧＹＹＡＥ 式（ｋ） ： ＶＷＷＳＥ 式（＋）：ＷＶＴＰＡＶＫＥ 式（ｍ）＋ＬＤＧＲＦＤＬＹＧＧＦＳＨＰＴＥ式（ｎ）
：ＹＮＤＮＩＳＦ 式（ｏ） ： ５ＳＴＤＹＧＫＹＡＧＰ ＩＦＤ式（１
）） ＋ＧＤＰＳＱＰＧＮＩＰＮＦＩＡＹＥ式（Ｑ）
： ＹＶＨＹＬＤＧＲＦＤ 式（ｒ） ： ＴＡＳＹＹＡＤＣ５Ｅ 式（ｓ） ：ＷＮＤＱＹ 式（ｔ） ： ＧＹＴＧＧＧＳＤＥＬ はなしか、または式（ａ）ないし（ｔ）中のアルファベ
ットは、以下のアミノ酸を示す。
ＧＤＦＡＬＲ 式（ｉ） ：ＷＧＹＬＡＶＲ 式（ｊ） ：ＡＧＹＹＡＥ 式（ｋ） ： ＶＷＷＳＥ 式（＋）：ＷＶＴＰＡＶＫＥ 式（ｍ）＋ＬＤＧＲＦＤＬＹＧＧＦＳＨＰＴＥ式（ｎ）
：ＹＮＤＮＩＳＦ 式（ｏ） ： ５ＳＴＤＹＧＫＹＡＧＰ ＩＦＤ式（１
）） ＋ＧＤＰＳＱＰＧＮＩＰＮＦＩＡＹＥ式（Ｑ）
： ＹＶＨＹＬＤＧＲＦＤ 式（ｒ） ： ＴＡＳＹＹＡＤＣ５Ｅ 式（ｓ） ：ＷＮＤＱＹ 式（ｔ） ： ＧＹＴＧＧＧＳＤＥＬ はなしか、または式（ａ）ないし（ｔ）中のアルファベ
ットは、以下のアミノ酸を示す。
Ａ：アラニン、Ｃニジスティン、Ｄ：アスパラギン酸、
Ｅ：グルタミン酸、Ｆ：フェニルアラニン、Ｇニゲリシ
ン、Ｈ：ヒスチジン、■＝インロイシン、Ｋ：リシン、
Ｌ：ロイシン、Ｍ：メチオニン、Ｎ：アスパラギン、Ｐ
ニブロリン、Ｑ：グルタミン、Ｒ：アルギニン、ｓ：セ
リン、Ｔ：スレオニン、ｖ：バリン、ｗニトリプトファ
ン、Ｙ：チロシン。
Ｅ：グルタミン酸、Ｆ：フェニルアラニン、Ｇニゲリシ
ン、Ｈ：ヒスチジン、■＝インロイシン、Ｋ：リシン、
Ｌ：ロイシン、Ｍ：メチオニン、Ｎ：アスパラギン、Ｐ
ニブロリン、Ｑ：グルタミン、Ｒ：アルギニン、ｓ：セ
リン、Ｔ：スレオニン、ｖ：バリン、ｗニトリプトファ
ン、Ｙ：チロシン。
実施例４
ＤＮＡ塩基配列の決定
プラスミドｐＬｃｏ−１（７）７．０ｋｂＤＮＡ挿入断
片の内、４．１ｋｂについて塩基配列を以下の方法で決
定した。即ち、プラスミドｐＬｃｏ−１を各種制限酵素
で切断し、５００ｂｐ前後のＤＮＡ断片を調製した。こ
れらのＤＮＡ断片をファージＭ１３にクローニングし、
ジデオキシ法［エフ・サンガーら、プロシーデインダス
・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシス
・ニー・ニス・エイ（Ｆ。
片の内、４．１ｋｂについて塩基配列を以下の方法で決
定した。即ち、プラスミドｐＬｃｏ−１を各種制限酵素
で切断し、５００ｂｐ前後のＤＮＡ断片を調製した。こ
れらのＤＮＡ断片をファージＭ１３にクローニングし、
ジデオキシ法［エフ・サンガーら、プロシーデインダス
・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシス
・ニー・ニス・エイ（Ｆ。
Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ）。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ）。
７４．５９６３−５９６７、１９７７１により塩基配列
を決定した。
を決定した。
決定された塩基配列は４０５４塩基対からなり、アクロ
モバクタ−・コラゲナーゼの全領域を含んでいる。塩基
配列（第２図）中には、１３３７〜１３３９番目のＡＴ
Ｇから始まり、３７７９〜３７８１番目のＴＡＧで終わ
る３７７８塩基対からなるコラゲナーゼに対応するオー
ブンリーディングフレームが存在する。ＡＴＧ開始コド
ンの５塩基対前にＧＡＡＧＡＡＡのリポソームパインデ
ィングサイトが存在する。
モバクタ−・コラゲナーゼの全領域を含んでいる。塩基
配列（第２図）中には、１３３７〜１３３９番目のＡＴ
Ｇから始まり、３７７９〜３７８１番目のＴＡＧで終わ
る３７７８塩基対からなるコラゲナーゼに対応するオー
ブンリーディングフレームが存在する。ＡＴＧ開始コド
ンの５塩基対前にＧＡＡＧＡＡＡのリポソームパインデ
ィングサイトが存在する。
全塩基配列中において、決定された塩基配列から推測さ
れるアミノ酸配列と、実施例３において決定された部分
アミノ酸配列とを比較してみると、以下の２０個のアミ
ノ酸配列において一致してい（ａ）ＳＱＬＳＲ ＡＧＴＣＡＧＣＴＧＡＧＴＣＧＡ ＳｅｒＧｌｎＬｅｕＳｅｒＡｒｇ （ｂ） ｌ Ｙ Ｒ ＡＴＴＴＡＴＣＧＴ １１ｅＴｙｒＡｒｇ （ｃ）ＹＴＧＮＡＳＳＶＶＫ ＴＡＴＡＣＧＧＧＴＡＡＣＧＣＧＡＧＴＴＣＴＧＴＴＧ
ＴＧＡＡＧＴｙｒＴｈｒＧｌｙＡｓｎＡｌａＳｅｒＳｅ
ｒＶａｌＶａｌＬｙｓ（ｄ）ＡＳＳＩＧＡＥＤＥＦＭＡ ＧＣＧＴＣＡＴＣＡＡＴＣＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧ
ＡＧＴＴＴＡＴＧＧＣＣＡｌａＳｅｒＳｅｒＴｈｒＧＩ
ｙＡｌａＧＩｕＡｓｐＧＩｕＰｈｅＭｅｔＡｌａＮＡＧ
ＲＥ ＧＣＧＡＡＴＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＡＧＡｌａＡｓｎＡ
ＩａＧＩｙＡｒｇＧｌｕ（ｅ）ＥＳＶＤＡＦＶＮ ＧＡＡＴＣＡＧＴＧＧＡＴＧＣＧＴＴＴＧＴＴＡＡＣＧ
ＩｕＳｅｒＶａｌＡｓｐＡＩａＰｈｅＶａｌＡｓｎ（ｆ
）ＱＧＮＷＩＮＹＫ ＣＡＡＧＧＧＡＡＴＴＧＧＡＴＣＡＡＴＴＡＣＡＡＧＧ
ｌｎＧＩｙＡｓｎＴｒｐｌ ｌｅＡｓｎＴｙｒＬｙｓ（
ｇ）ＭＧＹＥＥＧＹＦｌｔＱＳＬ ＡＴＧＧＧＴＴＡＣＧＡＡＧＡＧＧＧＴＴＡＣＴＴＴＣ
ＡＴＣＡＧＴＣＡＴＴＡＭａｔＧ ｌ ｙＴｙｒＧ ｌ
ｕＧ １ ｕＧ １ｙＴｙｒＰｈｅＨｉｓＧ １ｎｓｅ
ｒＬｅｕ（ｈ）ＡＬＧＤＦＡＬＩ？ にＣＴＴＴＡＧＧＣＧＡＴＴＴＴＧＣＴＣＴＡＡＧＧＡ
ｌａＬｅｕＧｌｙＡｓｐＰｈｅＡｌａＬｅｕＡｒｇ（ｉ
）ＷＧＹＬＡＶＲ ＴＧＧＧＧＧＴＡＣＴＴＡＧＣＴＧＴＡＣＧＴＴｒｐＧ
ｌｙＴｙｒＬｅｕＡｌａＶａｌＡｒｇ（ｊ）ＡＧＹＹＡ
Ｅ ＧＣＧＧＧＴＴＡＴＴＡＣＧＣＣＧＡＧＡＩａＧｌｙＴ
ｙｒＴｙｒＡＩａＧｌｕ（ｋ）ＶＷＷＳＥ ＧＴＧＴＧＧＴＧＧＡ（、ＴＧＡＡ ＶａｌＴｒｐＴｒｐＳｅｒＧｌｕ （１）ＷＶＴＰＡＶＫＥ ＴＧＧＧＴＣＡＣＣＣＣＡＧＣＧＣ；ＴＧＡＡＡ（１；
ＡＡＴｒｐＶａｌＴｈｒＰｒｏＡｌａＶａｌＬｙｓＧｌ
ｕ（ｍ）ＬＤＧＲＦＤＬＹＧＧＦ ＴＴＡＧＡＴＧＧＴＣＧＡＴＴＴＧＡＴＣＴＣＴＡＴＧ
ＧＡＧＧＧＴＴＴＬｅｕＡｓｐＧｌｙＡｒｇＰｈｅＧＩ
ｕＬｅｕＴｙｒＧｌｙＧＩｙＰｈｅＨＰＴＥＫ ＡにＴＣＡＴＣＣＡＡＣＴＧＡＡＡＡＡＳｅｒＨｉｓＰ
ｒｏＴｈｒＧ１ｕＬｙｓ（ｎ）ＹＮＤＮＩＳＦ ＴＡＣＡＡＴＣ；ＡＣＡＡＣＡＴＣＴＣＡＴ丁ＴＴｙｒ
ＡｓｎＧｌｕＡｓｎｌｌｅＳｅｒＰｈｅ（ｏ）ＳＳＴＤ
ＹＧＫＹＡＧＰ ＴＣＡＡＧＴＡＣＣＧＡＴＴＡＴＧＧＴＡＡＧＴＡＣＣ
ＣＡＧＧＧＣＣＡＳｅｒＳｅｒＴｈｒＧｌｕＴｙｒＧＩ
ｙＬｙｓＴｙｒＡｌａＧＩｙＰｒ。
れるアミノ酸配列と、実施例３において決定された部分
アミノ酸配列とを比較してみると、以下の２０個のアミ
ノ酸配列において一致してい（ａ）ＳＱＬＳＲ ＡＧＴＣＡＧＣＴＧＡＧＴＣＧＡ ＳｅｒＧｌｎＬｅｕＳｅｒＡｒｇ （ｂ） ｌ Ｙ Ｒ ＡＴＴＴＡＴＣＧＴ １１ｅＴｙｒＡｒｇ （ｃ）ＹＴＧＮＡＳＳＶＶＫ ＴＡＴＡＣＧＧＧＴＡＡＣＧＣＧＡＧＴＴＣＴＧＴＴＧ
ＴＧＡＡＧＴｙｒＴｈｒＧｌｙＡｓｎＡｌａＳｅｒＳｅ
ｒＶａｌＶａｌＬｙｓ（ｄ）ＡＳＳＩＧＡＥＤＥＦＭＡ ＧＣＧＴＣＡＴＣＡＡＴＣＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧ
ＡＧＴＴＴＡＴＧＧＣＣＡｌａＳｅｒＳｅｒＴｈｒＧＩ
ｙＡｌａＧＩｕＡｓｐＧＩｕＰｈｅＭｅｔＡｌａＮＡＧ
ＲＥ ＧＣＧＡＡＴＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＡＧＡｌａＡｓｎＡ
ＩａＧＩｙＡｒｇＧｌｕ（ｅ）ＥＳＶＤＡＦＶＮ ＧＡＡＴＣＡＧＴＧＧＡＴＧＣＧＴＴＴＧＴＴＡＡＣＧ
ＩｕＳｅｒＶａｌＡｓｐＡＩａＰｈｅＶａｌＡｓｎ（ｆ
）ＱＧＮＷＩＮＹＫ ＣＡＡＧＧＧＡＡＴＴＧＧＡＴＣＡＡＴＴＡＣＡＡＧＧ
ｌｎＧＩｙＡｓｎＴｒｐｌ ｌｅＡｓｎＴｙｒＬｙｓ（
ｇ）ＭＧＹＥＥＧＹＦｌｔＱＳＬ ＡＴＧＧＧＴＴＡＣＧＡＡＧＡＧＧＧＴＴＡＣＴＴＴＣ
ＡＴＣＡＧＴＣＡＴＴＡＭａｔＧ ｌ ｙＴｙｒＧ ｌ
ｕＧ １ ｕＧ １ｙＴｙｒＰｈｅＨｉｓＧ １ｎｓｅ
ｒＬｅｕ（ｈ）ＡＬＧＤＦＡＬＩ？ にＣＴＴＴＡＧＧＣＧＡＴＴＴＴＧＣＴＣＴＡＡＧＧＡ
ｌａＬｅｕＧｌｙＡｓｐＰｈｅＡｌａＬｅｕＡｒｇ（ｉ
）ＷＧＹＬＡＶＲ ＴＧＧＧＧＧＴＡＣＴＴＡＧＣＴＧＴＡＣＧＴＴｒｐＧ
ｌｙＴｙｒＬｅｕＡｌａＶａｌＡｒｇ（ｊ）ＡＧＹＹＡ
Ｅ ＧＣＧＧＧＴＴＡＴＴＡＣＧＣＣＧＡＧＡＩａＧｌｙＴ
ｙｒＴｙｒＡＩａＧｌｕ（ｋ）ＶＷＷＳＥ ＧＴＧＴＧＧＴＧＧＡ（、ＴＧＡＡ ＶａｌＴｒｐＴｒｐＳｅｒＧｌｕ （１）ＷＶＴＰＡＶＫＥ ＴＧＧＧＴＣＡＣＣＣＣＡＧＣＧＣ；ＴＧＡＡＡ（１；
ＡＡＴｒｐＶａｌＴｈｒＰｒｏＡｌａＶａｌＬｙｓＧｌ
ｕ（ｍ）ＬＤＧＲＦＤＬＹＧＧＦ ＴＴＡＧＡＴＧＧＴＣＧＡＴＴＴＧＡＴＣＴＣＴＡＴＧ
ＧＡＧＧＧＴＴＴＬｅｕＡｓｐＧｌｙＡｒｇＰｈｅＧＩ
ｕＬｅｕＴｙｒＧｌｙＧＩｙＰｈｅＨＰＴＥＫ ＡにＴＣＡＴＣＣＡＡＣＴＧＡＡＡＡＡＳｅｒＨｉｓＰ
ｒｏＴｈｒＧ１ｕＬｙｓ（ｎ）ＹＮＤＮＩＳＦ ＴＡＣＡＡＴＣ；ＡＣＡＡＣＡＴＣＴＣＡＴ丁ＴＴｙｒ
ＡｓｎＧｌｕＡｓｎｌｌｅＳｅｒＰｈｅ（ｏ）ＳＳＴＤ
ＹＧＫＹＡＧＰ ＴＣＡＡＧＴＡＣＣＧＡＴＴＡＴＧＧＴＡＡＧＴＡＣＣ
ＣＡＧＧＧＣＣＡＳｅｒＳｅｒＴｈｒＧｌｕＴｙｒＧＩ
ｙＬｙｓＴｙｒＡｌａＧＩｙＰｒ。
ＦＤ
ＡＴＴＴＴＣＧＡＴ
１１ｅＰｈｅＧＩｕ
（ｐ）ＧＤＰＳＱＰＧＮ ＪＰＮ
ＧＧＣＧＡＣＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＣＧＧＧＧＡＡＴＡ
ＴＴＣＣＣＡＡＣＧｌｙＡｓｐＰｒｏＳｅｒＧｌｎＰｒ
ｏＧｌｙＡｓｎｌ ＩｅＰｒｏＡｓｎＩＡＹＥ ＴＴＴＡＴＴＧＣＴＴＡＴＧＡＡ ＰｈｅｌｌｅＡｌａＴｙｒＧｌｕ （Ｑ）ＹＶＨＹＬＤＧＲＦＤ ＴＡＣＧＴＧＣＡＴＴＡＣＴＴＡＧＡＴＧＧＴＣＧＡＴ
ＴＴＧＡＴＴｙｒＶａ ＩＩ ｉｓＴｙｒＬｅｕＡｓｐ
ＧＩｙＡｒｇＰｈｅＡｓｐ（ｒ）ＴＡＳＹＹＡＤＣ５Ｅ ＡＣＣＧＣＣＴＣＡＴＡＴＴＡＣＧＣＡＧＡＴＴＧＴＡ
ＧＴＧＡにＴｈｒＡｌａＳｅｒＴｙｒＴｙｒＡｌａＡｓ
ｐＣｙｓＳｅｒＧｌｕ（ｓ）ＷＮＤＱＹ ＴＧＧＡＡＴＧＡＴＣＡＡＴＡＣ ＴｒｐＡｓｎＡｓｐＧ ＩｎＴｙｒ （ｔ）ＧＹＴＧＧＧＳＤＥＬ ＧＧＧＴＡＴＡＣＧＧＧＴＧＧＣＧＧＧＡＧＣＧＡＴＧ
ＡＡＣＴＡＧｌｙＴｙｒＴｈｒＧＩｙＧＩｙＧｌｙＳｅ
ｒＡｓｐＧｌｕＬｅｕ実施例５ 遺伝子産物の解析 まず、コラゲナーゼ遺伝子を大腸菌で大量に生産させる
ための組換えプラスミドを作成した。プラスミドｐＬｃ
ｏ−１の７ｋｂ挿入挿入ＤＮＡ上、第１２１３番目のＨ
ｐａｌルミｌサイトｍＨＩリンカ−を、３９３６番目の
ＥｃｏＲＶサイトに５ａ１１リンカ−を挿入した。この
ように２つのリンカ−を挿入したｐＬｃｏ−１をＢａｍ
ＨＩおよび５ａｌｒで切断することにより、コラゲナー
ゼ遺伝子の全長を含む２．７ ｋ ｂのＤＮＡ断片を調
製することができる。回収した当該ＤＮＡ断片をベクタ
ーｐｏｃ ｌ ８のＢａｍＨＩ／５ａｉｌサイトに挿入
してｐＨＵｃ１４を作成した。組換えプラスミドｐＨＵ
ｃ１４を大腸菌ＪＭ１０９に形質転換して、コラゲナー
ゼを大量に生産する大腸菌組換え体を作成した。
ＴＴＣＣＣＡＡＣＧｌｙＡｓｐＰｒｏＳｅｒＧｌｎＰｒ
ｏＧｌｙＡｓｎｌ ＩｅＰｒｏＡｓｎＩＡＹＥ ＴＴＴＡＴＴＧＣＴＴＡＴＧＡＡ ＰｈｅｌｌｅＡｌａＴｙｒＧｌｕ （Ｑ）ＹＶＨＹＬＤＧＲＦＤ ＴＡＣＧＴＧＣＡＴＴＡＣＴＴＡＧＡＴＧＧＴＣＧＡＴ
ＴＴＧＡＴＴｙｒＶａ ＩＩ ｉｓＴｙｒＬｅｕＡｓｐ
ＧＩｙＡｒｇＰｈｅＡｓｐ（ｒ）ＴＡＳＹＹＡＤＣ５Ｅ ＡＣＣＧＣＣＴＣＡＴＡＴＴＡＣＧＣＡＧＡＴＴＧＴＡ
ＧＴＧＡにＴｈｒＡｌａＳｅｒＴｙｒＴｙｒＡｌａＡｓ
ｐＣｙｓＳｅｒＧｌｕ（ｓ）ＷＮＤＱＹ ＴＧＧＡＡＴＧＡＴＣＡＡＴＡＣ ＴｒｐＡｓｎＡｓｐＧ ＩｎＴｙｒ （ｔ）ＧＹＴＧＧＧＳＤＥＬ ＧＧＧＴＡＴＡＣＧＧＧＴＧＧＣＧＧＧＡＧＣＧＡＴＧ
ＡＡＣＴＡＧｌｙＴｙｒＴｈｒＧＩｙＧＩｙＧｌｙＳｅ
ｒＡｓｐＧｌｕＬｅｕ実施例５ 遺伝子産物の解析 まず、コラゲナーゼ遺伝子を大腸菌で大量に生産させる
ための組換えプラスミドを作成した。プラスミドｐＬｃ
ｏ−１の７ｋｂ挿入挿入ＤＮＡ上、第１２１３番目のＨ
ｐａｌルミｌサイトｍＨＩリンカ−を、３９３６番目の
ＥｃｏＲＶサイトに５ａ１１リンカ−を挿入した。この
ように２つのリンカ−を挿入したｐＬｃｏ−１をＢａｍ
ＨＩおよび５ａｌｒで切断することにより、コラゲナー
ゼ遺伝子の全長を含む２．７ ｋ ｂのＤＮＡ断片を調
製することができる。回収した当該ＤＮＡ断片をベクタ
ーｐｏｃ ｌ ８のＢａｍＨＩ／５ａｉｌサイトに挿入
してｐＨＵｃ１４を作成した。組換えプラスミドｐＨＵ
ｃ１４を大腸菌ＪＭ１０９に形質転換して、コラゲナー
ゼを大量に生産する大腸菌組換え体を作成した。
組換え体大腸菌内でのアクロモバクタ−・コラゲナーゼ
遺伝子産物を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法およびウェスターンプロット法によって解析した。ウ
ェスターンプロット法はバーネットの方法［バーネット
・ダブリユウ・エヌ、アナリティカル・バイオケミスト
リー（ＢｕｒｎｅｔｔｅＷ、Ｎ、、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、）、１１２．６８（ｈ６８５． （１９８１）
］を改良して行った。コラゲナーゼ遺伝子を含有する犬
腸菌組換え体を、Ｔ ＰＴＧを１ｍＨになるように添加
したしグロス中で、３７℃で１７時間培養した。遠心に
より菌体を集めた後、超音波処理により菌体を破砕した
。この菌体破砕液をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動法により分画した。ウェスターンプロット法により
分画されたタンパク質をニトロセルロース膜に移したの
ち、ウサギより調製した抗コラゲナーゼ抗体およびパー
オキンダーゼ標識した抗つサギＩｇＧ抗体を用いて、コ
ラゲナーゼのバンドだけを発色させた。第３図に示すよ
うに、ｐ ＨＵＣ１４を持つ大腸菌５Ｍ１０９中には、
分子量約８５ｋｄのタンパク質を主成分とする抗コラゲ
ナーゼ抗体と反応する数多くのバンドが認められた。ｐ
Ｌｃｏ−１を持つ大腸菌５Ｍ１０９中にあ、抗コラゲナ
ーゼ抗体と反応するタンパク質がわずかであるが認めら
れた。
遺伝子産物を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法およびウェスターンプロット法によって解析した。ウ
ェスターンプロット法はバーネットの方法［バーネット
・ダブリユウ・エヌ、アナリティカル・バイオケミスト
リー（ＢｕｒｎｅｔｔｅＷ、Ｎ、、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、）、１１２．６８（ｈ６８５． （１９８１）
］を改良して行った。コラゲナーゼ遺伝子を含有する犬
腸菌組換え体を、Ｔ ＰＴＧを１ｍＨになるように添加
したしグロス中で、３７℃で１７時間培養した。遠心に
より菌体を集めた後、超音波処理により菌体を破砕した
。この菌体破砕液をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動法により分画した。ウェスターンプロット法により
分画されたタンパク質をニトロセルロース膜に移したの
ち、ウサギより調製した抗コラゲナーゼ抗体およびパー
オキンダーゼ標識した抗つサギＩｇＧ抗体を用いて、コ
ラゲナーゼのバンドだけを発色させた。第３図に示すよ
うに、ｐ ＨＵＣ１４を持つ大腸菌５Ｍ１０９中には、
分子量約８５ｋｄのタンパク質を主成分とする抗コラゲ
ナーゼ抗体と反応する数多くのバンドが認められた。ｐ
Ｌｃｏ−１を持つ大腸菌５Ｍ１０９中にあ、抗コラゲナ
ーゼ抗体と反応するタンパク質がわずかであるが認めら
れた。
一方、対照とした組換えプラスミドを含まない大腸菌Ｊ
ＭＩ ０９中には、抗コラゲナーゼ抗体と反応するタン
パク質は全く認められなかった。以上の結−果は、コラ
ゲナーゼ遺伝子を含む組換え体プラスミドｐＬＣＯ−１
およびｐＨＵｃ１４を持つ大腸菌中では、アクロモバク
タ−・コラゲナーゼと免疫学的に同等のタンパク質が生
産されていることを示しており、しかもｐＨＵｃ１４を
含む大腸菌中では大量に生産されていることを示してい
る。
ＭＩ ０９中には、抗コラゲナーゼ抗体と反応するタン
パク質は全く認められなかった。以上の結−果は、コラ
ゲナーゼ遺伝子を含む組換え体プラスミドｐＬＣＯ−１
およびｐＨＵｃ１４を持つ大腸菌中では、アクロモバク
タ−・コラゲナーゼと免疫学的に同等のタンパク質が生
産されていることを示しており、しかもｐＨＵｃ１４を
含む大腸菌中では大量に生産されていることを示してい
る。
実施例６
形質転換体のコラゲナーゼ活性
アクロモバクタ−・コラゲナーゼ遺伝子を含有する大腸
菌組換体中のコラゲナーゼ活性を、合成基質４−フェニ
ルアゾーベンジオキシー力ルポニルーＬ−Ｐｒｏ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ−ＨＣｆｆ（ＰＺ
−ＰＬＧＰＲ）を用いて測定した。コラゲナーゼ活性の
測定法および活性単位（Ｕ）の定義は、特表昭６０−５
００４１３号に詳細に開示されている。大腸菌の超音波
処理菌体破砕液の調製法は、実施例５に示した。
菌組換体中のコラゲナーゼ活性を、合成基質４−フェニ
ルアゾーベンジオキシー力ルポニルーＬ−Ｐｒｏ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ−ＨＣｆｆ（ＰＺ
−ＰＬＧＰＲ）を用いて測定した。コラゲナーゼ活性の
測定法および活性単位（Ｕ）の定義は、特表昭６０−５
００４１３号に詳細に開示されている。大腸菌の超音波
処理菌体破砕液の調製法は、実施例５に示した。
第１表に示すように、コラゲナーゼ遺伝子ｐＨＵＣｌ４
を含む大腸菌ＪＭＩ Ｏ９中には、高いコラゲナーゼ活
性が認められた。プラスミドｐＬＣＯ−１を含む大腸菌
ＪＭ１０９およびプラスミドを含まない大腸菌ＪＭＩ
０９中には、コラゲナーゼ活性は認められなかった。以
上の結果からコラゲナーゼ遺伝子を含む大腸菌組換体中
で発現している遺伝子産物は、コラゲナーゼ活性を有し
ていることが明らかになった。なお、プラスミドｐＬＣ
Ｏ−１を含む大腸菌中にコラゲナーゼ活性を検出できな
いのは、発現量が低いためと考えられる。
を含む大腸菌ＪＭＩ Ｏ９中には、高いコラゲナーゼ活
性が認められた。プラスミドｐＬＣＯ−１を含む大腸菌
ＪＭ１０９およびプラスミドを含まない大腸菌ＪＭＩ
０９中には、コラゲナーゼ活性は認められなかった。以
上の結果からコラゲナーゼ遺伝子を含む大腸菌組換体中
で発現している遺伝子産物は、コラゲナーゼ活性を有し
ていることが明らかになった。なお、プラスミドｐＬＣ
Ｏ−１を含む大腸菌中にコラゲナーゼ活性を検出できな
いのは、発現量が低いためと考えられる。
第１表 大腸菌組換体のコラゲナーゼ活性プラスミド
コラゲナーゼ活性 なし 〈５ ｐＬＣ○−１〈５ ｐＵｃ１４ １８９ プラスミド：表記したプラスミドを含有する大腸菌ＪＭ
１０９のコラゲナーゼ活性を 示した。
コラゲナーゼ活性 なし 〈５ ｐＬＣ○−１〈５ ｐＵｃ１４ １８９ プラスミド：表記したプラスミドを含有する大腸菌ＪＭ
１０９のコラゲナーゼ活性を 示した。
（発明の効果）
本発明によりビブリオ・アルギノリティカス由来のアク
ロモバクタ−・コラゲナーゼの遺伝子が取得され、その
アミノ酸配列が明らかになった。
ロモバクタ−・コラゲナーゼの遺伝子が取得され、その
アミノ酸配列が明らかになった。
これにより、アクロモバクタ−・コラゲナーゼを遺伝子
工学技術を利用することで例えば適当な宿主で大量に生
産することや、コラゲナーゼを遺伝子工学的手法により
改良することなどの手段が講じられるようになった。
工学技術を利用することで例えば適当な宿主で大量に生
産することや、コラゲナーゼを遺伝子工学的手法により
改良することなどの手段が講じられるようになった。
第１図は、コラゲナーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＬｃ
ｏ−１中の７．Ｏｋｂ挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図を
示す図面である。図中、下部矢印は、コラゲナーゼ構造
遺伝子の領域および転写の方向を示す。０内の数字は、
塩基番号を示す。 点線は、制限酵素による切断点が２者のうちで特定でき
ないことを示している。 第２図は、コラゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の全塩
基配列および当該塩基配列より推定され線のアンダーラ
インを付した領域は、精製コラゲナーゼの部分アミノ酸
配列（実施例３参照）と−致する部分を示している。 第３図は、ウェスターンプロット法による大腸菌内での
コラゲナーゼ遺伝子産物の解析を行った結果を示す模式
図であり、図中、矢印は同時に泳動を行った分子量マー
カーの泳動位置を示す。
ｏ−１中の７．Ｏｋｂ挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図を
示す図面である。図中、下部矢印は、コラゲナーゼ構造
遺伝子の領域および転写の方向を示す。０内の数字は、
塩基番号を示す。 点線は、制限酵素による切断点が２者のうちで特定でき
ないことを示している。 第２図は、コラゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の全塩
基配列および当該塩基配列より推定され線のアンダーラ
インを付した領域は、精製コラゲナーゼの部分アミノ酸
配列（実施例３参照）と−致する部分を示している。 第３図は、ウェスターンプロット法による大腸菌内での
コラゲナーゼ遺伝子産物の解析を行った結果を示す模式
図であり、図中、矢印は同時に泳動を行った分子量マー
カーの泳動位置を示す。
Claims (12)
- （１）ビブリオ・アルギノリティカス（Ｖｉｂｒｉｏａ
ｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）に属する細菌由来のコラゲ
ナーゼ遺伝子。 - （２）添付の第１図に示す制限酵素地図を有するビブリ
オ・アルギノリティカス由来のコラゲナーゼをコードす
る遺伝子。 - （３）少なくとも下記式（ａ）ないし（ｔ）で示される
ペプチド断片を有するビブリオ・アルギノリティカス由
来のコラゲナーゼをコードする請求項第２項記載の遺伝
子。 式（ａ）：ＳＱＬＳＲ 式（ｂ）：ＩＹＲ 式（ｃ）：ＹＴＧＮＡＳＳＶＶＫ 式（ｄ）：ＡＳＳＩＧＡＥＤＥＦＭＡＡＮＡＧＲＥ 式（ｅ）：ＥＳＶＤＡＦＶＮ 式（ｆ）：ＱＧＮＷＩＮＹＫ 式（ｇ）：ＭＧＹＥＥＧＹＦＨＱＳＬ 式（ｈ）：ＡＬＧＤＦＡＬＲ 式（ｉ）：ＷＧＹＬＡＶＲ 式（ｊ）：ＡＧＹＹＡＥ 式（ｋ）：ＶＷＷＳＥ 式（ｌ）：ＷＶＴＰＡＶＫＥ 式（ｍ）：ＬＤＧＲＦＤＬＹＧＧＦＳＨＰＴＥＫ 式（ｎ）：ＹＮＤＮＩＳＦ 式（ｏ）：ＳＳＴＤＹＧＫＹＡＧＰＩＦＤ 式（ｐ）：ＧＤＰＳＱＰＧＮＩＰＮＦＩＡＹＥ式（ｑ）
：ＹＶＨＹＬＤＧＲＦＤ 式（ｒ）：ＴＡＳＹＹＡＤＣＳＥ 式（ｓ）：ＷＮＤＱＹ 式（ｔ）：ＧＹＴＧＧＧＳＤＥＬ 但し、式（ａ）ないし（ｔ）中のアルファベットは、以
下のアミノ酸を示す。 Ａ：アラニン、Ｃ：システイン、Ｄ：アスパラギン酸、
Ｅ：グルタミン酸、Ｆ：フェニルアラニン、Ｇ：グリシ
ン、Ｈ：ヒスチジン、Ｉ：イソロイシン、Ｋ：リシン、
Ｌ：ロイシン、Ｍ：メチオニン、Ｎ：アスパラギン、Ｐ
：プロリン、Ｑ：グルタミン、Ｒ：アルギニン、Ｓ：セ
リン、Ｔ：スレオニン、Ｖ：バリン、Ｗ：トリプトファ
ン、Ｙ：チロシン。 - （４）請求項第２項記載のビブリオ・アルギノリティカ
ス由来のコラゲナーゼ遺伝子または当該遺伝子と生物学
的に実質的に同等な遺伝子を含有する組換えベクター。 - （５）請求項第２項記載のビブリオ・アルギノリティカ
ス由来のコラゲナーゼ遺伝子を含有するプラスミドによ
り形質転換された宿主細胞。 - （６）ビブリオ・アルギノリティカス由来のコラゲナー
ゼの製造法において、請求項第５項記載の宿主細胞を培
養することにより該酵素を発現させ、培養物より該酵素
を回収・精製することを特徴とする該コラゲナーゼの製
造法。 - （７）下記式（ I ）で表されるアミノ酸配列を有する
ビブリオ・アルギノリティカス（ Ｖｉｂｒｉｏａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来のコラ
ゲナーゼ。 式（ I ）： 【遺伝子配列があります】 但し、式（ I ）中、Ｘは、水素原子または次式（II）
で表されるポリペプチドを示す。 式（II）： 【遺伝子配列があります】 また、式（ I ）、（II）中のアルファベットは、以下
のアミノ酸を示す。 Ａ；アラニン、Ｃ；システイン、Ｄ；アスパラギン酸、
Ｅ；グルタミン酸、Ｆ；フェニルアラニン、Ｇ；グリシ
ン、Ｈ：ヒスチジン、Ｉ；イソロイシン、Ｋ；リシン、
Ｌ；ロイシン、Ｍ；メチオニン、Ｎ；アスパラギン、Ｐ
；プロリン、Ｑ；グルタミン、Ｒ；アルギニン、Ｓ；セ
リン、Ｔ；スレオニン、Ｖ；バリン、Ｗ；トリプトファ
ン、Ｙ；チロシン。 - （８）請求項第１項記載の式（ I ）で表されるアミノ
酸配列を有するコラゲナーゼのアミノ酸配列をコードす
る遺伝子。 - （９）下記式（III）で表される塩基配列または式（II
I）と実質的に生物学的に同等な塩基配列を有する生物
学的に順化されたビブリオ・アルギノリティカス由来の
コラゲナーゼ遺伝子。 式（III）： 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 但し、式（III）中、Ｚはなしか、または式（IV）で表
される塩基配列を示す。 式（IV）： 【遺伝子配列があります】 - （１０）特許請求の範囲第８項に記載のビブリオ・アル
ギノリティカス由来のコラゲナーゼ遺伝子、または当該
遺伝子と実質的に生物学的に同等な遺伝子を有する組換
えベクター。 - （１１）特許請求の範囲第８項に記載のビブリオ・アル
ギノリティカス由来のコラゲナーゼ遺伝子を含有するプ
ラスミドにより形質転換された宿主細胞。 - （１２）特許請求の範囲第１１項に記載の組換え体宿主
細胞を培養し、その菌体ないしは培養液から酵素を回収
することを特徴とするビブリオ・アルギノリティカス由
来コラゲナーゼの製造法。
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